GRP78 ओवरएक्प्रेशन ट्रिगर्स PINK1-IP3R-मध्यस्थता न्यूरोप्रोटेक्टिव माइटोफैगी भाग 1

अमूर्त:

स्पाइनल रूट एवल्शन (आरए) का एक प्रायोगिक मॉडल कारण आणविक कार्यक्रमों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो न्यूरॉन-लक्ष्य वियोग के बाद प्रतिगामी न्यूरोडीजेनेरेशन को संचालित करते हैं।

स्पाइनल रूट एवल्शन एक घातक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की चोट है जो रोगी के दैनिक जीवन और संज्ञानात्मक क्षमता पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकती है। सौभाग्य से, हालांकि, स्मृति आवश्यक रूप से प्रभावित नहीं होती है, और अधिकांश रोगी कुछ प्रभावी संज्ञानात्मक पुनर्वास विधियों के माध्यम से अपनी स्मृति में सुधार कर सकते हैं।

कई अध्ययनों से पता चला है कि स्पाइनल रूट एवल्शन सीधे तौर पर किसी व्यक्ति की याददाश्त को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन मुख्य रूप से रोगी के मस्तिष्क की संज्ञानात्मक क्षमता को प्रभावित करता है, जिसमें ध्यान, अनुभूति और सीखना शामिल है। इसका मतलब यह है कि रीढ़ की हड्डी में ऐंठन से प्रभावित होने पर भी कई लोगों की याददाश्त अच्छी रहती है।

इसलिए, स्पाइनल रूट एवल्शन से प्रभावित लोगों के लिए, संज्ञानात्मक क्षमता में सुधार करना स्मृति में सुधार की कुंजी है। संज्ञानात्मक पुनर्वास एक प्रभावी तरीका है जो रोगियों को उनके मस्तिष्क की संज्ञानात्मक क्षमता के पुनर्निर्माण में मदद कर सकता है और इस प्रकार उनकी याददाश्त में सुधार कर सकता है। इन तरीकों में क्लोज़, गणितीय ऑपरेशन आदि शामिल हैं, जो रोगियों को उनकी एकाग्रता, संवेदनशीलता और प्रतिक्रिया की गति में सुधार करने में मदद कर सकते हैं।

इसके अलावा, सकारात्मक दृष्टिकोण भी याददाश्त को बेहतर बनाने में एक महत्वपूर्ण कारक है। स्पाइनल रूट एवल्शन वाले मरीजों को, जब चुनौतियों और कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, तो उन्हें आशावादी दृष्टिकोण बनाए रखने की कोशिश करनी चाहिए और पुनर्वास प्रक्रिया में सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए जीवन की विभिन्न चुनौतियों का बहादुरी से सामना करना चाहिए।

संक्षेप में, रीढ़ की हड्डी की जड़ की चोट सीधे तौर पर किसी व्यक्ति की याददाश्त को प्रभावित नहीं करती है। अधिकांश लोग संज्ञानात्मक पुनर्वास जैसे प्रभावी तरीकों के माध्यम से अपनी याददाश्त में सुधार कर सकते हैं। साथ ही, आशावादी रवैया भी याददाश्त में सुधार की कुंजी है। पुनर्वास प्रक्रिया के दौरान, हमें दृढ़ता से विश्वास करना चाहिए कि हम कठिनाइयों पर काबू पा सकते हैं और कदम दर कदम स्वस्थ भविष्य की ओर बढ़ सकते हैं। यह देखा जा सकता है कि हमें अपनी याददाश्त में सुधार करने की जरूरत है। सिस्टैंच याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि सिस्टैंच एक पारंपरिक चीनी औषधीय सामग्री है जिसके कई अनूठे प्रभाव हैं, जिनमें से एक मेमोरी में सुधार करना है। सिस्टैंच की प्रभावकारिता इसके विभिन्न सक्रिय तत्वों से आती है, जिनमें टैनिक एसिड, पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड ग्लाइकोसाइड आदि शामिल हैं। ये तत्व विभिन्न तरीकों से मस्तिष्क स्वास्थ्य को बढ़ावा दे सकते हैं।

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यह न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया न्यूरोनल रोग-संबंधी प्रक्रियाओं जैसे एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव और ऑटोफैगी फ्लक्स रुकावट की उपस्थिति के साथ सामान्य विशेषताओं को साझा करती है।

हमने पहले पाया था कि GRP78 की अतिअभिव्यक्ति ने आरए के बाद मोटोन्यूरोनल न्यूरोप्रोटेक्शन को बढ़ावा दिया था। उसके बाद, हमने तुलनात्मक निष्पक्ष प्रोटिओमिक विश्लेषण और औषधीय और आनुवंशिक हस्तक्षेप करके अंतर्निहित तंत्र को उजागर करने का लक्ष्य रखा।

अप्रत्याशित रूप से, जब GRP78 अतिअभिव्यक्त हुआ तो माइटोकॉन्ड्रियल कारक सबसे अधिक बदल गए, और GRP78 अतिअभिव्यक्त होने के बाद आरए-घायल मोटोन्यूरॉन्स में इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया की प्रचुरता, माइटोफैगी की एक पहचान भी देखी गई।

इसके अलावा, GRP78 ओवरएक्सप्रेशन ने LC 3- माइटोकॉन्ड्रिया टैगिंग को बढ़ाया, PINK1 ट्रांसलोकेशन और माइटोफैगी इंडक्शन को बढ़ावा दिया, और ईआर-स्ट्रेस्ड कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को पुनः प्राप्त किया।

अंत में, हमने पाया कि हमारे मोटोन्यूरोनल मृत्यु के इन विट्रो मॉडल में GRP78-प्रवर्तित प्रो-सर्वाइवल माइटोफैगी को PINK1 और IP3R द्वारा मध्यस्थ किया गया था। यह डेटा GRP78 चैपरोन और माइटोफैगी के बीच एक नए संबंध को इंगित करता है, जो न्यूरोप्रोटेक्शन प्राप्त करने के लिए दवा डिजाइन के लिए नए चिकित्सीय विकल्प खोलता है।

कीवर्ड: GRP78/BiP; मिटोफैगी; motoneurons; न्यूरोडीजेनेरेशन; न्यूरोप्रोटेक्शन

1 परिचय

कार्यात्मक न्यूरोनल कनेक्टिविटी का विघटन न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रियाओं की एक सामान्य प्रारंभिक विशेषता है [1]। एक्सोनल अध: पतन उन न्यूरॉन्स को अलग कर देता है जो एक प्रतिगामी और प्रगतिशील निष्क्रिय प्रक्रिया के माध्यम से दम तोड़ देते हैं।

क्षति की स्थिति में, न्यूरॉन्स प्रतिक्रिया करते हैं, न्यूरोप्रोटेक्शन के अंतर्जात तंत्र को सक्रिय करते हैं जैसे कि अनफोल्डेडप्रोटीन रिस्पॉन्स (यूपीआर), हीट-शॉक रिस्पॉन्स, ऑटोफैगी पाथवे, यूबिकिटिन-प्रोटेसोम सिस्टम, चैपरोन एक्सप्रेशन, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) से संबंधित डिग्रेडेशन मशीनरी। (ईआरएडी), और एंटीऑक्सीडेंट रक्षा।

यद्यपि उनका सटीक सक्रियण कोशिका को ठीक करने में प्रभावी है, अत्यधिक क्षति, साथ ही उम्र बढ़ने के परिणामस्वरूप, उनमें से एक या अधिक कार्यक्रमों की दोषपूर्ण कार्यप्रणाली हो सकती है।

हमने तर्क दिया कि प्रकृति की नकल करना और इन अंतर्जात तंत्रों को बढ़ावा देना न्यूरोप्रोटेक्शन के लिए एक कुशल रणनीति हो सकती है [2,3]। जीआरपी78, जिसे बीआईपी या हीट शॉक प्रोटीन 5ए (एचएसपी5ए) के रूप में भी जाना जाता है, न्यूरोप्रोटेक्शन के अंतर्जात तंत्रों में महत्वपूर्ण कार्यों के साथ एक बहुक्रियाशील प्रोटीन है [4] ]. GRP78यूपीआर को ऑर्केस्ट्रेट्स करता है, जो ईआर तनाव के बाद सक्रिय होता है, इसमें एटीपीस गतिविधि होती है और यह एक सीए {7}}बाध्यकारी प्रोटीन [5,6] है।

यह नए संश्लेषित या गलत तरीके से मुड़े हुए प्रोटीन के उचित तह को बढ़ावा देने और ईआरएडीमशीनरी द्वारा गिरावट के लिए अलग किए गए प्रोटीन को लक्षित करने के लिए भी कार्य करता है ([7] में समीक्षा की गई)।

साक्ष्य यह भी बताते हैं कि GRP78 मैक्रोऑटोफैगी को ट्रिगर करने में भाग लेता है, जो कि प्रकट प्रोटीन और डिसफंक्शनल ऑर्गेनेल के घुलनशील और एकत्रित दोनों रूपों को हटा देता है [8-15]।

न्यूरोडीजेनेरेशन [16-23] के कई मॉडलों में जीआरपी78 की अत्यधिक अभिव्यक्ति लाभकारी साबित हुई है, और उम्र बढ़ने के दौरान और अपक्षयी विकारों की प्रगति के दौरान जीआरपी78 के स्तर में कमी देखी गई है [24]।

इनमें से कुछ अध्ययनों में बताया गया है कि एपोप्टोसिस के निषेध द्वारा न्यूरोप्रोटेक्शन की मध्यस्थता की गई थी; हालाँकि, न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रियाओं के दौरान एपोप्टोसिस शायद ही कभी न्यूरोनल कोशिका मृत्यु का मुख्य कारण होता है [20,25-27]।

इस प्रकार, हमारा मुख्य लक्ष्य उन तंत्रों को स्थापित करना है जिनके द्वारा GRP78 अतिअभिव्यक्ति न्यूरोडीजेनेरेशन के गैर-ट्रांसजेनिक मॉडल का उपयोग करके न्यूरोप्रोटेक्शन की ओर ले जाती है।

विशेष रूप से, स्पाइनल मोटोन्यूरॉन (एमएन) एक्सोटॉमी के कई मॉडलों के शारीरिक और तकनीकी लाभों का फायदा उठाते हुए, हमने पहले बताया था कि तंत्रिका रूट एवल्शन (आरए) मोटर न्यूरोडीजेनेरेशन (चोट के बाद एक महीने में एमएन हानि का 80%) की एक प्रतिगामी प्रक्रिया शुरू करता है। ईआर तनाव की उपस्थिति, ऑटोफैगी फ्लक्स ब्लॉकेज, पुटिका, और प्रोटीन तस्करी की गिरफ्तारी, एपोप्टोसिस/एंटियापोप्टोसिस/एनोइकिसिनेशन की सहमति लेकिन एक प्रभावी एपोप्टोसिस निष्पादन की अनुपस्थिति [20,25,28]।

हमने पाया कि क्षतिग्रस्त एमएन के भीतर आरए के लगभग 5 दिनों के बाद जीआरपी78 की अभिव्यक्ति खो जाती है और इसकी जबरन अतिअभिव्यक्ति एक्सोटॉमी के बाद उनके जीवित रहने की अनुमति देती है। जैसा कि हमने पहले बताया था कि एक सही ऑटोफैगी रिज़ॉल्यूशन आरए [26] के बाद न्यूरॉन के अस्तित्व को बढ़ाता है, हमें आश्चर्य है कि क्या यह समझना संभव है कि चयनात्मक ऑटोफैगी का सुरक्षात्मक प्रभाव हो सकता है या नहीं।

इसलिए, हमने निष्पक्ष प्रोटिओमिक विश्लेषण का उपयोग करके GRP78 न्यूरोप्रोटेक्शन में मध्यस्थता करने वाले तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक आरए मॉडल का उपयोग किया, और हमने ट्यूनिकैमाइसिन उपचार का उपयोग करके इन विट्रो गहराई विश्लेषण द्वारा परिणामी परिकल्पना को मान्य किया जो ईआर तनाव और प्रोटीन तस्करी गिरफ्तारी दोनों को ट्रिगर करता है, आरए मॉडल की दो मुख्य विशेषताएं [26].

2। सामग्री और विधि

2.1. सर्जिकल प्रक्रियाएं

12 सप्ताह की स्प्रैग-डावले मादा चूहों को प्रकाश और तापमान की मानक स्थितियों में रखा गया और उन्हें भोजन और पानी दिया गया। हमने एनेस्थीसिया के तहत केटामाइन/जाइलाज़ीन ({{1%).1 एमएल/100 ग्राम वजन) के कॉकटेल के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से सर्जिकल प्रक्रियाएं कीं, जैसा कि पहले बताया गया था [26,27]।

L4-L5 जड़ों की अतिरिक्त कशेरुका तंत्रिका जड़ उच्छेदन करने के लिए, हमने थीसियाटिक तंत्रिका के प्रत्येक पक्ष की पहचान करने के लिए मध्य रेखा की त्वचा में चीरा लगाया और इंटरवर्टेब्रलफोरैमिना से दूर चयनित जड़ों पर मध्यम कर्षण लगाया, जिससे मिश्रित रीढ़ की हड्डी प्राप्त हुई जिसमें मोटर और संवेदी जड़ें शामिल थीं। पृष्ठीय जड़ गैन्ग्लिया.

घाव को विमानों द्वारा सिल दिया गया और पोविडोन-आयोडीन से कीटाणुरहित किया गया, और जानवरों को गर्म वातावरण में ठीक होने दिया गया। शम-संचालित जानवरों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता था।

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं स्पेनिश (रियल डिक्रेटो 53/2013) और यूरोपीय (2010/63/यूई) द्वारा की गईं, और कैटलन सरकार के डिपार्टमेंट डी'एग्रीकल्चर, रामादेरिया, पेस्का, एलिमेंटासियो आई मेडीनेचुरल द्वारा अनुमोदित की गईं (जनरलीटैट डी) कैटलुन्या) विधान।

2.2. वायरल वैक्टर के साथ निर्माण, शुद्धिकरण और संक्रमण

सीडीएनए एन्कोडिंग GRP78 (ATCC, LGC Promochem, Teddington, UK) को pAC.CMV शटल वेक्टर में क्लोन किया गया था। पुनः संयोजक एडेनोवायरस का निर्माण HEK293 कोशिकाओं में समजात पुनर्संयोजन द्वारा किया गया था।

बैक्टीरियल गैलेक्टोसिडेज़ (एडी - - गैल) को व्यक्त करने वाला नियंत्रण एडेनोवायरस सीबी न्यूगार्ड (ड्यूक यूनिवर्सिटी, डरहम, एनसी, यूएसए) का एक उपहार था। निर्माता (सार्टोरियस, गोटिंगेन, जर्मनी) के निर्देशों के अनुसार विवाप्योर एडेनोपैक™ 20 किट का उपयोग करके वायरस को शुद्ध किया गया था।

एडेनो-संबद्ध वेक्टर निर्माण के लिए, GRP78 cDNA को CMV प्रमोटर और वुडचुकहेपेटाइटिस वायरस उत्तरदायी तत्व [29] के विनियमन के तहत AAV2 के ITR डोमेन के बीच NheI और हिंद III साइटों में क्लोन किया गया था।

AAVrh10 वेक्टर को पहले वर्णित के अनुसार उत्पन्न किया गया था [30] HEK 293-AAV कोशिकाओं (स्ट्रैटेगीन, बेलिंगहैम, WA, यूएसए) के ट्रिपल ट्रांसफ़ेक्शन द्वारा ब्रांच्ड पॉलीइथाइलीनमाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) के साथ प्लास्मिड युक्त AAV2 के ITR, AAV हेल्पर प्लास्मिड जिसमें Rep2 और Capfor rh10 शामिल हैं (कृपया जेएम विल्सन, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय, फिलाडेल्फिया, PA,USA द्वारा प्रदान किया गया), और pXX6 प्लास्मिड जिसमें हेल्पर एडेनोवायरल जीन शामिल हैं [31]। पुनः संयोजक वैक्टर को बेंज़ोनेस उपचार (50 यू/एमएल, नोवाजेन, मैडिसन, डब्ल्यूआई, यूएसए) और पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल (पीईजी 8000, सिग्मा-एल्ड्रिच) वर्षा के बाद स्पष्ट किया गया।

मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करते हुए CBATEG-UAB में वेक्टर उत्पादन इकाई द्वारा वेक्टर को आयोडिक्सानॉल ग्रेडिएंट द्वारा शुद्ध किया गया था। प्रति मिलीलीटर वायरल जीनोम (वीजी/एमएल) को पिकोग्रीन (इनविट्रोजन, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

आरए के तुरंत बाद, जानवरों को काठ की जगह पर कैल्सस्पेस में एक 33-गेज सुई और एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके एड-जीआरपी78 या एड-गैल वायरस (108 पीएफयू/एमएल) के 14 μL का इंजेक्शन लगाया गया था।

वैकल्पिक रूप से, GFP या GRP78 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए AAVrh10 एडेनो-जुड़े वायरस के 4 × 10-10 वायरल जीनोम के 10 μL के इंट्राथेकल प्रशासन को आरए [32] से तीन सप्ताह पहले आइसोफ्लुरेन-एनेस्थेटाइज्ड जानवरों के कशेरुक एल 3 और एल 4 के बीच सीएसएफ में धीरे-धीरे इंजेक्ट किया गया था।

हमने AAVrh10 का उपयोग किया क्योंकि यह विशेष रूप से 30% स्पाइनलमोटोनूरन्स को संक्रमित करता है [32]। इंट्राथेकल स्पेस तक उचित पहुंच की पुष्टि एनिमलटेल फ्लिक द्वारा की गई थी। इंजेक्शन वाली जगह पर सुइयों को 1 मिनट तक रखा गया, जिसके बाद मांसपेशियों और त्वचा को सिल दिया गया।

2.3. नमूना तैयार करना और प्रोटीन विश्लेषण

हमने 7 डीपीआई पर चूहों (एन=4-5) को एनेस्थेटाइज किया और एल4-एल5 रीढ़ की हड्डी के खंडों (5-मिमी लंबाई) के नमूने प्राप्त किए, जो तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोजन थे। हमने बर्फ पर पॉटर होमोजेनाइज़र के साथ ऊतक को लिसीज़ बफर (20 मिमी HEPES, pH 7.7, 250 मिमी सुक्रोज़, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, और प्रोटीज़ और फॉस्फेट अवरोधकों का एक कॉकटेल) में समरूप बनाया।

4 ◦C पर 20 मिनट के लिए 800× g पर लाइसेट्स के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, हमने बीसीए परख (पियर्स केमिकल कंपनी, डलास, TX, यूएसए) द्वारा परमाणु-पश्चात अंश और मात्राबद्ध प्रोटीन को एकत्र किया।

प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए, हमने प्रत्येक नमूने के 75 माइक्रोग्राम को 4% एसडीएस, 8 एम यूरिया, 0.1 एम एचईपीईएस, पीएच 7.7, 0.1 एम डीटीटी, जोड़ा गया 0 में घुलनशील किया। 05 एम आयोडोएसिटामाइड, और फिल्टर एडेड सैंपल प्रिपरेशन (एफएएसपी) विधि का उपयोग करके ट्रिप्सिन (एंजाइम: सब्सट्रेट का 1:10 अनुपात) के साथ पचाया गया।

सभी नमूनों का समानांतर में इलाज किया गया। हमने एक एलटीक्यू-ऑर्बिट्रैपवेलोस मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया, जो एक प्रोक्सोनईज़ीएलसी (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़ा था। हमने पेप्टाइड मिश्रण को सीधे विश्लेषणात्मक कॉलम (2 μL) पर लोड किया। ·न्यूनतम−1) और 100 µm के आंतरिक व्यास वाले 15-cm कॉलम का उपयोग करके उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी द्वारा पेप्टाइड्स को 5-µm C18 कणों (निक्कोटेक्नोस कंपनी, टोक्यो, जापान) से पैक किया गया।

क्रोमैटोग्राफ़िक ग्रेडिएंट्स 97% बफर ए (पानी में 1% फॉर्मिक एसिड (एफए)) और 3% बफर बी (एसीटोनिट्राइल, {{4%).1% एफए) पर 500 एनएल की प्रवाह दर के साथ शुरू हुए। ·मिनट−1, और 4 मिनट में 85%बफर ए + 15% बफर बी तक बढ़ गया, और 120 मिनट में 55% बफर ए + 45% बफर बी तक बढ़ गया।

हमने उपकरण को TOP20 डेटा डिपेंडेंट एक्विजिशन मोड में ऑर्बिट्रैप में एक पूर्ण एमएस स्कैन के साथ 60, {2}} के रिज़ॉल्यूशन पर और m/z 350-2000 की द्रव्यमान सीमा के साथ 20 सबसे तीव्र आयनों के एमएस-एमएस स्पेक्ट्रा के साथ संचालित किया। . हमने टुकड़े आयन स्पेक्ट्रा का उत्पादन करने के लिए टकराव-प्रेरित पृथक्करण विधि के साथ आयन जाल का उपयोग किया और 35% पर सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का उपयोग किया। हमने Xcalibur सॉफ़्टवेयर v2.1 के साथ सभी डेटा प्राप्त किया।

हमने पेप्टाइड पहचान और मात्रा निर्धारण के लिए प्रोटीन डिस्कवररसॉफ्टवेयर सूट (v1.3.0.339, थर्मो फिशर साइंटिफिक) और मैस्कॉट सर्च इंजन (v2.3.01, मैट्रिक्स साइंस50) का उपयोग किया।

हमने सबसे आम संदूषकों (599 प्रविष्टियाँ) वाले स्विसप्रोट रैट डेटाबेस के डेटा का विश्लेषण किया। हमने MS1 स्तर पर 7 पीपीएम की पूर्ववर्ती आयन द्रव्यमान सहनशीलता का उपयोग किया और ट्रिप्सिन के लिए तीन मिसक्लीवेज तक की अनुमति दी।

खंड आयन द्रव्यमान सहनशीलता को 0.5 Da पर सेट किया गया था। मेथिओनिन और एन-टर्मिनल प्रोटीन एसिटिलेशन के ऑक्सीकरण को परिवर्तनीय संशोधनों के रूप में सेट किया गया था, और सिस्टीन कार्बामिडोमिथाइलेशन को एक निश्चित संशोधन के रूप में सेट किया गया था।

हमने पेप्टाइड्स को उनकी झूठी खोज दर (एफडीआर> 5% पर विचार नहीं किया गया) के आधार पर फ़िल्टर किया। पेप्टाइड मात्रा निर्धारण के लिए, हमने प्रोटीओमडिस्कवरर का उपयोग करके गणना की गई पेप्टाइड्स के क्रोमैटोग्राफिक शिखर पर विचार किया और आर 3 का उपयोग करके लॉग 2 परिवर्तन द्वारा क्षेत्रों को सामान्यीकृत किया। हमने आर पैकेज MSstats (v. 2.0.1) का उपयोग करके डेटा की मात्रा निर्धारित की।

प्रत्येक अनुपात के लिए, हमने समायोजित पी-वैल्यू (महत्व के लिए पी < 0.05) की गणना की। अंत में, हमने DAVID एनोटेशन वेब टूल्स (https://david.ncifcrf.gov/ को 28 मई 2021 को एक्सेस किया गया) और KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway) के साथ विनियमित प्रोटीन के लिए जीन ओन्टोलॉजी और पाथवे विश्लेषण किया। html, 28 मई 2021 को एक्सेस किया गया), जैसा कि हमने पहले किया था ([25] में अधिक विवरण देखें)।

2.4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और छवि विश्लेषण

पेंटोबार्बिटल के साथ गहरे एनेस्थेसिया के बाद, हमने जानवरों को 1 0 यू/एमएल हेपरिन युक्त खारा घोल ट्रांसकार्डियल रूप से छिड़का, इसके बाद 7 डीपीआई (एन {{7) पर ऊतक निर्धारण के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.2 के साथ 4% पैराफॉर्मलडिहाइडिन डाला। }} प्रत्येक स्थिति के लिए), और रीढ़ की हड्डी के एल4 और एल5 खंडों (5-मिमी कुल लंबाई) को हटा दिया, जिन्हें 4 घंटे के लिए एक ही फिक्सेटिव में पोस्ट-फिक्स्ड किया गया और रात भर 30% सुक्रोज में क्रायोप्रिजर्व किया गया।

क्रायोटोम (लीका, वेट्ज़लर, जर्मनी) का उपयोग करके जिलेटिनाइज्ड स्लाइड्स पर सीरियलट्रांसवर्स सेक्शन ({0}}µm मोटे) प्राप्त किए गए और विश्लेषण तक -20 ◦C पर संग्रहीत किया गया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, हमने 0.03% ट्राइटोनएक्स -100 और 10% गोजातीय सीरम के साथ ट्रिस-बफर सलाइन (टीबीएस) में ब्लॉकिंग सॉल्यूशन के साथ 1 घंटे के लिए स्लाइड का इलाज किया और उसके बाद विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया: खरगोश एंटी-एलसी 3 बी (एबी 51520; एबकैम) ; 1:200) या माउस एंटी-COXIV (A21355; लाइफटेक्नोलॉजीज;1:500)।

टीबीएस के साथ कई बार धोने के बाद, 0.05% ट्वीन-20, अनुभागों को 2 घंटे के लिए साइ-2 या साइ{5}} संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (जैक्सनइम्यूनोरसर्च) के साथ इनक्यूबेट किया गया। वेस्ट ग्रोव, पीए, यूएसए)।

हमने डीएपीआई (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), या न्यूरोट्रेस फ्लोरोसेंट निस्सल स्टेन (मॉलिक्यूलर प्रोब्स, लीडेन, द नीदरलैंड्स) के साथ अनुभागों को काउंटरस्टेन किया और स्लाइस को फ्लोरोमाउंट-जी माउंटिंग मीडियम (साउथर्नबायोटेक, बर्मिंघम, एएल, यूएसए) के साथ माउंट किया। हाथ से बना मोविओल।

तुलना किए जाने वाले अनुभागों को एक ही स्लाइड पर और एक ही दिन में एक साथ संसाधित किया गया था।

विभिन्न उपचारों और नियंत्रणों से रीढ़ की हड्डी के नमूनों की छवियां एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (ज़ीस एलएसएम 700) की सहायता से विश्लेषण किए गए प्रत्येक मार्कर के लिए एक ही एक्सपोज़र समय, संवेदनशीलता और रिज़ॉल्यूशन के तहत ली गईं। हमने ImageJ सॉफ्टवेयर (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ; http://rsb.info.nih.gov/ij/ पर उपलब्ध, 28 मई 2021 को एक्सेस किया गया) के साथ सिग्नल की तीव्रता का विश्लेषण किया।

For more information:1950477648nn@gmail.com