लीवर कैंसर से प्रभावी ढंग से कैसे लड़ें? समस्या को हल करने में मदद करने के लिए सिस्टैंच डेजर्टिकोला सक्रिय संघटक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड

सार

पार्श्वभूमि:सिस्टैंच ट्यूबुलोसा(शेंक) आर। वाइट एक पारंपरिक चीनी दवा है जो इमली के पौधे की जड़ों को परजीवी बनाती है और इसका उपयोग पुरुष नपुंसकता, बाँझपन, शरीर की कमजोरी और टॉनिक के रूप में किया जाता है। हालांकि, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा पर इसका एंटीट्यूमर प्रभाव अभी भी मायावी है। यहां, हमने सी के एंटीट्यूमर प्रभाव की जांच की।ट्यूबुलोसाफेनिलएथेनॉयडग्लाइकोसाइड(CTPG) इन विट्रो और विवो और इसके तंत्र दोनों में H22 हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं पर।

तरीके: H22 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, एपोप्टोसिस, कोशिका चक्र और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (Δψm) का विश्लेषण क्रमशः उल्टे माइक्रोस्कोपी, एमटीटी परख और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। एपोप्टोसिस मार्ग में प्रोटीन की अभिव्यक्ति और सक्रियता का पता पश्चिमी धब्बा द्वारा लगाया गया था। पुरुष कुनमिंग चूहों का उपयोग करके स्थापित ट्यूमर माउस मॉडल में विवो एंटीट्यूमर प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था।

परिणाम: CTPG उपचार ने खुराक और समय पर निर्भर तरीके से H22 सेल की वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से दबा दिया, जो कि G 0 / G1 और G2 / M चरणों में बढ़े हुए एपोप्टोसिस और सेल चक्र गिरफ्तारी के साथ सहसंबद्ध था। इसके अलावा, CTPG- उपचारित H22 कोशिकाओं में गुणसूत्र संघनन देखा गया। सीटीपीजी उपचार ने बैक्स/बीसीएल -2 अनुपात में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की, m को कम किया, और साइटोक्रोम सी की रिहाई को बढ़ाया। PARP को साफ करने के लिए क्रमिक रूप से सक्रिय कस्पासे -7 और -3 बाहरी और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों में क्लीवेड कास्पेज़ -8 और कैस्पेज़ -9 के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। अंत में, CTPG ने चूहों में H22 कोशिकाओं के विकास को रोक दिया और ट्यूमर चूहों की जीवित रहने की दर में सुधार किया।

निष्कर्ष: इन परिणामों ने सुझाव दिया कि CTPG ने बाहरी और आंतरिक एपोप्टोसिस दोनों मार्गों के माध्यम से H22 कोशिका वृद्धि को दबा दिया।

कीवर्ड:सिस्टांचेट्यूबुलोसा, फेनिलेथेनॉइडग्लाइकोसाइड, एपोप्टोसिस, सिग्नलिंग पाथवे, ट्यूमर माउस मॉडल

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पार्श्वभूमि

लीवर कैंसर दुनिया भर में कैंसर की घटनाओं के लिए छठे और कैंसर से होने वाली मौतों के लिए चौथे स्थान पर है। इसके अलावा, यह कम सामाजिक जनसांख्यिकीय सूचकांक वाले देशों में कैंसर की घटनाओं के लिए चौथे और कैंसर मृत्यु दर के लिए पहले स्थान पर है। चीन में, लीवर कैंसर 2015 में कैंसर से संबंधित मौत का तीसरा प्रमुख कारण है [2]। दुनिया में 90 प्रतिशत से अधिक प्राथमिक यकृत कैंसर हेपेटोकेल्युलर कार्सिनोमा (एचसीसी) हैं [3]। वर्तमान में, एचसीसी के उपचार के लिए यकृत का उच्छेदन मुख्य विकल्प है। हालांकि, एचसीसी वाले 30 प्रतिशत से भी कम रोगियों ने उपचारात्मक यकृत उच्छेदन के मानदंडों को पूरा किया, और उच्च पुनरावृत्ति दर [4, 5] के कारण समग्र 5-वर्ष जीवित रहने की दर अभी भी 35-50 प्रतिशत जितनी कम है। ]. मध्यवर्ती से उन्नत एचसीसी वाले रोगियों के लिए उपचार विकल्पों की उपलब्धता बहुत सीमित है। सोराफेनीब, एक आणविक रूप से लक्षित दवा, को एफडीए द्वारा उन्नत एचसीसी के लिए प्रथम-पंक्ति उपचार के रूप में अनुमोदित किया गया है। हालांकि, सोराफेनीब केवल 3 महीने के अस्तित्व को बढ़ाता है और प्रतिक्रिया दर 4 प्रतिशत से कम है [6, 7]। एचसीसी के खिलाफ नई दवाओं या रणनीतियों को विकसित करना अत्यावश्यक है। पारंपरिक चीनी दवा (टीसीएम) अकेले या अन्य रणनीतियों के साथ संयुक्त रूप से एचसीसी के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया है और लंबे समय तक जीवित रहने, बेहतर जीवन गुणवत्ता, प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कम करने, और इसी तरह [8, 9] सहित नैदानिक ​​​​लाभ दिखाया गया है।सिस्टांचे, एक प्रकार का टीसीएम, विभिन्न जैविक कार्य करता है, जैसे कि एंटी-ऑक्सीडेशन, एंटी-इंफ्लेमेशन, एंटी-एजिंग और न्यूरोप्रोटेक्शन [10, 11]।फेनिलेथेनॉइडग्लाइकोसाइडके प्रमुख सक्रिय घटक माने गए हैंसिस्टांचे, जिसमें एंटी-ऑक्सीडेशन, एंटी-इंफ्लेमेशन, हेपेटोप्रोटेक्शन और न्यूरोप्रोटेक्शन सहित विविध गतिविधियाँ होती हैं [12–15]। हमारे समूह ने बताया है कि सिस्टांच ट्यूबुलोसाफेनिलएथेनॉयडग्लाइकोसाइड(सीटीपीजी) मेलेनोमा बी16-F10 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकता है और चूहों में ट्यूमर के विकास को रोक सकता है [16]। इस अध्ययन में, हमने इन विट्रो और विवो दोनों में एचसीसी एच 22 कोशिकाओं पर सीटीपीजी के एंटीट्यूमर प्रभाव को मापा और इसके तंत्र की जांच की। हमने पाया कि CTPG ने H22 कोशिकाओं में बाह्य और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों के माध्यम से एपोप्टोसिस को प्रेरित किया और चूहों में H22 ट्यूमर के विकास को दबा दिया।

तरीकों

कोशिका की परत

माउस H22 हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं को झिंजियांग की जैविक संसाधन और आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रयोगशाला, झिंजियांग विश्वविद्यालय (उरुमकी, झिंजियांग, चीन) से प्राप्त किया गया था और RPMI 1640 माध्यम (गिब्को) में 100 U/ml पेनिसिलिन और 100 ug/ml के साथ पूरक किया गया था। स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10 प्रतिशत गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (गिब्को) 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 के आर्द्र वातावरण में।

एमटीटी परख

CTPG को Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (हेटियन, झिंजियांग, चीन) से खरीदा गया था और CTPG के प्रमुख यौगिकों को उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी [16] द्वारा योग्य और परिमाणित किया गया था। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन 3- (4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2, 5-डिपेनहिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ) द्वारा किया गया था। , यूएसए) परख। H22 कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 2 × 1 के घनत्व पर 04 कोशिकाओं में 100 उल माध्यम प्रति कुएं में टीका लगाया गया और 37 डिग्री पर सुसंस्कृत किया गया। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को क्रमशः 24, 48 और 72 घंटे के लिए CTPG (0, 100, 200, 300 और 400 ug/ml) या 0.3 प्रतिशत DMSO (400 ug/ml CTPG के बराबर) की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। . 7 मिनट के लिए 1000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया गया था और प्रत्येक कुएं में 100 एमटीटी समाधान (पीबीएस में 5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ा गया था। प्लेटों को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया था और गठित फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को भंग करने के लिए 100 उल डीएमएसओ जोड़ा गया था। OD490 मानों का पता एक 96- अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट रीडर (बायो-रेड लेबोरेटरीज, सीए, यूएसए) द्वारा लगाया गया था। सेल व्यवहार्यता की गणना सूत्र के अनुसार की गई: सेल व्यवहार्यता (प्रतिशत)=(ओडीट्रीटेड/ओडीनट्रीटेड) × 100 प्रतिशत।

एपोप्टोसिस का पता लगाना

H22 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए CTPG (0, 1 0 0, 200, 300, और 400 ug / ml) या 0.3 प्रतिशत DMSO के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया, और फिर एनेक्सिन वी FITC / के साथ दाग दिया गया। प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (येसेन, चीन) निर्माता के निर्देशों के अनुसार। नमूनों का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री (BD FACSCalibur, USA) द्वारा किया गया।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का पता लगाना

H22 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए CTPG (0, 200, और 400 कुरूप / एमएल) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, और फिर 20 के लिए झिल्ली-पारगम्य JC -1 डाई (बायोटाइम, चीन) के साथ दाग दिया गया था। 37 डिग्री पर न्यूनतम। जेसी -1 बफर के साथ दो बार धोने के बाद, नमूनों को 300 उल जेसी -1 बफर के साथ फिर से जोड़ा गया और प्रवाह साइटोमेट्री (बीडी एफएसीएससीलिबुर, यूएसए) द्वारा विश्लेषण किया गया।

कोशिका चक्र का विश्लेषण

H22 कोशिकाओं को 6 0 मिमी संस्कृति व्यंजनों में टीका लगाया गया और CTPG (0, 1 0 0, 200, 300 और 400 कुरूप / एमएल) या 0.3 प्रतिशत डीएमएसओ के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। 24 घंटे सभी कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार एकत्र और धोया गया था। कोशिकाओं को 70 प्रतिशत बर्फ-ठंडे इथेनॉल में −20 डिग्री पर 2 घंटे के लिए तय किया गया था और दो बार पीबीएस के साथ धोया गया था, फिर 300 उल प्रोपीडियम आयोडाइड / RNase धुंधला बफर (बीडी बायोसाइंसेस) में फिर से निलंबित कर दिया गया था। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के बाद, फ्लो साइटोमेट्री (BD FACSCalibur, USA) द्वारा नमूने एकत्र किए गए और सेल चक्र वितरण का विश्लेषण ModFit LT 3.0 सॉफ्टवेयर के साथ किया गया।

होचस्ट 33,258 धुंधला हो जाना

H22 सेल नाभिक के रूपात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण झिल्ली-पारगम्य डीएनए-बाध्यकारी डाई Hoechst 33,258 धुंधला द्वारा किया गया था। H22 कोशिकाओं को एक 6-वेल प्लेट में 1 × 105 कोशिकाओं/कुएं की सांद्रता में 2 मिलीलीटर माध्यम में रखा गया था। 60 प्रतिशत ~ 70 प्रतिशत संगम के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए CTPG (0, 100, 200, 300 और 400 ug/ml) से उपचारित किया गया। कोशिकाओं को एकत्र किया गया और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री पर 4 प्रतिशत बर्फ-ठंडे पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया। पीबीएस के साथ धोने के बाद, कोशिकाओं को होचस्ट 33, 258 (बायोटाइम, चीन) के साथ 10 मिनट के लिए 4 डिग्री पर दाग दिया गया। नमूने एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (निकॉन एक्लिप्स टीआई-ई, जापान) द्वारा देखे गए थे।

पश्चिमी धब्बा

एंटी-कस्पेज़ -3, एंटी-क्लीव्ड कास्पेज़ -3, एंटी-बीसीएल -2, और एंटी-बैक्स को बायोटाइम बायोटेक कं, लिमिटेड (शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। एंटी-कस्पेज़ -7, एंटी-क्लीवेड-कस्पेज़ -7, एंटी-कस्पेज़ -8, एंटी-क्लीवेड-कस्पेज़ -8, एंटी-कस्पेज़ -9, एंटी-कस्पेज़ -cleaved-caspase-9, एंटी-PARP, एंटी-क्लीव्ड PARP, एंटी-माउस IgG-HRP, और एंटी-खरगोश IgG-HRP सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे। एंटी - -एक्टिन को बीजिंग कॉमविन बायोटेक कं, लिमिटेड (बीजिंग, चीन) से खरीदा गया था।

H22 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए CTPG (0, 1 0 0, 200, 300 और 400 ug/ml) या 0.3 प्रतिशत DMSO के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। कोशिकाओं को एकत्र किया गया और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेल Lysis Solution RIPA (बीजिंग कॉमविन बायोटेक कं, लिमिटेड) के साथ लाइस किया गया। सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए नमूने नीचे (12, 000 15 मिनट के लिए 4 डिग्री पर) काटे गए थे और बीसीए किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए) द्वारा प्रोटीन सांद्रता को मापा गया था। प्रत्येक नमूने में समान मात्रा में प्रोटीन को 12 प्रतिशत एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और पीवीडीएफ झिल्ली (बायोशर्प, चीन) में स्थानांतरित कर दिया गया। टीबीएसटी बफर के साथ अवरुद्ध होने के बाद 5 प्रतिशत नॉनफैट दूध होता है, झिल्ली को संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ क्रमशः हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) से संयुग्मित किया जाता है। टीबीएसटी से धोने के बाद, ईसीएल परख किट (बायोटाइम, चीन) द्वारा लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाया गया।

पशु और नैतिकता कथन

6-8 सप्ताह पुराने नर कुनमिंग चूहों को पशु प्रयोगशाला केंद्र, झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी (उरुमकी, झिंजियांग, चीन) से खरीदा गया था। झिंजियांग विश्वविद्यालय के एक मानक तापमान-नियंत्रित, हल्के-चक्र वाले पशु सुविधा में चूहे रखे गए थे। सभी जानवरों का अध्ययन झिंजियांग विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। प्रोटोकॉल को झिंजियांग यूनिवर्सिटी ऑफ बायोलॉजिकल रिसोर्सेज एंड जेनेटिक इंजीनियरिंग (BRGE-AE001) की झिंजियांग की प्रमुख प्रयोगशाला के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

ट्यूमर माउस अध्ययन

ट्यूमर माउस मॉडल को शामिल करने के लिए, नर कुनमिंग चूहों को सूक्ष्म रूप से 1 × 1 0 6 H22 कोशिकाओं के साथ 1 0 0 उल पीबीएस में दाहिने फ्लैंक में इंजेक्ट किया गया था। 3 दिनों के बाद, चूहों को बेतरतीब ढंग से 3 समूहों (7 चूहों / समूह) में विभाजित किया गया। नियंत्रण समूह को ट्यूमर के चारों ओर 0.1 मिली डीएमएसओ के साथ सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया था। सीटीपीजी -200 और सीटीपीजी - 400 समूहों को ट्यूमर के चारों ओर 0.1 मिली डीएमएसओ में 200 या 400 मिलीग्राम / किग्रा सीटीपीजी के साथ सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया था। 21 दिनों तक हर 2 दिन में चूहे का इलाज किया गया। 25 दिनों तक के कैलीपर्स का उपयोग करके ट्यूमर के आकार को मापा गया और ट्यूमर की मात्रा की गणना सूत्र के अनुसार की गई: ट्यूमर की मात्रा (मिमी 3)=(लंबाई × चौड़ाई 2) / 2। 25 दिनों के बाद, इस अध्ययन के अंत तक हर दिन ट्यूमर चूहों के जीवित रहने की निगरानी की गई।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय महत्व की गणना उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच विचरण के एकतरफा विश्लेषण द्वारा की गई थी। सभी डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था। p < 0.05="" को="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="">

परिणाम

CTPG ने इन विट्रो में H22 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम कर दिया

HCC पर CTPG के एंटीट्यूमर प्रभाव का पता लगाने के लिए, H22 कोशिकाओं को इन विट्रो में CTPG (0, 100, 200, 300, और 400 ug/ml) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। 24 घंटे के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके H22 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को देखा गया। हमने पाया कि CTPG उपचार द्वारा H22 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को नाटकीय रूप से बदल दिया गया था। सीटीपीजी की बढ़ती सांद्रता के साथ, कोशिकाएँ छोटी और गोल हो गईं और कोशिका संख्या भी बहुत कम हो गई (चित्र 1 ए)। MTT परख का उपयोग क्रमशः 24, 48 और 72 घंटे के लिए CTPG उपचार के बाद H22 कोशिकाओं की व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। CTPG ने खुराक-निर्भर और समय-निर्भर तरीके से H22 सेल व्यवहार्यता को काफी कम कर दिया (चित्र। 1b)। 300 ug/ml पर CTPG सर्वोत्तम निरोधात्मक दर (चित्र 1c) पर पहुंचा। H22 कोशिकाओं के लिए CTPG के IC50 का मान 24 घंटे में 236 ug/ml और 48 h पर 169.8 ug/ml है।

H22 कोशिकाओं में CTPG प्रेरित एपोप्टोसिस

यह जांचने के लिए कि क्या एपोप्टोसिस के शामिल होने से H22 कोशिकाओं की घटी हुई व्यवहार्यता की मध्यस्थता की जाती है, H22 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए CTPG (0, 100, 200, 300, और 400 कुरूप / एमएल) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया और दाग दिया गया। पीआई और एनेक्सिन वी के साथ। प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों से पता चला है कि सीटीपीजी ने खुराक पर निर्भर तरीके (छवि 2 ए) में एच 22 कोशिकाओं (प्रारंभिक और देर से एपोप्टोसिस सहित) के एपोप्टोसिस को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित किया। हालांकि CTPG की उच्च खुराक ने H22 कोशिकाओं के परिगलन में भी काफी वृद्धि की, लेकिन एपोप्टोसिस (52.6 प्रतिशत) की तुलना में इसके कम अनुपात (8.3 प्रतिशत) के कारण परिगलन H22 कोशिका वृद्धि के निषेध में एक छोटी भूमिका निभाता है। इसके अलावा, CTPG उपचार के बाद H22 कोशिकाओं के कुल प्रोटीन को अलग कर दिया गया और एंटी-एपोप्टोटिक बी सेल लिंफोमा 2 (बीसीएल -2) और प्रो-एपोप्टोटिक बीसीएल -2- से जुड़े एक्स प्रोटीन (बैक्स) के भावों का पता लगाया गया। पश्चिमी धब्बा। ग्रेस्केल स्कैनिंग डेटा से पता चला है कि बैक्स और बीसीएल -2 के अभिव्यक्ति स्तर क्रमशः बढ़े और घटे थे। Bax/Bcl-2 अनुपात में काफी वृद्धि हुई थी (चित्र 2b)। ये परिणाम बताते हैं कि CTPG H22 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है।

CTPG H22 कोशिकाओं में गुणसूत्र संघनन और कोशिका चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करता है

यह बताया गया है कि दवाओं से प्रेरित डीएनए क्षति और कोशिका चक्र गिरफ्तारी ट्यूमर कोशिका वृद्धि को रोक सकती है और ट्यूमर कोशिकाओं में एपोप्टोसिस का कारण बन सकती है [17, 18]। 24 घंटे के लिए CTPG उपचार के बाद H22 कोशिकाओं में नाभिक की आकृति विज्ञान का पता लगाने के लिए, H22 कोशिकाओं को Hoechst 33,342 द्वारा दाग दिया गया और उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया। CTPG उपचारित कोशिकाओं ने नाभिक के चमकीले संघनित क्रोमैटिन की खुराक पर निर्भर वृद्धि दिखाई, जबकि अनुपचारित कोशिकाओं ने सजातीय रूप से सना हुआ नाभिक दिखाया (चित्र 3 ए)। 24 घंटे के लिए CTPG उपचार के बाद PI धुंधला द्वारा H22 कोशिकाओं में कोशिका चक्र वितरण का और विश्लेषण किया गया। जैसा कि चित्र 3बी में दिखाया गया है, सीटीपीजी उपचार ने जी 0/जी1- और जी2/एम-चरण कोशिकाओं के अनुपात में काफी वृद्धि की और एस-चरण कोशिकाओं के अनुपात में काफी कमी आई, यह सुझाव देते हुए कि सीटीपीजी ने जी को प्रेरित किया। 0/G1 और G2/M H22 कोशिकाओं में चरण गिरफ्तारी। CTPG की उच्च खुराक ने उप G1 कोशिकाओं के अनुपात में भी काफी वृद्धि की।

CTPG ने माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को कम किया और साइटोक्रोम c . की रिहाई में वृद्धि की

माइटोकॉन्ड्रियल-आश्रित मार्ग एपोप्टोसिस के प्रेरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [19, 20]। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (Δψm) के परिवर्तनों की निगरानी JC द्वारा की जा सकती है -1 JC के कारण धुंधला हो जाना -1 समुच्चय (लाल प्रतिदीप्ति) m [21] की कमी के साथ मोनोमर (हरा प्रतिदीप्ति) में विघटित हो सकता है। 24 घंटे के लिए CTPG उपचार के बाद, H22 कोशिकाओं को JC - 1 डाई द्वारा दाग दिया गया। प्रवाह साइटोमेट्री डेटा से पता चला है कि FL -2 चैनल में लाल प्रतिदीप्ति और FL -1 चैनल में हरी प्रतिदीप्ति काफी कम हो गई थी और CTPG उपचार पर बढ़ गई थी। PE− FITC प्लस कोशिकाओं के अनुपात में काफी वृद्धि हुई थी (चित्र 4a), यह सुझाव देते हुए कि CTPG ने H22 कोशिकाओं में m को कम कर दिया। यह बढ़े हुए Bax/Bcl-2 अनुपात के अनुरूप है। नतीजतन, हमने देखा कि सीटीपीजी उपचार (छवि 4 बी) पर साइटोक्रोम सी की रिहाई में काफी वृद्धि हुई थी। इन परिणामों ने संकेत दिया कि सीटीपीजी माइटोकॉन्ड्रियल-आश्रित (आंतरिक) मार्ग के माध्यम से एच 22 कोशिकाओं में आंशिक रूप से एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकता है।

CTPG ने कस्पासे मार्ग को सक्रिय किया और डीएनए की मरम्मत को रोका

इसके बाद, बाहरी और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों के माध्यम से CTPG द्वारा प्रेरित कस्पासे की सक्रियता का विश्लेषण किया गया। 24 घंटे के लिए CTPG उपचार के बाद, कुल प्रोटीन को H22 कोशिकाओं से अलग कर दिया गया और पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रो- और क्लीवेड-कैस्पेज़ के स्तर का पता लगाया गया। अनुपचारित या डीएमएसओ नियंत्रण की तुलना में, सीटीपीजी उपचार ने न केवल क्लीवेड कस्पासे के स्तर -8 (बाह्य मार्ग) बल्कि क्लीवेड कस्पासे के स्तर -9 (आंतरिक मार्ग) (अंजीर) को भी काफी हद तक विनियमित किया है। 5). क्रमिक रूप से, सक्रिय कस्पासे -8 और -9 ने डाउनस्ट्रीम प्रो-कस्पेज़ को साफ़ किया -3 और -7 जो अंजीर में देखे गए थे। 5. सक्रिय कस्पासे -3 ने डीएनए को साफ किया डीएनए की मरम्मत को रोकने के लिए पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ (PARP) के एंजाइम की मरम्मत करें और डीएनए क्षति को जमा करें जैसा कि चित्र 3 ए में देखा गया है।

इन परिणामों ने संकेत दिया कि CTPG ने H22 कोशिकाओं में बाह्य और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों के माध्यम से एपोप्टोसिस को प्रेरित किया।

CTPG विवो में H22 HCC के विकास को दबा देता है और ट्यूमर चूहों की उत्तरजीविता दर में सुधार करता है

अंत में, HCC पर CTPG के एंटीट्यूमर प्रभाव का मूल्यांकन एक ट्यूमर माउस मॉडल में किया गया था, जिसे H22 कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा स्थापित किया गया था। H22 सेल इंजेक्शन के 3 दिनों के बाद, ट्यूमर चूहों का 8 बार CTPG से इलाज किया गया। संकेतित समय बिंदुओं पर चूहों और ट्यूमर के आकार के शरीर के वजन की निगरानी की गई। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 6a, प्रत्येक समूह में चूहों के शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, यह सुझाव देता है कि CTPG की चयनित खुराक का कोई स्पष्ट दुष्प्रभाव नहीं है। दिलचस्प बात यह है कि 2 0 0 मिलीग्राम/किलोग्राम और 400 मिलीग्राम/किलोग्राम सीटीपीजी दोनों के साथ इलाज किए गए चूहों में ट्यूमर की वृद्धि काफी बाधित थी (छवि 6 बी)। इसके अलावा, सीटीपीजी उपचार की दो खुराक ने प्रयोग के अंत में नियंत्रण समूह (0/7) की तुलना में ट्यूमर चूहों (3/7, 3/7) के अस्तित्व में काफी सुधार किया (छवि 6 बी)। हमने यह भी पाया कि सीटीपीजी ने खुराक पर निर्भर तरीके से नर कुनमिंग चूहों से पृथक स्प्लेनोसाइट्स के प्रसार को काफी बढ़ाया (छवि 6 सी), यह सुझाव देते हुए कि सीटीपीजी का एक इम्यूनोस्टिम्युलेटरी प्रभाव है।

बहस

टीसीएम का उपयोग लंबे इतिहास में कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों के इलाज के लिए किया जाता रहा है। यह बताया गया है कि टीसीएम विभिन्न प्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं में बाह्य (मृत्यु रिसेप्टर-मध्यस्थता) और आंतरिक (माइटोकॉन्ड्रिया-आश्रित) सिग्नलिंग मार्ग दोनों के माध्यम से एंटीट्यूमर प्रभाव [22-25] को प्रेरित कर सकता है। दो रास्ते क्रमशः [24, 26] कस्पासे -8 और -9 को सक्रिय कर सकते हैं। यहां, हमने पाया कि CTPG ने एपोप्टोसिस और सेल साइकल अरेस्ट को शामिल करके H22 सेल की वृद्धि को काफी दबा दिया। क्लीवेड कास्पेज़ -8 और -9 के स्तर को सीटीपीजी उपचार द्वारा काफी हद तक विनियमित किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि एपोप्टोसिस के प्रेरण में बाहरी और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों शामिल थे। हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि सीटीपीजी ने माइटोकॉन्ड्रिया-आश्रित मार्ग द्वारा मेलेनोमा बी 16- एफ 10 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया, जिसने क्लीवेड कास्पेज़ के स्तर को बढ़ाया -9 लेकिन कास्पेज़ नहीं -8 [16]। CTPG विभिन्न प्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं में अलग-अलग सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय कर सकता है।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता को बीसीएल-2 प्रोटीन परिवार के सदस्यों द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है जिसमें बैक्स और बीसीएल शामिल हैं-2 [27, 28]। बैक्स से बीसीएल -2 का अनुपात माइटोकॉन्ड्रिया-आश्रित एपोप्टोसिस मार्ग [29] में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। CTPG द्वारा उपचारित H22 कोशिकाओं में, Bax / Bcl -2 अनुपात को काफी हद तक विनियमित किया गया था, जो इस अध्ययन में देखे गए m की कमी और साइटोक्रोम c की रिहाई का कारण हो सकता है। नतीजतन, प्रो-कस्पेज़ -9 को साफ और सक्रिय किया गया था। अंत में, सक्रिय कस्पासे -8 और -9 के आरंभकर्ताओं ने डीएनए की मरम्मत को रोकने के लिए PARP को साफ करने के लिए कस्पासे -3 के जल्लाद को सक्रिय किया। एक साथ लिया गया, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि CTPG ने H22 कोशिकाओं में बाह्य और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों के माध्यम से एपोप्टोसिस को प्रेरित किया।

ट्यूमर माउस मॉडल में, CTPG ने H22 HCC के विकास को महत्वपूर्ण रूप से दबा दिया और ट्यूमर चूहों के अस्तित्व में काफी सुधार किया। दिलचस्प बात यह है कि सीटीपीजी खुराक-निर्भरता ने कुनमिंग चूहों से स्प्लेनोसाइट्स के प्रसार को बढ़ावा दिया, जो हमारे पिछले अध्ययन [16] के अनुरूप है।

इन परिणामों ने सुझाव दिया कि CTPG प्रत्यक्ष एंटीट्यूमर प्रभाव और अप्रत्यक्ष प्रतिरक्षा वृद्धि दोनों के माध्यम से चूहों में H22 HCC के विकास को दबा सकता है।

निष्कर्ष

CTPG ने इन विट्रो और विवो दोनों में H22 कोशिकाओं के विकास को दबा दिया और H22 कोशिकाओं में बाह्य और आंतरिक सिग्नलिंग मार्ग दोनों के माध्यम से प्रेरित एपोप्टोसिस को दबा दिया। इन आंकड़ों ने संकेत दिया कि एचसीसी के उपचार के लिए सीटीपीजी एक संभावित उम्मीदवार हो सकता है।

लघुरूप

बैक्स: बीसीएल-2-एसोसिएटेड एक्स प्रोटीन; बीसीएल-2: बी सेल लिंफोमा 2; CTPG: सिस्टैंच ट्यूबुलोसा फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स; एचसीसी: हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा; एचआरपी: हॉर्सरैडिश पेरोक्साइड; एमटीटी: 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-यल)-2, 5- डिपेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड; PARP: पॉली (ADP-राइबोज) पोलीमरेज़ का डीएनए मरम्मत एंजाइम; टीसीएम: पारंपरिक चीनी दवा; m: माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता।

अनुदान

इस काम को झिंजियांग उइगुर स्वायत्त क्षेत्र की जेएल को उच्च स्तरीय प्रतिभा परिचय परियोजना, जेएल को चीनी राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (31460241), और झिंजियांग विश्वविद्यालय के डॉक्टरेट स्टार्ट-अप फंड (बीएस160261 से एक्सडब्ल्यू और बीएस150236) द्वारा समर्थित किया गया था। वाईएल)।

डेटा और सामग्री की उपलब्धता

इस अध्ययन के लिए कच्चा डेटा संबंधित लेखक के उचित अनुरोध पर उपलब्ध है।

लेखकों का योगदान

जेएल और जेएल ने प्रयोगों को डिजाइन किया। PY, JL, AA और YY ने प्रयोग किए। LX, XW और YL ने डेटा का विश्लेषण किया। PY, JL, और JL ने पांडुलिपि लिखी। सभी लेखकों ने योगदान दिया और अंतिम पांडुलिपि को मंजूरी दी।

नैतिकता अनुमोदन

पशु अध्ययन को झिंजियांग विश्वविद्यालय के जैविक संसाधनों और आनुवंशिक इंजीनियरिंग की झिंजियांग प्रमुख प्रयोगशाला के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

प्रतिस्पर्धी रुचियां

लेखक घोषणा करते हैं कि उनकी कोई प्रतियोगी रुचि नहीं है।

प्रकाशक का नोट

स्प्रिंगर नेचर प्रकाशित नक्शों और संस्थागत संबद्धता में क्षेत्राधिकार के दावों के संबंध में तटस्थ रहता है।

लेखक विवरण

1 झिंजियांग प्रमुख प्रयोगशाला जैविक संसाधन और आनुवंशिक इंजीनियरिंग, कॉलेज ऑफ लाइफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, झिंजियांग विश्वविद्यालय, 666 शेंगली रोड, उरुमकी, झिंजियांग 830046, चीन।

2 कॉलेज ऑफ लाइफ साइंस, झिंजियांग नॉर्मल यूनिवर्सिटी, 102 ज़िनयी रोड, उरुमकी 830054, झिंजियांग, चीन।

झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी, उरुमकी 830011, चीन के 3 संबद्ध ट्यूमर अस्पताल।