प्रतिरक्षा-उत्तेजक एंटीबॉडी मजबूत माइलॉयड सक्रियण और टिकाऊ एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को जोड़ती है (भाग 1)।

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सार

टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) सहित इनेट पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और प्राइम एडेप्टिव एंटी-ट्यूमर इम्युनिटी को बदल सकते हैं।हालांकि, प्रणालीगत प्रशासन के बाद व्यापक प्रतिरक्षा सक्रियण से जुड़ी विषाक्तता के कारण टीएलआर एगोनिस्ट को अच्छी तरह से सहन नहीं किया गया है।एक चिकित्सीय डिजाइन करने के लिए जो प्रणालीगत वितरण के लिए उपयुक्त है औरट्यूमर-लक्षित प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम, हमने प्रतिरक्षा-उत्तेजक एंटीबॉडी संयुग्मों (आईएसएसी) का एक उपन्यास वर्ग विकसित किया जिसमें ट्यूमर-लक्षित एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित टीएलआर 7/8 एगोनिस्ट शामिल है।व्यवस्थित रूप से प्रशासित एंटी-एचईआर 2 आईएसएसी को विवो में अच्छी तरह से सहन किया गया था और इंट्राटूमोरल मायलोइड कोशिकाओं के मजबूत सक्रियण को प्राप्त किया, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर की निकासी और बाद में प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति हुई।इन विट्रो पोटेंसी और विवो प्रभावकारिता में फैगोसाइटोसिस और टी सेल-मध्यस्थता एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को सक्षम करने के लिए बरकरार एफसी कार्यक्षमता और टीएलआर एगोनिज्म द्वारा संचालित अग्रानुक्रम गतिविधि की आवश्यकता होती है।ISAC-मध्यस्थता प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति HER2 तक सीमित नहीं थी, क्योंकि ISAC- उपचारित चूहों को HER2-नकारात्मक ट्यूमर के साथ पुन: चुनौती देने से बचाया गया था।ये परिणाम ISAC के नैदानिक ​​विकास के लिए एक मजबूत तर्क प्रदान करते हैं और दिखाते हैं कि Fc R और TLR7/8 सिग्नलिंग के बीच तालमेल ISAC की मध्यस्थता विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के तंत्र में योगदान देता है।

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परिचय

20वीं सदी के अंत से पहले, कैंसर रोगियों के पास आमतौर पर उपचार के तीन तरीके उपलब्ध थे: शल्य चिकित्सा, विकिरण और कीमोथेरेपी। कैंसर इम्यूनोथेरेपी के उद्भव ने एक शक्तिशाली चौथा तौर-तरीका जोड़ा जिसने ऑन्कोलॉजी के प्रदर्शनों की सूची को गैर-हॉजकिन के लिंफोमा के लिए रीटक्सिमैब के अनुमोदन के साथ शुरू किया और चेकपॉइंट अवरोधकों 1,2 के व्यापक रूप से अपनाने के लिए विस्तारित किया। हालांकि, इम्यूनोथेरेपी सहित कोई भी एक चिकित्सा अस्थायी रूप से सीमित है, जब तक कि यह टिकाऊ जैविक और प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न नहीं करती है जो ट्यूमर की विषमता और पारस्परिक बोझ को 3-5 से दूर करती है। एंटी-पीडी -1 और पीडी-एल1 एंटीबॉडी जैसे चेकपॉइंट इनहिबिटर नाटकीय रूप से कई संकेतों में परिणामों में सुधार करते हैं, जिसमें उच्च ट्यूमर म्यूटेशनल बोझ या माइक्रोसेटेलाइट अस्थिरता वाले रोगियों में शामिल हैं, और चेकपॉइंट इम्यूनोथेरेपी के लिए ट्यूमर की संवेदनशीलता का एक निर्धारक पूर्व की सीमा है। -मौजूदा टी सेल घुसपैठ। "ठंडे" ट्यूमर वाले मरीज़ जिनके पास एक विरल टी सेल घुसपैठ है, वे चेकपॉइंट नाकाबंदी के प्रति कम प्रतिक्रियाशील होते हैं और "हॉट" ट्यूमर वाले रोगियों की तुलना में खराब पूर्वानुमान होते हैं, जहां ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के भीतर इम्यूनोसप्रेस्ड ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाएं मौजूद होती हैं। . ट्यूमर बायोप्सी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से संकेत मिलता है कि पेशेवर एंटीजन-प्रेजेंटिंग सेल्स (APCs) जैसे डेंड्राइटिक सेल (DCs) अक्सर TME के ​​भीतर T कोशिकाओं की तुलना में अधिक होते हैं, यद्यपि अभी भी इम्यूनोसप्रेसिव मैकेनिज्म 8,9 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। टीएमई में माइलॉयड कोशिकाओं की उपस्थिति और टी सेल सक्रियण को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका को देखते हुए, ट्यूमर से जुड़े एपीसी को सक्रिय करने के लिए व्यापक टी सेल प्रतिरक्षा और एक प्रभावी एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए उपचार विकसित करने का प्रयास बढ़ रहा है।

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 दाता। (डी) रिटक्सिमैब को लाइसिन अवशेषों के माध्यम से एसएटीए के साथ प्रतिक्रिया दी गई थी ताकि हाइड्रॉक्सिलमाइन के साथ डीसेटाइलेशन से पहले मुक्त अमाइन को संरक्षित सल्फहाइड्रील समूहों में परिवर्तित किया जा सके और बाद में टी 785- एमसीसी के साथ रीटक्सिमैब-आईएसएसी प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया की जा सके। (ई) पीएनजीएएस एफ उपचार के बाद रीटक्सिमैब-आईएसएसी का एलसी-एमएस विश्लेषण। DAR की गणना 606 g/mol के लिंकर-एगोनिस्ट द्रव्यमान जोड़ के आधार पर की गई थी। ( च ) फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण से पहले 2 घंटे के लिए 2 घंटे के लिए 4 डिग्री पर सीडी20 प्लस टोलेडो ट्यूमर कोशिकाओं के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए रीटक्सिमैब या रीटक्सिमैब-आईएसएसी को ऊष्मायन किया गया था। डेटा 1 प्रयोग से तीन प्रतियों के नमूनों के साथ हैं और 2 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं।(घ) हौसले से अलग किए गए मानव माइलॉयड एपीसी को रीटक्सिमैब, टी785, रीटक्सिमैब, और टी785 या रीटक्सिमैब-आईएसएसी के साथ सीएफएसई-लेबल सीडी20 प्लस टोलेडो ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में 3:1 प्रभावक से लक्ष्य अनुपात में सुसंस्कृत किया गया था। इन assays में T785 की मात्रा के अनुरूप होने वाले T785 की एकाग्रता के साथ एक्स-अक्ष पर रीटक्सिमैब एकाग्रता को दर्शाया गया है

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 दाताओं (माध्य और SEM); *पी<0.05,><0.01,><0.001,><>

अब यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि प्रीक्लिनिकल मॉडल में इम्युनोस्टिमुलेटरी एजेंटों की स्थानीय डिलीवरी, ट्यूमर से जुड़े एंटीजन को संसाधित करने और पेश करने में सक्षम सक्रिय कोशिकाओं में ट्यूमर निवासी एपीसी को पुन: उत्पन्न कर सकती है, जिसमें टी कोशिकाओं को शामिल किया जाता है, जो बाद में एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा 10-13 की मध्यस्थता करते हैं। . कारमी एट अल द्वारा अग्रणी ऐसी ही एक रणनीति ने प्रदर्शित किया कि टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) -3 एगोनिस्ट या टीएनएफ और सीडी 40 एल के साथ एलोजेनिक ट्यूमर-टारगेटिंग एंटीबॉडी की इंट्राटूमोरल डिलीवरी ने ट्यूमर से जुड़े एपीसी को कार्यात्मक रूप से बचाया, जिससे एंटीजन तेज हो गया। बाद में एंटी-ट्यूमर टी सेल इम्युनिटी को शामिल करना। यह संयोजन रणनीति, जिसने टीएलआर एगोनिस्ट के साथ एंटीबॉडी प्रभावकारी कार्य का लाभ उठाया, ने प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेटिक घावों को मिटा दिया और मेजबान को ट्यूमर पुनरावृत्ति 11,14 से बचाया। इसी तरह, एक टीएलआर9 एगोनिस्ट, सीपीजी, सक्रिय एपीसी और ट्यूमर के भीतर टी कोशिकाओं के संयोजन में एक एगोनिस्टिक एंटी-ओएक्स40 एंटीबॉडी, जिसके परिणामस्वरूप चूहों में कई ट्यूमर प्रकारों के खिलाफ प्रभावशाली प्रभाव पड़ता है। क्लिनिक में एपीसी सक्रिय करने वाली रणनीतियों का प्रभावी अनुवाद किया जा रहा है मेलेनोमा के रोगियों में नैदानिक ​​​​डेटा के साथ कई संकेतों में जांच की गई, यह सुझाव देते हुए कि एंटी-पीडी -1 एंटीबॉडी के संयोजन में टीएलआर 9 एगोनिस्ट के इंट्रा-ट्यूमरल डिलीवरी से गैर-इंजेक्शन वाले घावों में ट्यूमर सिकुड़न और एब्सकोपल प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। 15. इसी तरह, कई समूह ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी के लिए TLR7/8 एगोनिस्ट का अनुसरण कर रहे हैं क्योंकि मानव APCs में TLR7/8 का अभिव्यक्ति पैटर्न murine APCs16–18 में TLR7 और TLR9 के अभिव्यक्ति पैटर्न को अधिक बारीकी से दर्शाता है। अंतत:, इंट्रा-ट्यूमर डिलीवरी रणनीतियों को अपनाना, यदि प्रभावोत्पादक है, तो ट्यूमर की पहुंच द्वारा सीमित किया जाएगा क्योंकि एपीसी को लक्षित करने वाले प्रतिरक्षा एगोनिस्टों की प्रणालीगत डिलीवरी को विषाक्तता, छोटे आधे जीवन और लक्षित साइटों के लिए उप-इष्टतम वितरण द्वारा प्रतिबंधित किया गया है।हमारा लक्ष्य एक प्रतिरक्षा-उत्तेजक एंटीबॉडी संयुग्म (आईएसएसी) को डिजाइन करना था जिसमें एक ट्यूमर-लक्षित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी शामिल है जो एक प्रतिरक्षा एगोनिस्ट के लिए संयुग्मित है, जो टिकाऊ एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण के रूप में है। ISAC के प्रणालीगत प्रशासन ने TME में स्थानीयकृत APC सक्रियण प्राप्त किया जो Fc . पर निर्भर थाटीएलआर एगोनिस्ट के प्रणालीगत वितरण से जुड़ी विशिष्ट विषाक्तता को दरकिनार करते हुए प्रभावकारक कार्य और टीएलआर सक्रियण। इसके अलावा, ट्यूमर-असर वाले चूहों के लिए इन संयुग्मों के प्रणालीगत प्रशासन ने टी कोशिकाओं के लिए एंटीजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति को सक्षम किया, जो कई मॉडलों में निरंतर एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा के लिए अग्रणी है जो कि असंबद्ध ट्यूमर-लक्षित एंटीबॉडी के लिए प्रतिरोधी हैं।

परिणाम

एक टीएलआर एगोनिस्ट के एंटीबॉडी के साथ संयोजन को सक्षम करने के लिए आईएसएसी डिजाइन और विशेषता, आणविक डॉकिंग टूल्स को एक उपन्यास टीएलआर 7/8 एगोनिस्ट (टी785) को ब्यूटाइल-एमाइन के साथ डिजाइन करने के लिए नियोजित किया गया था जो एंटीबॉडी के लिए लगाव के विलायक-सुलभ बिंदु के रूप में कार्य करता था ( चित्रा 1ए, पूरक चित्रा 1ए-सी)। T785 ने मानव TLR7 को 0.643 μM के EC5 0 और HEK293 सेल लाइनों में 1.60 μM के EC50 के साथ मानव TLR8 लगाया, जो एक NF-κB-inducible स्रावित क्षारीय फॉस्फेट रिपोर्टर और या तो TLR7 या TLR8 (चित्र 1B) को सह-व्यक्त करता है। ) TLR7/8 के लिए T785 की विशिष्टता की पुष्टि T785 की HEK293 रिपोर्टर कोशिकाओं में NF-κB गतिविधि को प्रेरित करने में असमर्थता द्वारा की गई थी जिसमें TLR7/8 अभिव्यक्ति (पूरक चित्रा 2A) की कमी है। प्राथमिक कोशिकाओं में एगोनिस्टिक गतिविधि की पुष्टि करने के लिए, ताजा पृथक मोनोसाइट्स और डीसी, जिसे माइलॉयड एपीसी (~ 96 प्रतिशत मोनोसाइट्स, 4 प्रतिशत डीसी; पूरक चित्रा 3ए) कहा जाता है, जो टीएलआर 7 और टीएलआर 8 दोनों को व्यक्त करते हैं, को रात भर में 1 माइक्रोन टी785 या आर848 से प्रेरित किया गया। अच्छी तरह से स्थापित और विशेषता TLR7/8 एगोनिस्ट 19. T785 और R848 ने माइलॉयड APCs को एक समान सीमा तक उत्तेजित किया (चित्र 1C) 20,21। T785 की गतिविधि की पुष्टि हौसले से पृथक मानव प्लास्मेसीटॉइड डीसी (pDCs) में भी की गई थी, जो TLR7 को व्यक्त करते हैं लेकिन TLR8 (पूरक चित्रा 2B) को नहीं। इन विट्रो संस्कृतियों में मानव में आईएसएसी के प्रभावों की जांच करने के लिए, एक आईएसएसी को रीटक्सिमैब (चित्रा 1डी) के साथ उत्पन्न किया गया था, एक नैदानिक ​​रूप से मान्य एंटी-सीडी20 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जिसका उपयोग बी सेल विकृतियों के उपचार के लिए किया जाता है, एक बहु-चरण प्रतिक्रिया में टी785 के संयुग्मन द्वारा। संगत हेटेरोबिफ़ंक्शनल क्रॉसलिंकर्स के साथ 22. टी 785-आईएसएसी संयुग्मन दक्षता को एलसी-एमएस द्वारा पीएनजीएएस एफ के साथ डीग्लाइकोसिलेशन के बाद मापा गया था, जिसके परिणामस्वरूप 1.71 (चित्रा 1ई) का औसत दवा-से-एंटीबॉडी अनुपात (डीएआर) था। हमने पुष्टि की है कि आईएसएसी ने सीडी के साथ प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों के बाद तुलनीय बंधन को बरकरार रखा है 20- टोलेडो ट्यूमर सेल लाइन को व्यक्त करते हुए, एक अच्छी तरह से विशेषता सेल लाइन जो एक रोगी से व्युत्पन्न बड़े सेल लिंफोमा (चित्रा 1 एफ) 23. टी। 785-मानव Fc रिसेप्टर्स (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) के लिए ISAC बाइंडिंग का मूल्यांकन Biacore द्वारा किया गया था और इसकी तुलना रीतुसीमाब (पूरक तालिका 1) से की गई थी। ISACs मानव माइलॉयड APCs को सक्रिय करते हैं। }}आईएसएसी का मूल्यांकन 18 घंटे के लिए सीएफएसई-लेबल सीडी20 प्लस टोलेडो ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ताजा पृथक मानव माइलॉयड एपीसी के सहसंस्कृति के बाद किया गया था। माइलॉयड एपीसी को रीटक्सिमैब टी 785- के साथ सुसंस्कृत किया गया, आईएसएसी ने डीसी के आकारिकी के अनुरूप तेजी से रूपात्मक परिवर्तन किए, जबकि डीसी आकारिकी नहीं थी रीटक्सिमैब, टी785 या रीटक्सिमैब के एक विषुव मिश्रण, और टी785 (चित्रा 1जी) के साथ इनक्यूबेट किए गए सहसंस्कृति में देखा गया। रीटक्सिमैब टी 785- से प्रेरित एपीसी आठ दिनों तक आकारिकी में व्यवहार्य और वृक्ष के समान बने रहे, जबकि मिश्रण से प्रेरित एपीसी आठ दिन (चित्रा 1एच) तक ज्यादातर गैर-व्यवहार्य थे। बहुरंगा प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण18 घंटे के बाद संकेत दिया कि एपीसी ने रीटक्सिमैब टी के साथ प्रेरित किया 785-आईएसएसी ने सीडी 14 और सीडी 16 को डाउनग्रेड किया और सीडी 123 को अपग्रेड किया, एक सेल सतह मार्कर को दिखाया गयासक्रिय मायलोइड डीसी पर अप-विनियमित हो 24। इसके विपरीत, एपीसी को रीटक्सिमैब से प्रेरित किया जाता है,T785 या मिश्रण ने इन मार्करों की अभिव्यक्ति को संशोधित नहीं किया (चित्र 1I, पूरक चित्र 4A, पूरक आंकड़े 3BC में वर्णित गेटिंग रणनीति)।

मानव एपीसी ने रीटक्सिमैब टी से प्रेरित किया 785-आईएसएसी ने खुराक पर निर्भर तरीके से कॉस्टिम्युलिटरी अणु सीडी को भी अपग्रेड किया 86, सीडी 40 और एचएलए-डीआर अपग्रेडेशन के साथ समान रुझान सक्रिय एपीसी के फेनोटाइप के अनुरूप हैं (चित्र 1I) और पूरक चित्रा 4बी)। सतह मार्कर अभिव्यक्ति में खुराक पर निर्भर परिवर्तन सुसंगत थे कि क्या माध्य फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई, चित्रा 1) के रूप में मूल्यांकन किया गया था या कोशिकाओं की कुल आबादी के प्रतिशत के रूप में जो संबंधित मार्कर (पूरक चित्रा 5) के लिए सकारात्मक है। सेल-मुक्त सुपरनैटेंट्स के बाद के विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि रीटक्सिमैब टी 785-आईएसएसी-उत्तेजित एपीसी ने टीएनएफ और आईएल -1 (चित्रा 2जे और पूरक चित्रा 4सी) की उच्च मात्रा को स्रावित किया। टी 785-आईएसएसी की इम्युनोस्टिमुलेटरी क्षमता रीटक्सिमैब तक ही सीमित नहीं थी, क्योंकि टी 785- ट्रैस्टुजुमाब के साथ उत्पन्न आईएसएसी ने भी बढ़ाया मायलोइड सक्रियण (पूरक चित्रा 4डी) प्राप्त किया। CD8 प्लस T कोशिकाओं के प्रतिजन-प्रस्तुति और क्रॉस-प्राइमिंग को प्राप्त करने के लिए ISAC-उत्तेजित APCs की क्षमता का मूल्यांकन ओवलब्यूमिन (OVA) मॉडल प्रतिजन प्रणाली 25,26 का उपयोग करके किया गया था। जंगली प्रकार के चूहों से अलग किए गए स्प्लेनिक सीडी 11 सी प्लस डीसी को ओवीए के साथ गठित प्रतिरक्षा परिसरों और या तो एंटी-ओवीए एंटीबॉडी या आईएसएसी के साथ रातोंरात सुसंस्कृत किया गया था। OVA-लोडेड DC की मात्रा निर्धारित की गई और OT-I CD8 प्लस T कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया, जो OVA पेप्टाइड, SIINFEKL के लिए TCR विशिष्टता को प्रभावित करता है, जो MHC-I के साथ जटिल है। एंटी-ओवीए आईएसएसी-मध्यस्थता संवर्धित क्रॉस-प्रस्तुति, जैसा कि एमएचसी-आई, बाध्य एसआईआईएनफेकेएल पेप्टाइड की मात्रा से मापा जाता है, और सीडी 8 प्लस टी सेल प्रसार (पूरक आंकड़े 6 ए और 6 बी) द्वारा मापा गया क्रॉस-प्राइमिंग बढ़ाया जाता है। आईएसएएसी ने टीएलआर को बढ़ाया है। और एफसी आर-संबद्ध इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मानव माइलॉयड एपीसी में एफसी रुपये और टीएलआर का सक्रियण एक जटिल फॉस्फो-सिग्नलिंग कैस्केड को प्रेरित करता है, और इन प्रतिक्रियाओं की परिमाण और विशेषताएं विभिन्न प्रतिरक्षा सेल सबसेट 27 के बीच भिन्न होती हैं। हमने विभिन्न में लगे डाउनस्ट्रीम इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग की जांच की। पीबीएमसी-ट्यूमर सहसंस्कृतियों के भीतर सेल प्रकार जो रीटक्सिमैब टी से प्रेरित होते हैं 785- मास साइटोमेट्री (CyTOF) 28 का उपयोग करते हुए इक्विमोलर मिश्रण नियंत्रण की तुलना में ISAC। 28. ल्यूकोसाइट उपसमूह (यानी मोनोसाइट्स, सीडी 4 प्लस टी सेल) की पहचान वंश मार्करों का उपयोग करके स्पैड क्लस्टरिंग के माध्यम से की गई थी। CD20 प्लस टोलेडो ट्यूमर कोशिकाओं और स्वस्थ बी कोशिकाओं दोनों को शामिल करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं के साथ 29। TLR (pIRF7) और Fc R (pERK1 / 2) सिग्नलिंग से जुड़े फॉस्फोराइलेशन इवेंट मोनोसाइट्स और सीडीसी में टी 785- ISAC के साथ उत्तेजना के 15 मिनट बाद बढ़ाए गए थे, जबकि व्यक्तिगत घटकों के मिश्रण 30,31 की तुलना में। इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग काफी हद तक मायलोइड मूल (मोनोसाइट्स और सीडीसी) की कोशिकाओं के साथ-साथ पीडीसी तक ही सीमित थी, जो किसभी अपेक्षित एफसी रुपये और टीएलआर7 और/या टीएलआर8 व्यक्त करते हैं। मोनोसाइट्स और सीडीसी में, आईएसएसी द्वारा प्रेरित उत्तेजना के परिणामस्वरूप एमएपीकेएपीके 2, पी 38, सीआरईबी, और राइबोसोमल प्रोटीन एस 6 (आरपीएस 6) का काफी अधिक फास्फोराइलेशन हुआ, जो डाउनस्ट्रीम प्रोटीन संश्लेषण (चित्रा 2 ए-सी और पूरक चित्रा 7 ए) शुरू करने की आवश्यकता है। CD141 प्लस cDCs और CD1c प्लस cDCs ने दोनों CDC उपसमुच्चयों में pIRF7 के तुलनीय स्तर दिखाए, जबकि RPS6 और pERK1 / 2 के स्तर CD141 प्लस cDCs में उच्च ट्रेंड में थे, जो CD1c की तुलना में CD8 प्लस T सेल प्राइमिंग और एंटीजन क्रॉस-प्रेजेंटेशन में उत्कृष्ट हैं। प्लस सीडीसी (पूरक चित्रा 7बी)।

T785-ISAC उत्तेजना के कैनेटीक्स अपेक्षित सिग्नलिंग गतिकी के अनुरूप थे: ERK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन 5 मिनट के बाद चरम पर था, जबकि इसका डाउनस्ट्रीम पार्टनर RPS6 15-मिनट समय बिंदु (पूरक) तक चरम फॉस्फोराइलेशन तक नहीं पहुंचा था। चित्रा 7सी)। यह कैनेटीक्स अपेक्षित गतिकी का समर्थन करता है क्योंकि सिग्नलिंग समय के साथ फैलता है, और सुझाव देता है कि एपीसी के आईएसएसी उत्तेजना के लिए एक निरंतर और प्रवर्धित सिग्नलिंग प्रतिक्रिया है। एफसी आर और टीएलआर सिग्नलिंग मार्ग से जुड़े आईएसएसी उत्तेजना के बाद देखी गई प्रवर्धित प्रतिक्रिया को देखते हुए, हमने अगली बार सशर्त-घनत्व पुन: नमूना अनुमान पारस्परिक सूचना (डीआरईएमआई) और सशर्त-घनत्व पुनर्विक्रय विज़ुअलाइज़ेशन (डीआरईवीआई) एल्गोरिदम का उपयोग जोड़ीदार संबंधों की ताकत को मापने के लिए किया। एफसी आर और टीएलआर सिग्नलिंग मार्ग 32. ये एल्गोरिदम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए DREVI प्लॉट उत्पन्न करते हैं, जहां वक्र के नीचे का क्षेत्र (एयूसी) समग्र सिग्नल तीव्रता का संकेतक है, विभक्ति बिंदु (आईपी) सक्रियण सीमा का एक उपाय है, और DREMI स्कोर प्रश्न में दो फॉस्फोप्रोटीन की जोड़ीदार निर्भरता को निर्धारित करता है। इस विश्लेषण ने बढ़े हुए DREMI स्कोर की पहचान की, जो कि T 785- ISAC उत्तेजना के बाद Fc R और TLR सिग्नलिंग पाथवे से जुड़े प्रोटीन के बीच बढ़ी हुई जोड़ीदार निर्भरता का संकेत है, जो कि इक्विमोलर मिश्रण नियंत्रण (चित्र 2D) की तुलना में है। pERK1 / 2 और pIRF7 के बीच एक मजबूत अन्योन्याश्रयता को विशिष्ट रूप से T 785- ISAC के साथ उत्तेजना के बाद देखा गया था, लेकिन मिश्रण नहीं, जैसा कि बढ़े हुए DREMI स्कोर, प्रवर्धित संकेत तीव्रता, और IRF7 फॉस्फोराइलेशन (चित्रा 2D) के लिए आवश्यक कम सक्रियण सीमा से संकेत मिलता है। ) इस विश्लेषण ने ISAC उत्तेजना के बाद प्रोटीन अनुवाद (RPS6 फॉस्फोराइलेशन) शुरू करने के लिए आवश्यक एक कम सक्रियण सीमा का भी संकेत दिया, जैसा कि बढ़े हुए DREMI स्कोर द्वारा निर्धारित किया गया है और pERK1 / 2- pRPS6 और pIRF 7- pRPS6 के जोड़ीदार संयोजनों के लिए IP को कम किया गया है। . इसके अलावा, RPS6 फॉस्फोराइलेशन का स्तर ERK1 / 2 या IRF7 फॉस्फोराइलेशन के परिणामस्वरूप बढ़ाया गया था, जैसा कि जोड़ीदार AUCs (चित्र 2D) द्वारा निर्धारित किया गया था। ये संयुक्त परिणाम न केवल अपेक्षित एफसी आर और टीएलआर मार्गों के माध्यम से आईएसएसी के संकेतन की पुष्टि करते हैं, बल्कि इसके अलावा, दो मार्गों के बीच तालमेल का समर्थन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप सक्रियण सीमा कम हो जाती है और संकेत तीव्रता बढ़ जाती है।

चित्रा 3: आईएसएसी को माइलॉयड सक्रियण में मध्यस्थता करने के लिए एफसी इफेक्टर फ़ंक्शन और टीएलआर एगोनिस्ट की आवश्यकता होती है। ताजा पृथक मानव माइलॉयड एपीसी को सीडी 20 प्लस टोलेडो ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में 3:1 इफ़ेक्टर टू टारगेट अनुपात और (ए) 80 एनएम की उपस्थिति में 18 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। 1 μM R406 के साथ या उसके बिना rituximab-ISAC का, (b) संकेतित एंटीबॉडी आइसोटाइप पर rituximab-ISAC, (c) rituximab-ISAC या deglycosylated rituximab-ISAC (ISAC-deglycosylated)। (एसी) कोशिकाओं का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था और डेटा को माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में सूचित किया जाता है। ( d ) HEK-Blue-TLR7 या TLR8 रिपोर्टर कोशिकाओं को NF-κB- प्रेरित SEAP गतिविधि के मूल्यांकन से पहले T785 या TLRnull की उपस्थिति में 18 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। दिखाया गया डेटा है1 प्रयोग से और कम से कम 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि से। (ई) सीडी 20 प्लस टोलेडो ट्यूमर कोशिकाओं और संकेतित रीटक्सिमैब-आईएसएसी की उपस्थिति में ताजा पृथक मानव मायलोइड एपीसी को 18 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री (माध्यिका के रूप में दिखाया गया डेटा) द्वारा विश्लेषण किया गया था।प्रतिदीप्ति तीव्रता)। (एई) दिखाए गए डेटा 1-4 अतिरिक्त प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं और प्रत्येक प्रयोग (माध्य और एसईएम) के लिए 3 दाताओं से अधिक या उसके बराबर हैं। सांख्यिकीय महत्व को *P . के रूप में परिभाषित किया गया है<0.05,><0.01,><0.001,><>

आईएसएसी को माइलॉयड एपीसी के सक्रियण में मध्यस्थता करने के लिए एफसी इफेक्टर फ़ंक्शन की आवश्यकता होती है। आईएसएसी फ़ंक्शन में एफसी गतिविधि के योगदान की जांच आर 406 के साथ डाउनस्ट्रीम एफसी आर सिग्नलिंग के अपस्फीति के बाद की गई थी, जो साइक का एक छोटा अणु किनेज अवरोधक है जो सक्रिय एफसी के डाउनस्ट्रीम सिग्नल ट्रांसडक्शन को रोकता है 33,34 रुपये . R406 के अतिरिक्त ने T785-ISAC की मध्यस्थता वाले माइलॉयड सक्रियण को समाप्त कर दिया, जैसा कि कॉस्टिम्युलेटरी अणु सीडी के अपग्रेडेशन की कमी 86 से स्पष्ट है, लेकिन T785 द्वारा TLR7/8 सक्रियण के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में बदलाव नहीं किया (चित्र 3A) और पूरक चित्र 8)। R406 के साथ Syk निषेध भी निरस्त सिग्नलिंग मोनोसाइट्स में T 785- ISAC उत्तेजना के बाद देखा गया था, के साथफॉस्फोराइलेटेड एमएपीकेएपीके-2, ईआरके1/2, और आईआरएफ7 के स्तर में काफी कमी आई है (पूरक चित्रा 7डी)।इन आंकड़ों को देखते हुए, रीतुसीमाब टी785-आईएसएसी को चार प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले आइसोटाइप्स में से प्रत्येक पर तुलनीय डीएआर के साथ तैयार किया गया था ताकि यह परिभाषित किया जा सके कि टी785-आईएसएसी गतिविधि किस सीमा तक ज्ञात एफसी आर बाइंडिंग एफिनिटीज 35,36 के साथ बदलती है। एग्लीकोसिलेटेड और फ्यूकोसिलेटेड रीटक्सिमैब ISACs की भी जांच की गई, क्योंकि ग्लाइकोसिलेशन Fc R बाइंडिंग को समाप्त कर देता है, जबकि fucosylation FCGR3A 37 के लिए बाइंडिंग एफिनिटी को बढ़ाता है। रीटक्सिमैब T785-ISAC की इम्युनोस्टिम्युलेटरी क्षमता एंटीबॉडी आइसोटाइप के Fc R आत्मीयता के साथ सहसंबद्ध है (चित्र। 3बी)। इसके विपरीत, फ्यूकोसिलेटेड IgG1 (IgG1-AF), वाइल्डटाइप IgG1, और IgG3 T785-ISACs ने IgG1-AF T785-ISAC के साथ माइलॉयड सक्रियण प्राप्त किया। सीडी का स्तर 86 अपग्रेडेशन (चित्र 3ख)। PNGase F के साथ वाइल्डटाइप रिट्क्सिमैब T785-ISAC का डिग्लाइकोसिलेशन, जो Fc-Fc R बाइंडिंग आत्मीयता को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो में ISAC प्रतिरक्षा उत्तेजक गतिविधि कम हो जाती है, जो कार्यात्मक रूप से सक्रिय Fc क्षेत्र (चित्र 3C) के महत्व का समर्थन करती है।

आईएसएसी को माइलॉयड सक्रियण में मध्यस्थता के लिए टीएलआर एगोनिज्म की आवश्यकता होती हैआईएसएसी फ़ंक्शन पर टीएलआर गतिविधि के योगदान की जांच टीएलआर एगोनिज्म के उन्मूलन के बाद टी785 से 2-अमीनो पाइरीडीन को हटाकर की गई थी, जिसके बारे में माना जाता है कि यह बाध्यकारी में महत्वपूर्ण एस्पार्टेट अवशेषों के साथ एक नमक पुल बनाता है। TLR7 और TLR8 38 (TLRnull, चित्र 3D) की जेबें। TLRnull यौगिक को रीटक्सिमैब (TLRnull ISAC) से संयुग्मित किया गया था और इन विट्रो में CD20 प्लस ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में माइलॉयड सक्रियण क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया था। TLRnull ISAC ने कॉस्टिमुलिटरी अणु CD86 के अपग्रेडेशन को प्रेरित नहीं किया या CD14 या CD123 की अभिव्यक्ति को संशोधित नहीं किया, यह दर्शाता है कि T785-ISACs (चित्र 3E) के साथ देखे गए सक्रियण फेनोटाइप के लिए TLR एगोनिज़्म की आवश्यकता है। इसके अलावा, TLRnull ISAC ने मोनोसाइट्स में IRF -7 के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित नहीं किया, जो TLR7/8 (पूरक चित्रा 7E) को संलग्न करने में असमर्थता के अनुरूप है। व्यवस्थित रूप से प्रशासित ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785- ISAC की अनुपस्थिति में ट्यूमर को समाप्त करता है। मानव ज़ेनोग्राफ़्ट ट्यूमर मॉडल में बी, टी, या एनके सेल गतिविधिबी, टी, और एनके सेल गतिविधि की अनुपस्थिति में माइलॉयड- और न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता वाले ठोस ट्यूमर के विनाश को प्रेरित करने के लिए आईएसएसी की क्षमता का मूल्यांकन मानव ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल 39,40 का उपयोग करके किया गया था। Trastuzumab, एक नैदानिक ​​रूप से मान्य HER2-लक्षित एंटीबॉडी, को यह निर्धारित करने के लिए जांच के लिए चुना गया था कि क्या Trastuzumab T785-ISAC HER2 प्लस सॉलिड ट्यूमर मॉडल (चित्र 4 और पूरक चित्र 9) में ट्रैस्टुज़ुमैब के लिए ट्यूमर प्रतिरोध को दूर कर सकता है। ) 41,42. सबसे पहले, ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785-आईएसएसी के प्रणालीगत प्रशासन की तुलना ट्रैस्टुज़ुमैब और टी785 के मिश्रण के इंट्रा-ट्यूमर डिलीवरी से की गई थी। ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785-आईएसएसी ने ट्यूमर प्रतिगमन और निकासी को उकसाया, जबकि घटकों के एक विषुव मिश्रण की डिलीवरी ने अकेले ट्रैस्टुज़ुमैब (चित्रा 4ए) की तुलना में न्यूनतम चिकित्सीय लाभ प्रदान किया। उनके उपयुक्त आइसोटाइप नियंत्रणों के साथ ट्यूमर-लक्षित आईएसएसी की तुलना करने वाले बाद के अध्ययनों ने पुष्टि की कि ट्यूमर-लक्षित गतिविधि के लिए ट्यूमर-लक्षित (चित्रा 4बी और पूरक चित्रा 10) की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण रूप से, ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785- आईएसएसी के प्रणालीगत प्रशासन और इसके आइसोटाइप नियंत्रण को शरीर के वजन पर न्यूनतम प्रभाव के साथ अच्छी तरह से सहन किया गया था (पूरक चित्रा 11)।यह निर्धारित करने के लिए कि विवो में आईएसएसी प्रभावकारिता में योगदान देने वाली क्रिया का तंत्र इन विट्रो में वर्णित समान है, एफसी-अक्षम (ट्रैस्टुजुमाब एन297ए-आईएसएसी) और ट्रैस्टुजुमाब टीएलआरनुल-आईएसएसी का परीक्षण एक ही स्तन ट्यूमर xenograft मॉडल में किया गया था।वाइल्डटाइप ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-ISAC के समानांतर।जबकि ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी ने ट्यूमर के प्रतिगमन और निकासी का नेतृत्व किया, एफसी-अक्षम और टीएलआरनल दोनों आईएसएसी ट्यूमर-विरोधी गतिविधि (चित्रा 4सी) को प्राप्त करने में विफल रहे।साथ में ये डेटा ट्यूमर लक्ष्यीकरण और ISAC एंटी-ट्यूमर गतिविधि के लिए Fc R और TLR दोनों सगाई की आवश्यकता का संकेत देते हैं।

ट्यूमर-विरोधी प्रभावों की मध्यस्थता में न्युट्रोफिल बनाम अन्य मायलोइड कोशिकाओं के अंतर योगदान का मूल्यांकन सेल-विशिष्ट कमी द्वारा किया गया था।एक Ly6G एंटीबॉडी का उपयोग करके न्यूट्रोफिल समाप्त हो गए थे, जबकि न्यूट्रोफिल और अपरिपक्व APCs (मोनोसाइट्स) दोनों की कमीGr1 एंटीबॉडी के साथ हासिल किया गया था।क्लोड्रोनेट-लोडेड लिपोसोम का उपयोग करके फागोसाइटिक कोशिकाओं को समाप्त कर दिया गया था।हमने पाया कि फैगोसाइटिक कोशिकाओं, संभवतः मैक्रोफेज, ने आईएसएसी उपचार (चित्रा 4डी) के बाद एंटी-ट्यूमर गतिविधि की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण योगदान दिया।हालांकि, Ly6G विरोधी के साथ न्यूट्रोफिल की कमी का ISAC प्रभावकारिता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।Gr1 की कमी ने ISAC की मध्यस्थता की प्रभावकारिता को तुरंत प्रभावित नहीं किया, लेकिन ट्यूमर नियंत्रण (चित्रा 4D) की अवधि को कम कर दिया।कम . वाले मॉडलों में ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने के लिए टी785-आईएसएसी की क्षमता की जांच करने के लिएHER2 अभिव्यक्ति, हमने अगली बार ट्रैस्टुज़ुमैब-प्रतिरोधी, HER 2- मध्यम व्यक्त ट्यूमर मॉडल, JIMT -1 में प्रभावकारिता का मॉडल तैयार किया।JIMT-1 कैंसर सेल लाइन में सतह HER2 की लगभग 6.5 x105 प्रतियां होने का अनुमान है और यह निम्न स्तर को व्यक्त करता हैHER2 प्रवाह cytometry 43 द्वारा HCC1954 ट्यूमर सेल लाइन की तुलना में।जबट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी ने आइसोटाइप आईएसएसी या ट्रैस्टुज़ुमैब नियंत्रण की तुलना में ट्यूमर के विकास को काफी धीमा कर दिया, कोई ट्यूमर प्रतिगमन या निकासी नहीं देखी गई (चित्रा 4ई)।हमने उस पर्टुजुमाब की परिकल्पना की थी, जो एक HER2 एपिटोप को ट्रैस्टुजुमाब की बाध्यकारी साइट से अलग बांधता है, Fc-क्लस्टरिंग को बढ़ाएगा, और बाद में JIMT -1 मॉडल में ADCP और ISAC की प्रभावकारिता को बढ़ाएगा।ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी और पेर्टुज़ुमैब के संयोजन से उल्लेखनीय रूप से बढ़ी हुई प्रभावकारिता और महत्वपूर्ण ट्यूमर प्रतिगमन (चित्रा 4F) हुआ।Trastuzumab T785-ISAC की प्रतिरक्षा उत्तेजना के बिना, trastuzumab के साथ pertuzumab के संयोजन से कोई लाभ नहीं हुआ।

हमने अगली बार ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी द्वारा ट्रिगर की गई आणविक और सेलुलर घटनाओं की जांच की, जिसके परिणामस्वरूप अंततः एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता हुई।ट्यूमर में प्रारंभिक जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तननैनोस्ट्रिंग माउस पैन-कैंसर प्रतिरक्षा प्रोफाइलिंग पैनल के साथ मापा गया था, जिसमें टीएलआर 7 सिग्नलिंग और सक्रियण (आईआरएफ -7, एनएफ-केबी से जुड़े जीन) से जुड़े जीन सहित उपचार के 24 घंटों के भीतर जीन के 13.7 प्रतिशत के महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन का खुलासा किया गया था।ट्रैस्टुज़ुमैब या आइसोटाइप टी के बाद 0-0.1 प्रतिशत की तुलना में 785-आईएसएसी उपचार (चित्र 4जी) 44।एनसॉल्वर एडवांस्ड एनालिसिस पाथवे स्कोर द्वारा मूल्यांकन किए गए जीन एक्सप्रेशन पाथवे के विश्लेषण से प्रमुख प्रतिरक्षा-संबंधित जीन हस्ताक्षरों (मैक्रोफेज फंक्शंस, डीसी फंक्शंस, एंटीजन प्रोसेसिंग और प्रेजेंटेशन) के महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन का पता चला, जो थेइन विट्रो और इन विवो निष्कर्षों के अनुरूप है कि एफसी-एफसी आर इंटरैक्शन आईएसएसी-मध्यस्थता गतिविधि (चित्रा 4एच और पूरक चित्रा 12) के लिए महत्वपूर्ण हैं।केमोकाइन्स और साइटोकिन्स से जुड़े जीन सिग्नेचर स्कोर ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी उपचार के बाद अत्यधिक बढ़े हुए थे, जो प्रशासन के 24 घंटे बाद ट्यूमर के भीतर साइटोकिन और केमोकाइन स्राव को मापने वाले प्रोटीन परिमाणीकरण के अनुरूप थे (चित्र 4H)और पूरक चित्र 13)।इन निष्कर्षों, इन विट्रो और विवो प्रभावकारिता डेटा के अनुरूप, एक मजबूत टीएलआर- और एफसी आर-मध्यस्थता प्रतिक्रिया आईएसएसी द्वारा प्रेरित है।

फ्लो साइटोमेट्री और आईएचसी का उपयोग यह आकलन करने के लिए किया गया था कि क्या टी 785-आईएसएसी-मध्यस्थता सक्रियण और केमोकाइन अभिव्यक्ति में वृद्धि अंततः प्रतिरक्षा प्रभावकारी कोशिकाओं की भर्ती के लिए हुई।माइलॉयड प्रतिरक्षा घुसपैठ को 24 घंटे और 7 दिनों के बाद ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785- ISAC या ट्रैस्टुज़ुमैब की एकल खुराक के प्रशासन द्वारा और अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में प्रवाहित किया गया था।उपचार के 24 घंटे बाद ट्यूमर के विश्लेषण से पता चलाCD11b प्लस Ly6C प्लस मोनोसाइट्स और CD11b प्लस Ly6G प्लस ग्रैन्यूलोसाइट्स की घुसपैठ ट्रैस्टुज़ुमैब या ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785- के साथ इलाज किए गए ट्यूमर में अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 4I) की तुलना में।उपचार के सात दिनों के बाद, सीडी11बी प्लस सीडी11सी प्लस एफ4/80 प्लस पॉजिटिव मायलोइड एपीसी को ट्रैस्टुजुमाब टी 785-आईएसएसी उपचारित समूह की तुलना में काफी बढ़ा दिया गया था।ट्रैस्टुज़ुमैब या अनुपचारित नियंत्रण (चित्र 4I) 45,46।मायलोइड एपीसी में यह वृद्धि हो सकती हैट्रैस्टुजुमाब टी785-आईएसएसी उपचार के बाद मायलोइड-संबंधित केमोकाइन के उत्पादन में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए जिम्मेदार।जबकि 24- घंटे के समय बिंदु पर माइलॉयड एपीसी की आवृत्ति में कोई उल्लेखनीय वृद्धि नहीं हुई थी, इस फेनोटाइप की कोशिकाओं को ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी उपचार के बाद सक्रिय किया गया था, जैसा कि कोशिका की सतह पर सीडी40 के अपग्रेडेशन द्वारा मापा जाता है। , ट्रैस्टुज़ुमैब या अनुपचारित नियंत्रणों से समान जनसंख्या की तुलना में (चित्र 4I)।नैनोस्ट्रिंग डेटा के साथ यह खोज आगे ट्रैस्टुज़ुमैब टी785-आईएसएसी की ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मायलोइड कोशिकाओं को संलग्न और सक्रिय करने की क्षमता को प्रदर्शित करती है।उपचार के एक सप्ताह बाद देखे गए माइलॉयड एपीसी की सीडी 11 बी सकारात्मकता को देखते हुए, मोनोसाइट्स की शुरुआती घुसपैठ माइलॉयड एपीसी आबादी के अग्रदूत हो सकते हैं जो आईएसएसी-उपचारित ट्यूमर में परिपक्व होते हैं, लेकिन ट्रैस्टुज़ुमैब-उपचारित ट्यूमर में नहीं।हालांकि, यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि नैनोस्ट्रिंग और एमएसडी द्वारा आईएसएसी उत्तेजना के 24 घंटे बाद प्रो-इंफ्लेमेटरी समीपस्थ घटनाओं को कैसे मापा जाता है, जो अंततः बाद में 6- दिन के समय बिंदु पर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मायलोइड कोशिकाओं की परिपक्वता जैसी डिस्टल घटनाओं को प्रभावित करता है। , और अंततः, ट्यूमर प्रतिगमन और निकासी को प्रभावित किया।
अंत में, आईएचसी को इसके नियंत्रण की तुलना में ट्रैस्टुजुमाब टी 785-आईएसएसी के साथ उपचार के बाद ट्यूमर में प्रमुख प्रतिरक्षा सेल आबादी की उपस्थिति और स्थान का आकलन करने के लिए किया गया था।दिन 7 प्रवाह साइटोमेट्री के अनुरूप, F4/80 व्यक्त कोशिकाओं मेंट्यूमर और पेरिटुमोरल क्षेत्र को ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785- ISAC (चित्र 4J) के साथ एकल उपचार के बाद 9 दिन में ऊंचा किया गया था।इसके अलावा, लक्षित ISAC उपचार के परिणामस्वरूप पेरिटुमोरल क्षेत्र में CD11c प्लस कोशिकाओं में नाटकीय वृद्धि हुई जो कि rHER2 एंटीबॉडी उपचार या आइसोटाइप या आइसोटाइप-आईएसएसी (चित्रा 4J) के साथ उपचार के बाद नहीं देखी गई थी।फ्लो साइटोमेट्री और IHC दोनों द्वारा CD11c प्लस कोशिकाओं में वृद्धि को NanoString डेटा में भी दर्शाया गया था, जिसमें ITGAX की mRNA अभिव्यक्ति 6 ​​और 9 दिनों में ट्रैस्टुज़ुमैब टी 785- ISAC प्रशासन (पूरक चित्रा 14) के बाद काफी बढ़ गई थी।

चित्र 5: T785-ISACs MMC सिनजेनिक ट्यूमर मॉडल में मजबूत एंटी-ट्यूमर प्रभाव प्राप्त करते हैं। (आह) FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) चूहों को MMC ट्यूमर सेल लाइन के साथ प्रत्यारोपित किया गया। (ए) ट्यूमर की मात्रा लगभग 500 मिमी 3 तक पहुंचने पर मादा चूहों को यादृच्छिक किया गया था। चूहे को तब इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से माउस विरोधी चूहे HER2 एंटीबॉडी के 5 मिलीग्राम / किग्रा q5d x 2, माउस विरोधी चूहे HER2 T 785- ISAC, या आइसोटाइप T 785- ISAC (TA99) (n) के साथ इलाज किया गया था। =4-7 प्रति हाथ चूहे)। (बी, सी) नर चूहों को यादृच्छिक किया गया था जब ट्यूमर की मात्रा लगभग 500 मिमी 3 तक पहुंच गई थी और फागोसाइट रिक्तीकरण के लिए क्लोड्रोनेट-लोडेड या नियंत्रण लिपोसोम के साथ प्रारंभिक उपचार की तारीख से एक दिन पहले शुरू किया गया था (दिन 15 के माध्यम से 6 चक्र) या विरोधी -सीडी8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >उनके अंतिम उपचार के 60 दिन बाद एमएमसी ट्यूमर सेल लाइन के साथ चुनौती दी गई। ट्यूमर भोले चूहों ने आरोपण नियंत्रण (एन =5 प्रति समूह चूहों) के रूप में कार्य किया। (विज्ञापन) डेटा कम से कम 2 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। एक बार ट्यूमर होने पर चूहे मानवीय रूप से इच्छामृत्यु कर दिए गए थे2,000 मिमी3 पर पहुंच गया। डेटा उन समूहों के लिए दिखाया गया है जिनमें कोई ट्यूमर नहीं पहुंचा था2,000 मिमी3. (ईआई) चूहों के समूह यादृच्छिक थे जब एमएमसी ट्यूमर ट्यूमर की मात्रा लगभग 5 0 0 मिमी 3 तक पहुंच गई और 5 मिलीग्राम / किग्रा आईएसएसी या नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दिन 0 और दिन 5 में इलाज किया गया। एमएसडी द्वारा साइटोकिन माप के लिए ट्यूमर को संसाधित किया गया था। , प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, नैनोस्ट्रिंग एमआरएनए मात्रा का ठहराव, या फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड के लिएदिखाए गए समय पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। (ई) ज्वालामुखी भूखंड नैनोस्ट्रिंग द्वारा 24 घंटे (एन =5 चूहों प्रति समूह) में मापा गया इलाज बनाम आइसोटाइप नियंत्रण ट्यूमर में जीन अभिव्यक्ति के लॉग 2 गुना परिवर्तन को दर्शाते हैं। < 0.05="" के="" समायोजित="" पी-मान="" के="" साथ="" परिवर्तन="" लाल="" रंग="" में="" दिखाए="" जाते="" हैं।="" (="" च="" )="" उपचार="" के="" 24="" घंटे="" बाद="" विश्लेषण="" किए="" गए="" ट्यूमर="" के="" लिए="" nsolver="" एडवांस्ड="" एनालिसिस="" पाथवे="" स्कोर="" द्वारा="" निर्धारित="" जीन="" सिग्नेचर="" स्कोर="" (="" n="5" प्रति="" समूह="" चूहों)।="" (छ,="" ज)="" उपचार="" की="" शुरुआत="" के="" 24="" घंटे="" और="" 6="" दिन="" बाद="" ट्यूमर="" कोशिकीय="" संरचना="" और="" सक्रियण="" अवस्था="" का="" फ्लो="" साइटोमेट्री="" विश्लेषण="" (एन="4" प्रति="" समूह="" चूहों)।="" डेटा="" कम="" से="" कम="" 2="" प्रयोगों="" के="" प्रतिनिधि="" हैं।="">प्रतिनिधि छवियों के साथ-साथ F4/80, CD11c, और CD8 IHC ट्यूमर की मात्रा का ठहराव प्रत्येक संकेतित उपचार के 6 दिन बाद काटा गया। स्केल बार 50 माइक्रोन हैं। (i) डेटा को माध्य और SEM के रूप में सूचित किया जाता है; *पी<0.05,><0.01,><0.001,><>

ट्यूमर-लक्षित टी785-आईएसएसी, सिनजेनिक एमएमसी ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर रिग्रेशन को ग्रहण करता है
बी, टी, और एनके कोशिकाओं की उपस्थिति में ट्यूमर-विरोधी प्रभावकारिता की मध्यस्थता करने के लिए आईएसएसी की क्षमता का आकलन करने के लिए, हमने एक समानार्थी चूहे एचईआर 2 (आरएचईआर 2) -एक्सप्रेसिंग माउस स्तन कार्सिनोमा (एमएमसी) सेल लाइन का इस्तेमाल किया जो एक सहज स्तन से प्राप्त हुआ था। आरएचईआर 2- में कार्सिनोमा एफवीबी चूहों को व्यक्त करता है।MMC में rHER2 अभिव्यक्ति से जुड़ी क्रॉस-प्रजाति इम्युनोजेनेसिटी को कम करने के लिए, ट्रांसजेनिक चूहों जो अंतर्जात रूप से चूहे Her2 को नियंत्रण में व्यक्त करते हैंएमएमटीवी प्रमोटर के मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया गया था (पूरक चित्रा 15) 47. पूरी तरह से बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली की उपस्थिति का लाभ उठाते हुए, हमने 500 मिमी 3 के बड़े ट्यूमर बोझ के साथ ट्यूमर से निपटने के लिए आईएसएसी की क्षमता का आकलन करने का लक्ष्य रखा, क्योंकि आमतौर पर बड़े ट्यूमर होते हैं प्री-क्लिनिकल मॉडल में इलाज करना अधिक कठिन है 48. rHER2 T785-ISAC सहित सभी उपचारों का प्रणालीगत प्रशासन, शरीर के वजन पर न्यूनतम प्रभाव के साथ अच्छी तरह से सहन किया गया था (पूरक चित्र 16A)। हालांकि, केवल rHER2 T785-ISAC, बड़े, स्थापित ट्यूमर (चित्र 5क) को प्रभावित करने वाले चूहों को ठीक करने में सक्षम था। जैसा कि ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल में देखा गया था, सेल रिक्तीकरण अध्ययनों से पता चला है कि जब फ़ैगोसाइटिक कोशिकाओं को क्लोड्रोनेट-लोडेड लिपोसोम (चित्रा 5 बी) से समाप्त कर दिया गया था, तो महत्वपूर्ण एंटी-ट्यूमर गतिविधि खो गई थी। जबकि ISAC से T कोशिकाओं पर सीधे कार्य करने की अपेक्षा नहीं की जाती है, एक सीडी के साथ पूर्व-उपचार किए गए चूहों 8- घटते एंटीबॉडी ने rHER2 T 785- ISAC (चित्र 5C) के दो प्रशासनों के बाद ट्यूमर को साफ करने की क्षमता खो दी। इससे पता चलता है कि ट्यूमर-लक्षित आईएसएसी ट्यूमर से जुड़े प्रतिजनों की प्रस्तुति के बाद, टी कोशिकाओं के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से कार्य कर सकते हैं। प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति की उपस्थिति के अनुरूप, चूहोंrHER2 T के बाद MMC ट्यूमर को ठीक किया गया 785- ISAC उपचार को ट्यूमर रिकॉलेंज (चित्र 5D) से बचाया गया।

सिनजेनिक मॉडल में आईएसएसी प्रभावकारिता अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए, हमने अगली बार आईएसएसी खुराक के बाद ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में सेलुलर, ट्रांसक्रिप्शनल और साइटोकाइन परिवर्तनों की जांच की। बड़े MMC ट्यूमर वाले चूहों के दो समूहों का इलाज rHER2 T 785- ISAC या नियंत्रण से किया गया। पहले कॉहोर्ट से ट्यूमर को खुराक (दिन 1) के 24 घंटे बाद काटा गया था जब सभी ट्यूमर समान आकार के थे (पूरक चित्रा 16 बी)। दूसरे कोहोर्ट को पहले के 5 दिन बाद दूसरी खुराक दी गई, फिर 24 घंटे बाद (दिन 6) काटा गया, जिस बिंदु पर टी 785-आईएसएसी (पूरक चित्रा 16 बी) के साथ इलाज किए गए लोगों को छोड़कर सभी उपचार समूहों में ट्यूमर औसत दर्जे का हो गया। ) ट्यूमर का विश्लेषण IHC, mRNA अभिव्यक्ति और प्रोटीन लाइसेट्स में साइटोकाइन स्राव द्वारा किया गया था। आगे एक्सनोग्राफ़्ट मॉडल में हमारी टिप्पणियों का समर्थन करते हुए कि आईएसएसी गतिविधि के लिए ट्यूमर लक्ष्यीकरण आवश्यक है, आरएचईआर 2 टी 785- के 24 घंटे बाद ट्यूमर के एमआरएनए विश्लेषण ने नैनोस्ट्रिंग माउस पैन-कैंसर प्रतिरक्षा में जीन के 34.1 प्रतिशत के नाटकीय अपग्रेडेशन को दिखाया। आइसोटाइप-उपचारित ट्यूमर की तुलना में प्रोफाइलिंग पैनल। अकेले एंटी-आरएचईआर 2 एंटीबॉडी का जीन अभिव्यक्ति (विश्लेषण किए गए जीन का 3.5 प्रतिशत) पर केवल थोड़ा सा प्रभाव था, जबकि गैर-लक्षित आइसोटाइप टी 785-आईएसएसी ने जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 5ई) को प्रभावित नहीं किया। जैसा कि HCC1954 xenograft मॉडल में देखा गया है, TLR 7- मध्यस्थता संकेतन और सक्रियण से जुड़े जीनों को ट्यूमर-लक्षित rHER2 T 785- ISAC द्वारा काफी हद तक अपग्रेड किया गया था, जो एक मजबूत TLR-मध्यस्थता प्रतिक्रिया (चित्र 5E) का संकेत है। जीन एक्सप्रेशन पाथवे विश्लेषण ने फिर से प्रमुख प्रतिरक्षा-संबंधी जीन हस्ताक्षरों के महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन का खुलासा किया, जिसमें जीन एक्सप्रेशन पाथवे विश्लेषण के लिए हस्ताक्षर शामिल हैं, rHER2 T 785- ISAC उपचार के बाद प्रमुख प्रतिरक्षा-संबंधित जीन हस्ताक्षरों के महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन का पता चला, जिसमें केमोकाइन्स से जुड़े लोग भी शामिल हैं। और साइटोकिन्स (चित्र 5F)। प्रोटीन की मात्रा का ठहराव उसी ट्यूमर पर किया गया था जैसा कि नैनोस्ट्रिंग द्वारा विश्लेषण किया गया था, और जीन हस्ताक्षर निष्कर्षों के अनुरूप, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और केमोकाइन के स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई थी, जिसे rHER2 T 785- ISAC उपचार (पूरक चित्रा 17) के बाद 24 घंटे में मापा गया था। ) एंटीजन प्रोसेसिंग और प्रेजेंटेशन, डेंड्रिटिक सेल फंक्शन और मैक्रोफेज फंक्शन के लिए जीन सिग्नेचर स्कोर को भी काफी बढ़ा दिया गया था, जो rHER2 T 785-ISAC के 24 घंटे बाद anFc-Fc R मध्यस्थता और फागोसाइटोसिस-चालित प्रतिक्रिया का समर्थन करता है।उपचार (चित्र 5F और पूरक चित्र 18)। एक मजबूत टीएलआर- और एफसी आर-मध्यस्थता प्रतिक्रिया से संबद्ध महत्वपूर्ण रूप से उन्नत जीन हस्ताक्षर स्कोर के अलावा, टी सेल कार्यों के लिए जीन हस्ताक्षर स्कोर भी आरएचईआर 2 टी 785-आईएसएसी उपचार के 24 घंटों के भीतर काफी बढ़ गया था, आगे समर्थन करते हुए यह पता लगाना कि ISAC-मध्यस्थता प्रभावकारिता के लिए T कोशिकाओं की आवश्यकता है (चित्र 5F और पूरक चित्र 18)।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए जो प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन और केमोकाइन उत्पादन में शुरुआती वृद्धि में योगदान कर सकते हैं, ट्यूमर का विश्लेषण rHER2 T 785- ISAC या नियंत्रण की पहली खुराक के 24 घंटे बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था, और दीक्षा के 6 दिन बाद किया गया था। उपचार, दूसरी खुराक के 24 घंटे बाद। पहले दिन ट्यूमर के विश्लेषण से पता चला कि rHER2 T785-ISAC, और CD11b प्लस Ly6G प्लस ग्रैन्यूलोसाइट्स के साथ इलाज किए गए ट्यूमर में rHER2 mAb या rHER2 T785-ISAC के साथ इलाज किए गए ट्यूमर में CD11b प्लस Ly6C प्लस मोनोसाइट्स की घुसपैठ का पता चला है। , लेकिन आइसोटाइप ISAC या आइसोटाइप एंटीबॉडी नियंत्रण नहीं (चित्र 5G)। मोनोसाइट्स का स्तर rHER2 T 785- ISAC उपचारित ट्यूमर में 6 दिनों के बाद और भी बढ़ गया। HCC1954 xenograft मॉडल में हमने जो देखा, उसके समान, myeloid APCs (CD11b plus CD11c plus F4/80 plus ) को नियंत्रणों की तुलना में rHER2 T 785- ISAC उपचार के बाद 6 दिन में काफी ऊंचा किया गया था (चित्र 5G और पूरक चित्र 19) ) इसके अलावा, माइलॉयड APCs को विशेष रूप से rHER2 T 785- ISAC उपचारित समूह में दोनों समय बिंदुओं पर सक्रिय पाया गया, जैसा कि कोशिका की सतह पर CD40 के अपग्रेडेशन द्वारा मापा जाता है (चित्र 5H)। महत्वपूर्ण रूप से, क्लोड्रोनेट-लोडेड लिपोसोम (पूरक चित्रा 20) का उपयोग करके फागोसाइट रिक्तीकरण के बाद ट्यूमर मायलोइड एपीसी में वृद्धि को मापा नहीं गया था। अंत में, IHC को rHER2 T 785- ISAC के साथ उपचार के बाद MMC मॉडल में प्रमुख प्रतिरक्षा सेल आबादी की उपस्थिति और स्थान का आकलन करने के लिए किया गया था। जैसा कि HCC1954 xenograft मॉडल में देखा गया था, rHER2 T 785- ISAC के साथ उपचार के परिणामस्वरूप पेरिटुमोरल क्षेत्र में CD11c प्लस और F4/80 प्लस कोशिकाओं में नाटकीय वृद्धि हुई जो rHER2 एंटीबॉडी उपचार या आइसोटाइप के साथ उपचार के बाद नहीं देखी गई थी। या आइसोटाइप टी785-आईएसएसी (चित्र 5I)। टी सेल केमोकाइन्स की प्रारंभिक अभिव्यक्ति और टी सेल फंक्शन के लिए बढ़े हुए जीन सिग्नेचर स्कोर के अनुरूप, IHC द्वारा rHER2 T 785- ISAC उपचारित चूहों के ट्यूमर के भीतर CD8 प्लस कोशिकाओं की महत्वपूर्ण घुसपैठ को 6 दिन में देखा गया था, जबकि विरोधी rHER2 एंटीबॉडी या आइसोटाइप नियंत्रण के साथ इलाज किए गए चूहों में CD8 धुंधला कम रहा (चित्र 5I)। सीडी8 प्लस आईएचसी धुंधला हो जाना, टी सेल फ़ंक्शन से जुड़े जीन और सीडी 8-आश्रित ट्यूमर निकासी की बढ़ी हुई जीन अभिव्यक्ति के साथ, टी की क्षमता का समर्थन करता है 785- एक ठंडे ट्यूमर को गर्म करने के लिए आईएसएसी। सीएल { {58}}आईएसएसी एचईआर में ट्यूमर प्रतिगमन प्राप्त करते हैं2-मध्यम व्यक्त ज़ेनोग्राफ़्ट ट्यूमर मॉडलयह प्रदर्शित करने के लिए कि आईएसएसी कई प्रतिरक्षा-उत्तेजक पेलोड में एक मजबूत मंच है, हमने एक प्रसिद्ध टीएलआर 7 एगोनिस्ट, सीएल264 का उपयोग करके एक डीएआर के साथ एक आईएसएसी विकसित किया है। ट्रैस्टुजुमाब टी785-आईएसएसी (चित्रा 6ए और पूरक चित्रा 21)के तुलनीय। इंट्रा-ट्यूमर माइलॉयड सक्रियण की मध्यस्थता करने के लिए CL264 या T785 के साथ निर्मित ट्रैस्टुज़ुमैब ISACs की क्षमता का आकलन HCC1954 xenograft मॉडल में ट्रैस्टुज़ुमैब, ट्रैस्टुज़ुमैब CL 264-ISAC या ट्रैस्टुज़ुमैब T785-ISAC के एकल प्रशासन के 24 घंटे बाद किया गया था। . ट्रैस्टुजुमाब सीएल 264-आईएसएसी के साथ संवर्धित माइलॉयड सक्रियण देखा गया था, जैसा कि ट्यूमर-घुसपैठ करने वाले सीडी11बी प्लस सीडी11सी प्लस एफ4/80 प्लस मायलोइड एपीसी पर ट्रैस्टुजुमाब या ट्रैस्टुजुमाब टी785-आईएसएसी (चित्रा 6बी) पर बढ़ी हुई सीडी40 अभिव्यक्ति द्वारा दर्शाया गया है। )यह निर्धारित करने के लिए कि CL264-ISAC की बढ़ी हुई मायलॉइड सक्रियण क्षमता का विवो में अधिक से अधिक एंटी-ट्यूमर गतिविधि में अनुवाद किया गया है, ट्रैस्टुज़ुमैब CL264-ISAC की तुलना निम्न से की गई थीT785-HER2High HCC1954 में ISAC और HER2Med JIMT-1 ट्यूमर मॉडल। जबकि दोनोंTrastuzumab ISACs ने HCC1954 HER2High मॉडल में पूर्ण ट्यूमर प्रतिगमन की मध्यस्थता की, CL 264- ISAC ने JIMT में ट्यूमर-विरोधी गतिविधि को बढ़ाया -1 HER2Med मॉडल ने सुझाव दिया कि ISAC शक्ति और निम्न एंटीजन घनत्व ट्यूमर को लक्षित करने की क्षमता हो सकती है। लिंक किया जा सकता है (चित्र 6सी-डी)।

दोनों ISAC को अच्छी तरह से सहन किया गया था, लेकिन हमने ट्रैस्टुज़ुमैब CL264-ISAC या rituximab CL264-ISAC के साथ इलाज किए गए जानवरों में 5-10 प्रतिशत की क्षणिक शरीर के वजन में कमी देखी, शरीर के वजन में सुधार के साथ या तीसरी खुराक द्वारा आधार रेखा से ऊपर (पूरक चित्र 16ए)। प्रणालीगत साइटोकाइन स्राव को टी 785-आईएसएसी या सीएल264-आईएसएसी के साथ उपचार के बाद मापा गया था। टीएनएफ के निम्न स्तर को टी 785-आईएसएसी के प्रशासन के चार घंटे बाद जानवरों के सीरम में मापा गया, जबकि लक्षित और आइसोटाइप सीएल264-आईएसएसी दोनों ने व्यवस्थित रूप से टीएनएफ स्राव के उच्च स्तर को प्राप्त किया (पूरक चित्रा 11) . यह संभावना नहीं है कि T785 और CL264 ISACs के बीच ये प्रभाव ट्यूमर सेल के विकास पर ISAC के प्रत्यक्ष प्रभाव के कारण थे, क्योंकि ISAC ने इन विट्रो में कैंसर सेल प्रसार को बाधित नहीं किया (पूरक चित्रा 9)।

CL264-ISACs सिनजेनिक ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर क्लीयरेंस और इम्यूनोलॉजिक मेमोरी प्राप्त करते हैं, विभिन्न HER2 एंटीजन घनत्व वाले मानव ट्यूमर xenograft मॉडल में CL264-ISAC के साथ देखी गई बढ़ी हुई शक्ति और प्रभावकारिता को देखते हुए, हमने अगली बार CL की गतिविधि की विशेषता बताई। 264-सिंजेनिक ट्यूमर मॉडल में ISACs। एमएमसी मॉडल में टी 785-आईएसएसी के समान, सीएल 264-आईएसएसी ने टी सेल-निर्भर तरीके से ट्यूमर प्रतिगमन और निकासी का नेतृत्व किया, जिससे टिकाऊ इम्यूनोलॉजिक मेमोरी (पूरक चित्रा 22ए) हो गई। कम प्रतिजन अभिव्यक्ति के साथ एक समानार्थी ट्यूमर मॉडल में ISAC प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, हमने एक CT26 सेल लाइन विकसित की जो चूहे HER2 (CT 26- rHER2) को दृढ़ता से व्यक्त करती है। महत्वपूर्ण रूप से, CT26 कोशिकाओं में से लगभग 8.5 प्रतिशत ट्यूमर आरोपण के बाद rHER2 व्यक्त नहीं करते हैं (चित्र 6ई)। rHER2 CL 264- के साथ इलाज किए गए वाइल्डटाइप बाल्ब / c चूहों ने पर्याप्त एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रदर्शित की, जिसमें चूहों के 75 प्रतिशत (8 में से 6) ने अपने ट्यूमर को साफ किया और प्रयोग की अवधि के लिए ट्यूमर-मुक्त बने रहे, जबकि एंटी-आरएचईआर 2 एंटीबॉडी के साथ इलाज किए गए चूहों में से कोई भी पूर्ण प्रतिगमन (चित्रा 6 एफ) नहीं था। आरएचईआर2 सीएल264-आईएसएसी उपचार के बाद शरीर के वजन में लगभग 10 प्रतिशत की क्षणिक कमी देखी गई, अध्ययन की शुरुआत के आठ दिनों के बाद शरीर के वजन में सुधार हुआ (पूरक चित्र 22बी)। हमने मूल्यांकन किया कि क्या rHER2 CL 264- ISAC ने लक्षित एंटीजन, rHER2 की अभिव्यक्ति की कमी वाले ट्यूमर के खिलाफ इम्यूनोलॉजिक मेमोरी की मध्यस्थता की है, जो पहले CT से ठीक हो चुके चूहों को चुनौती देकर 26- माता-पिता CT26 सेल लाइन के साथ rHER2 ट्यूमर जिसमें rHER2 की कमी थी। अभिव्यक्ति। चूहे पहले CT से ठीक हो गए 26- rHER2 ISAC के साथ rHER2 ट्यूमर माता-पिता CT26 सेल लाइन (चित्र 6I) के साथ चुनौती से पूरी तरह से सुरक्षित थे। CD4 और CD8 T कोशिकाओं के ट्यूमर के पुन: चुनौती से पहले की कमी ने दिखाया कि सुरक्षा के लिए T कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। अंत में, हमने परीक्षण किया कि क्या पहले आईएसएसी के साथ ठीक किए गए चूहों में विकसित प्रतिरक्षात्मक स्मृति प्राथमिक ट्यूमर के ट्यूमर से जुड़े एंटीजन के लिए विशिष्ट थी। माता-पिता के CT26 ट्यूमर रिकॉलेंज के दौरान, चूहों को एक साथ एक अलग ट्यूमर, 4T1 के साथ चुनौती दी गई थी, जिसे कॉन्ट्रैटरल फ्लैंक में प्रत्यारोपित किया गया था। डेटा से पता चलता है कि प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति का विकास थाCT26 ट्यूमर से जुड़े एंटीजन के लिए विशिष्ट rHER2 से अलग है, क्योंकि 4T1 ट्यूमर के ट्यूमर के विकास पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 6G)।