इस तथ्य को स्थापित करने के बाद कि ओबैन का सेनोलिटिक प्रभाव सेल प्रकार-निर्भर है

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ouabain के कारण K*/Nat होमोस्टैसिस की गड़बड़ी नियंत्रण और पुराने A549 और END-MSCs में विभिन्न शारीरिक प्रतिक्रियाओं की ओर ले जाती है

इस तथ्य को स्थापित करने के बाद कि ouabain का सेनोलिटिक प्रभाव सेल प्रकार पर निर्भर है, आगे हमने यह स्पष्ट करने की कोशिश की कि hMSCs और A549 की प्रतिक्रियाओं में प्रकट अंतर क्या हो सकते हैं। इसके लिए, हमने END-MSCs और etoposide के ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित सेनेकेंस का विश्लेषण किया। A549 की अधिक सटीक रूप से प्रेरित बुढ़ापा।सिनोमोरियम लाभविभिन्न कार्डियक ग्लाइकोसाइड की क्रिया का मुख्य आणविक तंत्र Nat/K plus -ATPase [44] का निषेध है। Nat/K plus -ATPase एक प्लाज्मा झिल्ली एंजाइम है जो सेल से सोडियम पंप करता है, जबकि एकाग्रता ग्रेडिएंट्स के खिलाफ सेल में पोटेशियम पंप करता है। और इस प्रकार के प्लस और ना प्लस होमियोस्टेसिस के रखरखाव में भाग लेना। इसलिए, हमने पूछा कि क्या दो प्रकार के नियंत्रण और सीनेसेंट कोशिकाओं के बीच बेसल और ऊबैन-प्रेरित आयन होमियोस्टेसिस में कोई अंतर हो सकता है।

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के प्लस और ना प्लस होमियोस्टैसिस में ऊबैन के कारण होने वाली गड़बड़ी अंततः प्लाज्मा झिल्ली क्षमता के अपव्यय की ओर ले जाती है। इस प्रकार, आगे, हमने गैर-उत्तेजक कोशिकाओं की ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता को मापने के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच DiBAC4 (3) का उपयोग किया। इस डाई की बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति झिल्ली विध्रुवण को दर्शाती है।रेगिस्तान जलकुंभीप्रत्येक कोशिका प्रकार में परीक्षण किए गए ouabain प्रेरित पूर्वानुमेय झिल्ली विध्रुवण, आयनिक असंतुलन की पुष्टि करते हैं (चित्र। 10a)। विशेष रूप से, हमने नियंत्रण और सीनेसेंट END-MSCs में झिल्ली विध्रुवण के तुलनीय स्तरों का अवलोकन किया, जबकि सेन्सेंट A549 को A549 कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में काफी अधिक विध्रुवित झिल्ली की विशेषता थी।

आयनिक विनियमन के अन्य महत्वपूर्ण परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपी) में परिवर्तन हैं।

इस प्रकार, फ्लोरोसेंट जांच JC-1 का उपयोग करके हमने ouabain उपचार पर नियंत्रण और सेन्सेंट कोशिकाओं में MMP का आकलन किया। यह विशेष रूप से हाइलाइट किया जाना चाहिए कि सेन्सेंट कोशिकाओं को आमतौर पर माइटोकॉन्ड्रिया की खराबी, ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन, और इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर में वृद्धि को दर्शाते हुए एमएमपी में कमी की विशेषता है। जैसा कि अपेक्षित था, सेन्सेंट END-MSCs और A549 कोशिकाओं में MMP नियंत्रण वाले की तुलना में कम था,

हालांकि इस कमी ने सेन्सेंट कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया (अंजीर। आईडी, 6 ए, 10 बी)।फ्लेवोनोइड निष्कर्षण विधि पीडीएफउपरोक्त परिणामों के समान, ouabain ने अपने प्रोलिफ़ेरेटिंग समकक्षों की तुलना में सेन्स-सेंट A549 में स्पष्ट MMP विध्रुवण को प्रेरित किया, जबकि MMP ऑफ़ कंट्रोल और सेन्सेंट END-MSCs पर प्रभाव न्यूनतम था (Fig.10b)। इस भाग के भीतर वर्णित परिणामों को सारांशित करते हुए, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि ouabain द्वारा Na plus / K plus -ATPase को अवरुद्ध करने से प्लाज्मा झिल्ली का नाटकीय विध्रुवण होता है और सेन्सेंट END-MSCS के विपरीत, सेन्सेंट A549 के मामले में MMP की गिरावट होती है।

के प्लस आयात के तंत्र में बदलाव सेन्सेंट END-MSCs के ouabain-प्रतिरोध की मध्यस्थता करते हैं

To clarify mechanisms mediating ouabain-induced changes in membrane polarization and MMP between senescent A549 and END-MSCs, further, we employed an advanced bio-informatic approach. The aim of the analysis was to reveal possible transcriptomic features mediating cell type depend-ent ouabain-resistance or -sensitivity of senescent cells. In other words, we asked the question: how senescence of END-MSCs (ouabain-resistant cells) differs from senescence of A549 (ouabain-sensitive cells)? To answer this question, we utilized three independent RNA sequencing (RNA-Seq) datasets. The first one was RNA-Seq analysis

Fig.6 एटोपोसाइड-प्रेरित ए549 सेनेसेंस मॉडल का सत्यापन। सेन्सेंट A549 कोशिकाएं प्रसार के नुकसान को प्रदर्शित करती हैं, b उन्नत सेल आकार, c ऑटोफ्लोरेसेंस स्तर और d SA-b-Gal गतिविधि को नियंत्रण वाले की तुलना में प्राप्त करती हैं। p53 और Rb का e फॉस्फोराइलेशन स्तर और नियंत्रण में p21 और HMGBI प्रोटीन का अभिव्यक्ति स्तर और सेन्सेंट A549। प्रस्तुत मान माध्य ± एसडी हैं। एकतरफा एनोवा में कई समूहों की तुलना के लिए लागू किया गया था, एन =3, एनएस महत्वपूर्ण नहीं, *** पी<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoidsछवियों के लिए स्केल बार 500 सुक्ष्ममापी हैं । GAPDH का उपयोग हमारे द्वारा किए गए नियंत्रण और पुराने END-MSCs के लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। दूसरा नियंत्रण के लिए डेटासेट था और GEO [43] से डाउनलोड किया गया पुराना A549। ध्यान दें, वर्तमान अध्ययन में और कार्डियक ग्लाइकोसाइड-प्रेरित सेनो-लिसिस के पायलट अध्ययनों में लागू होने वाले सेनेसेंस-उत्प्रेरण की स्थिति मेल खाती है। और तीसरा डेटासेट नियंत्रण और सेन्सेंट आईएमआर -90 के लिए था जो सीधे कार्डियक ग्लाइकोसाइड्स पर सेनोलिटिक यौगिकों के रूप में अध्ययन से प्राप्त किया गया था [25]। महत्वपूर्ण रूप से, आईएमआर -90 ऊबैन-प्रेरित विश्लेषण के लिए प्रवण साबित हुआ था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि END-MSCs और A549 के लिए प्रासंगिक केवल दो डेटासेट की तुलना करने से अंततः अनुचित परिणाम प्राप्त होंगे, क्योंकि इस तरह के विश्लेषण में END-MSCs और A549 में सेनेसेंस प्रक्रिया के बीच मांगे जाने वाले अंतर मध्यस्थता की भिन्नता से अप्रभेद्य होंगे। विविध तकनीकी बैच प्रभाव (यानी अनुक्रमण मशीन का प्रकार, नमूने की स्थिति चली)। किसी भी बैच प्रभाव को कम करने के लिए, हमने ouabain-प्रतिरोधी कोशिकाओं (END-MSCs) के लिए एक डेटासेट और ouabain-संवेदनशील कोशिकाओं (A549, IMR -90) के लिए दो की तुलना की। आगे के तुलनात्मक विश्लेषण की प्रासंगिकता को मान्य करने के लिए, हमने तीनों वर्णित प्रयोगों के नमूनों वाले सारांश डेटासेट के आधार पर GO शब्द "सेलुलर सेनेसेंस" (GO 0090398) से संबंधित जीनों के सबसेट के लिए एक प्रमुख घटक विश्लेषण किया। दरअसल, प्रत्येक कोशिका प्रकार के नमूनों के लिए दो अलग-अलग समूहों में क्लस्टर किया जाता है- नियंत्रण और सेन्सेंट वाले (चित्र 10d)।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

ouabain-प्रतिरोधी और -संवेदी कोशिकाओं के जीर्णता के दौरान विभेदित रूप से व्यक्त जीन (DEG) का विश्लेषण करने के लिए, हमने सांख्यिकीय मॉडल तैयार किया जिसने दो भविष्यवक्ताओं और उनकी बातचीत को अभिव्यक्त किया। विश्लेषण की योजनाबद्ध प्रस्तुति अंजीर में प्रदर्शित की गई है। 10c। संक्षेप में, मॉडल में पहले भविष्यवक्ता ने सभी नमूनों को नियंत्रण और सेनेसेंस उपसमूहों द्वारा विभाजित किया, दूसरा - ouabain प्रतिरोध या ouabain संवेदनशीलता द्वारा, और मॉडल में अंतिम घटक परिलक्षित हुआ दोनों भविष्यवक्ताओं की बातचीत। अंतिम चर के लिए अंतर अभिव्यक्ति परीक्षण का परिणाम अनुपूरक तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है।

हमने तब जैविक प्रक्रियाओं (बीपी) (पूरक तालिका 2) के लिए जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) शर्तों में जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) किया। विशेष रूप से, महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध प्रक्रियाओं के बीच, हमने 'पोटेशियम आयन आयात' और 'केशन ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसपोर्ट के सकारात्मक विनियमन को ouabain-प्रतिरोधी END-MSCs के पुरानेपन के दौरान ouabain-संवेदनशील कोशिकाओं (अंजीर। 10e) की तुलना में अप-विनियमित किया। ) इन प्रक्रियाओं से संबंधित मुख्य संवर्धन जीन सूचियों में KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4 शामिल थे, जिन्हें सेन्सेंट END-MSCs (चित्र। 10f) में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था। केसीएनजे जीन द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन आवक-सुधारकर्ता प्रकार के पोटेशियम चैनल हैं, जिनमें पोटेशियम को सेल के बजाय सेल में प्रवाहित करने की अधिक प्रवृत्ति होती है।हेस्परिडिन का उपयोग करता हैSLC12 कटियन-यू-प्लेड क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों का एक परिवार है। WNK4 जीन सेरीन / थ्रेओनीन किनसे के लिए एन्कोड करता है जो सोडियम-युग्मित क्लोराइड कोट्रांसपोर्टर्स के उत्प्रेरक और पोटेशियम-युग्मित क्लोराइड कोट्रांसपोर्टर्स के अवरोधक के रूप में कार्य करता है। साथ में, इन निष्कर्षों ने यह सुझाव देने की अनुमति दी कि सेन्स-सेंट END-MSCs कम इंट्रासेल्युलर K प्लस लेव-एल्स को सेन्सेंट A549 कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से बहाल कर सकते हैं और इस प्रकार ouabain- प्रेरित आयनिक असंतुलन के साथ प्रबंधन कर सकते हैं।

सेन्सेंट END-MSCs उन्नत प्रदर्शित करते हैं

एपोप्टोसिस-प्रतिरोध नियंत्रण वाले की तुलना में, जबकि सीनेसेंट A549 नहीं करता है

कोशिका मृत्यु के नियमन में इंट्रासेल्युलर के प्लस की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित है [46]। इंट्रासेल्युलर K प्लस होमियोस्टेसिस को बनाए रखने की क्षमता में सेन्स-सेंट END-MSCs और A549 कोशिकाओं के बीच के अंतर ने हमें दोनों सेल प्रकारों के सेनेकेंस के दौरान प्राप्त समग्र तनाव प्रतिरोध की तुलना करने के लिए प्रेरित किया। यह ज्ञात है कि बहिर्जात तनाव आयनिक होमियोस्टेसिस में गड़बड़ी के साथ होते हैं, जिससे विभिन्न आयनों का तेजी से आदान-प्रदान होता है, जिसमें कोशिका और उसके पर्यावरण के बीच K प्लस शामिल है [46]। तनावपूर्ण प्रभावों के परिणाम काफी हद तक उपयुक्त इंट्रासेल्युलर आयनिक संतुलन को बहाल करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर निर्भर करते हैं। जैसा कि चित्र 10e, f में दिखाया गया है, END-MSCs की बुढ़ापा के साथ-साथ K प्लस आयात के अपग्रेडेशन के साथ यह सुझाव दिया गया था कि इस दौरान

Fig.10 Ouabain-प्रतिरोधी सीनेसेंट END-MSCs प्रभावी K प्लस आयात के माध्यम से ouabain के कारण K प्लस / Nat होमोस्टैसिस की गड़बड़ी को बहाल करने में सक्षम हैं, जबकि ouabain-संवेदनशील सेन्सेंट कोशिकाओं में इस क्षमता का अभाव है। फ्लोरोसेंट जांच DiBAC4 (3) का उपयोग करते हुए, ouabain उपचार से पहले और 24 घंटे के बाद नियंत्रण और सीनेसेंट END-MSCs और A549 कोशिकाओं का एक झिल्ली संभावित निर्धारण। b माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित मूल्यांकन नियंत्रण और सीनेसेंट END-MSCs और A549 कोशिकाओं से पहले और 24 घंटे के बाद ouabain उपचार के बाद, फ्लोरोसेंट जांच JC -1 का उपयोग करते हुए। c तीन स्वतंत्र RNA-Seq डेटासेट के तुलनात्मक जैव सूचनात्मक विश्लेषण का डिज़ाइन। तीन स्वतंत्र RNA-Seq डेटा सेट के संयुक्त डेटा के आधार पर GO शब्द "सेलुलर सेनेसेंस" (GO 0090398) से संबंधित जीन के सबसेट के लिए प्रमुख घटक विश्लेषण . e GSEA परिणाम ouabain-मध्यस्थता विश्लेषण (END-MSCs) के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं और ouabain-मध्यस्थता विश्लेषण (A549 और IMR -90) के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं के बीच 'केशन ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसपोर्ट के सकारात्मक विनियमन' के लिए है। 'पोटेशियम आयन जैविक प्रक्रियाओं का आयात करते हैं। f हीटमैप 'केशन ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसपोर्ट के सकारात्मक विनियमन' और 'पोटेशियम आयन आयात' जैविक प्रक्रियाओं के लिए मुख्य संवर्धन जीन को दर्शाता है। मान माध्य ± एसडी हैं। छात्र के टी-टेस्ट द्वारा सांख्यिकीय महत्व का आकलन किया गया था: एनएस महत्वपूर्ण नहीं, * पी<><><>

वृद्धावस्था विकास END-MSCs K प्लस स्तरों को पुनर्स्थापित करने की अपनी क्षमता को बढ़ाते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हम A549 सेनेकेंस के लिए एक समान प्रवृत्ति को प्रकट करने में सक्षम नहीं थे, इस प्रकार, A549 को सेनेसेंस प्रगति के दौरान K * आयात से संबंधित कोई विशिष्ट विशेषता प्राप्त नहीं हुई। साहित्यिक आंकड़ों के अनुसार, इंट्रासेल्युलर के * में तनाव-प्रेरित कमी और कैसपेज़ और न्यूक्लियस के अपने स्तर के पक्ष सक्रियण को बहाल करने में असमर्थता और इस प्रकार एक प्रो-एपोप्टोटिक कारक होने का प्रस्ताव है [46]।

इस सुझाव के अनुरूप, उपरोक्त RNA-seq डेटासेट के जैव सूचनात्मक विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हमने A549 और IMR -90 (चित्र lla) की तुलना में END-MSCs के जीर्णता के दौरान एपोप्टोसिस से संबंधित प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण डाउन-रेगुलेशन का खुलासा किया। . इसके अलावा, A549 और IMR -90 की शिथिलता को BAD, BAX, BOK, BAK -1, और NOXA (Fig.11b) सहित प्रो-एपोप्टोटिक जीन के महत्वपूर्ण अप-विनियमन की विशेषता है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि END-MSCs वृद्धावस्था के दौरान एपोप्टोसिस-प्रतिरोधी फेनोटाइप प्राप्त करते हैं, जबकि सेन्सेंट IMR -90 और A549 एपोप्टोसिस-प्रवण (छवि 11 बी) बन गए। इस अवलोकन को मजबूत करने के लिए, हमने अतिरिक्त रूप से नियंत्रण और प्रतिकृति सेनेसेंट AD-MSCs के लिए माइक्रोएरे डेटासेट का विश्लेषण किया, जो ऊपर बताए अनुसार सेनेसेंस के दौरान ouabain-प्रतिरोध को भी पूर्व-सेवारत करता है (चित्र 4g)। एपोप्टोसिस-संबंधी जीनों के अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण करते समय, हमने सेन्सेंट END-MSCs (पूरक चित्र। S8a, b) के समान सेन्सेंट AD-MSCs के अलग-अलग एपोप्टोसिस-प्रतिरोधी फेनोटाइप का अवलोकन किया।

ट्रांसक्रिपटामिक विश्लेषण के परिणामों को सत्यापित करने के लिए, हमने आरटी-पीसीआर (सप्लीमेंटल अंजीर। S9) द्वारा एपोप्टोसिस और के प्लस दोनों प्रकार के सेन्सेंट कोशिकाओं-END-MSCs और A549 से संबंधित जीनों के अभिव्यक्ति स्तर का अनुमान लगाया। इसके अतिरिक्त, हमने अन्य ouabain-प्रतिरोधी और ouabain-संवेदनशील सेलुलर मॉडल, डॉक्सोरूबिसिन-उपचारित सीनेसेंट DP-MSCs, और etoposide- उपचारित सीनेसेंट SK-सहायता, क्रमशः (पूरक चित्र। S9) का उपयोग करके समान जीन सूची की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। जैसा कि सप्लीमेंटल अंजीर में दिखाया गया है। S9, दोनों प्रकार के ouabain-प्रतिरोधी कोशिकाओं-सीनसेंट END-MSCs और DP-MSCs ने समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित किए, विशेष रूप से KCNJ2, SLC12A और WNK4 जो K प्लस बहाली में भाग ले रहे थे, को अपग्रेड किया गया था, प्रॉपोपोटिक BAX को डाउनग्रेड किया गया था, जबकि एंटीपैप्टोटिक MCL-I को अपग्रेड किया गया था। इसके अलावा, एक ही जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न ouabain- संवेदनशील A549 और SK-Hep1 के लिए देखे गए लोगों से भिन्न थे। ये परिणाम हमारे ट्रांसक्रिपटामिक डेटा की पुष्टि करते हैं और विभिन्न सेल प्रकारों के सेनेकेंस के दौरान प्राप्त विभिन्न एपोप्टोसिस प्रोफाइल के बारे में निष्कर्ष को सुदृढ़ करते हैं।

हमने अगला परीक्षण किया कि क्या END-MSCs और A549 के सेनेकेंस के दौरान एपोप्टोसिस पृष्ठभूमि में देखे गए अंतर सेन्सेंट कोशिकाओं के समग्र तनाव प्रतिरोध पर प्रभाव पड़ सकता है। ऐसा करने के लिए, हमने ऑक्सीडेटिव तनाव और स्ट्रोस्पोरिन पर सेल व्यवहार्यता का आकलन किया, आमतौर पर एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए लागू किया गया। वास्तव में, सीनेसेंट END-MSCs अपने नियंत्रण समकक्षों (छवि 1lc) की तुलना में दोनों तनावों के लिए काफी अधिक प्रतिरोधी निकले। इसके विपरीत, A549 कोशिकाओं ने इसके विपरीत स्थिति का प्रदर्शन किया, क्योंकि सीनेसेंट कोशिकाओं ने तनाव-प्रेरित कोशिका मृत्यु (चित्र। 11d) के प्रति अधिक संवेदनशील होने की प्रवृत्ति प्रदर्शित की। यह अवलोकन मौजूदा प्रतिमान को बदल देता है कि मृत्यु प्रतिरोध में वृद्धि किसी भी प्रकार की सीनेसेंट कोशिकाओं की एक सामान्य विशेषता है, जो इसकी स्पष्ट सेल विशिष्टता को प्रदर्शित करती है।

उपरोक्त आंकड़ों के आधार पर, हमने यह मान लिया था कि सेन्सेंट END-MSCs के एपोप्टोसिस "रक्षा" को कम करने से आगे के विश्लेषण के लिए अनुकूल परिस्थितियों का निर्माण होना चाहिए। इस संबंध में, हमने बीसीएल -2 परिवार के प्रोटीन-एमसीएल -1 के एक प्रसिद्ध एंटीपैप्टोटिक सदस्य पर ध्यान केंद्रित किया, क्योंकि इसकी अभिव्यक्ति एपोप्टोसिस-प्रतिरोधी सेन्सेंट END-MSCs (चित्र। 1lb और पूरक चित्र) में अपग्रेड की गई थी। एस9ए)। यह अंत करने के लिए, हमने ए -1210477 विशिष्ट एमसीएल -1 अवरोधक के साथ नियंत्रण और सेन्सेंट END-MSCs का दिखावा किया, और फिर विश्लेषण को प्रेरित करने के लिए कार्डियक ग्लाइकोसाइड लागू किया। ध्यान दें, ए -1210477 का नियंत्रण कोशिकाओं की प्रसार क्षमता और सेन्सेंट की व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं था जैसा कि विकास घटता (छवि 1le) पर दर्शाया गया है। कार्डिएक ग्लाइकोसाइड्स के बाद के अनुप्रयोग से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में कमी आई, हालांकि प्रभाव कभी-कभी सेन्सेंट ईएससी (छवि 11 एफ) में अधिक स्पष्ट था। इसलिए, एमसीएल -1 को ए -1210477 के साथ रोकना, विश्लेषण के लिए संकेत देने वाली ouabain- प्रेरित मौत की ओर पूर्वनिर्मित सीनेसेंट ईएससी। END-MSCs सेनेसेंस के दौरान प्राप्त एपोप्टोसिस-प्रतिरोध के लिए बाद के साक्ष्य कार्डियक ग्लाइकोसाइड्स द्वारा ट्रिगर किए गए प्रभावी विश्लेषण के लिए एक आंतरिक अवरोध हैं।

बहस

वर्तमान अध्ययन के भीतर, हमने hMSCs पर कार्डियक ग्लाइकोसाइड्स, अर्थात् ouabain और bufalin के सेनोलिटिक प्रभावों का परीक्षण किया। दोनों यौगिकों को हाल ही में प्राथमिक कोशिकाओं IMR -90, HUVEC, ARPE -19, T/ सी -28 और कैंसर कोशिकाएं एसके-हेल्प, ए549, एसके-मेल -5, एमसीएफ 7, एचसीटी 116, एचसीएटी, एच 1299, यू 373- एमजी, एच 1755 [25,26]। अप्रत्याशित रूप से, हम नियंत्रण वाले की तुलना में किसी भी तरजीही साइटोटोक्सिक प्रभाव को प्रकट करने में सक्षम नहीं थे, न तो ouabain और न ही बुफ़ालिन सेन्सेंट END-MSCs पर। महत्वपूर्ण रूप से, विश्लेषण की अनुपस्थिति को वसा ऊतक, दंत लुगदी और वार्टन जेली, और विभिन्न सेनेसेंस मॉडल से प्राप्त एचएमएससी का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। उत्तरार्द्ध ने हमें इस सुझाव के लिए प्रेरित किया कि कार्डियक ग्लाइकोसाइड-प्रेरित विश्लेषण का प्रतिरोध hMSCs की सामान्य विशेषता हो सकती है। उसी समय, हम सेन्सेंट ए 549 और एसके-हेल्प में एपोप्टोसिस को अधिमानतः प्रेरित करने में सक्षम थे, इस प्रकार प्रासंगिक लेखों में वर्णित कार्डियक ग्लाइकोसाइड के सेनोलिटिक प्रभाव को पुन: उत्पन्न करते हैं [25,26]। ouabain- प्रेरित विश्लेषण (ouabain-प्रतिरोधी / ouabain-संवेदनशील) के प्रति प्रतिरोधी और संवेदनशील कोशिकाओं के साथ, हमने इस अंतर के अंतर्निहित मूलभूत कारणों को स्पष्ट करने का प्रयास किया। कार्डियक ग्लाइकोसाइड क्रिया का सामान्य आणविक तंत्र नेट/के प्लस -एटीपीस के लिए बाध्यकारी है और इसकी गतिविधि को अवरुद्ध करता है। एटीपी को हाइड्रोलाइज करके यह एंजाइम सेल से बाहर ना प्लस पंपिंग सुनिश्चित करता है और के प्लस को कोशिकाओं में आयात करता है और इस प्रकार शारीरिक विद्युत रासायनिक ढाल, आयनिक होमियोस्टेसिस, सेलुलर पीएच और सेल वॉल्यूम को बनाए रखता है जो सेल अस्तित्व और कामकाज के लिए आवश्यक हैं [47]। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि ouabain की सेनोलिटिक क्षमता उपचारित कोशिकाओं में K प्लस / Nat असंतुलन की गंभीरता पर निर्भर हो सकती है। इस सुझाव के अनुरूप, हमने खुलासा किया कि ouabain ने प्लाज्मा झिल्ली के अधिक स्पष्ट विध्रुवण और ouabain-संवेदनशील सीनेसेंट A549 में MMP की गिरावट को प्रेरित किया।

सामान्यतया, कोशिका के अस्तित्व पर Nat/K plus -ATPase को बाधित करने वाले प्रभाव को कोशिका-प्रकार विशिष्ट दिखाया गया। उदाहरण के लिए, ऑबैन को लिम्फोसाइट्स, जर्कैट कोशिकाओं और कैनाइन एपिथेलियल कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रबल करने के लिए दिखाया गया था, जबकि यह चूहे महाधमनी, चूहे सेरेब्रल ग्रेन्युल कोशिकाओं और पोर्सिन रीनल समीपस्थ ट्यूबलर एलएलसी-पीके 1 लिम्फोसाइटों से उपकला कोशिकाओं में मृत्यु को प्रेरित करने में विफल रहा। धनायनित अनुपात [48-54] का। प्रॉपोपोटिक ouabain क्रिया के प्रस्तावित तंत्रों में से एक इंट्रासेल्युलर की कमी है जो एपोप्टोटिक संकोचन, कैसपेज़ की सक्रियता और एपोप्टोटिक प्रोग्रामिंग [46, 47] की शुरुआत का पक्षधर है। तुलनीय K प्लस नुकसान को ध्यान में रखते हुए, लेकिन ouabain-प्रतिरोधी और ouabain- संवेदनशील मॉडल के लिए प्राप्त मृत्यु प्रेरण पर विपरीत प्रभाव, हमने cation की प्रतिपूरक प्रणालियों में अंतर का सुझाव दिया। इंट्रासेल्युलर के प्लस स्तर में गिरावट अनिवार्य रूप से इस कटियन की कमी की भरपाई के लिए बाह्य अंतरिक्ष से के प्लस आयात की सक्रियता की ओर ले जानी चाहिए। इसलिए, K प्लस बहाली की प्रभावशीलता ouabain उपचार पर एपोप्टोसिस की प्रवृत्ति को कम कर सकती है। इस सुझाव का परीक्षण करने के लिए, हमने ouabain-प्रतिरोधी कोशिकाओं (END-MSCs) और ouabain-संवेदनशील कोशिकाओं (A549 और IMR -90) के जीर्णता के दौरान ट्रांसक्रिपटामिक हस्ताक्षरों में परिवर्तन की तुलना करते हुए जटिल जैव सूचनात्मक विश्लेषण लागू किया। हमने END-MSCs सेनेसेंस के दौरान पोटेशियम आयन आयात से संबंधित प्रक्रियाओं के मजबूत अपग्रेडेशन को देखा, जबकि oua-bain-संवेदनशील A549 और IMR -90 के जीर्णता के दौरान ये प्रक्रिया अपरिवर्तित रही या घटी भी। उसके आधार पर हम अनुमान लगा सकते हैं कि सेन्सेंट END-MSCs सक्रिय रूप से सक्रिय कटियन आयात प्रणालियों के माध्यम से ouabain- प्रेरित K प्लस कमी का सामना कर सकते हैं, जो एपोप्टोसिस इंडक्शन को रोकता है। इसके विपरीत, हमारे-बैन-संवेदनशील सेन्सेंट A549 और IMR -90 K प्लस हानि को दूर करने में कम सक्षम प्रतीत होते हैं, और इस प्रकार एपोप्टोसिस-प्रवण हैं। इस धारणा के पक्ष में, ouabain ने अधिक महत्वपूर्ण प्लाज्मा और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली विध्रुवण को प्रेरित किया। सेनेसेंट A549 कोशिकाएं, मरने वाली कोशिकाओं के लिए विशिष्ट स्पष्ट आयनिक असंतुलन का प्रदर्शन करती हैं।

ऑबैन-प्रेरित एपोप्टोसिस की अनूठी विशेषता होने के बजाय, इंट्रासेल्युलर के प्लस सामग्री की एक बूंद शायद विभिन्न तनावों से उत्पन्न होने वाली एपोप्टोटिक मौत की सामान्य विशेषता है, जैसे स्टॉरोस्पोरिन उपचार और ऑक्सीडेटिव तनाव [46]। तदनुसार, साइटोप्लाज्मिक K प्लस को बहाल करने के लिए सेन्सेंट A549 की घटी हुई क्षमता को अंततः समग्र तनाव प्रतिरोध में गिरावट का कारण बनना चाहिए। हालांकि, यह धारणा सेल सेनेसेन्स की आधुनिक परिभाषा का खंडन करती है, जिसमें कहा गया है कि सेन्सेंट कोशिकाएं एपोप्टोसिस [16] के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं। यह विशेष रूप से उजागर किया जाना चाहिए कि उन्नत एपोप्टोसिस प्रतिरोध ने विश्लेषिकी विकास [16, 17] का आधार बनाया।

सेन्सेंट कोशिकाओं के बढ़े हुए तनाव प्रतिरोध का पहला उल्लेख 1995 से मिलता है जब रेप्लिकेटिव सेन्सेंट फ़ाइब्रोब्लास्ट्स को नियंत्रण वाले [55] की तुलना में सीरम निकासी के लिए अधिक प्रतिरोधी पाया गया था। इस प्रारंभिक अध्ययन के बाद सीमित संख्या में जांच से संकेत मिलता है कि सेन्सेंट कोशिकाएं यूवी-प्रकाश, स्ट्रोस्पोरिन, टैस्पिगैरगिन और अन्य तनावों के लिए उनके प्रोलिफायरिंग समकक्षों [56, 57] की तुलना में अधिक प्रतिरोधी हैं। हालाँकि, हम पहले से बहुत दूर हैं, जो कि सेन्सेंट कोशिकाओं की सामान्य विशेषता के रूप में बढ़े हुए एपोप्टोसिस प्रतिरोध के सवाल को उठाते हैं। इस प्रकार, 2003 में प्रकाशित समीक्षा में, यह बताया गया था कि "... एपोप्टोसिस प्रतिरोध सेन्सेंट कोशिकाओं की एक सामान्य विशेषता नहीं है, जो कोशिका प्रकार और एपोप्टोटिक उत्तेजनाओं के आधार पर एपोप्टोटिक प्रवण भी हो सकती है ..." [58]। दरअसल, कई डेटा ने नियंत्रण कोशिकाओं [59-61] की तुलना में तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस के लिए सीनेसेंट कोशिकाओं की उच्च संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया। उदाहरण के लिए, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में ऑक्सीडाइज्ड एलडीएल या टीएनएफए द्वारा प्रेरित सेन्सेंट एचयूवीईसी में एपोप्टोसिस का खतरा अधिक था [61]। स्पष्ट विवाद के बावजूद, आखिरी संदेह 2015 में सामने आया और इस तरह सुनाई दिया: "यह संदिग्ध लगता है कि वैश्विक एपोप्टोसिस प्रतिरोध सेनेसेंस कोशिकाओं की एक सामान्य विशेषता है" [62]। उसी वर्ष, विश्लेषण को उजागर करने वाला पहला अध्ययन प्रकाशित हुआ था [16] ]. इस अध्ययन के भीतर, लेखकों ने सेन्सेंट कोशिकाओं में प्रो-सर्वाइवल जीन नेटवर्क की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति पर प्रकाश डाला, जिसने एपोप्टोसिस के लिए उनके बढ़े हुए प्रतिरोध में योगदान दिया। इस प्रकार, शुरू में, सेनोलिटिक्स ने प्रोटीन को लक्षित करने के लिए दवाओं का प्रतिनिधित्व किया जो कि एपोप्टोसिस से सेन्सेंट कोशिकाओं की रक्षा करते थे। आईएनके-एटीटीएसी ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके सेन्स-सेंट कोशिकाओं को हटाने के प्रभावशाली परिणामों के साथ-साथ एनालिटिक्स की खोज ने हेमोलिटिक गतिविधि [16-26,63] के साथ नए कंप-पाउंड की खोज करने वाले अध्ययनों की झड़ी लगा दी। पिछले दो वर्षों में, एनालिटिक्स पर बहुत सारी समीक्षाएं प्रकाशित हुई हैं [13-15,64-66]। हालांकि, 2015 के बाद से सेन्सेंट कोशिकाओं के एपोप्टोसिस प्रतिरोध में वृद्धि बहस का विषय नहीं थी, हालांकि, वास्तव में, इन अध्ययनों के भीतर इसका परीक्षण नहीं किया गया था।

दिलचस्प बात यह है कि जब ouabain-प्रतिरोधी कोशिकाओं (END-MSCs) और ouabain- संवेदनशील कोशिकाओं (A549 और IMR -90) के ट्रांसक्रिपटामिक हस्ताक्षरों की तुलना करते हैं, तो हमने पाया कि END-MSCs की केवल बुढ़ापा नोटिस-सक्षम के अधिग्रहण के साथ थी। एपोप्टोटिक प्रोफाइल। इसके विपरीत, A549 और IMR -90 की बुढ़ापा प्रो-एपोप्टोटिक जीन के महत्वपूर्ण अप-विनियमन की विशेषता है, जिसमें BAD, BAX, BOK, BAK -1, NOXA, और इसी तरह शामिल हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इन परिणामों को अन्य ouabatin-प्रतिरोधी कोशिकाओं DP-MSCs का उपयोग करके बढ़ाया गया था। एक ओर, ये परिणाम hMSCs में ouabain- प्रेरित विश्लेषण की अनुपस्थिति के लिए एक अतिरिक्त आणविक स्पष्टीकरण प्रदान करते हैं, और दूसरी ओर, स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करते हैं कि A459 और IMR -90 जीर्णता के दौरान एपोप्टोसिस के शिकार हो जाते हैं। ध्यान दें, सेन्सेंट आईएमआर में एपोप्टोसिस से संबंधित जीन में ट्रांसक्रिपटामिक परिवर्तन के बारे में हमारा डेटा -90, ग्युरेरो एट अल द्वारा प्रकाशित लेख में प्रस्तुत परिणामों के साथ मेल खाता है, फिर भी चर्चा नहीं की गई है। नियंत्रण और सेन्सेंट आईएमआर के लिए डेटासेट के रूप में { {19}} इस अध्ययन से कोशिकाओं की उत्पत्ति हुई [25]। इस अध्ययन के भीतर प्रदान किए गए हीटमैप के सटीक विश्लेषण से पता चला कि नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में सेन्स-सेंट IMR -90 में BAX, BAD, BAD, BAKI, और NOXA के अपग्रेडेशन का पता चला है। इसके अलावा, बार एट अल। सेन्सेंट आईएमआर -90 में प्रॉपोपोटिक और एंटीपैप्टोटिक जीन के डाउनरेगुलेशन के "अप्रत्याशित" अपग्रेडेशन का भी खुलासा किया, जिसमें उल्लेख किया गया कि सेन्सेंट आईएमआर -90 को एपोप्टोसिस [21] से गुजरना चाहिए।

अपने अवलोकन को मजबूत करने के लिए, हमने नियंत्रण और सीनेसेंट END-MSCs और A459 के प्रतिरोध की तुलना सबसे आम एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण उत्तेजना-ऑक्सीडेटिव तनाव और स्टॉरोस्पोरिन से की। हमारे जैव सूचनात्मक विश्लेषण के परिणामों के अनुसार, पुराने END-MSCs नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कहीं अधिक तनाव-प्रतिरोधी निकले। उसी समय, सीनेसेंट ए549 ने विपरीत प्रतिक्रिया को दोनों प्रकार के तनावपूर्ण उत्तेजनाओं के लिए नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में थोड़ा अधिक संवेदनशील होने का प्रदर्शन किया। इसलिए, कार्डियक ग्लाइकोसाइड्स की सेनोलिटिक क्रिया, कम से कम A549 के लिए, उनके नियंत्रण समकक्षों की तुलना में एपोप्टोसिस के लिए इस मूल के सीनेसेंट कोशिकाओं की पूर्वसूचना द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है, जबकि hMSCs में ouabain- प्रेरित सेनोलिसिस की अनुपस्थिति को वृद्धि द्वारा समझाया जा सकता है। इन कोशिकाओं के जीर्णता के दौरान समग्र एपोप्टोटिक प्रतिरोध। इसके अलावा, एमसीएल द्वारा "एंटीपैप्टोटिक रक्षा" को कमजोर करना -1 अवरोध ने कार्डिएक ग्लाइकोसाइड्स द्वारा प्रेरित सेनोलिसिस के लिए END-MSCs को पूर्वनिर्धारित किया। यद्यपि हम MCL-1 को रोककर END-MSCs के वांछित सेनोलिसिस को प्राप्त करने में सक्षम थे, लेकिन सेनोलिसिस के लिए सेनेसेंट hMSCs को पूर्वनिर्धारित करने के लिए कंक्रीट एंटी-एपोप्टोटिक जीन की अभिव्यक्ति को संशोधित करने की रणनीति बहुत आशाजनक नहीं लगती है, क्योंकि अभिव्यक्ति कंक्रीट विरोधी या प्रो-एपोप्टोटिक जीन की गतिशीलता विभिन्न मूल की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकती है। हमारा मानना ​​​​है कि सेल सेनेसेंस के दौरान तथाकथित "एंटी-एपोप्टोटिक" प्रोफाइल का अधिग्रहण, ठोस एंटी- या प्रो-एपोप्टोटिक जीन में परिवर्तन के बजाय, ouabain प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार है, इस संबंध में पूरी प्रोफ़ाइल को स्विच करने की संभावना हो सकती है अधिक उचित लगते हैं।

प्रभावी विश्लेषण के लिए एक आंतरिक अवरोध होने के लिए hMSCs सेनेसेंस के दौरान हासिल किए गए एपोप्टोसिस-प्रतिरोध को उजागर करने वाले हमारे निष्कर्षों को कार्डियक ग्लाइकोसाइड से कहीं आगे बढ़ाया जा सकता है। विशेष रूप से, सीनेसेंट एचएमएससी को अन्य सेनोलिटिक यौगिकों के लिए प्रतिरोधी पाया गया। दरअसल, मौजूदा सबूतों का विश्लेषण करने पर हमने पाया कि नेविटोक्लेक्स, निकोटिनमाइड राइबोसाइड, डैनाज़ोल गेल्डानामाइसिन, गैनेटेस्पिब, फिसेटिन, बीसीएल-एक्सएल इनहिबिटर, क्वेरसेटिन, एटोमोक्सीर, एंटीमाइसीन ए, फॉक्सो 4- डीआरआई सहित कथित सेनोलिटिक गतिविधि वाले विभिन्न यौगिक। , 17- डीएमएजी सेन्सेंट मानव पेरीडिपोसाइट्स (मानव वसा ऊतक से प्राप्त फ़ाइब्रोब्लास्ट जैसी अग्रदूत कोशिकाओं) और अस्थि मज्जा से एचएमएससी [17-19, 36, 40] को लक्षित हटाने के लिए अप्रभावी हो गया। hMSCs में विश्लेषण की अनुपस्थिति के बारे में डेटा कुछ हद तक विवो चूहों के मॉडल में उपयोग किए गए प्रेरक परिणामों के विपरीत है, जो एनालिटिक्स के प्रणालीगत अनुप्रयोग पर सकारात्मक परिणामों का प्रदर्शन करता है [37, 38]। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया था कि एबीटी 263 का उपयोग कर सेन्सेंट लार ग्रंथि स्टेम कोशिकाओं की निकासी रेडियोथेरेपी-प्रेरित ज़ेरोस्टोमिया [38] को रोक सकती है। इसके अलावा, क्वेरसेटिन द्वारा सेन्सेंट अस्थि मज्जा MSCs को हटाने से अस्थि मज्जा गठन में सुधार हुआ [37]। महत्वपूर्ण रूप से, यह दिखाया गया था कि hMSCs के विपरीत सीनेसेंट चूहों और चूहे MSCs विश्लेषिकी के लिए उत्तरदायी हैं। उदाहरण के लिए, क्वेरसेटिन, क्वेरसेटिन-टिन-डासैटिनिब और ABT263 ने सेन्सेंट माउस MSCs को महत्वपूर्ण रूप से हटा दिया [16]। साथ ही, 17-डीएमएजी को प्रोजेरॉइड माउस मॉडल [19] में सीनेसेंट बीएमएमएससी को बहुत कम करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, इन अध्ययनों के भीतर वर्णित विभिन्न अंगों और प्रणालियों के कामकाज में सुधार सेन्सेंट माउस स्टेम कोशिकाओं के लक्षित हटाने का परिणाम होने का अनुमान लगाया गया है। हालाँकि, इन विश्लेषणों ने अभी तक hMSCs का कोई कार्यात्मक कायाकल्प नहीं दिखाया है। विश्लेषण के प्रति चूहों और मानव MSCs की जवाबदेही के बीच इस तरह के एक स्पष्ट अंतर से पता चलता है कि सेनोलिटिक उपचारों से सुधार प्रजातियों में संरक्षित नहीं किया जा सकता है। सेनो-लिटिक यौगिक UBX0101 के लिए प्राप्त परिणामों को अंतिम कथन की पुष्टि करने वाला एक अच्छा उदाहरण माना जा सकता है। इस एजेंट को ऑस्टियोआर्थराइटिस के माउस मॉडल में सेन्सेंट कोशिकाओं को साफ़ करने के लिए दिखाया गया है, जिसने दर्द को काफी कम कर दिया और क्षतिग्रस्त उपास्थि की मरम्मत को बढ़ावा दिया [20]। दुर्भाग्य से, UBX0101 चरण II नैदानिक ​​परीक्षणों [67-69] के दौरान मध्यम-से-सेवा दर्दनाक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रोगियों में रोग की प्रगति और दर्द को कम करने में विफल रहा। सेनोलिटिक संयोजन डायसैटिनिब-क्वेर्स-टिन [68] के बारे में भी इसी तरह की चिंताएं उठाई जाती हैं।

संक्षेप में, प्राप्त आंकड़ों से दो महत्वपूर्ण निष्कर्ष निकलते हैं। पूर्व ने प्रदर्शित किया कि कार्डियक ग्लाइकोसाइड सेन्सेंट hMSC को साफ़ करने में असमर्थ हैं। विश्लेषण की अनुपस्थिति को प्रभावी K प्लस सेलुलर आयात और सेन्सेंट hMSCs में एपोप्टोसिस प्रतिरोध में वृद्धि द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है। उत्तरार्द्ध अधिक मौलिक है और यह बताता है कि एपोप्टोसिस प्रतिरोध सेन्सेंट कोशिकाओं की एक सामान्य विशेषता नहीं है, क्योंकि जीर्णता के दौरान कुछ कोशिकाएं 'एपोप्टोसिस-प्रतिरोधी' फेनोटाइप प्राप्त करती हैं, जबकि अन्य नहीं करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, केवल एपोप्टोसिस-प्रवण सीनेसेंट A549 कोशिकाओं को कार्डियक ग्लाइकोसाइड द्वारा प्रभावी रूप से साफ किया जा सकता है। उसके आधार पर हम अनुमान लगा सकते हैं कि अन्य सेनोलिटिक दृष्टिकोणों की प्रभावशीलता इस बात पर निर्भर हो सकती है कि क्या सेन्सेंट कोशिकाएं अपने प्रोलिफ़ेरिंग समकक्षों की तुलना में वास्तव में एपोप्टोसिस-प्रतिरोधी हैं। अंत में, हालांकि 'एनालिटिक्स' एक गर्म विषय है और बहुत सारे प्रेरक डेटा प्रकाशित किए जाते हैं, विश्लेषण की प्रभावशीलता के बारे में निष्कर्ष सावधानी के साथ लिया जाना चाहिए क्योंकि सेल सेनेसेन्स की विविधता अभी भी एक 'पहेली' बनी हुई है।

यह लेख सेलुलर और आणविक जीवन विज्ञान (2021) 78:7757-7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x से निकाला गया है।