Ser389 पर फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 का निषेध न्यूरोइन्फ्लेमेशन को नियंत्रित करता है

अमूर्त: सेर9 फॉस्फोराइलेशन द्वारा ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज़ 3 (जीएसके3) का अवरोध प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है। हालाँकि, वैकल्पिक Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 निषेध के परिणाम खराब बने हुए हैं। यहां हमने जीएसके3 सेर389 नॉक-इन (केआई) चूहों में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की जांच की है, जिसमें सेर389 जीएसके3 का फॉस्फोराइलेशन ख़राब है। C57BL/6J वाइल्ड-टाइप (WT) समकक्षों की तुलना में इन जानवरों में सक्रिय माइक्रोग्लिया/घुसपैठ किए गए मैक्रोफेज, एस्ट्रोसाइट्स और घुसपैठ किए गए न्यूट्रोफिल की संख्या काफी अधिक थी, जो बताता है कि Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करने में विफलता के परिणामस्वरूप निरंतर निम्न-श्रेणी होती है। तंत्रिका सूजन. इसके अलावा, लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के जवाब में ग्लियाल सेल सक्रियण और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मस्तिष्क घुसपैठ जीएसके3 सर389 केआई चूहों में विफल रही। ऐसे प्रभाव मस्तिष्क-विशिष्ट थे, क्योंकि परिधीय प्रतिरक्षा समान रूप से प्रभावित नहीं हुई थी। इसके अतिरिक्त, LPS के जवाब में IkB किनेस कॉम्प्लेक्स (IKK) का फॉस्फोराइलेशन GSK3 Ser389 KI चूहों में विफल रहा, जबकि STAT3 फॉस्फोराइलेशन पूरी तरह से संरक्षित था, यह सुझाव देता है कि NF-κB सिग्नलिंग मार्ग विशेष रूप से इस GSK3 नियामक मार्ग से प्रभावित है। कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 निष्क्रियता मस्तिष्क की सूजन प्रतिक्रिया को नियंत्रित करती है, जिससे न्यूरोइन्फ्लेमेटरी पैथोलॉजी की प्रगति में इसकी भूमिका का मूल्यांकन करने की आवश्यकता बढ़ जाती है।

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कीवर्ड: न्यूरोइन्फ्लेमेशन; माइक्रोग्लिया; एस्ट्रोसाइट्स; न्यूट्रोफिल; एनएफ-κबी सिग्नलिंग; फ़्लो साइटॉमेट्री

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1 परिचय

ग्लाइकोजन सिंथेज़ किनेज़ 3 (जीएसके3) व्यापक विशिष्टता वाला एक सेरीन-थ्रेओनीन किनेज़ है। जीएसके3 सूजन, कोशिका वृद्धि, कोशिका विभेदन और ऊर्जा चयापचय जैसी विविध प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है और मधुमेह, अल्जाइमर रोग और कैंसर जैसी उम्र से संबंधित बीमारियों में शामिल है [1]। जीएसके3 और जीएसके3, दोनों जीएसके3 आइसोफोर्म सर्वव्यापी रूप से व्यक्त हैं, लेकिन उनके कार्य पूरी तरह से ओवरलैपिंग नहीं हैं [2]। जीएसके3 संवैधानिक रूप से सक्रिय है, हालांकि इसकी गतिविधि को साइटोसोलिक कॉम्प्लेक्स में अनुक्रमण के साथ-साथ अवशेषों सेर9 और सेर389 [3] में फॉस्फोराइलेशन द्वारा बाधित किया जा सकता है। Ser9 पर GSK3 का एक्ट-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन एक GSK3 नियामक मार्ग है जो अधिकांश सेल प्रकारों में मौजूद है, और यह GSK3 सक्रियण को सीमित करने और कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए डिफ़ॉल्ट मार्ग है। इसके विपरीत, हमने पाया है कि पी38 एमएपीके-प्रेरित सेर389 फॉस्फोराइलेशन मस्तिष्क, थाइमस और प्लीहा जैसे विशिष्ट ऊतकों तक ही सीमित है [4] और फॉस्फो-सेर389 जीएसके3 की मस्तिष्क अभिव्यक्ति विकासात्मक रूप से विनियमित है [5]। Ser389 द्वारा GSK3 का फॉस्फोराइलेशन मुख्य रूप से डीएनए डबल-स्ट्रैंड टूटने की प्रतिक्रिया से शुरू होता है और डीएनए की मरम्मत की अनुमति देना महत्वपूर्ण है [6,7]। इस प्रकार, जबकि सेर9 पर फॉस्फोराइलेशन साइटोप्लाज्मिक जीएसके3 को निष्क्रिय करने का मुख्य मार्ग है, डीएनए डीएसबी मरम्मत के दौरान अस्तित्व को बढ़ाने के लिए जीएसके3 के परमाणु पूल को निष्क्रिय करने के लिए सेर389 फॉस्फोराइलेशन का उपयोग किया जाता है [8]। DSB के जवाब में Ser389 फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से GSK3 को निष्क्रिय करने में विफलता से नेक्रोप्टोसिस द्वारा कोशिका मृत्यु में वृद्धि होती है [6,7]। यह अत्यधिक प्रासंगिक है क्योंकि नेक्रोटेपोटिक प्रकार की मृत्यु अधिक सूजन वाली होती है और सूजन संबंधी बीमारियों में पाई गई है [9]। हालाँकि, Ser9 के फॉस्फोराइलेशन के विपरीत, Ser389 पर GSK3 के फॉस्फोराइलेशन के निहितार्थ खराब बने हुए हैं। कई अध्ययनों ने जीएसके3 और सूजन के बीच संबंध का समर्थन किया है। इस प्रकार, तनाव, संक्रमण, या आघात जैसी सूजन संबंधी उत्तेजनाओं द्वारा जीएसके3 की सक्रियता आईएल-6, आईएल-1 और आईएफएन जैसे सूजनरोधी साइटोकिन्स के उत्पादन को बढ़ावा देती है, जबकि जीएसके3 निषेध के संश्लेषण को दबा देता है। प्रो-इंफ्लेमेटरी मध्यस्थ और प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा आईएल का उत्पादन बढ़ाता है [10]। जीएसके3 को लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जो ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया के मुख्य इम्युनोस्टिम्युलेटरी एंडोटॉक्सिन में से एक है [11,12]। बैक्टीरियल एलपीएस को टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) से बांधने पर, जीएसके3 जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं में सूजन संबंधी साइटोकिन्स की रिहाई में मध्यस्थता करता है [13]। इसके अलावा, यह बताया गया है कि एलपीएस की घातक खुराक से उपचारित चूहों को जीएसके3 अवरोधक देने से पशु की जीवित रहने की क्षमता में उल्लेखनीय वृद्धि होती है [14]। जीएसके3 से जुड़े इन सूजनरोधी प्रभावों के बावजूद, सूजनरोधी प्रभावों को भी प्रलेखित किया गया है [15,16]। इस प्रकार, टीएलआर सक्रियण [17] के बाद प्रो- और एंटी-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के बीच संतुलन बनाए रखने के लिए जीएसके3 विनियमन महत्वपूर्ण है। परमाणु कारक kB (NF-kB) प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के उत्पादन में मध्यस्थता करता है और टीएलआर द्वारा सक्रिय मुख्य प्रतिलेखन कारकों में से एक है। कई लेखकों ने पुष्टि की है कि जीएसके3 आईकेबी काइनेज कॉम्प्लेक्स (आईकेके) के फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से एनएफ-केबी सिग्नलिंग को सक्रिय करने में सक्षम है, जो आईकेबी को फॉस्फोराइलेट करता है और सक्रिय एनएफ-केबी जारी करता है। जीएसके3 द्वारा फॉस्फोराइलेट किया गया एक अन्य प्रतिलेखन कारक एक सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन का उत्प्रेरक है (STAT3), जो सेप्टिक शॉक के संदर्भ में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की मध्यस्थता करता है [18]। GSK3 द्वारा STAT3 फॉस्फोराइलेशन के परिणामस्वरूप परमाणु स्थानांतरण और सक्रियण होता है। इसके अलावा, जीएसके3 एंटी-इंफ्लेमेटरी सीआरईबी और एपी -1 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों को रोकता है, जिससे प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है [10,19]। माइक्रोग्लिया कोशिकाएं सीएनएस में निवासी मैक्रोफेज हैं। घुसपैठ किए गए ल्यूकोसाइट्स के साथ, माइक्रोग्लिया सक्रियण न्यूरोइन्फ्लेमेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एस्ट्रोसाइट्स भी न्यूरोइम्यून कार्यों के साथ ग्लियाल कोशिकाएं हैं क्योंकि वे माइक्रोग्लिया, ल्यूकोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ क्रॉसस्टॉक करते हैं, इस प्रकार जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों को संशोधित करते हैं [20]। सूजन संबंधी उत्तेजनाओं (ग्लिओसिस) के जवाब में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स का सक्रियण प्रमुख सेलुलर परिवर्तनों की विशेषता है जिसमें प्रसार, हाइपरट्रॉफी और साइटोकिन रिलीज [21] शामिल हैं। जीएसके3 एलपीएस की प्रतिक्रिया में या तंत्रिका जीएसके3 की अतिअभिव्यक्ति द्वारा ग्लियोसिस के विकास में शामिल रहा है [22]। इस बात के भी प्रमाण हैं कि जीएसके3 द्वारा प्रेरित ग्लियाल प्रतिक्रियाशीलता और न्यूरोइन्फ्लेमेशन को मस्तिष्क में एनएफ-केबी मार्ग के सक्रियण द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है [19,23]। इसके विपरीत, जीएसके3 के निष्क्रिय होने से ग्लियाल प्रतिक्रियाशीलता कम हो जाती है, न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया प्रतिबंधित हो जाती है, और तंत्रिका कोशिकाओं में सूजन-रोधी सीआरईबी गतिविधि बढ़ जाती है [24]। नतीजतन, यह सुझाव दिया गया है कि जीएसके3 अल्जाइमर रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस जैसे न्यूरोइन्फ्लेमेटरी विकारों की प्रगति में एक मौलिक भूमिका निभाता है [25]। फॉस्फोराइलेशन जीएसके3 गतिविधि का एक नियामक तंत्र है जिसका प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियंत्रण पर प्रमुख प्रभाव पड़ता है। इस प्रकार, क्लासिकल सेर9 फॉस्फोराइलेशन द्वारा जीएसके3 का निषेध सूजन-रोधी मध्यस्थों के उत्पादन को नियंत्रित करता है और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की रिहाई को कम करता है [26], हालांकि यह ट्रिनिट्रोबेंजीन सल्फोनिक एसिड से प्रेरित प्रयोगात्मक कोलाइटिस के एक मॉडल में सूजन के समाधान में भी शामिल है। [27]. मस्तिष्क के भीतर, सेर9 फॉस्फोराइलेशन द्वारा जीएसके3 का दोषपूर्ण निषेध पार्किंसंस रोग [28] और सिज़ोफ्रेनिया [29] जैसे सूजन संबंधी न्यूरोपैथोलॉजी से संबंधित है। इसके विपरीत, मस्तिष्क में पाए जाने वाले फॉस्फो-सेर389 जीएसके3 के उच्च स्तर के बावजूद [4], यह अज्ञात बना हुआ है कि क्या जीएसके3 को निष्क्रिय करने का यह मार्ग न्यूरोइन्फ्लेमेशन को ट्यून करने में भूमिका निभाता है। यहां, हम जीएसके3 केआई चूहों का उपयोग करके न्यूरोइन्फ्लेमेशन में सेर389 फॉस्फोराइलेशन-मध्यस्थता जीएसके3 निष्क्रियता की संभावित भूमिका की जांच करते हैं जिसमें जीएसके3 के सी-टर्मिनल फॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए जीएसके3 सेर389 को एएलए द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था [7,8]। हमारे परिणामों से पता चलता है कि शारीरिक स्थितियों के तहत Ser389 में फॉस्फोराइलेशन द्वारा निष्क्रिय GSK3 में विफलता से पुरानी निम्न-श्रेणी की न्यूरोइन्फ्लेमेशन के साथ-साथ LPS जैसी सूजन संबंधी उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया की कमी हो जाती है। यह पुरानी सूजन मस्तिष्क के लिए विशिष्ट प्रतीत होती है क्योंकि परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली काफी हद तक अप्रभावित रहती है। हम यह भी दिखाते हैं कि जीएसके3 केआई चूहों के मस्तिष्क में फॉस्फो-सर389 जीएसके3 की अनुपस्थिति एनएफ-केबी सिग्नलिंग को नियंत्रित करती है, जो न्यूरोइन्फ्लेमेशन के नियंत्रण में एक केंद्रीय घटना है। इसलिए, हमारे निष्कर्ष सूजन संबंधी न्यूरोपैथोलॉजी में Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 निष्क्रियता की भागीदारी के लिए समर्थन प्रदान करते हैं।

2. परिणाम

2.1. Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करने में विफलता से बेसल न्यूरोइन्फ्लेमेशन में वृद्धि होती है

Ser9 पर फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करना मस्तिष्क में एक सूजन-रोधी चरण से जुड़ा हुआ है [30]। यद्यपि मस्तिष्क में डीएनए डबल-स्ट्रैंड टूटने के कारण होने वाली न्यूरोनल मृत्यु को कम करने के लिए Ser389 पर फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करना महत्वपूर्ण है, लेकिन किसी भी अध्ययन ने इसकी जांच नहीं की है कि क्या यह मार्ग न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया को भी नियंत्रित कर सकता है। इसलिए, हमने Ser389 फॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए पहले वर्णित GSK3 Ser389 KI चूहों का उपयोग किया, जिसमें Ser389 को Ala द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है। हमने निवासी और घुसपैठ की गई कोशिकाओं का एक संतुलित मिश्रण प्राप्त करने के लिए पहले से अनुकूलित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, ऊतक और पेरकोल ग्रेडिएंट के यांत्रिक पृथक्करण द्वारा डब्ल्यूटी और जीएसके 3 सेर 389 केआई चूहों से पूरे मस्तिष्क (सेरिबैलम और घ्राण बल्बों को छोड़कर) में निवासी और घुसपैठ की गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच की। मस्तिष्क में, जिसमें माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज, एस्ट्रोसाइट्स, घुसपैठ किए गए न्यूट्रोफिल और लिम्फोसाइट्स शामिल हैं [31]। फिर मानक मार्करों (पूरक सामग्री में चित्र S1) [31-33] का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। सक्रिय और आराम करने वाले माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज की पहचान क्रमशः CD11b+CD45high और CD11b+CD45low के रूप में की गई, जबकि लिम्फोसाइटिक आबादी को CD45+CD11b− [32,34] के रूप में चिह्नित किया गया था। न्यूट्रोफिल को CD45+Ly6G+ कोशिकाओं के रूप में दर्शाया गया; और एस्ट्रोसाइट्स को CD45− जनसंख्या के भीतर कोशिका सतह प्रतिजन की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया था -2 (एसीएसए -2)। इस मार्कर का उपयोग विकासशील और वयस्क एस्ट्रोसाइट्स का पता लगाने के लिए किया जाता है [35]। ऑटोइम्यून डिमाइलिनेशन [36] जैसी सूजन संबंधी स्थितियों से जुड़े प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स में एसीएसए का अपग्रेडेशन देखा गया है। हमने पहले पाया था कि एलपीएस उपचार के बाद चूहों के मस्तिष्क में एसीएसए -2+ एस्ट्रोसाइट्स की संख्या बढ़ जाती है, जो आगे संकेत देता है कि एसीएसए -2 अभिव्यक्ति का स्तर सूजन संबंधी उत्तेजनाओं के जवाब में एस्ट्रोसाइट सक्रियण से संबंधित है [31]। हालाँकि एसीएसए -2 को माइक्रोग्लिया और मैक्रोफेज की एक छोटी उप-जनसंख्या में भी व्यक्त किया जा सकता है [35], ये कोशिकाएँ सीडी 45+ आबादी के भीतर हैं। शारीरिक स्थितियों के तहत चूहों से पृथक मस्तिष्क कोशिका के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से डब्ल्यूटी चूहों (चित्रा 1 ए) की तुलना में जीएसके 3 सर् 389 केआई चूहों में सक्रिय माइक्रोग्लिया / मैक्रोफेज के अंश में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला। इसके विपरीत, GSK3 Ser389 KI चूहों के मस्तिष्क में आराम करने वाले माइक्रोग्लिया का प्रतिशत कम हो गया (चित्र 1बी)। इसके अलावा, जीएसके3 सेर389 केआई चूहों (चित्रा 1सी) में एसीएसए -2+ एस्ट्रोसाइट्स (यानी, सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स) की उपस्थिति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। मस्तिष्क में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के संबंध में, डब्ल्यूटी चूहों (चित्रा 1डी) के सापेक्ष जीएसके3 सर389 केआई चूहों के मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल का एक स्पष्ट संचय था, जो आगे चलकर शारीरिक के तहत जीएसके3 सर389 केआई चूहों के मस्तिष्क में चल रही सूजन प्रतिक्रिया की उपस्थिति को दर्शाता है। स्थितियाँ। हालाँकि, GSK3 Ser389 KI चूहों (चित्र 1e) में मस्तिष्क में CD{57}}CD11b− ल्यूकोसाइट्स (मुख्य रूप से लिम्फोसाइटिक कोशिकाएं) की आवृत्ति प्रभावित नहीं हुई थी। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि Ser389 में फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को रोकने में विफलता मस्तिष्क में एक पुरानी जन्मजात सूजन प्रतिक्रिया की ओर ले जाती है जो माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स के बीच प्रतिक्रिया का कारण बनती है।

चित्र 1. Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करने से न्यूरोइन्फ्लेमेशन में शामिल मस्तिष्क कोशिका आबादी प्रभावित होती है। WT और GSK3 Ser389 KI दोनों चूहों के दिमाग को हटा दिया गया और (ए) CD11b++CD45हाई एक्टिवेटेड माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज, (b) CD11b++CD45low रेस्टिंग माइक्रोग्लिया, (c) ACSA के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया। -2+ एस्ट्रोसाइट्स, (डी) Ly6G+ न्यूट्रोफिल, और (ई) CD11b− लिम्फोसाइट्स। हिस्टोग्राम कोशिका संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे CD45− कोशिकाओं (एस्ट्रोसाइट्स) या CD45+ कोशिकाओं (अन्य सभी आबादी) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। डेटा को माध्य ± SEM (n=7–9) के रूप में दिखाया गया है। जीनोटाइप की तुलना करने के लिए छात्र टी-टेस्ट लागू किया गया था। *, पी < {{20}}.05; **, पी <0.01. डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, और GSK3 Ser389 नॉकिन।

2.2. प्लीहा कोशिकाओं पर Ser389 पर GSK3 फॉस्फोराइलेशन के प्रभाव का अभाव

यह पता लगाने के लिए कि क्या जीएसके3 सर389 केआई चूहों में पाई गई परिवर्तित सूजन की स्थिति मस्तिष्क तक ही सीमित है या क्या प्रभाव भी प्रणालीगत है, हमने प्लीहा में विभिन्न कोशिका आबादी के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया। न्यूट्रोफिल की पहचान Ly6G+ कोशिकाओं के रूप में की गई। Ly6G अभिव्यक्ति अत्यधिक परिवर्तनशील थी क्योंकि यह कोशिकाओं के परिपक्वता चरण पर निर्भर करती है, जैसा कि पहले दिखाया गया है [37]। इसके अलावा, मोनोसाइटिक माइलॉयड कोशिकाओं को Ly6G-CD38+CD11b+ कोशिकाओं के रूप में लेबल किया गया था। इन मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज ने सीडी38 अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर दो स्पष्ट रूप से अलग-अलग आबादी प्रस्तुत की, जैसा कि पहले बताया गया था [38]। सीडी 8+ कोशिकाएं, सीडी 4+ कोशिकाएं, और बी 220+ कोशिकाएं (बी कोशिकाएं) का भी मूल्यांकन किया गया (पूरक सामग्री में चित्र एस2)।

चित्र 2. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण WT और GSK3 Ser389 KI चूहों में समान प्लीहा कोशिका आबादी दिखाता है। प्लीहा कोशिकाओं के पृथक्करण के बाद, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग (ए) Ly6G+ न्यूट्रोफिल, (बी) सीडी38+सीडी11बी+ मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज, (सी) सीडी4+ कोशिकाओं, (डी) की संख्या का आकलन करने के लिए किया गया था। सीडी8+ कोशिकाएं, और (ई) बी220+ कोशिकाएं। हिस्टोग्राम कुल कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कोशिका संख्याएँ दिखाते हैं। डेटा माध्य ± SEM (n=5–7) के अनुरूप है। जीनोटाइप की तुलना करने के लिए छात्र टी-टेस्ट लागू किया गया था। डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, GSK3 Ser389 नॉकिन।

2.3. एलपीएस जीएसके3 सर389 केआई चूहों में न्यूरोइन्फ्लेमेशन को बढ़ाने में असमर्थ है

इसके बाद, हमने जांच की कि क्या बेसल टॉनिक सूजन पैदा करने के अलावा, Ser389 फॉस्फोराइलेशन को समाप्त करने से एलपीएस द्वारा ट्रिगर होने वाली सूजन प्रतिक्रिया भी प्रभावित हो सकती है। डब्ल्यूटी और जीएसके3 सेर389 केआई चूहों को बैक्टीरियल लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) की सबलेथल खुराक ({{3%).5 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया। मस्तिष्क की सूजन प्रतिक्रिया की जांच तीन दिन बाद की गई क्योंकि इस तरह के उपचार से पहले चूहों के मस्तिष्क में निम्न-श्रेणी की सूजन पैदा होती देखी गई है [39,40]। यह एलपीएस प्रतिक्रिया अवसाद, चिंता और पार्किंसंस रोग [41,42] सहित कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में देखी गई पुरानी सूजन की स्थिति से भी मिलती जुलती है। जैसा कि अपेक्षित था, एलपीएस ने डब्ल्यूटी चूहों में ग्लियाल प्रतिक्रियाशीलता को प्रेरित किया, जैसा कि सक्रिय माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज (चित्रा 3 ए) की आवृत्ति में वृद्धि और आराम करने वाले माइक्रोग्लिया (चित्रा 3 बी) की आवृत्ति में कमी से निर्धारित होता है। इसके विपरीत, एलपीएस जीएसके3 सर389 केआई चूहों (चित्र 3ए,बी) में किसी भी अन्य सूजन प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने में विफल रहा। तालिका 1 सीधे दो जीनोटाइप के बीच एलपीएस प्रतिक्रियाओं के परिमाण की तुलना करती है। इसके अलावा, इस एलपीएस उपचार ने डब्ल्यूटी चूहों में एसीएसए -2+ एस्ट्रोसाइट्स का प्रतिशत बढ़ा दिया, जैसा कि पहले बताया गया था [31], लेकिन जीएसके3 सर389 केआई चूहों (चित्र 3सी) में नहीं। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मस्तिष्क में घुसपैठ के संबंध में, एलपीएस ने डब्ल्यूटी चूहों में न्यूट्रोफिल का संचय किया लेकिन जीएसके3 सर389 केआई चूहों (चित्र 3डी) में इसका कोई प्रभाव नहीं पड़ा। अंत में, एलपीएस प्रशासन ने डब्ल्यूटी या जीएसके3 सेर389 केआई चूहों (चित्रा 3ई) में मस्तिष्क में लिम्फोसाइट संचय को बढ़ावा नहीं दिया। कुल मिलाकर, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि मस्तिष्क में टॉनिक सूजन की स्थिति को रोकने के लिए Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करना आवश्यक है, लेकिन LPS जैसी उत्तेजनाओं के जवाब में तीव्र मस्तिष्क सूजन में योगदान देता है।

तालिका 1. WT और GSK3 Ser389 KI चूहों के बीच LPS प्रभावों में अंतर। मान प्रत्येक जीनोटाइप में एलपीएस उपचार के बाद सेल संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं और वाहन उपचार नियंत्रण (मतलब ± SEM) के संबंध में वृद्धि के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। तारांकन WT और GSK3 Ser389 KI जानवरों में LPS के प्रभावों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, GSK3 Ser389 नॉकिन; एलपीएस, लिपोपॉलीसेकेराइड। *, पी < 0.05; **, पी <0.01.

चित्र 3. जीएसके3 सर389 केआई चूहों की न्यूरोइम्यून कोशिकाएं एलपीएस पर प्रतिक्रिया करने में विफल रहती हैं। वयस्क WT और GSK3 Ser389 KI चूहों को LPS ({{5%).5 mg/kg) के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन दिया गया। तीन दिन बाद, मस्तिष्क की आबादी (ए) सीडी11बी++सीडी45उच्च सक्रिय माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज, (बी) सीडी11बी+सीडी45कम आराम करने वाले माइक्रोग्लिया, (सी) एसीएसए-2+ एस्ट्रोसाइट्स, (डी) एलवाई6जी+ न्यूट्रोफिल, और ( ई) CD11b− लिम्फोसाइटों का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। हिस्टोग्राम दोनों जीनोटाइप में सेल नंबर पर एलपीएस प्रभाव दिखाते हैं। डेटा को CD45− कोशिकाओं (एस्ट्रोसाइट्स) या CD45+ कोशिकाओं (अन्य सभी आबादी) के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और मान ± SEM (n=7–9) के अनुरूप होते हैं। प्रत्येक जीनोटाइप में एलपीएस द्वारा प्रेरित परिवर्तनों के महत्व का मूल्यांकन करने के लिए छात्र टी-टेस्ट लागू किया गया था। ** पी < 0.01. डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, GSK3 Ser389 नॉकिन; एलपीएस, लिपोपॉलीसेकेराइड।

इसके बाद, हमने बेसल ग्लियाल सक्रियण और सूजन संबंधी उत्तेजनाओं के प्रति ग्लियाल प्रतिक्रिया पर हिप्पोकैम्पस जीएसके3 सेर389 फॉस्फोराइलेशन के संभावित प्रभाव की जांच की। इस उद्देश्य के लिए, डेंटेट गाइरस (चित्रा 4 ए) में माइक्रोस्कोपी द्वारा आईबीए लेबलिंग का मूल्यांकन किया गया था। सबसे पहले, WT चूहों का मूल्यांकन किया गया। माइक्रोग्राफ से कम बेसल ग्लियाल सक्रियण का पता चलता है, लेकिन एलपीएस इंजेक्शन के जवाब में ग्लियाल इम्यूनोएक्टिविटी में मजबूत वृद्धि हुई है ({{4%).5 मिलीग्राम/किग्रा, 3 दिन) (चित्र 4बी)। आईबीए -1 इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एकीकृत घनत्व की मात्रा ने ऐसे मान दिखाए जो उपचार के बाद डब्ल्यूटी चूहों में 53% अधिक थे (चित्र 4डी)। ये परिवर्तन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे और पहले बताए गए माउस हिप्पोकैम्पस में एलपीएस के कारण होने वाली प्रमुख सेलुलर हाइपरट्रॉफी के अनुरूप हैं [43,44]।

चित्र 4. एलपीएस की प्रतिक्रिया में ग्लियोसिस जीएसके3 सर389 केआई चूहों में बदल जाता है। वयस्क WT और GSK3 Ser389 KI चूहों को LPS या वाहन (C) के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया। 3 दिनों के बाद, मस्तिष्क को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित किया गया। (ए) माउस ब्रेन एटलस [45] से अनुकूलित एक कोरोनल हिप्पोकैम्पस अनुभाग छवियों के स्थानीयकरण को इंगित करता है, जिसमें डेंटेट गाइरस भी शामिल है। (बी) मस्तिष्क अनुभागों को माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज मार्कर आईबीए -1 के लिए इम्यूनोलेबल किया गया था। ग्राफ़ आईबीए -1 इम्युनोरिएक्टिविटी के एकीकृत घनत्व को दर्शाते हैं, जो ग्लियाल प्रतिक्रियाशीलता का माप है जो ग्लियाल धुंधलापन की तीव्रता और विस्तार दोनों को दर्शाता है। (सी) नियंत्रण डब्ल्यूटी और केआई जानवरों की तुलना। (डी) प्रत्येक माउस जीनोटाइप में एलपीएस प्रतिक्रिया। सभी मान वाहन के साथ व्यवहारित डब्ल्यूटी नियंत्रणों के बढ़े हुए सम्मान के साथ व्यक्त किए गए हैं (मतलब ± एसईएम, एन=4-5)। छात्र टी-टेस्ट लागू किया गया था. *, पी < 0.05. स्केल बार, 100 µm. डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, GSK3 Ser389 नॉकिन; सी, वाहन; एलपीएस, लिपोपॉलीसेकेराइड।

Ser389 KI चूहों के हिप्पोकैम्पस के विश्लेषण से WT चूहों के संबंध में बेसल माइक्रोग्लियल सक्रियण में अंतर पता चला। इस प्रकार, हालांकि माइक्रोग्राफ के दृश्य निरीक्षण ने उत्परिवर्ती जानवरों (चित्रा 4 बी) में एक मध्यम ग्लियाल सक्रियण दिखाया, एकीकृत घनत्व माप ने संकेत दिया कि ग्लियाल इम्यूनोएक्टिविटी में वृद्धि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी (चित्रा 4 सी)। दिलचस्प बात यह है कि, Ser389 KI चूहों ने LPS उपचार (चित्रा 4 बी) के बाद आगे सक्रियण का कोई संकेत नहीं दिखाया, और मात्रात्मक विश्लेषण ने पुष्टि की कि एलपीएस हिप्पोकैम्पस (चित्रा 4 डी) में आईबीए -1 इम्यूनोस्टेनिंग को बढ़ाने में असमर्थ था, जो कि ग्लियाल सेल सक्रियण का सुझाव देता है। GSK3 Ser389 फॉस्फोराइलेशन की अनुपस्थिति में LPS ख़राब है।

सिस्टैंच अनुपूरक लाभ—विरोधी-भड़काऊ

2.5. GSK3 Ser389 KI चूहों में LPS की परिधीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रभावित नहीं हुई

हमारे पिछले प्रयोगों ने LPS के प्रति मस्तिष्क की प्रतिक्रिया पर Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 निष्क्रियता के गहन परिणामों का खुलासा किया। इसके बाद, हमने पता लगाया कि क्या प्रणालीगत प्रतिरक्षा में समान प्रभाव मौजूद हैं। चूंकि एलपीएस को प्लीहा जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियण का कारण माना जाता है [46], डब्ल्यूटी और जीएसके3 सर389 केआई चूहों दोनों से प्लीहा कोशिका आबादी का मूल्यांकन एलपीएस इंजेक्शन ({{6%).5 मिलीग्राम/किग्रा) के 3 दिन बाद किया गया था। LPS उपचार के जवाब में WT चूहों में Ly6G+ न्यूट्रोफिल (चित्र 5a) और CD38++CD11b++Ly6G− मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज (चित्र 5b) की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। WT चूहों में अपेक्षित ये LPS प्रभाव, GSK3 Ser389 KI चूहों (चित्रा 5 ए, बी) में भी देखे गए थे। जब प्लीहा से लिम्फोसाइट आबादी का विश्लेषण किया गया तो जीनोटाइप के बीच कोई अंतर प्राप्त नहीं हुआ, क्योंकि प्लीहा सीडी 4+ कोशिकाओं (चित्रा 5 सी) और सीडी 8+ कोशिकाओं (चित्रा 5 डी) का प्रतिशत एलपीएस द्वारा भी कम कर दिया गया था। दोनों चूहों की किस्में (उत्परिवर्ती चूहों में कमी सांख्यिकीय रूप से केवल सीडी 4+ कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण थी); और बी 220+ बी कोशिकाएं जीनोटाइप से स्वतंत्र रूप से एलपीएस से अप्रभावित थीं (चित्रा 5ई)। ये अवलोकन दोनों जीनोटाइप के मस्तिष्क में पाए जाने वाले एलपीएस के विभेदक प्रभावों के विपरीत हैं। इस प्रकार, जबकि GSK3 Ser389 KI चूहे LPS द्वारा उत्पन्न न्यूरोइन्फ्लेमेशन के प्रति प्रतिरोधी हैं, ये चूहे LPS के प्रति प्रणालीगत रूप से असंवेदनशील नहीं हैं। इसलिए, GSK3 Ser389 फॉस्फोराइलेशन का प्रभाव मस्तिष्क के लिए चयनात्मक प्रतीत होता है।

चित्र 5. जीएसके3 सर389 केआई और डब्ल्यूटी चूहों में एलपीएस के समान परिधीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। वयस्क WT और GSK3 Ser389 KI चूहों को LPS के साथ आईपी इंजेक्ट किया गया। 3 दिनों के बाद, प्लीहा कोशिकाओं को निकाला गया और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन करने के लिए संसाधित किया गया, (ए) Ly6G+ न्यूट्रोफिल, (बी) सीडी 38+ सीडी 11 बी + मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज, (सी) सीडी 8+, की संख्या (डी) सीडी4+, और (ई) बी220+ सेल। हिस्टोग्राम डब्ल्यूटी और केआई चूहों सहित सेल नंबर पर एलपीएस के प्रभाव दिखाते हैं। प्रत्येक जीनोटाइप में एलपीएस द्वारा प्रेरित परिवर्तनों के महत्व का मूल्यांकन करने के लिए छात्र टी-टेस्ट लागू किया गया था। माध्य ± SEM दिखाया गया है (n=5–7)। *, पी < 0.05; **, पी <0.01. डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, GSK3 Ser389 नॉकिन; आईपी, इंट्रापेरिटोनियल; सी, वाहन; एलपीएस, लिपोपॉलीसेकेराइड।

2.6. हिप्पोकैम्पस में LPS-प्रेरित NF-κB पाथवे सक्रियण GSK3 Ser389 KI चूहों में समाप्त कर दिया गया है

एनएफ-κबी सूजन उत्पन्न करने के लिए एलपीएस के लिए आवश्यक एक ट्रांसक्रिप्शनल कारक है [47]। इसके अलावा, NF-κB को मस्तिष्क में GSK3 द्वारा विनियमित दिखाया गया है [2,19,23]। इसलिए, हमने आईकेके फॉस्फोराइलेशन के विश्लेषण द्वारा एलपीएस के जवाब में मस्तिष्क में एनएफ-κबी सक्रियण की जांच की, जो एनएफ-केबी सक्रियण मार्ग का एक प्रारंभिक चरण है। WT और GSK3 Ser389 KI चूहों को LPS (0.5 mg/kg) के साथ आईपी दिया गया और 4 घंटे के बाद, हिप्पोकैम्पस को काटा गया। वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा फॉस्फो-आईकेके / और कुल आईकेके / की जांच के लिए पूरे सेल अर्क का उपयोग किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, एलपीएस ने डब्ल्यूटी चूहों में हिप्पोकैम्पस में आईकेके फॉस्फोराइलेशन को बढ़ा दिया (चित्रा 6 ए, बी)। इसके विपरीत, LPS GSK3 Ser389 KI चूहों में IKK फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करने में विफल रहा (चित्र 6a,b)। STAT3 का सक्रियण LPS-प्रेरित सूजन [48] से भी जुड़ा हुआ है। इसलिए हमने वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा STAT3 के फॉस्फोराइलेशन की जांच की। एनएफ-केबी सक्रियण के विपरीत, एलपीएस (चित्रा 6 ए, सी) के जवाब में डब्ल्यूटी और जीएसके 3 सेर 389 केआई चूहों दोनों के हिप्पोकैम्पस में एसटीएटी 3 का फॉस्फोराइलेशन दृढ़ता से प्रेरित था। इस प्रकार, Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 निष्क्रियता को रोकना चुनिंदा रूप से NF-κB सिग्नलिंग को बाधित करता है, जो हिप्पोकैम्पस में NF-κB मार्ग के अपस्ट्रीम नियामक के रूप में GSK3 की भूमिका के अनुरूप है। इन परिणामों से पता चलता है कि जीएसके3 मार्ग एनएफ-κबी जैसे प्रमुख सूजन मध्यस्थों को नियंत्रित करके न्यूरोइन्फ्लेमेशन को प्रभावित करता है।

चित्र 6. Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करने में विफलता LPS-उपचारित चूहों में NF-κB और STAT3 सिग्नलिंग को अलग तरह से प्रभावित करती है। एनएफ-κबी और एसटीएटी3 मार्गों के सक्रियण की जांच एलपीएस ({{10}}.5 मिलीग्राम/किग्रा) या वाहन (सी) के आईपी इंजेक्शन के बाद हिप्पोकैम्पस 4 घंटे से पूरे सेल लाइसेट्स में की गई थी। WT और GSK3 Ser389 KI चूहे। ब्लाट्स फॉस्फोर-आईकेके/, कुल आईकेके/, फॉस्फोर-एसटीएटी3 और कुल एसटीएटी3 के पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण का वर्णन करते हैं। (ए) -ट्यूबुलिन डिटेक्शन को लोडिंग नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था। एसोसिएटेड ग्राफ़ पश्चिमी ब्लॉट बैंड के डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण से प्राप्त (बी) फॉस्फो-आईकेके / /आईकेके / और (सी) फॉस्फो-एसटीएटी3/एसटीएटी3 अनुपात के अनुरूप हैं। प्रत्येक जीनोटाइप में अनुपचारित नियंत्रण (सी) और एलपीएस-उपचारित जानवरों की तुलना करने के लिए छात्र टी-टेस्ट लागू किया गया था (मतलब ± एसईएम, एन=5-6)। *, पी < 0.05; ***, पी < 0.001. डेटा pIKK/IKK के लिए चार स्वतंत्र प्रयोगों और pSTAT3/STAT3 के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है। डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार; KI, GSK3 Ser389 नॉकिन; आईपी, इंट्रापेरिटोनियल; सी, वाहन; एलपीएस, लिपोपॉलीसेकेराइड।

3. चर्चा

मस्तिष्क में, जीएसके3 गतिविधि का विनियमन कई न्यूरोपैथोलॉजी से जुड़ा हुआ है जिसमें पुरानी सूजन एक आम पहचान है [25]। चूंकि एक बड़ा साहित्य इस बात का समर्थन करता है कि सेर9 फॉस्फोराइलेशन द्वारा जीएसके3 का निषेध सूजन-रोधी मध्यस्थों को नियंत्रित करता है और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स को डाउनरेगुलेट करता है [23,28,30], न्यूरोइंफ्लेमेटरी पैथोलॉजीज में दोषपूर्ण जीएसके3 निष्क्रियता को समझाने के लिए आमतौर पर प्रस्तावित तंत्र है फॉस्फोराइलेट सेर9 [3] में विफलता। हालाँकि, मस्तिष्क में फॉस्फो-Ser389 GSK3 के असामान्य रूप से उच्च स्तर का पता लगाया गया है [4], यह सुझाव देता है कि GSK3 निष्क्रियता के लिए यह वैकल्पिक मार्ग भी मस्तिष्क के भीतर एक प्रमुख भूमिका निभा सकता है। यहां प्रस्तुत प्रयोग न्यूरोइन्फ्लेमेशन में जीएसके3 सेर389 फॉस्फोराइलेशन के निहितार्थ को उजागर करते हैं, जो मस्तिष्क डीएनए की मरम्मत और न्यूरोनल अस्तित्व में इस मार्ग की भागीदारी का सुझाव देने वाले पिछले सबूतों को जोड़ता है [6,7]। वर्तमान कार्य में प्रमुख निष्कर्षों में से एक यह है कि जीएसके3 सेर389 केआई चूहों का मस्तिष्क निरंतर ग्लियोसिस और बढ़ी हुई प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ को दर्शाता है, जो इस धारणा के अनुरूप है कि सेर389 फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से जीएसके3 निष्क्रियता को रोकने से न्यूरोइन्फ्लेमेशन होता है। हमारे फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों के डेटा स्पष्ट रूप से इन जानवरों में बढ़े हुए न्यूरोइन्फ्लेमेशन की ओर इशारा करते हैं, क्योंकि Ser389 GSK3 KI चूहों के मस्तिष्क में सक्रिय माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज, ACSA 2+ एस्ट्रोसाइट्स और घुसपैठ किए गए न्यूट्रोफिल की संख्या काफी अधिक थी। हालाँकि, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा माइक्रो-एस्ट्रोग्लिओसिस स्पष्ट रूप से देखे जाने के बावजूद, Ser389 GSK3 KI चूहों के मस्तिष्क वर्गों से हिप्पोकैम्पस माइक्रोग्राफ के विश्लेषण से पता चला कि माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज की अतिवृद्धि केवल हल्की थी। इसी तरह के परिणाम तब देखे गए जब ग्लियोसिस की सीमा और तीव्रता का आकलन करने के लिए मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों का विश्लेषण किया गया (दिखाया नहीं गया)। इसलिए, हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि, प्रो-इंफ्लेमेटरी उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में, जीएसके3 सेर389 फॉस्फोराइलेशन की कमी से न्यूरोइन्फ्लेमेशन की एक डिग्री होती है जिसे निम्न-श्रेणी के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए। कई अध्ययन न्यूरोलॉजिकल विकारों में जीएसके3 अतिसक्रियता और न्यूरोडीजेनेरेशन के बीच संबंध का समर्थन करते हैं [25]। इस संदर्भ में, हमने Ser389 GSK3 KI चूहों में जो भड़काऊ प्रतिक्रिया देखी, वह न्यूरोडीजेनेरेशन का परिणाम हो सकती है, क्योंकि पिछले अध्ययनों ने इन जानवरों के कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस में न्यूरोनल मौत का पता लगाया है [6]। यह इस अवलोकन के अनुरूप है कि डीएनए क्षति कोशिका मृत्यु को रोकने और डीएसबी मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए एक तंत्र के रूप में सर्389 फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से जीएसके3 को निष्क्रिय कर देती है [7,8]। परिणामस्वरूप, KI चूहों का मस्तिष्क, जिसमें Ser389 फॉस्फोराइलेशन को रोका जाता है, DSB-प्रेरित न्यूरोनल मृत्यु से सुरक्षित नहीं है। फॉस्फोर-Ser389 GSK3 अभिव्यक्ति और कोशिका अस्तित्व के बीच का लिंक सबसे पहले लिम्फोसाइटों में प्रस्तावित किया गया था, जो अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल एक तंत्र के रूप में था। इस प्रकार, KI चूहों में GSK3 Ser389 फॉस्फोराइलेशन की अनुपस्थिति देर से परिपक्वता के दौरान बी कोशिकाओं में नेक्रोप्टोसिस को प्रेरित करती पाई गई, जो कई विकृति से संबंधित कोशिका मृत्यु का एक अत्यधिक भड़काऊ प्रकार है [9]। यह भी ध्यान रखना दिलचस्प है कि डीएनए क्षति के जवाब में जीएसके3 को निष्क्रिय करने के लिए न केवल सर्389 फॉस्फोराइलेशन बल्कि सर्9 फॉस्फोराइलेशन को भी ट्रिगर किया जा सकता है। हालाँकि, Ser389 GSK3 KI चूहों में एक न्यूरोडीजेनेरेटिव फेनोटाइप [6] मौजूद है जो कि Ser9 GSK3 KI चूहों [49,50] में मौजूद नहीं है, यह दर्शाता है कि Ser389 फॉस्फोराइलेशन GSK3 गतिविधि के नियंत्रण में विशिष्ट भूमिका निभाता है और ऐसे परिदृश्य हैं जिनमें Ser9 फॉस्फोराइलेशन क्षतिपूर्ति नहीं कर सकता है। Ser389 फॉस्फोराइलेशन के नुकसान के लिए। तदनुसार, यहां प्रकट किए गए Ser389 GSK3 डीरेग्यूलेशन, न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन के बीच दिलचस्प लिंक को यह स्पष्ट करने के लिए आगे की खोज की जानी चाहिए कि क्या Ser389 में परिवर्तित GSK3 फॉस्फोराइलेशन न्यूरोपैथोलॉजी में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है जिसमें पुरानी सूजन विशिष्ट होती है, जैसे कि अल्जाइमर रोग। इसके अलावा, जीएसके3 सेर389 केआई चूहों में देखी गई न्यूरोइम्यून कोशिकाओं की हल्की लेकिन लगातार सक्रियता इस परिकल्पना के अनुरूप है कि सेर389 को फॉस्फोराइलेट करने में विफलता इम्यूनोसेन्सेंस से जुड़ी हो सकती है। यह एक उम्र-संबंधित प्रक्रिया है जो प्रतिरक्षा कार्यों में गिरावट के साथ-साथ प्रिनफ्लेमेटरी मध्यस्थों की अभिव्यक्ति में वृद्धि की विशेषता है; जो दीर्घकालिक, निम्न-श्रेणी की सूजन की ओर ले जाता है [1,51]। कई लेखकों ने उम्र से संबंधित सूजन में जीएसके3 विनियमन की भागीदारी की ओर इशारा किया है [1,52]। यह भी प्रस्तावित किया गया है कि मस्तिष्क इम्यूनोसेन्सेंस के संदर्भ में देखे गए माइक्रोग्लिया के असामान्य कार्य अंततः न्यूरोडीजेनेरेशन का कारण बन सकते हैं [53]। इस प्रकार, Ser389 GSK3 KI चूहों में त्वरित इम्यूनोसेन्सेंस इन जानवरों में पहले बताए गए न्यूरॉन्स के नुकसान में योगदान दे सकता है [6]। एलपीएस का उपयोग "इन विवो" और "इन विट्रो" दोनों मॉडलों में सूजन उत्पन्न करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। हालाँकि, इस बात के प्रमाण हैं कि प्रशासित एलपीएस की खुराक काफी हद तक प्रेरित सूजन प्रतिक्रिया के प्रकार को निर्धारित करती है [54-56]। एलपीएस की उच्च खुराक सेप्टिक शॉक जैसी प्रतिक्रिया उत्पन्न करती है; जबकि मध्यम एलपीएस खुराक लगातार निम्न-श्रेणी की सूजन को ट्रिगर करती है जो कई पुरानी बीमारियों में देखी गई सूजन के करीब होती है [42]। इस संदर्भ में, इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि हमारे प्रयोगों के लिए चयनित एलपीएस खुराक (0.5 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी) मध्यम है और चूहों में एलपीएस (10-25 मिलीग्राम/किग्रा) के लिए रिपोर्ट की गई एलडी50 से बहुत दूर है [57,58 ]. पिछली रिपोर्टों [40,59] के साथ समझौते में, हमने पाया कि ऐसी एलपीएस खुराक घातक नहीं है और डब्ल्यूटी जानवरों में ग्लियोसिस और न्यूट्रोफिल के मस्तिष्क घुसपैठ को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है, जबकि लिम्फोसाइट घुसपैठ प्रभावित नहीं होती है। उल्लेखनीय रूप से, ऐसे मध्यम (लेकिन महत्वपूर्ण) एलपीएस प्रतिक्रिया को केआई चूहों के मस्तिष्क में सेर389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा जीएसके3 के निष्क्रिय निष्क्रियता के साथ समाप्त कर दिया गया था। इस अवलोकन के अनुसार, मस्तिष्क में विस्तारित जीएसके3 हाइपरएक्टिवेशन अंततः प्रो-इंफ्लेमेटरी अपमान के प्रति संवेदनशीलता को कम कर सकता है। यह उल्लेखनीय है कि उत्परिवर्ती चूहों में एलपीएस की दोषपूर्ण प्रतिक्रिया इम्युनोटॉलेरेंस या प्रतिरोध के तंत्र के साथ संगत है, सीएनएस में एक सामान्य प्रक्रिया जिसका उद्देश्य ग्लियाल सेल सक्रियण को कम करना और अत्यधिक सूजन से मस्तिष्क क्षति को सीमित करना है [60,61]। इस विचार के साथ सहमति में, एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि चूहों में जीएसके3 सक्रियण प्रतिरक्षा सहनशीलता को प्रेरित कर सकता है और एलपीएस प्रतिक्रियाओं को दबा सकता है [62]।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

यह विचार करना भी दिलचस्प है कि इस अध्ययन में वर्णित मस्तिष्क प्रभाव उच्च विशिष्टता दर्शाते हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क के विपरीत, डब्ल्यूटी और सेर389 जीएसके3 केआई जानवरों में मूल्यांकन की गई अधिकांश प्लीहा कोशिका आबादी ने अस्थिर परिस्थितियों में एक ही प्रोफ़ाइल प्रस्तुत की, साथ ही एलपीएस के लिए भी एक समान प्रतिक्रिया प्रस्तुत की। इससे पता चलता है कि Ser389 फॉस्फोराइलेशन पर निर्भर GSK3 निष्क्रियता मार्ग न्यूरोइन्फ्लेमेशन के नियमन में विशिष्ट भूमिका निभाता है। इस परिकल्पना के अनुरूप, मस्तिष्क कोशिकाएं अन्य ऊतकों की तुलना में फॉस्फो-सर389 जीएसके3 की उच्च अभिव्यक्ति दिखाती हैं, और मस्तिष्क के विकास के दौरान इस अभिव्यक्ति को कसकर नियंत्रित किया जाता है [5]। अंत में, हमारे निष्कर्षों के अनुसार, Ser389 पर फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 का विनियमन विशेष रूप से NF-kB सिग्नलिंग मार्ग द्वारा मध्यस्थ होता है, क्योंकि STAT3 सक्रियण Ser389 GSK3 KI में अप्रभावित था। कई डाउनस्ट्रीम सूजन मध्यस्थों को एनएफ-केबी सक्रियण द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें साइटोकिन्स, रिसेप्टर्स, ट्रांसक्रिप्शन कारक और एंजाइम शामिल हैं। इनमें से कौन सा एनएफ-केबी लक्ष्य Ser389 GSK3 फॉस्फोराइलेशन से प्रभावित है, इसकी पहचान करना हमारे काम के दायरे से बाहर है, लेकिन यह न्यूरोइन्फ्लेमेशन के तंत्र को स्पष्ट करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययनों के लिए एक रोमांचक लक्ष्य होगा।

4. सामग्री और विधियाँ

4.1. जानवरों

C57BL/6J जंगली-प्रकार (WT) चूहों को जैक्सन प्रयोगशालाओं से खरीदा गया था। C57BL/6 GSK3 Ser389 KI चूहों, जिसमें फॉस्फोराइलेशन को रोकने के लिए GSK3 के Ser389 अवशेषों को Ala द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, पहले बताए अनुसार उत्पन्न हुए थे [8]। सभी चूहों को प्रकाश/अंधेरे चक्र के तहत अल्बासेटे मेडिकल स्कूल से जुड़ी पशु सुविधा में रखा गया था। इबिटम में भोजन और पानी मुहैया कराया गया। प्रयोग के लिए चार से छह महीने के वयस्क चूहों का इस्तेमाल किया गया।

4.2. एलपीएस प्रशासन

एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए, चूहों को {{0}}.5 मिलीग्राम/किग्रा एलपीएस का एक एकल इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन प्राप्त हुआ। साल्मोनेला एंटरिका एलपीएस (सीरोटाइप टाइफिम्यूरियम, एल7261 सिग्मा एल्ड्रिच, मैड्रिड, स्पेन) को 10 मिलीग्राम/एमएल पर बाँझ, एंडोटॉक्सिन मुक्त 0.9% खारा में भंग कर दिया गया था। उपचार के तीन दिन बाद, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई, और मस्तिष्क और प्लीहा को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या ग्लियाल कोशिकाओं और घुसपैठ की गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए हटा दिया गया। वेस्टर्न ब्लॉटिंग विश्लेषण के लिए, जानवरों को 0.5 मिलीग्राम/किग्रा एलपीएस के आईपी इंजेक्शन के 4 घंटे बाद इच्छामृत्यु दी गई, क्योंकि एलपीएस को पहले आईपी प्रशासन के 2-4 घंटे बाद माउस और चूहे के दिमाग में सूजन वाले प्रोटीन को अपग्रेड करने की सूचना मिली थी [63,64]।

4.3. फ़्लो साइटॉमेट्री

मस्तिष्क के ऊतकों और प्लीहा कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, जानवरों को ट्राइब्रोमोएथेनॉल के एक आईपी इंजेक्शन के साथ संवेदनाहारी किया गया था, जिसे तीव्र टर्मिनल अध्ययनों के लिए अनुशंसित किया गया है। उपयोग की जाने वाली ट्राइब्रोमोएथेनॉल की कम खुराक (200 मिलीग्राम/किग्रा) सूजन संबंधी साइटोकिन अभिव्यक्ति पर गंभीर प्रतिकूल प्रभाव या प्रभाव के बिना हल्का एनेस्थीसिया प्रदान करती है [65]। सजगता की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के बाद पशु प्रक्रियाएं की गईं।

4.3.1. मस्तिष्क ऊतक पृथक्करण और तंत्रिका कोशिकाओं का पेरकोल ग्रेडिएंट अलगाव

मस्तिष्क की रक्त वाहिकाओं से परिसंचारी कोशिकाओं को हटाने के लिए ऊतक संग्रह से पहले चूहों को इंट्राकार्डियल रूप से 0.9% NaCl के 5 0 एमएल के साथ छिड़का गया था। छिड़काव के बाद, मस्तिष्क को हटा दिया गया, मेनिन्जेस और कोरॉइड प्लेक्सस को सावधानीपूर्वक अलग कर दिया गया, और सेरिबैलम और घ्राण बल्बों को हटा दिया गया। शेष ऊतक को ठंडे हैंक के संतुलित नमक समाधान में रखा गया था, जो कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड मुक्त है (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: गिब्को, मैड्रिड, स्पेन, 14175)। पाचन से पहले ऊतक के नमूनों को स्केलपेल से बारीक काट लिया गया। कटे हुए ऊतक को 5 एमएल की कुल मात्रा में एमएसीएस सी ट्यूब (मिल्टनी बायोटेक, पॉज़ुएलो डी अलारकोन, स्पेन, 130-093-237) ​​में रखा गया था, और 30 मिनट के लिए 6 आरपीएम पर एक मैकेनिक डिसोसिएटर के साथ संसाधित किया गया था। अर्ल के बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (EBSS [+]CaCl2) में पपैन (100 यू; वर्थिंगटन, एलके003178) और डिस्पेस II (6 यू; सिग्मा-एल्ड्रिच, मैड्रिड, स्पेन, डी4963) का उपयोग करके हमारे अपने प्रोटोकॉल [31] के अनुसार एंजाइमैटिक पृथक्करण किया गया था। /[+]एमजीएसओ4; गिब्को, मैड्रिड, स्पेन, 24010)। डीएनएस I (100 यू; सिग्मा-एल्ड्रिच, मैड्रिड, स्पेन, डीएन25) को डीएनए बलगम को हटाने के लिए समाधान में जोड़ा गया था जो कोशिका व्यवहार्यता पर प्रतिकूल प्रभाव डालता है [66]। उपयोग से पहले, पपैन को 5% CO2 में 37 ◦C पर 30 मिनट के लिए सक्रिय किया गया था। पाचन को रोकने के लिए, नमूनों को ठंडे एचबीएसएस से पतला किया गया और बर्फ पर रखा गया। फिर इस घोल को 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके 10 बार पिपेट किया गया और 70 माइक्रोन सेल छलनी (बीडी, 352350) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। परिणामी एकल-कोशिका निलंबन को आरटी पर 10 मिनट के लिए 300× जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। माइलिन को हटाने और समरूपता को व्यवहार्य ग्लियाल कोशिकाओं में समृद्ध करने के लिए 30% PercollTM (GE हेल्थकेयर, मैड्रिड, स्पेन, 17-0891-01) ग्रेडिएंट का उपयोग किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, आइसोटोनिक पेरकोल (एसआईपी) का एक स्टॉक समाधान तैयार किया गया था (9:1 पेरकोल 10× एचबीएसएस में [-]CaCl2/[-]MgCl2; गिब्को, 14185), और सेल छर्रों को 30% (v/) में फिर से निलंबित कर दिया गया था v) एसआईपी (1× एचबीएसएस में)। 14 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में सेल सस्पेंशन वाले 1× एचबीएसएस के 7 एमएल में 3 एमएल एसआईपी जोड़कर 30% पेरकोल ग्रेडिएंट किया गया था। प्रत्येक ग्रेडिएंट को 18 ◦C पर 30 मिनट के लिए 300× g पर बिना ब्रेक के सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, निचली परत से कोशिकाओं को एकत्र किया गया, 1 × एचबीएसएस से धोया गया, 300 × जी पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, और 4 ◦C पर 1 × लाल रक्त कोशिका लिसी बफर के 10 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया गया। विश्लेषण के बाद, सेल सस्पेंशन को 10 मिनट के लिए 300× g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और परिणामस्वरूप सेल पेलेट को अंततः फ्लो साइटोमेट्री के लिए धुंधला होने से पहले ब्लॉकिंग बफर के 50 μL में फिर से निलंबित कर दिया गया था।

4.3.2. प्लीहा कोशिका पृथक्करण

तिल्ली को आरपीएमआई 1640 युक्त पेट्री डिश पर रखा गया और छोटे टुकड़ों में काट दिया गया। परिणामी ऊतक को 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर (बीडी, 352350) में डाला गया और सिरिंज के प्लंजर के रिब्ड शीर्ष के साथ गोलाकार गति में तोड़ दिया गया। फिर आरपीएमआई 1640 को छलनी से गुजारा गया। विघटित ऊतक को 50 एमएल ट्यूब (सरस्टेड, बार्सिलोना, स्पेन, 62.547.254) में स्थानांतरित किया गया और 10 मिनट के लिए 100 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सेल सस्पेंशन वाले सतह पर तैरनेवाला को फिर से एकत्र किया गया और 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज किया गया। परिणामी सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था, और माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए गोली को 1% एफबीएस के साथ 10 एमएल फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) में फिर से निलंबित कर दिया गया था, जिसके बाद इसे 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज किया गया था। प्रति नमूना केवल 500,000 कोशिकाओं का उपयोग किया गया। फ्लो साइटोमेट्री के लिए धुंधला होने से पहले प्रत्येक नमूने को ब्लॉकिंग बफर के 50 μL में फिर से निलंबित कर दिया गया था।

4.3.3. बाह्यकोशिकीय प्रवाह साइटोमेट्री धुंधलापन

तालिका 2. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी और अभिकर्मक।

4.4. इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

चूहों को गहराई से बेहोश किया गया और इंट्राकार्डिअल रूप से खारा {{0}}.9% (w/v) छिड़का गया। उनके मस्तिष्क को एकत्र किया गया और 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ पोस्ट-फिक्स्ड किया गया। पोस्ट-फिक्सेशन के बाद, उन्हें 30% सुक्रोज के साथ क्रायोप्रोटेक्ट किया गया और सेक्शनिंग तक -20 ◦C पर फ्रीज किया गया। ऊतक खंडों (20 माइक्रोमीटर) को क्रायोस्टेट (थर्मोफिशर, माइक्रोम™ HM550) का उपयोग करके काटा गया, सुपरफ्रॉस्ट प्लस स्लाइड्स (थर्मोफिशर, J1800AMNZ) पर पिघलाया गया और अंत में धुंधला होने तक -20 ◦C पर संग्रहीत किया गया। ऊतक वर्गों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन पहले बताए अनुसार किया गया था [67]। प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधानों को 1% बीएसए के साथ 1× पीबीएस में पतला किया गया था। अनुभागों को प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-खरगोश आईबीए -1 (1:500 तनुकरण; वाको केमिकल्स, बार्सिलोना, स्पेन, 019-19741) के साथ ऊष्मायन किया गया था। एलेक्सा फ़्लूर 488-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (1:2000 तनुकरण; थर्मोफिशर, मैड्रिड, स्पेन, ए11031) का उपयोग द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में किया गया था। उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण ऊतक, साथ ही प्राथमिक और माध्यमिक नकारात्मक नियंत्रण शामिल थे। फ्लोरोसेंट लेबलिंग छवियां ZEISS एपोटोम का उपयोग करके हासिल की गईं। 2 माइक्रोस्कोप एक एक्सिओम 503 मोनो डिजिटल कैमरा और ज़ेन ब्लू कंट्रोल सॉफ्टवेयर संस्करण 2.3 (कार्ल ज़ीस) के साथ। हिप्पोकैम्पस को देखने के लिए 10× उद्देश्य (प्लान-एपोक्रोमैट, वी10×, एनए 0.45, एआईआर) का उपयोग किया गया था। रुचि के क्षेत्रों के भीतर एकीकृत घनत्व की गणना ImageJ सॉफ़्टवेयर के साथ की गई थी। यह पैरामीटर चयनित क्षेत्र में प्रत्येक पिक्सेल के लिए तीव्रता मानों के योग से मेल खाता है। इसलिए, इसका उपयोग प्रत्येक कोशिका की धुंधला तीव्रता के साथ संयोजन में दाग वाली कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

4.5. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

चूहे के दिमाग को तुरंत हटा दिया गया, और हिप्पोकैम्पी को तुरंत विच्छेदित और जमे हुए किया गया। जैसा कि पहले वर्णित है [68] प्रोटीज अवरोधक युक्त हाइपरटोनिक लिसीस बफर का उपयोग करके ऊतक तैयार किया गया था। उपयोग की जाने वाली प्राथमिक एंटीबॉडीज एंटी-खरगोश फॉस्फोर-आईकेके / (1:1000 तनुकरण; सेल सिग्नलिंग, अल्कोबेंडास, स्पेन, 2861), खरगोश-विरोधी आईकेके / (1:1000 तनुकरण; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, हीडलबर्ग, जर्मनी, एससी) थे। 9}}), एंटीरैबिट फॉस्फोर-एसटीएटी3 (1:1000 तनुकरण; सेल सिग्नलिंग, 9145) और एंटी-माउस एसटीएटी3 (1:1000 तनुकरण; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, एससी-8019)। एंटी-माउस-ट्यूबुलिन (1:2000 तनुकरण; सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, एससी -32293) का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। खरगोश-विरोधी एचआरपी (1:5000 तनुकरण; जैक्सन इम्यूनोरिसर्च लेबोरेटरीज, बाल्टीमोर, यूएसए, 111-035-144) और माउस-विरोधी एचआरपी (1:5000 तनुकरण; जैक्सन इम्यूनोरिसर्च लेबोरेटरीज, 115-035-003) का उपयोग द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में किया गया था। . एनआईएच इमेजजे सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, 1 मार्च 2022 को एक्सेस किया गया) के साथ बैंड डेंसिटोमेट्री विश्लेषण द्वारा प्रोटीन बैंड मात्रा का ठहराव किया गया था। समान भार सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक बैंड के लिए प्राप्त एकीकृत घनत्व को उचित हाउसकीपिंग लोडिंग नियंत्रण के संबंध में एक सापेक्ष मूल्य के रूप में व्यक्त किया गया था।

4.6. सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर (सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के साथ परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया। डेटा को आम तौर पर चार स्वतंत्र प्रयोगों (n {0}}–9) के माध्य (SEM) की माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। शापिरो-विल्क परीक्षण द्वारा डेटा के सामान्य वितरण की पुष्टि करने के बाद, दोनों समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व पैरामीट्रिक डेटा के लिए छात्र टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित किया गया था। अंतर को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था जब संभाव्यता (पी) मान 0 से कम थे। 05 (*), 0.01 (**), या 0.001 (***)। आंकड़े प्रतिनिधि प्रयोग दिखाते हैं।

प्र. 5। निष्कर्ष

संक्षेप में, हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 को निष्क्रिय करने में विफलता से पुरानी सूजन और एंडोटॉक्सिन सहिष्णुता हो जाती है और Ser9 और Ser389 फॉस्फोराइलेशन द्वारा GSK3 का निषेध न्यूरोइम्यून प्रतिक्रिया में पूरक और अनावश्यक भूमिका नहीं निभाता है। इसलिए, न्यूरोपैथोलॉजी और मस्तिष्क उम्र बढ़ने के लिए जीएसके3 सर389 फॉस्फोराइलेशन के विशिष्ट परिणामों की जांच की जानी चाहिए।

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