विभिन्न मॉडल जीवों में मेट के जीवनकाल को बढ़ावा देने वाली गतिविधि के अलावा

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परिचय

लेंस एपिथेलियल कोशिकाएं (LECs) लेंस के पूर्वकाल कैप्सूल को अस्तर करने वाली कोशिकाओं का एक मोनोलेयर बनाती हैं और भूमध्यरेखीय लेंस धनुष [1, 2] तक फैली हुई हैं। LECs का सामान्य निर्माण और कार्य पूरे लेंस की पारदर्शिता और मेटाबोलिक होमोस्टैसिस के रखरखाव के लिए आवश्यक है [3]। बढ़ते हुए प्रमाण इंगित करते हैं कि LECs की शिथिलता एंजाइम और क्रिस्टलीय सहित लेंस प्रोटीन के संशोधन, विकृतीकरण और एकत्रीकरण का कारण बन सकती है, जिससे अंततः लेंस अस्पष्टीकरण या मोतियाबिंद भी हो सकता है [3-5]। उम्र से संबंधित मोतियाबिंद (एआरसी) दृश्य हानि और अंधेपन का प्रमुख कारण बना हुआ है, जो वृद्ध व्यक्तियों के जीवन की गुणवत्ता को गंभीर रूप से प्रभावित करता है [6]। वर्तमान में, एआरसी की प्रगति को रोकने के लिए कोई प्रभावी रणनीति नहीं है। इसलिए, एक औषधीय हस्तक्षेप विकसित करना आवश्यक है जो लेंस की पारदर्शिता में सुधार कर सकता है और एआरसी प्रगति में देरी कर सकता है।

पिछले कुछ दशकों में, वैज्ञानिकों ने कई आनुवंशिक, आहार और औषधीय हस्तक्षेपों [7] का उपयोग करके स्वास्थ्य में सुधार और जीवनकाल बढ़ाने में उल्लेखनीय प्रगति हासिल की है। मेटफोर्मिन (एमईटी) व्यापक रूप से अध्ययन किए गए एंटी-एजिंग एजेंटों में से एक है। पर्याप्त अध्ययनों से पता चलता है कि मेट बुढ़ापा कम कर सकता है और विभिन्न पशु मॉडल प्रणालियों में एक स्वस्थ जीवन काल का विस्तार कर सकता है। मेट न केवल कैनोर्हाडाइटिस एलिगेंस के जीवनकाल को लम्बा खींच सकता है, बल्कि इसके स्वास्थ्य और जीवन शक्ति को भी बढ़ा सकता है [8]। मेट उनके जीवनकाल को बढ़ाने के लिए ड्रोसोफिला मिडगुट स्टेम कोशिकाओं में डीएनए क्षति के आयु-संबंधी और ऑक्सीडेटिव तनाव-संबंधी संचय को कम कर सकता है [9]। पिछले अध्ययनों से यह भी संकेत मिलता है कि पुरानी कम-खुराक मेट प्रशासन चूहों के स्वास्थ्य और जीवन काल में सुधार करता है [10]। इसके अलावा, उभरते हुए साक्ष्य इंगित करते हैं कि जब मधुमेह के रोगियों का मेट के साथ इलाज किया जाता है, तो वे उन नियंत्रणों की तुलना में जीवित रहने के लाभ प्रकट करते हैं, जिन्हें मधुमेह नहीं है [11]।

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विभिन्न मॉडल जीवों में मेट के जीवनकाल को बढ़ावा देने वाली गतिविधि के अलावा, मेट उम्र से संबंधित बीमारियों को सुधारने के लिए कई सेलुलर सिग्नल-लिंग मार्गों को लक्षित करता है। मेट को मुख्य रूप से एडेनोसाइन मोनोफॉस्फेट (एएमपी) -सक्रिय प्रोटीन किनेज (एएमपीके) सक्रियण के माध्यम से ऑटोफैगी को संशोधित करने और पार्किंसंस रोग [12] में एक न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका निभाने के लिए न्यूरोडीजेनेरेशन और न्यूरोइन्फ्लेमेशन को रोकने के लिए दिखाया गया है। इसी तरह, एमईटी एएमपीके और एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड पथ [13] के माध्यम से यकृत साइनसोइडल एंडोथेलियल सेल में उम्र से संबंधित परिवर्तनों को संशोधित करता है।सिस्टैंच खुराक redditइसके अलावा, मेट द्वारा क्रोनिक एएमपीके सक्रियण OVE26 चूहों में मधुमेह [14] में स्वरभंग को बढ़ाकर कार्डियोमायोपैथी को रोकता है। इसके अलावा, मेट ऑटोफैगी और कैलोरी प्रतिबंध [15] को बढ़ाकर उम्र से संबंधित हृदय की गिरावट को कम करता है। इसके अलावा, एमईटी उपचार एपीओई में उम्र से जुड़े एथेरोस्क्लेरोसिस को रोक सकता है -7- उच्च वसा वाले आहार से प्रेरित चूहों और खरगोशों, एथेरोस्क्लोरोटिक पट्टिका कैल्सीफिकेशन को रोकने, उच्च-संवेदनशीलता सी-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन के स्तर को कम करने और सक्रियण को दबाने से रोकता है। रक्त वाहिकाओं में परमाणु कारक कप्पा बी (एनएफ-केबी) मार्ग [16-18]।

इन अवलोकनों के आधार पर, वर्तमान अध्ययन ने यह पता लगाने का प्रयास किया कि क्या मेट एआरसी उम्र बढ़ने और अंतर्निहित आणविक तंत्र में देरी कर सकता है। हमारे निष्कर्ष इस प्रकार हैं: (i) क्रोनिक लो-डोज़ मेट उपचार ने स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में LECs के जीर्णता में देरी की, जिससे लेंस की अस्पष्टता बाधित हुई; (i) AMPK मार्ग निष्क्रिय था, और सेन्सेंट LECs में ऑटोफैजिक फ्लक्स बिगड़ा हुआ था; (i) ) क्रोनिक लो-डोज़ मेट उपचार ने एएमपीके मार्ग को सक्रिय करके और ऑटोफैगी को बढ़ाकर प्राकृतिक रूप से वृद्ध चूहों में एलईसी के जीर्णता में देरी की। हमारे निष्कर्ष मेट की पुटेटिव एंटी-एजिंग भूमिका की पुष्टि करते हैं और पर्याप्त सबूत प्रदान करते हैं कि मेट एआरसी के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प साबित हो सकता है।

परिणाम

LECs की बुढ़ापा स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में ARC से जुड़ी थी

उम्र बढ़ने के प्रभाव सहित एआरसी के कई संभावित तंत्रों की व्यापक जांच की गई है।सिस्टैंच निकालने के लाभ,हालाँकि, विवो में LECs और ARC के बीच संबंध स्पष्ट नहीं है। हमने अनुमान लगाया है कि LECs की शिथिलता का परिणाम विवो में ARC हो सकता है। इसलिए, हमने एआरसी के माउस मॉडल का निर्माण किया। हमारे परिणामों से पता चला कि प्राकृतिक रूप से वृद्ध चूहों (पुराने चूहों) में लेंस की पारदर्शिता नियंत्रण समूह (युवा चूहों) (छवि 1 ए) की तुलना में काफी कम हो गई थी। जैसा कि चित्र 1बी में दिखाया गया है, स्वाभाविक रूप से आयु वर्ग में मोतियाबिंद की घटना 95.23 प्रतिशत थी। एच एंड ई धुंधला परख ने संकेत दिया कि नियंत्रण समूह में एलईसी आकार में गोल थे और नियमित रूप से व्यवस्थित थे, और सामान्य एलईसी का घनत्व अपेक्षाकृत अधिक था, जबकि स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के एलईसी आकार में सपाट थे और असमान रूप से व्यवस्थित थे, और घनत्व सीनेसेंट एलईसी में उल्लेखनीय रूप से कमी आई थी (छवि 1 सी)। इसके अलावा, एसए - -गैल धुंधला ने दिखाया कि सेन्सेंट एलईसी का अनुपात स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों (छवि 1 डी) में ऊंचा हो गया था। इसके अलावा, हमने IHC धुंधला और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से सेनेकेंस से जुड़े मार्करों की प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। IHC धुंधला होने से पता चला है कि युवा चूहों (छवि 1e, f) की तुलना में प्राकृतिक रूप से वृद्ध चूहों के LECs में p21 और p53 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी। इसी तरह, हमने आगे पाया कि p21 और p53 की प्रोटीन अभिव्यक्ति युवा चूहों के लेंस कैप्सूल (चित्र 1g) की तुलना में स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के लेंस कैप्सूल में अधिक थी। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि LECs की बुढ़ापा स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में ARC से जुड़ी थी।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

क्रोनिक लो-डोज़ मेट प्रशासन ने लेंस की पारदर्शिता में सुधार किया और LECs की शिथिलता को कम किया इससे पहले कि हम ARC पर मेटफॉर्मिन के प्रभाव का परीक्षण करें, हमने निर्धारित किया कि क्या क्रोनिक लो-डोज़ मेट प्रशासन चूहों के लिए सुरक्षित है। 10 महीने के लिए मेट उपचार के बाद, 28 चूहों (स्वाभाविक रूप से आयु वर्ग में 18 और मेट समूह में 10) प्राकृतिक कारणों से मर गए। हमने पाया कि दोनों समूहों में जीवित चूहे स्वस्थ थे, और दोनों समूहों (तालिका 1) के बीच शरीर के वजन और अंग भार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इसलिए, इन परिणामों ने संकेत दिया कि अध्ययन में प्रयुक्त मेटफॉर्मिन की खुराक जानवरों के लिए सुरक्षित थी और बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल की जा सकती थी।

इसके बाद, क्रोनिक लो-डोज़ मेट को यह आकलन करने के लिए प्रशासित किया गया था कि क्या मेट लेंस की अस्पष्टता को रोक सकता है और स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में एलईसी की उम्र से संबंधित बुढ़ापा को राहत दे सकता है। जैसा कि अपेक्षित था, स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह (छवि 2 ए) में लेंस की पारदर्शिता की तुलना में मेट समूह में लेंस की पारदर्शिता में काफी सुधार हुआ था। इसके अलावा, रूपात्मक टिप्पणियों ने पुष्टि की कि मेट समूह के लेंस ने अस्पष्टता में कमी दिखाई। स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह में मोतियाबिंद की घटना 95.23 प्रतिशत थी, जबकि मेट समूह में 19.00 प्रतिशत (छवि 2 बी) थी। एच एंड ई धुंधला परख से पता चला कि एमईटी समूह में एलईसी का घनत्व उल्लेखनीय रूप से अधिक था। उससे स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों (चित्र। 2c) में। इसके अलावा, स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह (छवि 2 सी) की तुलना में मेट समूह के एलईसी आकार में अपेक्षाकृत गोल थे। एसए - -गैल स्टेनिंग ने दिखाया कि प्राकृतिक रूप से वृद्ध समूह (छवि 2 डी) की तुलना में मेट समूह में सेन्सेंट एलईसी का अनुपात काफी कम हो गया था। IHC विश्लेषण से पता चला कि p21 और p53 की अभिव्यक्ति स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह (Fig.2e, f) की तुलना में MET समूह के LECs में अधिक कम हो गई थी। इसी तरह, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि प्राकृतिक रूप से वृद्ध समूह (छवि 2 जी) की तुलना में मेट समूह के लेंस कैप्सूल में p21 और p53 की प्रोटीन अभिव्यक्ति उल्लेखनीय रूप से कम हो गई थी। इन परिणामों ने संकेत दिया कि पुरानी कम-खुराक मेट प्रशासन लेंस की पारदर्शिता में सुधार कर सकता है और एलईसी की शिथिलता को कम कर सकता है।

क्रोनिक लो-डोज़ मेट प्रशासन ने एएमपीके सक्रियण के माध्यम से स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में एलईसी के जीर्णता को क्षीण कर दिया डेटा की भारी मात्रा इस निष्कर्ष का समर्थन करती है कि एएमपीके को सक्रिय करना मॉडल जीवों में जीवनकाल बढ़ाने के लिए पर्याप्त है, इसकी अपील को दीर्घायु लक्ष्य के रूप में बढ़ाना [19,20] . इस सिद्धांत को ध्यान में रखते हुए, हमने चूहों के LECs में AMPK मार्ग की अभिव्यक्ति का आकलन किया। सापेक्ष एफएएस एमआरएनए स्तर स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह में कम हो गया था और मेट समूह (छवि 3 ए) में बढ़ गया था। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 3 बी, सी, फॉस्फोराइलेटेड एएमपीकेए (थ्र 172) और फॉस्फोराइलेटेड एसीसी (सेर79) की अभिव्यक्ति युवा चूहों की तुलना में स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के एलईसी में कम हो गई थी। हालाँकि, फॉस्फोराइलेटेड AMKa (Thr172) और फॉस्फोराइलेटेड ACC (Ser79) की अभिव्यक्ति को प्राकृतिक रूप से वृद्ध समूह की तुलना में MET समूह के LECs में ऊंचा किया गया था। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि फॉस्फोराइलेटेड एएमपीकेए (थ्र 172) और फॉस्फोराइलेटेड एसीसी (सेर79) की प्रोटीन अभिव्यक्ति स्वाभाविक रूप से वृद्धों के लेंस कैप्सूल में काफी कम हो गई थी, और फॉस्फोराइलेटेड एएमपीकेए (थ्र 172) और फॉस्फोराइलेटेड एसीसी के प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में काफी कमी आई थी। Ser79) मेट ग्रुप (Fig.3d) के लेंस कैप्सूल में बढ़ाए गए थे। इन आंकड़ों से पता चला कि एएमपीके मार्ग स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के एलईसी में निष्क्रिय था। इसके अलावा, क्रोनिक लो-डोज़ मेट प्रशासन ने AMPK सक्रियण के माध्यम से स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में LECs की शिथिलता को देखा।

क्रोनिक लो-डोज़ मेट प्रशासन ने स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में LECs की शिथिलता को कम करने के लिए ऑटोफैजिक प्रवाह को बहाल किया पिछले अध्ययनों ने संकेत दिया है कि उम्र बढ़ने के प्रतिकूल प्रभावों का मुकाबला करने में ऑटोफैगी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है [21,22]। मेट उपचार के बाद लेंस में आणविक और सेलुलर परिवर्तनों का और अधिक विश्लेषण करने के लिए, हमने LC3 और p62 की अभिव्यक्ति का निर्धारण किया क्योंकि उन्हें व्यापक रूप से ऑटोफैगी के स्तर के बायोमार्कर के रूप में स्वीकार किया जाता है। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 4a, सापेक्ष p62 mRNA अभिव्यक्ति स्तर स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह में नियंत्रण समूह की तुलना में काफी बढ़ गया था; हालाँकि, p62 के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति स्तर को स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह की तुलना में मेट समूह में काफी कम-विनियमित किया गया था।सिस्टांचे चंगेज खानइसके अलावा, IHC धुंधला होने से पता चला कि सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 प्रकाश श्रृंखला 3 (LC 3- II / l) और p62 का स्तर स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के LECs में बढ़ गया था। इसके अलावा, हमारे परिणामों ने स्पष्ट किया कि एलसी 3- II / l और p62 का स्तर MET समूह (चित्र। 4b, c) के LECs में उल्लेखनीय रूप से कम हो गया था। स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह (छवि 4 डी) के लेंस कैप्सूल में एलसी 3- ll और p62 के प्रोटीन स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई थी। कुल मिलाकर, हमने अनुमान लगाया कि स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के LECs में ऑटोफैजिक प्रवाह बिगड़ा हुआ था और स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में LECs की शिथिलता को कम करने के लिए पुरानी कम खुराक वाले मेट प्रशासन द्वारा बहाल किया जा सकता है।

बहस

अनुपचारित मोतियाबिंद दुनिया भर में अंधेपन का एक प्रमुख कारण है जो क्रिस्टलीय लेंस [23] के अस्पष्टीकरण की विशेषता है। महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला है कि उम्र मोतियाबिंद के लिए प्रमुख जोखिम कारक है, जिसे एआरसी के रूप में जाना जाता है, और एकमात्र उपचार शल्य चिकित्सा हटाने [24] है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि LECs की बुढ़ापा ARC [25] का मुख्य कारण है। आज तक, लेंस के बादलपन को रोकने और अवांछनीय दुष्प्रभावों के बिना LECs के जीर्णता को कम करने के लिए कोई प्रभावी चिकित्सीय एजेंट नहीं हैं। वर्तमान अध्ययन का फोकस एलईसी के जीर्णता के लिए आणविक जैविक आधार और सामान्य एलईसी को बुढ़ापा से बचाने के तंत्र का आकलन करना था। हमारे परिणामों से पता चला है कि एएमपीके की निष्क्रियता और ऑटोफैगी की हानि एलईसी और एआरसी की शिथिलता से जुड़ी थी। इसके अलावा, हमने पाया कि मेट एलईसी को जीर्णता से बचा सकता है और एएमपीके को सक्रिय करके और ऑटोफैगी को बढ़ाकर लेंस के बादल को रोक सकता है।

बुढ़ापा एक मौलिक जैविक प्रक्रिया है जिसके साथ ऊतक के कार्य में सामान्य गिरावट आती है। जैसे-जैसे उम्र बढ़ती है, उम्र से संबंधित रोग जैसे एआरसी गंभीर स्वास्थ्य बन जाते हैं

मुद्दे [26]। एलईसी के पुरानेपन को एआरसी [5] की घटना और विकास में शामिल होने की सूचना मिली है। हमारे परिणामों से पता चला कि स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों के LEC आकार में सपाट थे और असमान रूप से व्यवस्थित थे, और LECs का घनत्व स्पष्ट रूप से कम हो गया (चित्र 1c, d)। इसके अलावा, उम्र बढ़ने से जुड़े जीन (p21 और p53) की अभिव्यक्ति को स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों (छवि 1e, f, g) के LECs में अपग्रेड किया गया था। हमारे परिणामों का तात्पर्य है कि एलईसी की बुढ़ापा एआरसी की घटना और विकास से जुड़ी थी। इसलिए, नई उपचार रणनीतियों के लिए एक तर्क प्रदान करने के लिए एलईसी के पुरानेपन में अंतर्निहित आणविक तंत्र की एक सटीक समझ की आवश्यकता हो सकती है।

एमईटी दुनिया भर में टाइप 2 मधुमेह के लिए सबसे व्यापक रूप से निर्धारित मौखिक हाइपोग्लाइकेमिक दवा है। उभरते हुए सबूत बताते हैं कि मेट का ग्लाइसेमिया [27] में सुधार से जुड़े लोगों से परे स्वास्थ्य पर लाभकारी प्रभाव पड़ता है। यह पुष्टि की गई है कि मेट के तंत्र जैविक उम्र बढ़ने में मौलिक मार्गों को लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे एएमपीके को सक्रिय करना, ऑटोफैगी को बढ़ाना, सूजन को रोकना, और एंटी-ऑक्सीडेटिव प्रभाव [28] को बढ़ाना। मनुष्यों में, मेट का उपयोग नैदानिक ​​अभ्यास में 60 से अधिक वर्षों से किया जा रहा है; इसकी एक उच्च सुरक्षा प्रोफ़ाइल है और उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों के लिए जिम्मेदार कई महत्वपूर्ण मार्गों में हस्तक्षेप करने के लिए विशिष्ट रूप से स्थित है। हालांकि, एआरसी पर मेट के प्रभाव और उन प्रभावों के नियामक तंत्र की कभी रिपोर्ट नहीं की गई है। नतीजतन, हमारे अध्ययन में, स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों में पुरानी कम खुराक वाले मेट प्रशासन ने लेंस (छवि 2 ए) की पारदर्शिता में सुधार किया और विवो (छवि 2) में एलईसी की शिथिलता को कम किया।

यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि मेट एएमपीके मार्ग को सक्रिय करता है जो कि एंटी-एजिंग प्रभाव [29] को लागू करने के लिए मेट का संभावित तंत्र है। AMPK, एक कोशिकीय ऊर्जा संवेदक, कोशिकीय ऊर्जा संतुलन [30] को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कई अध्ययनों ने स्पष्ट किया है कि एएमपीके कई मार्गों और प्रक्रियाओं के एकीकरणकर्ता और मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है जो दीर्घायु के साथ ऊर्जावान को जोड़ता है। हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि एएमपीके की निष्क्रियता स्वाभाविक रूप से वृद्ध चूहों (छवि 3) में सेन्सेंट एलईसी की एक विशेषता थी। इसके बाद, MET को LECs (चित्र 3) की शिथिलता को रोकने के लिए AMPK मार्ग को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया था। एक स्थापित AMPK कार्यकर्ता के रूप में, उम्र बढ़ने की रोकथाम में MET की भूमिका को आम तौर पर डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग को संशोधित करने पर इसके प्रभावों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जैसे कि ऑटोफैगी की बहाली, Sirt1 और Foxo1 की सक्रियता और mTOR [31,32] का दमन। हमारे अध्ययन ने एआरसी की घटना को रोकने में एमईटी द्वारा सक्रिय एएमपीके फ़ंक्शन के महत्व पर बल देते हुए साक्ष्य की एक नई पंक्ति प्रदान की।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एएमपीके ऑटोफैगी के संवर्द्धन सहित एक एंटी-सेनेसेंस प्रभाव डालने के लिए कई मार्गों और प्रोटीनों के साथ संचार करता है। दीर्घायु आश्वासन के लिए एक मुख्य प्रक्रिया के रूप में उभरने वाली ऑटोफैगी ने उम्र से संबंधित बीमारियों के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में व्यापक रुचि को आकर्षित किया है। ऑटोफैगी एक तरल, बहु-चरणीय जटिल जैविक प्रक्रिया है। ऑटोफैगी की पूरी प्रक्रिया को ऑटोफैगिक फ्लक्स कहा जाता है, जिसका व्यापक रूप से ऑटोफैगी के स्तर को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयोग किया जाता है। ऑटोफैगी के एक संकेतक के रूप में, एलसी 3- इल कसकर ऑटोफैगोसोमल झिल्ली से बंधा होता है जो लाइसोसोमल एंजाइम द्वारा अपमानित होता है।सिस्टैंच जीवन विस्तारइसी तरह, p62, एक ऑटोफैगी-विशिष्ट सब्सट्रेट, आमतौर पर ऑटोफैगोलिसोसोम में नीचा होता है, और इसकी अभिव्यक्ति परोक्ष रूप से ऑटोफैगी के स्तर को दर्शाती है। वर्तमान अध्ययन में, हमारे निष्कर्षों का तात्पर्य है कि ऑटोफैगी के स्तर में स्पष्ट रूप से सेन्सेंट एलईसी (छवि 4) में गिरावट आई है, जबकि मेट ने ऑटोफैगी (छवि 4) की आयु से संबंधित हानि को उलट दिया। एमईटी के एंटी-एजिंग आणविक तंत्र को कोशिकाओं में एएमपीके के प्राथमिक कार्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है क्योंकि यह आम तौर पर एएमपीके सक्रियण [33] के माध्यम से स्वरभंग को बढ़ाता है। इसके अलावा, मेट को सीधे स्वरभंग को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जिससे बुढ़ापा की रोकथाम में योगदान होता है [34]। हालांकि, अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए अधिक विस्तृत अध्ययन की आवश्यकता है, यह साबित करते हुए कि मेट एक स्वतंत्र या एक आश्रित एएमपीके मार्ग के माध्यम से स्वरभंग को बढ़ाता है।

यह प्रदर्शित किया गया है कि एआरसी की व्यापकता एशियाई मूल [35, 36] की आबादी में सेक्स से जुड़ी नहीं है। इसलिए, हमने सेक्स को एक ऐसा कारक नहीं माना जो एआरसी को प्रभावित कर सकता है। उपर्युक्त सीमाओं को ध्यान में रखते हुए हमारे अध्ययन की व्याख्या की जानी चाहिए।

निष्कर्ष

सारांश में, हमने साबित किया कि एएमपीके मार्ग की निष्क्रियता और ऑटोफैगी की उम्र से संबंधित हानि LECs की शिथिलता और ARC की घटना में योगदान कर सकती है। इसके अलावा, हमारे प्रयोगों के आंकड़ों से पता चला है कि एमईटी ने एएमपीके मार्ग के सक्रियण और ऑटोफैगी के संवर्द्धन के माध्यम से एलईसी के जीर्णता और एआरसी के गठन में प्रभावी रूप से देरी की। हमारे निष्कर्ष आणविक तंत्र की आगे की जांच के लिए एक बुनियादी रेखा हैं जो एआरसी की उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान एमईटी की भूमिका में उपयोगी हैं और एआरसी की घटना और विकास के खिलाफ नई रणनीतियों के विकास पर अधिक गहन अध्ययन के लिए जानकारीपूर्ण होंगे।

सामग्री और तरीके अभिकर्मक

एमईटी ब्रिस्टल-मायर्स स्क्विब कंपनी (चीन) से खरीदा गया था। पी 21 (एबी 188224), पी 53 (एबी 131442), फॉस्फोराइलेटेड एएमपीकेए (पी-एएमपीके) (थ्र 172) (एबी 133448), एएमपीकेए 1 (एबी 32047), -एक्टिन (एबी8226) और के खिलाफ एंटीबॉडी। SQSTM1/p62 (3340-1) Abcam (MA, USA) से प्राप्त किए गए थे। LC3 (12741) और फॉस्फो-एसिटाइल CoA कार्बोक्सिलेज (p-ACC) (Ser79) (3661) के खिलाफ एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे। एमए, यूएसए)।

पशु और उपचार

नर C57BL6J चूहे जो 3 और 8 महीने के थे, उन्हें बीजिंग वाइटल रिवर लेबोरेटरी एनिमल टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (बीजिंग, चीन) से खरीदा गया था। चूहों को तापमान-नियंत्रित (तापमान, 20-25 डिग्री और सापेक्षिक आर्द्रता, 55 ± 15 प्रतिशत) की स्थिति में 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ रखा गया था। जानवरों पर आयोजित सभी प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल को हार्बिन मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

चूहों को निम्नलिखित तीन समूहों में विभाजित किया गया था: (i) युवा चूहों वाले नियंत्रण समूह (3 महीने पुराना, शरीर का वजन =29। 72 ± 1.66 ग्राम, एन =40) को एक मानक शुद्ध माउस आहार और पानी मिला। बिना तैयारी के; जब चूहे 1 0 महीने के थे, 120 चूहों को बेतरतीब ढंग से दो समूहों में विभाजित किया गया था: स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह और मेट समूह। (i) स्वाभाविक रूप से वृद्ध समूह (पुराने चूहों, 20 महीने पुराने, शरीर का वजन =32.98 ± 1.93 ग्राम, एन =60) को एक मानक शुद्ध माउस आहार और पानी का विज्ञापन मिला; (ii) मेट समूह ( 20 महीने पुराना, शरीर का वजन =31। 21 ± 2.81 ग्राम, एन =60) को एक मानक शुद्ध माउस आहार और पानी पर तब तक बनाए रखा गया जब तक कि चूहे 10 महीने की उम्र तक नहीं पहुंच गए; जिसके बाद इलाज शुरू किया गया। एमईटी समूह में चूहों को 0.1 प्रतिशत एमईटी (ब्रिस्टल मायर्स स्क्विब, चीन) के साथ पूरक आहार और 10 महीनों के लिए स्वतंत्र रूप से पानी खिलाया गया।

लेंस और लेंस कैप्सूल का अलगाव

गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों को इच्छामृत्यु दिया गया था। पूरी आंख को सभी प्रायोगिक जानवरों से तुरंत हटा दिया गया और बाँझ खारा में रखा गया। ऑप्टिक तंत्रिका को ऊपर की ओर रखा गया था और चिमटी के साथ तय किया गया था। फिर आंख में प्रवेश करने वाली ऑप्टिक तंत्रिका पर एक चीरा लगाया गया, और लेंस को बाहर निकालने के लिए श्वेतपटल को वापस खींच लिया गया।सिस्टैंचे nzइसके बाद, हमने लेंस के भूमध्यरेखीय तल से जुड़े सिलिअरी बॉडी के टुकड़ों को धीरे से हटाने के लिए चिमटी का इस्तेमाल किया। ताजा लेंस की तस्वीरें तुरंत ली गईं, और कमरे के तापमान पर लेंस को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ जल्दी से ठीक कर दिया गया। पूरे लेंस कैप्सूल को शेष लेंस से जल्दी से छील दिया गया, तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोजन, और बाद के प्रयोगों के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।

हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई)

ताजा लेंस तुरंत कमरे के तापमान पर 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था और पैराफिन में एम्बेडेड था। ऊतकीय परीक्षण के लिए, ऊतकों को 4-सुक्ष्ममापी स्लाइस में काटा गया। डीपराफिनाइजेशन और पुनर्जलीकरण के बाद, तैयार पैराफिन वर्गों को 8 मिनट के लिए हेमटॉक्सिलिन (एच) समाधान के साथ दाग दिया गया था, इसके बाद 1 प्रतिशत एसिड इथेनॉल में 5 डुबकी (70 प्रतिशत इथेनॉल में 1 प्रतिशत एचसीआई)

और आसुत जल से धोना। इसके बाद, वर्गों को 3 मिनट के लिए ईओसिन (ई) समाधान के साथ दाग दिया गया, इसके बाद ग्रेडेड अल्कोहल के साथ निर्जलीकरण और xylene के साथ समाशोधन किया गया। एक माइक्रोस्कोप (निकॉन, एक्लिप्स, जापान) के तहत रूपात्मक परिवर्तन देखे गए।

सेनेसेंस से जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ (एसए - - गैल) परख सेनेसेंस से जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ (एसए - - गैल) गतिविधि को एसए - - गैल स्टेनिंग किट (सिग्मा, सीएस {) का उपयोग करके मापा गया था। {12}}030)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, ऊतक वर्गों, उपचार की एक श्रृंखला के बाद, 5 मिनट (तीन बार) के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से धोया गया और फिर एसए - -गैल धुंधला समाधान (पीएच 6.0) में ऊष्मायन किया गया। 24 घंटे के लिए CO2 के बिना 37 डिग्री। छवियों को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (निकॉन, एक्लिप्स, जापान) के तहत कैप्चर किया गया था। SA- -गैल-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान सकारात्मक कोशिकाओं की औसत संख्या/कुल कोशिकाओं की औसत संख्या के रूप में लगाया गया था।

मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (gRT-PCR) चूहों के लेंस कैप्सूल से कुल आरएनए को TRlzol अभिकर्मक का उपयोग करके निकाला गया था। एक्सस्क्रिप्ट आरटी रिएजेंट किट (इनविट्रोजन) के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया था। मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-PCR) विश्लेषण एक SYBR ग्रीन सुपरमिक्स का उपयोग करके किया गया था

किट (तकरा, टोक्यो, जापान), अंतर्जात नियंत्रण के रूप में -एक्टिन के साथ। FAS (आगे, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC -3' और रिवर्स, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT -3'), p62 (आगे, 5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} और रिवर्स, 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') और -actin (आगे, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'और रिवर्स,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'। रिश्तेदार प्रत्येक जीन अभिव्यक्ति के स्तर थे

तरीका। -एक्टिन के लिए सामान्यीकृत और 2- △△ct r इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (IHC) धुंधला का उपयोग करके गणना की गई 1 0 प्रति समूह चयनित लेंसों में से प्रत्येक से कुल 5 प्रतिनिधि वर्गों का उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (IHC) विश्लेषण के लिए किया गया था। p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 और p62 की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए। तैयार किए गए नमूनों को 2 घंटे के लिए 6 0 डिग्री पर इनक्यूबेट करने के बाद, उन्हें ज़ाइलीन और ग्रेडेड अल्कोहल श्रृंखला के माध्यम से deparaffinization के लिए पारित किया गया था। इसके बाद, नमूनों को 0.1 एम साइट्रिक एसिड (पीएच 6.1) में 30 मिनट के लिए उबाला गया और कमरे के तापमान तक ठंडा किया गया। पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को रोकने के लिए नमूनों को 0.3 प्रतिशत एच ओ से भिगोया गया था। इसके बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी को जोड़ा गया और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा किया गया। संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। पीबीएस के साथ धोने के बाद, वांछित दाग तीव्रता विकसित होने तक नमूनों को डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) में ऊष्मायन किया गया था। निकॉन एक्लिप्स माइक्रोस्कोप (निकॉन, एक्लिप्स, जापान) का उपयोग करके प्रतिरक्षित कोशिकाओं की छवियों को कैप्चर किया गया था।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

चूहों के लेंस कैप्सूल से कुल प्रोटीन प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (पियर्स, यूएसए) के साथ रेडियो-इम्युनोप्रेरीगेशन परख (आरआईपीए) बफर का उपयोग करके निकाला गया था, और प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए एक बाइसीनोनिक एसिड (बीसीए) किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए) का उपयोग किया गया था। . सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) का उपयोग करके कुल प्रोटीन （40 ug） का विश्लेषण किया गया था और इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड फ़िल्टर (पीवीडीएफ) झिल्ली (मिलिपोर, जर्मनी) पर स्थानांतरित किया गया था। झिल्लियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया था। अगले दिन, झिल्ली को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। सुपर सिग्नल वेस्ट पिको के साथ केमिलुमिनसेंट सब्सट्रेट विधि का उपयोग करके इम्यूनोएक्टिव बैंड की कल्पना की गई थी। किट (पियर्स बायोटेक्नोलॉजी, यूएसए)। तीन स्वतंत्र अनुप्रयोग किए गए।

सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था। ग्राफपैड प्रिज्म 7.0 सॉफ्टवेयर और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रायोगिक डेटा के सांख्यिकीय महत्व की गणना के लिए छात्र के टी-टेस्ट और विचरण के विश्लेषण (एनोवा) का उपयोग किया गया था। पी-वैल्यू के साथ अंतर<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

डेटा उपलब्धता

वर्तमान अध्ययन के दौरान उपयोग किए गए और विश्लेषण किए गए डेटासेट इस प्रकाशित लेख में शामिल हैं।

यह लेख www.nature.com/cddiscovery से लिया गया है