GRP78 ओवरएक्प्रेशन ट्रिगर्स PINK1-IP3R-मध्यस्थता न्यूरोप्रोटेक्टिव मिटोफैगी भाग 2

2.5. पश्चिमी ब्लॉट

हमने वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए L4-L5 रीढ़ की हड्डी के खंड (5-मिमी लंबाई) प्राप्त करने के लिए 7 डीपीआई पर डोलेथल (एन=4) के साथ चूहों को गहराई से संवेदनाहारी किया। हमने नमूनों को लिक्विडनाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोज़ किया।

हाल के वर्षों में, अधिक से अधिक शोध परिणामों से पता चला है कि प्रोटीन ब्लॉटिंग और स्मृति के बीच घनिष्ठ संबंध है। प्रोटीन ब्लॉटिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक है, जिसका तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।

न्यूरॉन्स के बीच संबंध का स्मृति के भंडारण से गहरा संबंध है। प्रोटीन ब्लॉटिंग न्यूरॉन्स के बीच संबंध स्थिति और प्री- और पोस्ट-सिनैप्टिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगा सकता है, जिससे स्मृति निर्माण और भंडारण में प्रोटीन की महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है।

अध्ययनों से पता चला है कि प्रीसिनेप्टिक न्यूरोनल प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्मृति के निर्माण और भंडारण से गहरा संबंध है। उदाहरण के लिए, सीखने और स्मृति की प्रक्रिया के दौरान, न्यूरॉन्स प्रीसानेप्टिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बदलते हैं, और यह परिवर्तन नई यादों के निर्माण और भंडारण से संबंधित है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों में यह भी पाया गया है कि कुछ प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन अल्जाइमर रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से संबंधित हैं।

इसलिए, प्रोटीन ब्लॉटिंग न्यूरॉन्स के बीच संबंध की स्थिति और संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की गहन समझ प्रदान कर सकता है, जिससे न्यूरॉन्स के आणविक तंत्र का पता चलता है। स्मृति निर्माण और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है।

संक्षेप में, प्रोटीन ब्लॉटिंग और मेमोरी के बीच संबंध न्यूरॉन्स और मेमोरी स्टोरेज के बीच संबंध में प्रोटीन की भूमिका को दर्शाता है। यह स्मृति निर्माण और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए नए विचार और दिशाएं प्रदान करता है। आइए हम सक्रिय रूप से तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान को बढ़ावा दें और स्वास्थ्य और दीर्घायु में योगदान दें! यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि इसमें एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटी-एजिंग प्रभाव होते हैं, जो मस्तिष्क में ऑक्सीडेटिव और सूजन प्रतिक्रियाओं को कम करने में मदद कर सकते हैं, जिससे तंत्रिका के स्वास्थ्य की रक्षा होती है। प्रणाली। इसके अलावा, सिस्टैंच तंत्रिका कोशिकाओं के विकास और मरम्मत को भी बढ़ावा दे सकता है, जिससे तंत्रिका नेटवर्क की कनेक्टिविटी और कार्य में वृद्धि होती है। ये प्रभाव स्मृति, सीखने की क्षमता और सोचने की गति को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं, और संज्ञानात्मक शिथिलता और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की घटना को भी रोक सकते हैं।

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नमूनों को लाइसिस बफर (20 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.7, 251 एमएम सुक्रोज, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम ईजीटीए, और प्रोटीज (सिग्मा-एल्ड्रिच) और फॉस्फेट इनहिबिटर (रोश, बेसल, स्विट्जरलैंड) के कॉकटेल) में समरूपीकरण द्वारा संग्रहीत या आगे संसाधित किया गया था। ) बर्फ पर पॉटर होमोजेनाइज़र के साथ।

4◦C पर 20 मिनट के लिए 800× g पर लाइसेट्स के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, हमने सतह पर तैरनेवाला को परमाणु-पश्चात अंश के रूप में एकत्र किया, और BCAassay (पियर्स केमिकल कंपनी) द्वारा प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए, हमने प्रत्येक जानवर से एल4-एल5 खंडों के 30 माइक्रोग्राम पोस्ट-न्यूक्लियर अंशों को 12% एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर लोड किया, ताकि प्रोटीन का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण किया जा सके और इसके बाद 25 एमएम में बायोरेडक्यूवेट सिस्टम में पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया जा सके। ट्रिस, pH 8.4, 192 mM ग्लाइसिन, 20% (v/v) मेथनॉल।

हमने कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% बीएसए के साथ झिल्लियों को 5% बीएसए प्लस 0.1% ट्वीन{3}} के साथ ब्लॉक किया और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 ◦C पर इनक्यूबेट किया: माउस एंटी {{6}एक्टिन ( 1:10000; सिग्माएल्ड्रिच), माउस एंटी-जीआरपी78 (1:500, सिग्मा-एल्ड्रिच), माउस एंटी-सीवी (1:1000, इनविट्रोजन), रैबिट एंटी-एचएसपी60 (1:500, एंटीबॉडीज़-ऑनलाइन), माउस एंटी- NDUFA9 (1:1000, इनविट्रोजन), माउस एंटी-OPA1 (1:1000, BD बायोसाइंसेज), रैबिट एंटी-पार्किन (1:500, Abcam, कैम्ब्रिज, UK), माउस एंटी-PINK1 (1:500, Abcam), खरगोश विरोधी NRF2 (1:500, Abcam), विरोधी MNF2(1:500, Abcam), खरगोश विरोधी GRP75 (1:500, Abcam)।

कई बार धोने के बाद, झिल्लियों को हॉर्सरैडिशपेरोक्सीडेज (1:5000, वेक्टर) के साथ संयुग्मित एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। झिल्ली की कल्पना 1:1 (0.5 एम ल्यूमिनोल, 79.2 एमएम पी-कौमरिक एसिड, 1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.5) और (8.8 एम हाइड्रोजनपरॉक्साइड, 1 एम ट्रिस-एचसीएल; पीएच 8.5) के रसायनयुक्त मिश्रण का उपयोग करके की गई थी। छवियां जीन जीनोम उपकरण से ली गईं और जीन स्नैप और जीन टूल्स सॉफ़्टवेयर (सिनजीन) के साथ उनका विश्लेषण किया गया।

2.6. इन विट्रो मॉडल

NSC34 कोशिकाओं को संशोधित ईगल के मध्यम उच्च-ग्लूकोज (डीएमईएम, बायोक्रोम, कैम्ब्रिज, यूके) में संवर्धित किया गया, जिसमें 1 0% भ्रूण गोजातीय सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 100 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन और 0.5 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान शामिल थे। (सिग्मा-एल्ड्रिच) और 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में बनाए रखा जाता है, अनिवार्य रूप से जैसा कि पहले वर्णित है [26]।

माध्यम बदले बिना 4 दिनों के सेल कल्चर के बाद, एनएससी34 कोशिकाओं में लंबे न्यूराइट्स की उपस्थिति की विशेषता वाला एक विभेदित-सदृश फेनोटाइप था। चौथे दिन, कोशिकाओं में दवाएँ डाली गईं। ट्यून (सिग्मा-एल्ड्रिच, मिसौरी, यूएसए) और ईएफवी (ब्रिस्टल-मायर्स स्क्विब, न्यूयॉर्क, यूएसए) समाधान 10X की एकाग्रता पर तैयार किए गए और डीएमईएम में भंग कर दिए गए।

24 घंटे के बाद, 3 घंटे के लिए 4 मिलीग्राम/एमएल एमटीटी समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके सेल व्यवहार्यता का आकलन किया गया। गठित नीले फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को डीएमएसओ में भंग कर दिया गया था, और 570 एनएम पर अवशोषण को माइक्रोप्लेट रीडर (एलएक्स 800, बायो-टेक, विनोस्की, वीटी, यूएसए) के साथ मापा गया था।

2.7. न्यूक्लियोफेक्शन

हमने GFP, GRP78, HAPARK, माउस sh-eGFP, माउस sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), माउस sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio), और की अभिव्यक्ति के लिए 2 माइक्रोग्राम प्लास्मिड के साथ एक लाख कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट किया। /या माउस sh-IP3R (आईडी 16440, टेबू-बायो) निर्माता की सिफारिशों का पालन करते हुए अमाक्सा न्यूक्लियोफेक्टर II टीएम (लोन्ज़ा, बेसल, स्विट्जरलैंड) और न्यूक्लियोफैक्टर वी किट (लोन्ज़ा) का उपयोग करें।

स्थैतिक साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, हमने कोशिकाओं को 10% कोलेजन से लेपित अच्छी तरह से प्लेटों में डाला। कल्चर के बाद, हमने 4% पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं को ठीक किया, पीबीएस के साथ दो बार धोया, और संग्रहीत या बाद में पीबीएस 0.3% (v/v) ट्राइटन एक्स -100 और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त ब्लॉकिंग बफर जोड़ा। सेल कल्चर के 3 दिनों के बाद, डीएमईएम में घुली दवाएं जोड़ी गईं।

इन प्रयोगों के लिए, हमने 1 µM ट्यून (सिग्मा-एल्ड्रिच), 10 µM CsA (सिग्मा-एल्ड्रिच), 5 µM CsA (सिग्मा-एल्ड्रिच), या 10 µM BAPTA-AM (सिग्मा) का उपयोग किया -एल्ड्रिच)। उपचार के 5 घंटे बाद, हमने या तो कोशिकाओं को 4% पीएफए ​​के साथ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए ठीक किया या उन्हें संशोधित आरआईपीए बफर (5 {{23%) एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5,150 एमएम NaCl, 1 एमएम ईजीटीए में समरूप बनाया। , इम्युनोब्लॉटिंग के लिए 1% एनपी -40, 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, प्रोटीज और फॉस्फेट कॉकटेल)। नमूनों को दो बार पीबीएस से धोकर और पीबीएस प्लस 0.3% (v/v) ट्राइटन एक्स -100 और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त ब्लॉकिंग बफर के साथ इनक्यूबेट करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की गई।

हमने निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडीज के साथ इनक्यूबेट किया: खरगोश एंटी-आईपी3आर (1:200, एबकैम), माउस एंटी-एचए (1:2000, एबकैम), माउस एंटी-जीआरपी78 (1:200, सिग्मा-एल्ड्रिच), और खरगोश एंटी-एचएसपी60 (1:500, एंटीबॉडीज-ऑनलाइन)। ऊपर बताए अनुसार एमटीटी द्वारा व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, हमने उपचार को 24 घंटे के लिए छोड़ दिया।

2.8. माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड उत्पादन और ∆ψM का मापन

उपचार के अंतिम 30 मिनट के दौरान कोशिकाओं को सुपरऑक्साइड विश्लेषण के लिए 2.5 μM मिटोसॉक्स या ∆ψM विश्लेषण के लिए 2.5 μMTRMR, दोनों आणविक जांच और इनविट्रोजन से इनक्यूबेट किया गया था। प्रतिदीप्ति का पता IX81 ओलंपस माइक्रोस्कोप से लगाया गया और स्थैतिक साइटोमेट्री सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इसकी मात्रा निर्धारित की गई।

2.9. ऑक्सीजन की खपत का विद्युत रासायनिक माप

कोशिकाओं (एचबीएसएस में 1 × 106 प्रति 1 एमएल) को गैस-तंग कक्ष में 37 ◦C पर उत्तेजित किया गया था। माप क्लार्क-प्रकार O2 इलेक्ट्रोड (रैंक ब्रदर्स, कैम्ब्रिज, यूके) के साथ लिया गया था और Dup.18 डेटा के साथ रिकॉर्ड किया गया था अधिग्रहण उपकरण (डब्ल्यूपीआई) वाहन या ट्यून के साथ उपचार के तुरंत बाद।

2.10. माइटोकॉन्ड्रियल और साइटोसोलिक फ्रैक्शनेशन

कोशिकाओं को बर्फ पर पॉटर होमोजेनाइज़र के साथ लिसिस बफर (10 मिमी HEPES, pH 7.4, 1 मिमी EGTA, 250 मिमी सुक्रोज़, और प्रोटीज़ (सिग्मा-एल्ड्रिच) और फॉस्फेटेज़ इनहिबिटर (रोश) का एक कॉकटेल) में समरूप बनाया गया था।

5 मिनट के लिए 2 {{3 }}× g पर लाइसेट्स के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को 12 मिनट के लिए 10,000× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरनेवाला को घुलनशील अंश (S2) माना जाता था और इसमें साइटोसोलिक प्रोटीन और माइक्रोसोम होते हैं।

पेलेट (पी2) समृद्ध माइटोकॉन्ड्रियल अंश था, जिसे संशोधित आरआईपीए बफर (5 0 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 15 {{11%) एमएम NaCl, 1 एमएम ईजीटीए, 1% एनपी {{8) में फिर से निलंबित कर दिया गया था। }}, 0.5% सोडियमडीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, प्रोटीज़ और फॉस्फेट कॉकटेल) और प्रोटीन सांद्रता बीसीए परख द्वारा निर्धारित की गई थी। फिर नमूनों को वेस्टर्न ब्लॉट के लिए संसाधित किया गया।

2.11. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

हमने रीढ़ की हड्डी L{0}L5 खंडों (1-मिमी स्लाइस) को 2% (w/v) PFA और 2.5% (v/v) ग्लूटाराल्डिहाइड (EM ग्रेड) के फिक्सेटिव घोल में डुबाया। 0.1 एम पीबीएस, पीएच 7.4 में और उन्हें 2 घंटे के लिए एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर रखा, फिर 1% (डब्ल्यू/वी) पीएफए ​​में फिक्स किया गया और बाद में 1% (डब्ल्यू/वी) ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (टीएएबी लैब) के साथ पोस्टफिक्स किया गया। ) 2 घंटे के लिए पीबीएस में 0.08% (w/v) पोटैशियमहेक्सासायनोफेरेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) युक्त।

हमने विआयनीकृत पानी से चार बार धुलाई की और एसीटोन में क्रमिक निर्जलीकरण किया। सभी प्रक्रियाएँ 4 ◦C पर निष्पादित की गईं, जैसा कि पहले बताया गया है [33]। हमने नमूनों को ईपीओएन रेज़िन में एम्बेड किया और 48 घंटों के लिए 60 ◦C पर पोलीमराइज़ किया।

नमूनों को लेइकॉल्ट्राकट यूसीटी माइक्रोटोम के साथ अर्ध-पतले खंड (1 माइक्रोमीटर) प्राप्त करने के लिए संसाधित किया गया था, जिसे 1% (डब्ल्यू/वी) जलीय टोल्यूडीन नीले घोल से रंगा गया था, और एमएन से समृद्ध वेंट्रल हॉर्न क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप से जांच की गई थी।

अल्ट्राथिन सेक्शन (70 एनएम) को हीरे के चाकू से काटा गया, लेपित ग्रिड पर रखा गया, और पारंपरिक यूरेनिल एसीटेट और रेनॉल्ड्स के लेड साइट्रेट समाधान के साथ तुलना की गई।

अंत में, हमने GatanUltrascan ES1000CCD कैमरा से सुसज्जित ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (Jeol 1400) के साथ अनुभागों का अवलोकन किया। हमने प्रति शर्त तीन स्लाइस का चयन किया, प्रति अनुभाग तीन एमएन का विश्लेषण किया, और इमेजजे टूल का उपयोग करके एमएन के कुल क्षेत्र की तुलना में नाभिक के क्षेत्रों को मापा।

2.12. जैव सूचना विज्ञान और सांख्यिकी

हमने सामान्यता की धारणा को पूरा करने वाले डेटा के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच मूल्यों की तुलना करने के लिए विचरण (एनोवा) के विश्लेषण का उपयोग किया। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया, उसके बाद तुकी के पोस्ट हॉक मल्टीपल-रेंजटेस्ट, या छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म5 सॉफ़्टवेयर (n=3–5; p <{6}}.05 महत्व के लिए) का उपयोग करके किए गए थे।

3. परिणाम

3.1. मूलपाठ

3.1.1. GRP78 ओवरएक्प्रेशन के प्रोटीन विश्लेषण से माइटोकॉन्ड्रिया को मुख्य लक्ष्य के रूप में प्रकट किया गया

GRP78 अतिअभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थ न्यूरोप्रोटेक्शन की ओर ले जाने वाले आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए, हमने GRP78 (Ad-GRP78) की अतिअभिव्यक्ति के लिए एडेनोवायरस से संक्रमित आरए-घायल जानवरों के बीच मात्रात्मक और गुणात्मक दोनों अंतरों की पहचान करने के लिए एक तुलनात्मक लेबल-मुक्त प्रोटिओमिक विश्लेषण किया, जो पहले न्यूरोप्रोटेक्टिव पाया गया था। नियंत्रण के रूप में एमएन, या बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ (एड-ß-गैल) का [20]।

हमारी प्रयोगशाला में किए गए पिछले अध्ययनों के अनुसार चोट लगने के सात दिन बाद (डीपीआई) विश्लेषण के लिए चुना गया समय-बिंदु था [20,25]। डिस्टल एक्सोटॉमी के बाद पुनर्जनन के एक मॉडल और कटिस्नायुशूल तंत्रिका के सिवनी बनाम हमारे अपक्षयी आरए मॉडल के बीच पिछली तुलना में, हमने देखा कि सिग्नलिंग घटनाएं 7 डीपीआई तक समान थीं, जब आरए [20,25] के बाद डायवर्जेंटप्रो-डीजेनेरेटिव घटनाएं सामने आईं।

एल 4- एल 5 रीढ़ की हड्डी खंडों से पोस्ट-न्यूक्लियर अंशों के एलसी-एमएस/एमएस लेबल-मुक्त विश्लेषण के परिणामस्वरूप 1420 प्रोटीन की पहचान हुई, जिसमें प्रति प्रोटीन कम से कम दो पेप्टाइड्स थे, जैसा कि पहले अन्य नमूनों और अध्ययनों के लिए रिपोर्ट किया गया था [25] .

आरए-घायल जानवरों में, वायरस से संक्रमित नहीं होने वाले आरए-घायल जानवरों के संबंध में, क्रमशः Ad-GRP78 या Ad-ß-Gal ओवरएक्प्रेशन के कारण कुल 566 और 732 प्रोटीन या पेप्टाइड्स में महत्वपूर्ण बदलाव हुए थे (p < {{8%) .05) (टेबल्स S1 और S2)।

हमने दोनों सूचियों की तुलना की और पाया कि Ad-GRP78overexpression (तालिका S3) के कारण 22 0 को विशिष्ट रूप से बदल दिया गया था। एनोटेशन, विज़ुअलाइज़ेशन और इंटीग्रेटेड डिस्कवरी (DAVID) टूल के लिए डेटाबेस का उपयोग करके इन प्रोटीनों के कार्यात्मक एनोटेशन ने हमें पहचानने की अनुमति दी डेटा सेट में सबसे महत्वपूर्ण जैविक कार्य (एफडीआर <0.05) [34,35]।

GRP78 अतिअभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं, कार्य और घटकों में शामिल प्रोटीन के स्तर में अंतर आया (तालिका S4A-C, चित्र S1A-C)। जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) शर्तों और इन आंकड़ों के केईजीजी पाथवे संवर्धन विश्लेषण से पता चला कि एड-जीआरपी78 से संक्रमित जानवरों में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के साथ कई प्रोटीन के स्तर में महत्वपूर्ण कमी आई थी, जिसमें बाहरी और आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल चेहरे के प्रोटीन, श्वसन परिसर के प्रोटीन शामिल थे। और मैट्रिक्स प्रोटीन.

हमने प्रोटिओमिक सूची में प्रकट प्रोटीन स्तरों में अंतर की पुष्टि की, जैसे कि GRP75, जिसे अपग्रेड किया गया था (पी <{1}}.05), और कॉम्प्लेक्स वी (सीवी) की सबयूनिट, डाउनरेगुलेट किया गया (पी=0.03) उम्मीद के मुताबिक GRP78 समूहों में (चित्रा 1ए)।

पूरी सूची में, सबसे अधिक डाउनरेगुलेट किए गए थे 2-ऑक्सोग्लुटारेट/मैलेटकैरियर प्रोटीन ओजीसी (एससीएल25ए11), एमटी-एनडी3 (एक ट्यूमर दबानेवाला यंत्र जो थीमालेट-एस्पार्टेट शटल में भाग लेता है और कॉम्प्लेक्स की अनुमति देने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में एनएडीएच पूल को पुनर्जीवित करता है) I फ़ंक्शन), कॉम्प्लेक्स I का NADH डिहाइड्रोजनेज सबयूनिट 3, गैम्मामिनोब्यूट्रिक एसिड एमिनोट्रांस्फरेज़ ABAT, और कॉम्प्लेक्स III का यूबिकिनोल-साइटोक्रोम C रिडक्टेस सबयूनिट। इसके विपरीत, बहुत कम प्रोटीनों को अपग्रेड किया गया (चित्र 1बी)।

अपेक्षा के अनुरूप एक अपंजीकृत प्रोटीन GRP78 था, और अन्य अपंजीकृत प्रोटीन अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर EAAT2 थे, जो मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली में और कभी-कभी माइटोकॉन्ड्रिया में उत्तेजक सिनैप्स पर स्थित होते हैं, और हाइड्रॉक्सीसिल-सीओए डिहाइड्रोजनेज HADHA, जो माइटोकॉन्ड्रियल बीटा के अंतिम तीन चरणों को उत्प्रेरित करता है। -लंबी-श्रृंखला फैटी एसिड का ऑक्सीकरण।

हमने यह जांचने के लिए विश्लेषण बढ़ाया कि क्या माइटोकॉन्ड्रिया में अन्य प्रोटीन या माइटोकॉन्ड्रिया फ़ंक्शन-संबंधित प्रोटीन को कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया प्रभाव (चित्रा 1 सी) की पुष्टि करने के लिए प्रोटिओमिक सूची से बाहर संशोधित किया गया था।

हमने देखा कि माइटोकॉन्ड्रियल संरक्षित डायनामिन-संबंधित GTPase ऑप्टिक एट्रोफी 1 (OPA1), जो संलयन में शामिल है [36], को डाउनरेगुलेट किया गया था (पी <{4}}.1); LONP1, एक एटीपी-निर्भर प्रोटीज जो मिसफोल्डेड पॉलीपेप्टाइड्स के चयनात्मक क्षरण में मध्यस्थता करता है, ने वृद्धि की प्रवृत्ति प्रस्तुत की, लेकिन यूबिकिनोन NDUFA9, प्रतिलेखन कारक NRF2 के स्तर में कोई अंतर नहीं देखा गया, जो जीन को नियंत्रित करता है जिसमें एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया तत्व या अन्य डायनामिन होते हैं। -संबंधित GTPase जलसेक में शामिल है, जैसे माइटोफ्यूसिन 2 (एमएफएन2) [36]।

माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर पाए जाने वाले परिवर्तनों का एक व्यापक सारांश चित्र 1डी में इस योजना में दिखाया गया है। माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता तनाव प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया सामग्री के आदान-प्रदान के लिए फ्यूज हो जाता है, और माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया और बाद में माइटोफैगी को अलग करने की अनुमति देता है [37]।

यह ध्यान में रखते हुए कि डाउनरेगुलेटेड प्रोटीन की बड़ी संख्या माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानीयकृत होती है और एमएफएन2 और एल/एस ओपीए1 रूपों के अनुपात (चित्र 1सी) का विश्लेषण करके माइटोकॉन्ड्रिया संलयन गतिविधि के संबंध में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं देखा गया, हमने माइटोफैगी से संबंधित मार्करों की जांच की।

शास्त्रीय रूप से, माइटोकॉन्ड्रिया का ऑटोफैगी-निर्भर क्षरण विध्रुवण के बाद होता है, और यह आमतौर पर बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर फॉस्फेट और टेन्सिनहोमोलॉग (पीटीईएन)-प्रेरित पुटेटिव काइनेज 1 (PINK1) की पूरी लंबाई के बढ़ते संचय से शुरू होता है।

इसके बाद, सर्वव्यापकता द्वारा विध्रुवित माइटोकॉन्ड्रिया के माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली प्रोटीन को चिह्नित करने के लिए इन-रिंग-रिंग E3 यूबिकिटिन-प्रोटीन लिगेज पार्किन की भर्ती की जाती है [38-41]। चित्र 2ए का शीर्ष पार्किंन स्तर में कोई बदलाव नहीं दिखाता है, लेकिन 7 डीपीआई पर नियंत्रण के संबंध में इप्सिलेटरल एल{10}}एल5रीढ़ की हड्डी खंड में आरए-चोट द्वारा उत्पादित पूर्ण-लंबाई PINK1 में महत्वपूर्ण कमी दिखाता है। इसके विपरीत, GRP78 की अधिक अभिव्यक्ति ने पार्किन को कम कर दिया लेकिन गैर-संबंधित प्रोटीन -गैल (चित्रा 2 ए, नीचे) की नियंत्रण अभिव्यक्ति की तुलना में आरए के बाद पिंक 1 स्तर को दोगुना कर दिया।

पूर्ण लंबाई PINK1 का अपनियमन माइटोफैगी [42] के प्रेरण के अनुरूप है, और पार्किन कमी ऑर्गेनेल विखंडन की एक उन्नत स्थिति से संबंधित हो सकती है जैसा कि बाकी माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन द्वारा देखा गया है।

हम माइटोकॉन्ड्रिया और माइक्रोट्यूब्यूल से जुड़े प्रोटीन 1ए/1बी प्रकाश श्रृंखला 3 (एलसी3)-पॉजिटिव पंक्टा के सह-स्थानीयकरण की जांच करते हैं, जो कोर मैक्रोऑटोफैगी मशीनरी का एक प्रमुख घटक है और माइटोफैगी प्रक्रिया के लिए आवश्यक है [43]।

कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने माइटोकॉन्ड्रिया के सह-स्थानीयकरण में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी, जिसे एंटी-सीओएक्स IV का उपयोग करके लेबल किया गया था, केवल क्षतिग्रस्त एमएन में आरए के बाद एलसी {2}} पॉजिटिव पंक्टा के साथ 7 डीपीआई (चित्रा 2 बी) पर जीआरपी78 को ओवरएक्सप्रेस किया गया।

हमने ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नमूनों के विश्लेषण द्वारा GRP78 को ओवरएक्सप्रेस करने पर ही अवलक्षित एमएन में माइटोफैगी के अस्तित्व की पुष्टि की।

हमने एड-जीआरपी78 जानवरों से एमएन के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया के निकट संबंध में माइटोकॉन्ड्रिया के साथ प्रचुर मात्रा में रिक्तिकाएं देखीं, जो माइटोफैगी की एक पहचान है [37], और माइटोकॉन्ड्रिया के निकट संबंध में कई ईआरसीस्टर्न, लेकिन एड-जीआरपी78 जानवरों में हमने उनका पता नहीं लगाया। 5 डीपीआई पर चूहे के नमूने (चित्र 2सी)।

चित्र 1. आरए-घायल जानवरों में GRP78 अतिअभिव्यक्ति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन को लक्षित करती है। (ए) इम्यूनोब्लॉट और बार ग्राफ़ जीआरपी78, जीआरपी75 और सीवी प्रोटीन स्तर के औसत गुना परिवर्तन (± एसईएम) को जीआरपी78 बनाम एल5 रीढ़ की हड्डी के खंडों में दिखा रहे हैं।

-गैल ने आरए-घायल चूहों को 7 डीपीआई से अधिक व्यक्त किया। स्तरों को एक्टिन मूल्यों (एन=4; * पी < 0.05 बनाम विज्ञापन- -गैल, छात्र का टी-टेस्ट) के लिए सामान्यीकृत किया गया। (बी) आरए-घायल जानवरों में एल 4- एल 5 रीढ़ की हड्डी के खंडों के प्रोटिओमिक विश्लेषण द्वारा प्राप्त माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन गुना परिवर्तनों का हिस्टोग्राम, जो 7 डीपीआई द्वारा विज्ञापन - - गैल समूह की तुलना में जीआरपी 78 को अधिक व्यक्त करता है। (सी)इम्यूनोब्लॉट और बार ग्राफ़ एनडीयूएफए9, एलओएनपी1, एनआरएफ2, एमएफएन2, ओपीए-1 के औसत गुना परिवर्तन (± एसईएम) दिखाते हैं जो एक्टिन के लिए सामान्यीकृत हैं। (समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं। विद्यार्थी का टी-टेस्ट)। (डी) आरए-घायल जानवरों से एल 4- एल 5 रीढ़ की हड्डी के खंडों में जीआरपी78 की अतिअभिव्यक्ति से परिवर्तित प्रोटीन के साथ योजनाबद्ध माइटोकॉन्ड्रिया, 7 डीपीआई पर पीले (कम) या नीले (बढ़े हुए) में हाइलाइट किए गए।

चित्र 2. जीआरपी78 को ओवरएक्सप्रेस करने वाले चूहों में आरए के बाद माइटोफैगी को विवो में संशोधित किया जाता है। (ए) पिंक1 और पार्क के लिए इम्यूनोब्लॉट्स और संबंधित बार ग्राफ, आरए-घायल चूहों के एल4-एल5 रीढ़ की हड्डी के खंडों में एक्टिन स्तर के लिए सामान्यीकृत प्रोटीन स्तर (मतलब ± एसईएम) के विश्लेषण को मोड़ते हैं।

नियंत्रण (ऊपर) या विज्ञापन से {0}}गैल और विज्ञापन-जीआरपी78 समूह (नीचे) 7 डीपीआई द्वारा। (एन=4; * पी <0.05, छात्र का टी-टेस्ट)। (बी) बाईं ओर, घायल जानवरों के इप्सिलैटरल साइट पर प्रतिनिधि एमएन के माइक्रोफोटोग्राफ, जिन्हें 7 डीपीआई पर एएवीआरएच {{8}जीएफपी या एएवीआरएच 10-जीआरपी78 समूहों का इंट्राथेकल इंजेक्शन प्राप्त हुआ। नमूनों को COX IV (लाल) और LC3 (हरा) के लिए रंगा गया और फ्लोरोसेंट निस्सल (नीला) के साथ उलटा दाग दिया गया।

स्केल बार=10 µm और इनसेट 10X में डिजिटल ज़ूम।

ध्यान दें कि सह-स्थानीयकरण केवल AAVrh10-GRP78 समूह में देखा जाता है। दाएँ, COX IV और LC3 के सह-स्थानीयकरण बिंदुओं के % का विश्लेषण दर्शाने वाला बार ग्राफ़। COX IV और LC3 सह-स्थानीयकरण का औसत ± SEM (n=4; ** p < 0.01, छात्र का t-परीक्षण)। (सी) प्रतिनिधि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां जहां माइटोकॉन्ड्रिया को रीढ़ की हड्डी के एमएन के भीतर प्रतिष्ठित किया जाता है: ए, एमएन साइटोप्लाज्म की छवि माइटोकॉन्ड्रिया को नियंत्रण जानवर में दिखाती है; बी, ऐड- -गैल समूह से आरए-घायल चूहे से एमएन साइटोप्लाज्म की छवि; सी, एड-जीआरपी78 समूह से आरए-घायल चूहे से एमएन साइटोप्लाज्म की छवि जिसमें कुछ घिरे माइटोकॉन्ड्रिया लाल तारांकन से संकेतित हैं; डी, उच्च आवर्धन छवि एक बड़े माइटोकॉन्ड्रिया और ईआर संपर्क को इंगित करते हुए (सी) में दिखाई गई है। स्केल बार्स को आंकड़ों में दर्शाया गया है।

कुल मिलाकर, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि GRP78 ओवरएक्प्रेशन आरए के बाद माइटोफैगिन डिस्कनेक्टेड एमएन को प्रेरित कर सकता है, और यह न्यूरोप्रोटेक्शन को बढ़ावा दे सकता है।

3.1.2. GRP78 ओवरएक्सप्रेशन क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को पुनर्स्थापित करता है

इसके बाद हमने ईआर तनाव के इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया पर जीआरपी78 ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव की जांच की, क्योंकि यह अपमान विवो में आरए की चोट के बाद पहले दिखाई देता है [20,26], और यह नए न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय तरीका है [2,44] ].

यह मॉडल ट्यूनिकैमाइसिन (ट्यून) को नियोजित करता है, जो एक ईआर-तनाव प्रेरक है जो एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन-लिपिड मध्यवर्ती के गठन का कारण बनता है, जिससे नए संश्लेषित प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन को रोका जाता है और प्रोटीन मिसफोल्डिंग की ओर जाता है। हमने इसका उपयोग किया क्योंकि आरए [26] के बाद रुका हुआ स्रावी मार्ग भी न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया में महत्वपूर्ण बताया गया है।

हमने सबसे पहले सत्यापित किया कि उपयुक्त वेक्टर के साथ एनएससी34मोटोन्यूरॉन जैसी कोशिकाओं के न्यूक्लियोफेक्शन के परिणामस्वरूप जीआरपी78 (चित्र 3ए) का उत्पादन हुआ। इन कोशिकाओं में, GRP78 की अभिव्यक्ति ने ट्यून युक्त माध्यम में जीवित रहने में उल्लेखनीय वृद्धि की (चित्रा 3बी)।

हालाँकि ट्यून उपचार आम तौर पर GRP78 को ही प्रेरित करता है, यह अंतर्जात अतिअभिव्यक्ति काफी देर से (24 घंटे तक) होती है (चित्र S2)। हमने यह भी सोचा कि क्या हम यह निर्धारित कर सकते हैं कि क्या GRP78 ओवरएक्प्रेशन का दूसरे इन विट्रो मॉडल में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है, जिसे हमने पहले आरए चोट के बाद एमएन मौत की कई विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए रिपोर्ट किया था [26]।

यह मॉडल नोकोडाज़ोल से प्रेरित साइटोस्केलेटल क्षति पर आधारित है, जो सूक्ष्मनलिकाएं के पोलीमराइजेशन में हस्तक्षेप करता है। GRP78 अभिव्यक्ति ने नोकोडाज़ोल की उपस्थिति में संवर्धित कोशिकाओं की व्यवहार्यता में भी वृद्धि की (चित्रा 3बी)।

फिर, हमने मिटोसॉक्स का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी को मापकर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन किया, टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (∆ψm), और ईआर तनाव के अधीन हमारे एनएससी 34 कोशिकाओं में ओ 2 खपत दर। GRP78 ओवरएक्सप्रेशन के साथ या उसके बिना।

एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने एफेविरेंज़ (ईएफवी) का उपयोग किया, एक माइटोटॉक्सिक एजेंट जो सभी तीन मापदंडों को बदल देता है [45]। हमने देखा कि ट्यून जोड़ने के बाद मिटोसॉक्स का स्तर उत्तरोत्तर बढ़ गया, जो 24 घंटे तक सांख्यिकीय महत्व तक पहुंच गया और वाहन-उपचार नियंत्रण (चित्रा एस 3 ए) के संबंध में उपचार के पहले घंटे से ईएफवी-उपचारित कोशिकाओं में आरओएस पीढ़ी में काफी वृद्धि हुई थी।

जीआरपी78 की अधिक अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप ट्यून या ईएफवी उपचार के बाद 24 घंटे में जीएफपी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के संबंध में आरओएसिन माइटोकॉन्ड्रिया का स्तर काफी कम हो गया (चित्र 3सी)। ट्यून उपचार के 5 और 24 घंटे के बाद और EFV उपचार के 24 घंटे के बाद ∆ψm नष्ट हो गया था (चित्र S3B)। इस पैरामीटर की पुनर्प्राप्ति GRP78 ओवरएक्सप्रेशनिन ट्यून- या ईएफवी-उपचारित कोशिकाओं (चित्रा 3डी) द्वारा हासिल की गई थी।

GFP व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में ट्यून जोड़ने के बाद विश्लेषण के 80 मिनट के दौरान O2 की खपत की दर कम हो गई थी (ढलान −0.063,R2=0.98), लेकिन O2 की खपत थी ट्यून (ढलान −0.221, R2=0.99) की उपस्थिति के बावजूद GRP{7}}अतिअभिव्यक्त करने वाली कोशिकाओं में स्थिर (चित्र 3E, बाएँ)।

5 घंटे के बाद, जीआरपी अतिअभिव्यक्त करने वाली कोशिकाओं में श्वसन सामान्य था और जीएफपी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में गंभीर रूप से प्रभावित हुआ (चित्र 3ई, दाएं)। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि GRP78 ईआर तनाव या माइटोटॉक्सिसिटी के कारण होने वाले माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन को कमजोर करता है।

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