सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड अस्थि अवशोषण को कैसे प्रभावित करता है?

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सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड एटेनुएट्सओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और हड्डी के पुनर्जीवन को रोककर RANKL सिग्नलिंग और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के माध्यम से

देझी सांग एट अल

ऑस्टियोपोरोसिस एक चयापचय रोग है जो ऑस्टियोपीनिया और बोनमाइक्रोस्ट्रक्चरल बिगड़ने की विशेषता है। ओस्टियोक्लास्ट प्राथमिक प्रभावकारी कोशिकाएं हैं जो हड्डी के मैट्रिक्स को नीचा दिखाती हैं और उनके असामान्य कार्य से ऑस्टियोपोरोसिस का विकास होता है। सेलुलर चयापचय के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) संचय ऑस्टियोक्लास्ट प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है, इसलिए, ऑस्टियोपोरोसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है।सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा(सीडीपी) में एंटीट्यूमर है,सूजनरोधी, और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि। हालांकि, सीडीपीओन ओस्टियोक्लास्ट का प्रभाव स्पष्ट नहीं है। इस अध्ययन में, सीडीपी को प्रदर्शित करने के लिए टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और वेस्टर्नब्लॉट विश्लेषण का उपयोग किया गया था।(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन को रोकता है। इसके अलावा, सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)Ctsk, Mmp9, और Acp5 सहित ओस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को भी बाधित किया, और परमाणु कारक B (RANK) अभिव्यक्ति के रिसेप्टर एक्टिवेटर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। यंत्रवत विश्लेषण से पता चला कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्ट में RANKL की मध्यस्थता वाले ROS उत्पादन को कम करने के लिए एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है और सक्रिय टी कोशिकाओं और माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे सक्रियण के परमाणु कारक को रोकता है। ये परिणाम बताते हैं कि सीडीपी अत्यधिक ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि के कारण होने वाले ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज के लिए एक उम्मीदवार दवा का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

कीवर्डअस्थि अवशोषण,सिस्टांचेडेजर्टिकोलापॉलीसेकेराइड, एमएपीके, ऑस्टियोक्लास्ट, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां

1|परिचय

अस्थि निर्माण के बीच संतुलन, ऑस्टियोब्लास्ट द्वारा मध्यस्थता, और अस्थि पुनर्जीवन, अस्थिकोरक द्वारा मध्यस्थता, अस्थि चयापचय होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (मैनोलागास, 2000; ज़ुएट अल।, 2018)। जब हड्डी का पुनर्जीवन हड्डी के गठन से अधिक हो जाता है, तो ऑस्टियोपोरोसिस होता है, जो कम हड्डी द्रव्यमान और हड्डी की सूक्ष्म संरचना क्षति (इकेडा, 2008) की विशेषता है। ऑस्टियोपोरोसिस बुजुर्ग व्यक्तियों और रजोनिवृत्ति के बाद की महिलाओं में एक आम बीमारी है और इसके रोगजनन को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है (कूपर एंड मेल्टन, 1992)। एस्ट्रोजन की कमी ऑस्टियोपोरोसिस (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013) का एक प्राथमिक कारण है। इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को परमाणु कारक (बी लिगैंड (आरएएनकेएल) के रिसेप्टर उत्प्रेरक द्वारा प्रेरित किया जा सकता है और ऑस्टियोक्लास्ट गठन (यिप एट अल।, 2005) से जुड़ा हुआ है, और इस प्रकार ऑस्टियोपोरोसिस के विकास में योगदान दे सकता है (मैनोलागास, 2010)। कुछ अध्ययनों में पाया गया है कि Nrf2-एंटीऑक्सीडेंट की कमी से ROS का स्तर बढ़ जाता है और RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013) को बढ़ावा देता है। इसलिए, ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन के दौरान आरओएस उत्पादन को कम करने का मूल्यांकन ऑस्टियोपोरोसिस के उपचार के लिए एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में किया जाना चाहिए।

ओस्टियोक्लास्ट मोनोसाइट या मैक्रोफेजहेमेटोपोएटिक वंश से प्राप्त होते हैं और एकमात्र बहुसंस्कृति कोशिकाएं हैं जो अस्थि पुनर्जीवन (टीटेलबाम, 2000) करती हैं। इसलिए, अस्थि चयापचय रोगों (लोरेंजो, 2017) के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने में ओस्टियोक्लास्ट के गठन से जुड़े शोध का बहुत महत्व है। ऑस्टियोब्लास्ट्स और सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम‐सीएसएफ) और आरएएनसीएल, महत्वपूर्ण साइटोकिन्स हैं जो ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस (किम एंड किम, 2016; टीटेलबाम एंड रॉस, 2003) को नियंत्रित करते हैं। RANKL सक्रिय T कोशिकाओं (NFATc1) के परमाणु कारक की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जो ऑस्टियोक्लास्ट गठन के दौरान सक्रिय एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक है (इशिदेट अल।, 2002)। सक्रिय NFATc1 ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन जैसे टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (TRAcP) और कैथेप्सिन K (CTSK) की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है जो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन (बाल्कन एट अल।, 2009; क्रोटिएट अल।, 2008) को नियंत्रित करता है।

सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा(सीडीपी) के मांसल तनों से पृथक किया जाता हैसिस्टांचेऔर प्रतिरक्षा विनियमन, एंटीट्यूमर, एंटीएजिंग, और अन्य औषधीय प्रभाव (गुओ एट अल।, 2016; जिया, गुआन, गुओ, और डू, 2012) के पास है। सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)माउसमाइक्रोग्लियल कोशिकाओं (बीवी-2 कोशिकाओं; नान एट अल।, 2013) में ऑनलिपोपॉलीसेकेराइड-प्रेरित नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) उत्पादन पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ा। इसके अलावा, एफेनिलेथेनॉइड-समृद्ध अर्क (ईसीडी)सिस्टांचेमांसपेशियों की क्षति को कम करके, लैक्टिक एसिड संचय में देरी, और ऊर्जा भंडारण (कै एट अल।, 2010) में सुधार करके चूहों की तैराकी क्षमता को बढ़ाया। हालांकि, ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन और गतिविधि पर सीडीपी का प्रभाव अज्ञात रहता है।

इस अध्ययन में, हमने दिखाया कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन और अस्थि पुनर्जीवन को रोकता है। अंतर्निहित तंत्र यह था कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)आरओएस उत्पादन को कम करने के लिए एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, और फिर आरएएनसीएल-सक्रिय एनएफएटी और माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके)-सिग्नलिंग कैस्केड को दबा देता है। ये परिणाम बताते हैं कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)अत्यधिक ऑस्टियोक्लास्टिक हड्डी के पुनर्जीवन के कारण होने वाले ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

2|सामग्री और तरीके

2.1|सामग्री

सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)(शुद्धता> 98 प्रतिशत) Solarbio (बीजिंग, चीन) से खरीदा गया था और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1 मिमी के स्टॉक एकाग्रता पर तैयार किया गया था। एंटीबॉडी c‐Fos के लिए विशिष्ट हैं, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, फॉस्फोराइलेटेड (p) ‐ERK, p‐p38, p‐JNK, और ‐actin सांता से प्राप्त किए गए थे। क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सैन जोस, सीए)। V‐ATPase d2 के लिए एंटीबॉडी का उत्पादन पहले वर्णित (एच। फेंग एट अल।, 2009) के रूप में किया गया था। 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल)-5-(3-कार्बोक्सिमेथोक्सीफेनिल)-2-(4-सल्फोफेनिल)-2H-टेट्राजोलियम (एमटीएस) और लूसिफ़ेरेज़ परख प्रणाली क्रोमेगा (सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) से प्राप्त की गई थी। रिकॉम्बिनेंट M‐CSF को R&D सिस्टम्स (मिनियापोलिस, MN) से खरीदा गया था। पुनः संयोजक GST-rRANKL प्रोटीन को पहले वर्णित (जू एट अल।, 2000) के रूप में व्यक्त और शुद्ध किया गया था।

2.2|कोश पालन

RAW264.7 कोशिकाएं (माउस मैक्रोफेज कोशिकाएं) अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी, मानस, वीए) से प्राप्त की गईं और संशोधित न्यूनतम आवश्यक माध्यम (थर्मो फिशरसाइंटिफिक, स्कोर्सबी, ऑस्ट्रेलिया) में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीयरम, 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक। , 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 यूजी/एमएल ऑफ स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्ण माध्यम)। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स (BMMs) को 6-सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों से अलग किया गया था, जिन्हें पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया विश्वविद्यालय (RA/3/100/1244) की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार निष्क्रिय किया गया था। लंबी हड्डियां थीं नरम ऊतकों से मुक्त विच्छेदित और अस्थि मज्जा को फीमर और टिबिया से निकाल दिया गया था, जिसे तब M‐CSF (50 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में एक पूर्ण माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था।

2.3|ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस परख

बीएमएम को 96-वेल कल्चर प्लेट्स में 6 × 103 सेल प्रति कुएं के घनत्व पर चढ़ाया गया और एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) और जीएसटी-आरआरएएनसीएल (100 एनजी / एमएल) युक्त एक पूर्ण माध्यम के साथ इलाज किया गया। सीडीपी की बदलती सांद्रता(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>तीन नाभिक) की पहचान ऑस्टियोक्लास्ट के रूप में की गई थी।

2.4|साइटोटोक्सिसिटी परख

बीएमएम को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 6 × 103 कोशिकाओं प्रति कुएं और बचे हुए रात में पालन करने के लिए रखा गया था। अगले दिन, कोशिकाओं को सीडीपी . की अलग-अलग सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा). एक और 48 घंटे के बाद, एमटीएस समाधान (20 μl / अच्छी तरह से) जोड़ा गया और 2 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन किया गया। अवशोषक 490 एनएम एक माइक्रोप्लेट रीडर (मल्टीस्कैनस्पेक्ट्रम; थर्मो लैबसिस्टम्स, चान्तिली, वीए।

2.5|इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला हो जाना

BMM को रातोंरात M‐CSF (50 एनजी / एमएल) की उपस्थिति में 6 × 103 कोशिकाओं प्रति कुएं के घनत्व पर रखा गया था। कोशिकाओं को तब M-CSFand GST-rRANKL (100 एनजी / एमएल) से तब तक उत्तेजित किया गया जब तक कि परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट नहीं बन गए। थियोस्टियोक्लास्ट्स को तब सीडीपी की अलग-अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ फिक्सिंग से पहले 48 घंटे के लिए, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100-पीबीएस के साथ पारगम्य, और पीबीएस में 3 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ अवरुद्ध। तैयार कोशिकाओं को 45 मिनट के लिए रोडामाइन-संयुग्मित फैलोलाइडिन के साथ जोड़ा गया था। F-actin के लिए डार्क टू स्टेन। कोशिकाओं को तब पीबीएस से धोया गया था, नाभिक को 4-6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) के साथ काउंटर किया गया था, और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए कवरस्लिप्स के साथ लगाया गया था।

2.6|हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन परख

ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि को मापने के लिए छह-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित प्लेटों (बीडी बायोकोट; थर्मोफिशर साइंटिफिक) पर सुसंस्कृत बीएमएम (1 × 105 सेल प्रति कुएं) को जीएसटी-आरआरएएनसीएल (100 एनजी / एमएल) और एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया था। ) जब तक परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट उत्पन्न नहीं हुए (झोउ एट अल।, 2016)। कोशिकाओं को तब प्लेट्यूजिंग सेल पृथक्करण समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच) से धीरे से अलग कर दिया गया था और समान संख्या में परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट को अलग-अलग कुओं में इनहाइड्रॉक्सीपैटाइट-लेपित 96-वेल प्लेट्स (कॉर्निंग ओस्टियोसे, कॉर्निंग, एनवाई) पर रखा गया था। परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट को CDP के साथ या बिना GST‐rRANKL और M‐CSF युक्त माध्यम में इनक्यूबेट किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)संकेतित सांद्रता पर। 48 घंटे के बाद, आधे कुओं को TRAcP गतिविधि के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकली दाग ​​दिया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है, प्रति कुएं में बहुराष्ट्रीय कोशिकाओं की संख्या का आकलन करें। शेष कुओं को 10 मिनट के लिए प्रक्षालित किया गया ताकि कोशिकाओं को हटाया जा सके और पुनर्जीवन क्षेत्रों की अनुमति दी जा सके। पुनर्जीवित क्षेत्रों को मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत फोटो खिंचवाया गया था और इमेज जे सॉफ्टवेयर (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी) का उपयोग ओस्टियोक्लास्ट्स द्वारा पुनर्वितरित हाइड्रोक्सीपाटाइट सतह के प्रतिशत क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए किया गया था।

2.7|लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर assays

NFATc1 ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेशन की जांच करने के लिए, RAW264.7 कोशिकाओं को NFATc1-उत्तरदायी ल्यूसिफरेज रिपोर्टर निर्माण (चेंग एट अल।, 2018; वैन डेर क्रान एट अल।, 2013) के साथ सख्ती से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 1 के घनत्व पर 48-अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था। .5 × 105 कोशिकाओं प्रति कुएं और सीडीपी . के विभिन्न सांद्रता के साथ ढोंग किया(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)1 घंटे के लिए प्रीट्रीटमेंट के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए GST-rRANKL (100 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया था, और निर्माता के प्रोटोकॉल (Promega) के अनुसार ल्यूसिफरेज रिपोर्टर परख प्रणाली का उपयोग करके ल्यूसिफरेज गतिविधि को मापा गया था।

2.8|मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेनरिएक्शन (आरटी-पीसीआर) विश्लेषण

निर्माता के प्रोटोकॉल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के अनुसार ट्राईजोल अभिकर्मक का उपयोग करके कुल आरएनए को कोशिकाओं से अलग किया गया था। पूरक डीएनए को 1 कुरूप आरएनए टेम्पलेट और ओलिगो-डीटी प्राइमरों के साथ मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके विशिष्ट अनुक्रमों के पॉलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया प्रवर्धन का प्रदर्शन किया गया था: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री, इसके बाद 40 एस के लिए 94 डिग्री के 30 चक्र, 40 एस के लिए 60 डिग्री, और 40 एस के लिए 72 डिग्री, और पर 5 मिनट का अंतिम विस्तार चरण 72 डिग्री। विशिष्ट प्राइमरों की विस्तृत जानकारी तालिका 1 में दिखाई गई है। सापेक्ष मैसेंजर आरएनए स्तरों की गणना हाउसकीपिंग जीन एचएमबीएस की अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण द्वारा की गई थी।

2.9|वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

BMM को छह-अच्छी तरह से प्लेटों में M-CSF के साथ पूर्ण माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था और बताए गए समय के लिए GST-rRANKL (100 एनजी / एमएल) से प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को रेडियोइम्यूनोप्रेजर्वेशन लिसीज़ बफर में लाइस किया गया और प्रोटीन को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल किया गया और पॉली (विनाइलिडीन फ्लोराइड) झिल्ली (जीई हेल्थकेयर, सिल्वरवाटर, ऑस्ट्रेलिया) में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्लियों को 1 घंटे के लिए 5 प्रतिशत स्किम दूध में अवरुद्ध कर दिया गया और फिर 4 डिग्री पर रात भर जेंटलशेकिंग के साथ विभिन्न विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच की गई। झिल्ली को धोया गया और बाद में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया। एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशीलता को तब बढ़ाया गया रसायन विज्ञान अभिकर्मक (एमर्सहम फार्माशिया बायोटेक, पिस्काटावे, एनजे) के साथ पाया गया और एक छवि-मात्रा एलएएस 4000 (जीई हेल्थकेयर) के साथ देखा गया।

2.10|इंट्रासेल्युलर आरओएस डिटेक्शन

इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का पता 2′,7-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट सेलुलर आरओएस डिटेक्शन परख किट (एबकैम, मेलबर्न, ऑस्ट्रेलिया) का उपयोग करके लगाया गया था। बीएमएम (5 × 103 सेल प्रति कुएं) 96-वेलप्लेट्स में सुसंस्कृत थे और 72 घंटे के लिए RANKL (100 एनजी / एमएल), एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल), और सीडीपी के साथ इलाज किया गया था। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर 2′,7-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट का उपयोग करके मापा गया था, जो आरओएस की उपस्थिति में फ्लोरोसेंटडीसीएफ में ऑक्सीकरण करता है। कोशिकाओं को हांक के बफर में धोया गया और DCFH‐DA के 10 माइक्रोन के साथ 30 मिनट के लिए अंधेरे में ऊष्मायन किया गया। छवियों को confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।

2.11|सांख्यिकीय आंकड़े

सभी डेटा कम से कम तीन प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया गया हो। डेटा को माध्य ± SD के रूप में व्यक्त किया जाता है। छात्र-न्यूमैन-केल्सपोस्ट हॉक परीक्षणों के बाद विचरण के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग परिणामों के बीच अंतर के महत्व को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसमें p < 0.05="" को="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="">

3|परिणाम

3.1|CDP RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्ट फ्यूजन को रोकता है

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टफॉर्मेशन को दबा सकता है, हमने सबसे पहले माउस BMM (लियू एट अल।, 2013; सॉन्ग एट अल।, 2016) का उपयोग करके ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस परख किया। CDP की बढ़ती सांद्रता के साथ 5 दिनों के लिए BMM को RANKL और M‐CSF के साथ व्यवहार किया गया। CDP ने TRAcP- धनात्मक बहुसंस्कृति कोशिकाओं की संख्या कम कर दी जब CDP . की सांद्रता(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)5 माइक्रोन या उच्चतर तक पहुंच गया (चित्र 1ए,बी)। सीडीपी का मूल्यांकन करने के लिए(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)विषाक्तता और पुष्टि करें कि ये परिणाम कोशिका मृत्यु या संख्या का प्रतिबिंब नहीं थे, हमने एक एमटीएस परख की। BMM को RANKL और M‐CSF के साथ 48 घंटे के लिए CDP की अलग-अलग खुराक के साथ इलाज किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा). 15 µMor कम (चित्र 1c) की सांद्रता पर BMM प्रसार पर CDP का कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

सीडीपी के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्ट संलयन पर, ऑस्टियोक्लास्ट को RANKL और M‐CSF उपचार के साथ, CDP की अलग-अलग खुराक के साथ या बिना प्रेरित किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा). ओस्टियोक्लास्ट्स को रोडामाइन-फालोइडिन और डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था ताकि प्रति ऑस्टियोक्लास्ट (चित्रा 2 ए) में नाभिक की संख्या का आकलन किया जा सके। ओस्टियोक्लास्ट संख्या और न्यूक्लियर ऑस्टियोक्लास्ट की औसत संख्या सीडीपी के बाद घट गई।(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)उपचार (5-10 µ एम; चित्रा 2बी, सी)। इसलिए, सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)खुराक पर निर्भर तरीके से RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्ट फ्यूजन पर निरोधात्मक प्रभाव पड़ा।

3.2|सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टिकहाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन गतिविधि को क्षीण करता है

CDP . के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन परख किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्ट समारोह (चित्रा 3 ए) पर। 24 घंटे के बाद, नियंत्रण समूहों (चित्रा 3 बी, सी) की तुलना में 5 और 10 माइक्रोन सीडीपी के साथ उपचार द्वारा हाइड्रॉक्सीपैटाइट पुनर्जीवन क्षेत्र में काफी कमी आई थी, जबकि प्रति कुएं ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या में बदलाव नहीं हुआ था। ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि सी.डी.पी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)बिना किसी साइटोटोक्सिक प्रभाव के ऑस्टियोक्लास्ट गठन और ऑस्टियोक्लेस्ट्रेसोरेशन गतिविधि दोनों पर मजबूत निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है।

3.3|सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीनएक्सप्रेशन को रोकता है

सीडीपी के निरोधात्मक प्रभावों की और जांच करने के लिए(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और ऑस्टियोक्लास्टिक बोन रिसोर्प्शन पर, बीएमएम को सीडीपी की अलग-अलग सांद्रता के साथ 5 दिनों के लिए RANKL और M‐CSF के साथ इलाज किया गया था।(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा).RT-PCR तब ऑस्टियोक्लास्टमार्कर जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। Nfatc1 की अभिव्यक्ति, ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक, CDP . द्वारा बाधित किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)खुराक पर निर्भर तरीके से (चित्र 4a)। इसके अलावा, सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)(5 और 10 )M) ने Mmp9, Ctsk, और Acp5 (चित्र 4b-d) सहित अस्थि पुनर्जीवन-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को कम कर दिया।

3.4|CDP NFATc1 गतिविधि और डाउनस्ट्रीम प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा देता है

सीडीपी के प्रभाव की जांच करने के लिए(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL- प्रेरित NFATc1 गतिविधि पर, aluciferase रिपोर्टर परख की गई। सीडीपी के साथ उपचार(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा), 5 माइक्रोन और उच्चतर की सांद्रता, महत्वपूर्ण रूप से RANKL- प्रेरित NFATc1 गतिविधि (चित्र 5a) को बाधित करती है। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)3 और 5 दिनों (चित्रा 5 बी) के लिए RANKL और M‐CSF के साथ इलाज किए गए BMM में NFATc1 और c‐Fos की महत्वपूर्ण रूप से दबी हुई प्रोटीन अभिव्यक्ति। इसके अलावा, ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन-संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति, जैसे V‐ATPase‐d2 और CTSK, को CDP की उपस्थिति में डाउनग्रेड किया गया था।(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)नियंत्रण समूहों की तुलना हालाँकि, CDP का RANK अभिव्यक्ति (चित्र 5b) पर कोई प्रभाव नहीं था।

3.5|CDP RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान ROS उत्पादन को परिमार्जन करने के लिए एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है

सीडीपी पर निर्भर ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस निषेध के अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए, बीएमएम को पीबीएस या सीडीपी के साथ RANKL (100 एनजी / एमएल) और एम-सीएसएफ (50 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया था।(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)72 घंटे के लिए RANKL द्वारा प्रेरित इंट्रासेल्युलर ROS उत्पादन पर CDP के प्रभाव की हमने जांच की। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर आरएएनसीएल उपचार द्वारा बढ़ाए गए थे, जिसे सीडीपी (5 और 10 माइक्रोन; चित्रा 6 ए) द्वारा देखा गया था। खुराक पर निर्भर तरीके (चित्रा 6 बी, सी) में सीडीपी उपचार द्वारा आरओएस-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या और आरओएस धुंधला की तीव्रता दोनों को कम किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)बीएमएम में इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (NOS2) की अभिव्यक्ति को दबाते हुए थिओरेडॉक्सिन (TRX1) और ग्लूटाथियोन रिडक्टेस (GSR) अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया, जिसे 3 दिनों (चित्रा 6d) के लिए RANKL और M‐CSF के साथ इलाज किया गया था।

आगे पता लगाने के लिए कि क्या सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)आरओएस उत्पादन को कम करके ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव को दबा दिया, फिर हमने कोशिकाओं में उच्च आरओएस स्थिति की नकल करने के लिए बीएमएम को पेरोक्साइड (10 माइक्रोन) के साथ इलाज किया। BMM को RANKL और M-CSF द्वारा 3 दिनों के लिए प्रेरित किया गया और वेस्टर्नब्लॉट विश्लेषण और RT-PCR के परिणामों से पता चला कि पेरोक्साइड ने NFATc1 और c-Fos अभिव्यक्ति को नियंत्रण समूहों की तुलना में बढ़ावा दिया। चित्र 5 में परिणामों के अनुरूप, NFATc1 और c‐Fos की अभिव्यक्ति को CDP द्वारा दबा दिया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)जबकि पेरोक्साइड ने सीडीपी (चित्रा 6e, एफ) के निरोधात्मक प्रभाव को बचाया। इन आंकड़ों ने संकेत दिया कि CDP ने ROS उत्पादन को कम करके NFATc1 और c‐Fos की अभिव्यक्ति को दबा दिया।

3.6|सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान MAPK मार्गों का दमन करता है

इसके बाद, हमने सीडीपी के प्रभाव की जांच की(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL की मध्यस्थता TRAF6 अभिव्यक्ति और MAPK मार्ग सक्रियण पर उपचार। 2 घंटे के लिए ऊष्मायन सीरम मुक्त माध्यम के बाद, BMM को RANKL से प्रेरित किया गया, बिना CDP के, 60 मिनट के लिए। सीडीपी (10 माइक्रोन) के साथ उत्तेजना का TRAF6 अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और 10 और 20 मिनट (चित्र 7) पर JNK2 और ERK1 / 2 के फॉस्फोराइलेशन को देखा। इसके अतिरिक्त, p38 फॉस्फोराइलेशन को CDP . द्वारा महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)नियंत्रण समूहों की तुलना में 60 मिनट का उपचार (चित्र 7)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्ट गठन और गतिविधि पर इसके निरोधात्मक प्रभाव के अनुरूप, RANKL- प्रेरित MAPK सिग्नलिंग मार्ग को दबा देता है।

4|बहस

"रेगिस्तान जिनसेंग" के रूप में जाना जाने वाला सिस्टांचे ने हाल ही में प्रतिरक्षा को संशोधित करने और उम्र बढ़ने और ऑक्सीडेटिव तनाव (जिया एट अल।, 2012; स्नितनिकोवाएट अल।, 2012) के दौरान सुरक्षात्मक रूप से कार्य करने की क्षमता के लिए बहुत ध्यान आकर्षित किया है। फेनिलप्रोपेनाइड-प्रतिस्थापित ग्लाइकोसाइड, सिस्टैंच के प्रमुख सक्रिय घटक, मैक्रोफेज (आह, चाए, चिन, और किम, 2017) में एनओएक्टिविटी को बाधित करने के लिए दिखाए गए हैं। इसके साथसिस्टांचेइस्किमिया के बाद रीपरफ्यूज्ड मायोकार्डियम में कम ऑक्सीडेटिव तनाव को निकालें और कार्डियोप्रोटेक्शन (यू, ली, और काओ, 2016) के लिए अग्रणी एपोप्टोटिक मार्गों के निषेध में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। Cistanche के एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में,CDP(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)औषधीय कार्यों की एक किस्म है। हमारे वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि CDP ने RANKL- सक्रिय ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और सक्रियण को ROS उत्पादन के साथ-साथ NFAT और MAPK सक्रियण को भी दबा दिया।

एक एसिड फॉस्फेट के रूप में, टीआरएसीपी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मौजूद है और ऑस्टियोक्लास्ट और वायुकोशीय मैक्रोफेज (स्निप्स, लैम, डोड, ग्रे, और कोहेन, 1986) में प्रचुर मात्रा में है। TRAcP ऑस्टियोक्लास्ट का एक विशिष्ट एंजाइम है और इसकी अभिव्यक्ति ऑस्टियोक्लास्ट फ़ंक्शन से निकटता से संबंधित है, जिसे ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि और हड्डी पुनर्जीवन का एक संकेतक माना जाता है (मिंकिन, 1982)। आंतरिक अध्ययन, सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)TRAcP पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को रोकता है, यह दर्शाता है कि RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को CDP द्वारा अवरुद्ध किया गया था(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा). ऑस्टियोक्लास्ट द्वारा हड्डी के मैट्रिक्स का क्षरण कैथेप्सिन के (सीटीएसके) और एमएमपी (ग्रुबर, 2015) पर निर्भर करता है। यहाँ, CDP ने Mmp9, Ctsk, और Acp5 जैसे ऑस्टियोक्लास्ट कार्यात्मक जीनों की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया।

ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन और कार्य कई सिग्नलिंग मार्ग (बॉयल, सिमोनेट, और लेसी, 2003) द्वारा नियंत्रित होते हैं। RANK से जुड़ने के बाद, RANKL NFATc1 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए एडेप्टर प्रोटीन TRAF6 की भर्ती करता है, जो ऑस्टियोक्लास्ट गठन के लिए एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन कारक है, जो TRAcP और CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al।, 2002) सहित ऑस्टियोक्लास्ट-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है। इस अध्ययन में हमने पाया कि सी.डी.पी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ओस्टियोक्लास्ट में RANK और TRAF6 अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। हालाँकि, CDP(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)BMM के ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान RANKL- प्रेरित NFATc1 सक्रियण को बाधित किया। इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया था कि इलेक्ट्रॉनों को वितरित करने की प्रक्रिया में माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा उत्पादित आरओएस, ओस्टियोक्लास्ट के प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है और हड्डी मैट्रिक्स गिरावट को नियंत्रित करता है (हा एट अल।, 2004)। हाल के एक अध्ययन में पाया गया कि RANKL ने Bach1 परमाणु आयात को प्रेरित किया और Nrf2 की मध्यस्थता वाले एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम उत्पादन को कम किया, जिससे चूहों में इंट्रासेल्युलर ROS अभिव्यक्ति और ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस में वृद्धि हुई (कंजाकी एट अल।, 2017)। इसके अलावा, होमोसिस्टीन एन्हांस्ड ऑस्टियोक्लास्ट गठन और गतिविधि (कोह एट अल।, 2006) द्वारा इंट्रासेल्युलर आरओएस पीढ़ी में वृद्धि हुई। हमारे अध्ययन में पाया गया कि CDP ने NOS2 अभिव्यक्ति को बाधित करके और TRX1 और ग्लूटाथियोन रिडक्टेस जैसे एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देकर ऑस्टियोक्लास्ट में ROS संचय को कम कर दिया। जब हमने इंट्रासेल्युलर ROS संचय को बढ़ाने के लिए पेरोक्साइड के साथ BMM का इलाज किया, तो परिणाम जो ROS में सुधार कर सकते थे NFATc1 अभिव्यक्ति से पता चला कि ROS अपस्ट्रीम था NFATc1.हमने यह भी पाया कि पेरोक्साइड ने CDPon NFATc1 अभिव्यक्ति के निरोधात्मक प्रभाव को बचाया। इसलिए, हमारा डेटा बताता है कि CDP NFATc1 अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए ROS संचय को दबाता है, फिर ऑस्टियोक्लास्ट के गठन और कार्य को रोकता है।

ईआरके, जेएनके, और पी38 एमएपीके परिवार से संबंधित हैं, जो ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव (सेगर एंड क्रेब्स, 1995) के नियमन में भी शामिल है। आरएएनकेएल ईआरके, जेएनके, और पी38 (मिजुकामी एट अल।) के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाकर एमएपीके मार्ग को सक्रिय करता है। 2002)। हमने दिखाया कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)MAPK मार्ग में प्रमुख प्रोटीनों के RANKL की मध्यस्थता वाले फॉस्फोराइलेशन को दबा दिया, जिससे ऑस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति पर CDP के निरोधात्मक प्रभाव में योगदान हुआ। हमारे ज्ञान के लिए, यह पहला अध्ययन है जो सीडीपी के निरोधात्मक प्रभाव दिखा रहा है(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)इन विट्रो में सीडीपी की कार्रवाई के उपन्यास तंत्र का प्रतिनिधित्व करते हुए आरओएस उत्पादन, एनएफएटी, और एमएपीके सक्रियण पर।

संक्षेप में, हमने दिखाया कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और हाइड्रॉक्सीपैटाइट रिसोर्प्शन को क्षीण करता है, और सीटीस्क, एमएमपी9, और एसीपी5 सहित ओस्टियोक्लास्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति। सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL की मध्यस्थता वाले ROS उत्पादन, साथ ही NFAT और MAPK सक्रियण (चित्र 8) को दबाने में सक्षम था। सामूहिक रूप से, हमारे परिणाम बताते हैं कि सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)आरओएस ओवरप्रोडक्शन के साथ ऑस्टियोक्लास्ट से संबंधित स्थितियों के उपचार के लिए एक उम्मीदवार दवा का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

चित्र 8 सीडीपी का योजनाबद्ध आरेख(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)अस्थिकोरक विभेदन में कार्य करता है। सीडीपी(सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा)RANKL- प्रेरित ROS उत्पादन, साथ ही NFATc1 और MAPK सक्रियण को दबाता है, इसलिए ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस को रोकता है। सीडीपी,सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्करा; एमएपीके, मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज; NFATc1, सक्रिय टी सेल का परमाणु कारक; RANKL, न्यूक्लियर फैक्टर Bligand के रिसेप्टर एक्टिवेटर; आरओएस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां [रंग की आकृति को wileyonlinelibrary.com पर देखा जा सकता है]

आभार

इस अध्ययन को चीन के नेचर साइंस फाउंडेशन (81572164), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख प्रौद्योगिकी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017वाईएफसी1103300), गुआंग्शी प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2016जीएक्सएनएसएफएए380295), और गुआंग्शी प्रांत के विश्वविद्यालय विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान परियोजना (केवाई2015वाईबी054) द्वारा समर्थित किया गया था। ) यह गुआंग्शी वैज्ञानिक अनुसंधान और प्रौद्योगिकी विकास योजना परियोजना (जीकेजी 1334903, 1598013-15), पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया चिकित्सा और स्वास्थ्य अनुसंधान अवसंरचना कोष, गठिया ऑस्ट्रेलिया फाउंडेशन, पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया विश्वविद्यालय (यूडब्ल्यूए) अनुसंधान सहयोग पुरस्कार, और ऑस्ट्रेलियाई स्वास्थ्य और चिकित्सा द्वारा भी समर्थित है। अनुसंधान परिषद (NHMRC, संख्या 1107828 और 1027932)।

हितों का टकराव

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है

से: 'सिस्टांचेडेजर्टिकोलाबहुशर्कराDezhi Song et al द्वारा RANKL सिग्नलिंग और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को बाधित करके ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और हड्डी के पुनर्जीवन को दर्शाता है।

---©2018 विली पीरियोडिकल्स, इंक. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp जे सेल फिजियोल। 2018; 233: 9674-9684