एमिलॉयड बीटा एकत्रीकरण का अवरोध और सिस्टांच टुबुलोसा जलीय अर्क का जमाव

1 परिचय

डिमेंशिया सबसे आम पुरानी बुढ़ापे की बीमारियों में से एक है। 2015 में विश्व अल्जाइमर रिपोर्ट ने अनुमान लगाया कि लगभग 46.8 मिलियन लोग डिमेंशिया से पीड़ित हैं, और यह संख्या 2030 में 74.7 मिलियन और 2050 में 131.5 मिलियन होने की उम्मीद है। वैश्विक डिमेंशिया आबादी साल दर साल बढ़ती जाएगी और भविष्य में नियंत्रण से बाहर हो जाएगी। डिमेंशिया के इलाज के लिए वैश्विक स्वास्थ्य सेवा व्यय 2010 में लगभग 604 बिलियन अमेरिकी डॉलर था और 2030 में यह राशि 1000 बिलियन होने की उम्मीद है। डिमेंशिया के रोगियों में आकस्मिक मृत्यु का जोखिम अधिक होता है और इसलिए उन्हें अधिक चिकित्सा देखभाल की आवश्यकता होती है। यह डिमेंशिया रोगी के पारिवारिक देखभाल करने वालों के लिए एक भारी बोझ है। देखभाल करने वालों, परिवार और समाज पर डिमेंशिया का प्रभाव बहुत अधिक शारीरिक, मनोवैज्ञानिक, जीवन और आर्थिक तनाव पैदा कर सकता है। डिमेंशिया के दो प्रमुख रूप हैं, अल्जाइमर रोग (AD) और संवहनी डिमेंशिया। AD सबसे आम मनोभ्रंश है और यह एक अपरिवर्तनीय और प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। 2015 में संयुक्त राज्य अमेरिका में AD मृत्यु का छठा प्रमुख कारण था।

एडी की रोकथाम के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा पीएचजीएस75% ईसीएच 30% एसीटी 12%

हाल के अध्ययनों से यह पता चलता है कि एमिलॉयड पेप्टाइड (ए) (पट्टिकाएँ) और प्रोटीन टौ (टेंगल्स) एकत्रीकरण द्वारा प्रेरित न्यूरॉन विषाक्तता का AD रोगजनन से गहरा संबंध है। मस्तिष्क में A और प्रोटीन टौ के संचय से न्यूरॉन क्षति और स्मृति हानि हो सकती है। अघुलनशील A ऑलिगोमर्स बाह्यकोशिकीय पट्टिकाओं में एकत्रित होते हैं और सिनैप्टिक डिसफंक्शन, न्यूरॉन विषाक्तता और कोशिका मृत्यु का कारण बनते हैं। दुर्भाग्य से, A और प्रोटीन टौ को साफ़ करने, A के गठन या ऑलिगोमेराइजेशन को बाधित करने और अपरिवर्तनीय न्यूरॉन क्षति को निलंबित या ठीक करने के लिए अभी तक कोई प्रभावी उपचार उपलब्ध नहीं है। गैलेंटामाइन और डोनेपेज़िल जैसे वर्तमान चिकित्सीय एजेंट, जो एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ अवरोधक हैं, केवल न्यूरोट्रांसमीटर स्तर को बढ़ाकर अस्थायी रूप से स्मृति हानि को कम कर सकते हैं। 2012 में, कोई भी उम्मीदवार दवा बड़े AD रोगी नैदानिक ​​​​अध्ययनों में A प्रभाव को कम करने में सक्षम नहीं थी। इसलिए, अल्जाइमर रोग के प्रसार को दबाने के लिए एक नए उपचार के लिए अनुसंधान की तत्काल आवश्यकता है। हाल ही में धातु आयनों को A एकत्रीकरण से निकटता से संबंधित एक महत्वपूर्ण कारक माना गया है। संभावित लीड यौगिकों के रूप में माने जाने वाले धातु केलेटर्स AD-विरोधी दृष्टिकोण के लिए एक पूरी नई रणनीति प्रदान करते हैं।

सिस्टान्चे टुबुलोसा का सूखा तना(श्रेंक) आर. वाइट, रौ कांग रोंग, चीन के रेगिस्तान, झिंजैंग में व्यापक रूप से उगाया जाता है। यह एक महत्वपूर्ण पारंपरिक चीनी दवा है जो चीन फार्माकोपिया में सूचीबद्ध टॉनिक चीनी दवा से संबंधित है और शारीरिक कमजोरी, गुर्दे की कमी, बांझपन, भूलने की बीमारी, नपुंसकता और बुढ़ापे में कब्ज के इलाज के लिए हजारों सालों से इस्तेमाल की जाती है।सी. ट्यूबुलोसा जलीय अर्क (सीटीई)कैप्सूल को चीन में संवहनी मनोभ्रंश के लिए एक वनस्पति दवा के रूप में अनुमोदित किया गया है। हल्के से मध्यम एडी से पीड़ित 18 रोगियों के एक नैदानिक ​​​​परीक्षण के अनुसार, सीटीई कैप्सूल ने रोगियों को एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ अवरोधकों की तुलना में अधिक स्थिर स्मृति स्थिति दी। हमारे पिछले अध्ययन में, सीटीई ने एमिलॉयड पेप्टाइड (ए) जमाव को कम किया और अल्जाइमर रोग जैसे चूहों में स्मृति हानि में सुधार किया। फेनिलथेनॉइड ग्लाइकोसाइड, इचिनाकोसाइड (1), एक्टियोसाइड (2), और आइसोएक्टियोसाइड (3) को सीटीई का प्रमुख घटक माना जाता है। यौगिक 1 में 1-मिथाइल-4-फेनिल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपाइरीडीन (एमपीटीपी), 1-मिथाइल-4-फेनिलपाइरीडिनियम आयन (एमपीपी+), और 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए) की विषाक्तता के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधि है। हमारी पिछली रिपोर्ट से पता चला है कि 1 ने इन विट्रो अध्ययन में ए ओलिगोमेराइजेशन और विषाक्तता को दबा दिया, और ए जमाव को बाधित किया, ए-प्रेरित चूहों में बिगड़ी हुई स्मृति और संज्ञानात्मक शिथिलता में सुधार किया। यौगिक 2 और 3 ने इन विट्रो में ए गिरावट को बढ़ाया और ए ओलिगोमेराइजेशन को कम किया। यौगिक 3 ने ए-प्रेरित चूहों में ए जमाव को कम किया। इन अध्ययनों के आधार पर, सी. ट्यूबुलोसा ने पहले ही साबित कर दिया है कि इसमें एडी का इलाज करने की क्षमता है। सीटीई एंटी-ए एकत्रीकरण और जमाव से निकटता से संबंधित है। सीटीई तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमें सक्रिय घटक की पहचान करने के लिए एक सुविधाजनक और कुशल विधि की आवश्यकता है, साथ ही मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों में सामग्री की भी। अधिकांश अध्ययनों को मात्रात्मक निर्धारण के लिए डिज़ाइन किया गया थाजड़ी-बूटियों में इचिनाकोसाइड, एक्टियोसाइड और आइसोएक्टियोसाइडया खाद्य पदार्थों को उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित किया गया था, लेकिन केवल दो अध्ययन सीरम या ऊतकों में निर्धारण के लिए थे। हालांकि, सीटीई मौखिक प्रशासन के बाद मस्तिष्क के ऊतकों में 1-3 के एक साथ विश्लेषण पर कोई रिपोर्ट नहीं है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि सीटीई सक्रिय घटक या उनके मेटाबोलाइट्स रक्त-मस्तिष्क बाधा को सफलतापूर्वक पार कर गए और मस्तिष्क के न्यूरॉन्स पर कार्य किया। इसलिए, यह शोध एक उन्नत और संवेदनशील विधि प्रदान करता है जिसमें ठोस सबूत हैं जो स्पष्ट रूप से ए एकत्रीकरण और जमाव के खिलाफ सीटीई के अंतर्निहित तंत्र को दर्शाता है।

2. परिणाम

2.1. तीन प्रमुख यौगिकों का पृथक्करण और पहचान (1–3)

सी. ट्यूबुलोसा के सूखे तने को कमरे के तापमान पर 75% EtOH के साथ निकाला गया। संघनित 75% EtOH अर्क को राल और C18 कॉलम क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया ताकि तीन प्रमुख यौगिक, इचिनाकोसाइड (1), प्राप्त हो सकें।एक्टियोसाइड (2), और आइसोएक्टियोसाइड(3). उनकी संरचनाओं को एनएमआर (न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेजोनेंस) स्पेक्ट्रोस्कोपी और ईएसआई-एमएस (इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण द्रव्यमान) के विश्लेषण और साहित्य डेटा (चित्र 1, पूरक सामग्री चित्र एस 3-एस 11) के साथ तुलना करके स्पष्ट किया गया था।

2.2. सीटीई से फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (1–3) सामग्री परख

फेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड विश्लेषण के लिए परख विधि मान्य की गई। यौगिक 1–3 (5.0 मिलीग्राम) का सही-सही वजन किया गया और 50% मेथनॉल (40 एमएल) के साथ मिलाया गया। मिश्रणों को 5 मिनट के लिए सोनिकेट किया गया। तीन फेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1–3) मानक घोल को मानक स्टॉक घोल (100 ug/mL) के रूप में मिलाया गया। मानक स्टॉक घोल का उपयोग क्रमशः संकेतित घोलों की पाँच अलग-अलग सांद्रता (5, 10, 25, 50, और 100 ug/mL) तैयार करने के लिए किया गया था, जिसे 50% मेथनॉल की क्रमिक मात्रा के साथ पतला करके बनाया गया था। फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (1–3) वक्रों को 5–100 ug/mL से अल्ट्रा-परफॉरमेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (UPLC) का उपयोग करके स्थापित किया गया था और वे क्रमशः रैखिक थे (1, r2= 0.9999; 2, r2= 0.9999; 3, r2= 0.9998)। इंट्रा-डे और इंटर-डे परिशुद्धता [% RSD (सापेक्ष मानक विचलन) 0.1 से 1.8% तक थी] और सटीकता (95.6–104.2%) UPLC द्वारा 1–3 के लिए स्वीकार्य थी। UPLC ने CTE सामग्री के 1, 2 और 3 को क्रमशः 254, 38 और 41 mg/g के रूप में निर्धारित किया (चित्र S2)।

एडी रोगियों के इलाज के लिए प्राकृतिक सिस्टांच ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. यूपीएलसी/एमएस/एमएस सत्यापन

फेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1–3) को चूहे के मस्तिष्क ऊतक होमोजीनट के साथ मिलाया गया और ठोस चरण निष्कर्षण के साथ अल्ट्रा परफॉरमेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमीटर (UPLC/MS/MS) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। 1–3 की पहचान की निचली सीमा (LLOQ) 0.2 ng/mL थी। मस्तिष्क ऊतक होमोजीनट (10 ng/mL) के साथ फेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड रिकवरी क्रमशः 1 के लिए 91.39%, 2 के लिए 89.54% और 3 के लिए 96.81% पर बढ़ी (चित्र 2)।

2.4. AD-जैसे चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों का विश्लेषण

सीटीई मौखिक प्रशासन (200 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) के 14 दिनों के बाद, एडी-जैसे चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों को एकत्र किया गया और दो भागों, हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम में विभाजित किया गया, और दोनों को होमोजीनाइज़ किया गया। क्योंकि प्रत्येक चूहे से हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम होमोजीनेट्स सॉलिड फेज़ एक्सट्रैक्शन में लोड करने के लिए बहुत कम थे और अत्यधिक प्रयोगात्मक त्रुटियों से बचने के लिए, चार अलग-अलग चूहों से हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम होमोजीनेट्स को सॉलिड फेज़ एक्सट्रैक्शन विधि (चित्र 3ए, बी) का उपयोग करके यूपीएलसी/एमएस/एमएस के लिए विश्लेषित नमूने में मिलाया गया। हिप्पोकैम्पस (चित्र 3ए) और स्ट्रिएटम (चित्र 3बी) में फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1-3) देखे गए। खाली मस्तिष्क के ऊतकों (चित्र 3सी) में कोई महत्वपूर्ण शिखर नहीं था। हिप्पोकैम्पस में इचिनाकोसाइड की मात्रा 11.97 ± 0.34 ng/mL थी, एक्टियोसाइड की मात्रा 1.25 ± 0.16 ng/mL थी, और आइसोएक्टियोसाइड की मात्रा 1.38 ± 0.08 ng/mL थी। स्ट्रिएटम में इचिनाकोसाइड की मात्रा 22.60 ± 1.69 ng/mL थी, एक्टियोसाइड की मात्रा 2.03 ± 0.61 ng/mL थी, और आइसोएक्टियोसाइड की मात्रा 4.90 ± 0.64 ng/mL थी। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम में 1–3 की महत्वपूर्ण पता लगाने योग्य मात्रा के अनुसार CTE रक्त-मस्तिष्क बाधा से होकर गुजरेगा। UPLC विश्लेषण (चित्र S2) द्वारा CTE में 1 की मात्रा 2 और 3 से बहुत अधिक है। इसलिए, यह देखना उचित है कि मौखिक CTE प्रशासन के बाद मस्तिष्क के ऊतकों में 1 सबसे अधिक होता है।

2.5. फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (1–3) मेटल चेलेटिंग गतिविधि

साहित्य में, मुक्त यौगिकों और उनके धातु परिसर का निर्धारण HPLC का उपयोग करके किया गया था। इस अध्ययन में केलेशन गतिविधि के माप का विश्लेषण UPLC द्वारा किया गया था। प्रत्येक फेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1–3) के 50 µg/mL घोल को क्रमशः कॉपर (Cu), कैल्शियम (Ca), मैग्नीशियम (Mg), जिंक (Zn), आयरन (Fe) या चूहे के सीरम के 10 µg/mL घोल में मिलाया गया। प्रत्येक धातु घोल या सीरम वाले प्रत्येक यौगिक का UPLC द्वारा विश्लेषण किया गया। फेनिलेथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1–3) ने आयरन और सीरम के साथ धातु कीलेटिंग गतिविधि प्रदर्शित की (चित्र 5, पूरक सामग्री चित्र S1)।

2.6. चूहे के सीरम में इचिनाकोसाइड (1) का विवो विश्लेषण

चूहे के सीरम में इचिनाकोसाइड के वितरण को समझने के लिए, इचिनाकोसाइड (1) मौखिक प्रशासन (100 मिलीग्राम/किग्रा) के बाद प्रारंभिक समय से 720 मिनट तक सीरम एकत्र किया गया और UPLC द्वारा विश्लेषण किया गया। चित्र 6 चूहे के सीरम में इचिनाकोसाइड की सांद्रता बनाम समय प्रोफ़ाइल दिखाता है।

3. चर्चा

डिमेंशिया, खास तौर पर AD, एक अपरिवर्तनीय उम्र बढ़ने और पुरानी बीमारी है जो सवालों के एक गॉर्डियन गाँठ की ओर ले जाती है। यह असाध्य बीमारी गंभीर आर्थिक मुद्दों की ओर ले जाती है, जिससे भारी और बढ़ते वित्तीय बोझ का सामना करना पड़ता है। दुनिया भर में, AD शोधकर्ताओं ने इसकी जांच करने के लिए बहुत प्रयास किए हैंनई एंटी-एडी दवाएंलेकिन 2012 में A को लक्षित करने वाले कई बड़े नैदानिक ​​परीक्षणों में विफल रहा। A को सीधे लक्षित करने के अलावा, मस्तिष्क में धातु आयन होमियोस्टेसिस को A एकत्रीकरण और जमाव से संबंधित प्रमुख कारण माना जाता है जो AD गठन की ओर जाता है। इसलिए, धातु आयन AD के रोगजनन में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, और धातु केलेशन परिकल्पना एक महत्वपूर्ण शोध दिशा बन गई है।

हमारे पिछले अध्ययनों के अनुसार,सीटीई ने संभावित मनोभ्रंश विरोधी गतिविधि प्रदर्शित की. यहां तक ​​कि मानव नैदानिक ​​अध्ययनों में भी, मध्यम एडी रोगियों के लिए सीटीई कैप्सूल के साथ 1 वर्ष के उपचार के बाद, अल्जाइमर रोग मूल्यांकन स्केल-संज्ञानात्मक उप-स्केल (एडीएएस-कॉग) स्कोर उपचार से पहले की तुलना में महत्वपूर्ण गिरावट नहीं दिखाएगा। सीटीई ने एडी रोगियों के एडीएएस-कॉग स्कोर को स्थिर रखा, लेकिन अन्य प्रिस्क्रिप्शन दवाओं ने ऐसा नहीं किया। लाइसेंस प्राप्त प्रिस्क्रिप्शन दवाओं का एकमात्र विकल्पए.डी. उपचारएसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ इनहिबिटर्स (AChEIs) जैसे कि डोनेपेज़िल और गैलेंटामाइन हैं जो अल्पावधि में AD के लक्षणों में सुधार करते हैं, लेकिन उपचार के 1 वर्ष बाद गिरावट आती है। नैदानिक ​​अध्ययनों के आधार पर, CTE के पास AD-विरोधी एजेंट के विकास के लिए एक संभावित उपचार होने का अवसर है। हमारी पिछली रिपोर्टों के आधार पर, इचिनाकोसाइड (1), एक्टिओसाइड (2), और आइसोएक्टिओसाइड (3) A से होने वाले नुकसान से न्यूरॉन्स की रक्षा करेंगे, इन विट्रो में A ऑलिगोमेराइजेशन को कम करेंगे, और इन विवो में A से प्रेरित संज्ञानात्मक शिथिलता को महत्वपूर्ण रूप से कम करेंगे। इन विट्रो अध्ययन ने संकेत दिया कि 1–3 की सक्रिय खुराक 5{{10}} µg/mL तक थी। हालांकि पिछले अध्ययनों ने माना था कि चूहों में 1 और 2 की मौखिक जैवउपलब्धता बहुत कम थी (1 के लिए 0.83% और 2 के लिए 0.12%) वर्तमान अध्ययनों से पता चलता है कि 1–3 में आंतों की कोशिकाओं में खराब झिल्ली पारगम्यता और अवशोषण था और अधिकांश 1 को जठरांत्र संबंधी नलिकाओं में चयापचय किया जाएगा। चूहे के सीरम में यौगिक 2 सामग्री 10 मिलीग्राम/किलोग्राम एक्टियोसाइड की खुराक के साथ 15 मिनट के अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद केवल लगभग 4.5 µg/mL थी। हालांकि, यह अध्ययन दिखाता है कि CTE मौखिक प्रशासन (आंकड़े 3 और 4) के बाद चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों के हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम में 1–3 का पता लगाया जाएगा। इसके अलावा, चित्रा 6 से पता चला है कि चूहे के सीरम में यौगिक 1 की सामग्री यौगिक 1 मौखिक प्रशासन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम) के 15 मिनट से 720 मिनट के बाद लगभग 5 गुना बढ़ गई। चित्र 5 दर्शाता है कि तीन फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड में आयरन और सीरम के साथ धातु-चेलेटिंग गतिविधि होगी। आयरन और सीरम तीन फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड के अधिकतम अवधारण समय क्षेत्र को बदलते हैं। आयरन केलेशन फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड की बहुत कम जैव उपलब्धता की गलत पहचान का महत्वपूर्ण कारण हो सकता है। इसलिए, वास्तविक जैव उपलब्धता और फार्माकोकाइनेटिक्स को पुनः प्राप्त करने के लिए तीन CTE फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड के रक्त सीरम और मस्तिष्क विश्लेषण में धातु केलेटिंग गतिविधि पर विचार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, परिणामों ने संकेत दिया कि तीन फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1-3) रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार कर जाएंगे और शरीर के परिसंचरण के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों तक पहुंचेंगे। इस अध्ययन ने UPLC/MS/MS का उपयोग करके 1-3 विश्लेषण के लिए सबसे तेज़ और संवेदनशील विधि विकसित की और यह साबित करने के लिए शक्तिशाली सबूत प्रदान किए कि फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (1-3) CTE के प्रमुख जैव सक्रिय घटक हैं।

अल्जाइमर रोग की रोकथाम के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. सामग्री और विधियाँ

4.1. पौध सामग्री

मई 2016 में हांग्जो, चीन से सी. ट्यूबुलोसा के तने एकत्र किए गए थे। पौधे की पहचान डॉ. लिन एचसी वाउचर नमूनों (सं. 20016CT) से की गई थी, जिन्हें सिंफर तियान-ली फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड, हांग्जो, चीन में जमा किया गया है।

4.2. पृथक्करण और शुद्धिकरण

सूखे सी. ट्यूबुलोसा के तने को पीसकर पाउडर बनाया गया और फिर 75% EtOH के साथ पाँच बार निकाला गया। कम दबाव में विलायक वाष्पीकरण के बाद, कच्चे अर्क को 20% EtOH से 100% EtOH तक H2O/EtOH ग्रेडिएंट विलायक प्रणालियों के साथ मैक्रोपोरस रेजिन AB-8 कॉलम क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया। पतली परत क्रोमैटोग्राफी के अनुसार, आगे के पृथक्करण के लिए चार अंश (Fr.1~Fr.4) एकत्र किए गए। Fr. 2 को मोबाइल चरण प्रणाली के रूप में 18% एसिटोनाइट्राइल का उपयोग करके COSMOSIL® 5C18-AR-II कॉलम (250 मिमी × 20 मिमी आईडी, 5 µm) पर प्रारंभिक उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के अधीन किया गया। प्रवाह दर 15 एमएल/मिनट थी। रुचि के तीन प्रमुख शिखर चुनिंदा रूप से एकत्र किए गए थे। लक्षित यौगिकों वाले अंशों को आगे संघनित करके सुखाया गया, जिससे क्रमशः 1, 2, और 3 प्राप्त हुए।

4.3. प्रायोगिक विश्लेषण

1H और 13C NMR स्पेक्ट्रा ब्रूकर एवेंस DRX 500 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर (बिलरिका, एमए, यूएसए) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, जिसमें आंतरिक मानक के रूप में टेट्रामेथिलसिलेन (TMS) था। प्रारंभिक HPLC को रिवर्स फेज कॉलम (कॉस्मोसिल C18-AR-II कॉलम, 250 मिमी × 20 मिमी आईडी; नैकलाई टेस्क, इंक., क्योटो, जापान) का उपयोग करके शिमादज़ू LC-6AD श्रृंखला उपकरण पर प्रॉमिनेंस HPLC UV-Vis डिटेक्टरों (क्योटो, जापान) के साथ किया गया था।

इचिनाकोसाइड (1): सफेद पाउडर; ईएसआई−एमएस एम/जेड: 785 [एम−एच]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H-6), 2.79 (2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3.56 (1H, m, Ha-8), 3.79 (1H, m, H-30 ), 3.91 (1H, m, Hb-8), 4.29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4.38 (1H, d, J {{4{{80}}}}.9 Hz, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, टी, जे {{४६}}.६ हर्ट्ज, एच{{४८}} ), ५.१७(१एच, डी, जे {{५२}}.५ हर्ट्ज, आरएचए-एच{{५५}}), ६.२७ (१एच, डी, जे {{५९}}.९ हर्ट्ज, एच{{६१}} ), ६.५८ (१एच, डीडी, जे {{६५}}.१,२.० हर्ट्ज, एच{{६९}}), ६.६७ (१एच, डी, जे {{७३}}.१ हर्ट्ज, एच{{७५}}), ६.७० (१एच, डी, जे {{७९}}.० हर्ट्ज, एच{{८१}}), ६.७७ (१एच, डी, जे {{८५}}.२ हर्ट्ज, एच{{८७}} ), ६.९४ (१एच, डीडी, जे {{९१}}.३, २.० हर्ट्ज, एच-600 ), 7.05 (1एच, डी, जे=2.0 हर्ट्ज, एच-200 ), δ 7.59 (1एच, डी, जे=15.9 हर्ट्ज, एच-700 ); 13सी-एनएमआर (सीडी3ओडी, 125 मेगाहर्ट्ज): δ 18.5 (Rha-C-6), 36.6 (C-7), 62.6 (Glc-C-6), 69.4 (C-60 ), 70.5 (C-40 ), 70.6 (Rha-C-5), 71.5 (Glc-C-4), 72.0 (Rha-C-3), 72.3 (C-8), 72.4 (Rha-C-2), 73.8 (Rha-C-4), 74.7 (C-50 ), 75.1 (Glc-C-2), 76.1 (सी-20 ), 77.8 (जीएलसी-सी-5), 77.9 (जीएलसी-सी-3), 81.7 (सी-30 ), 103.1 (आरएचए-सी-1), 104.2 (सी-10 ), 104.7 (जीएलसी-सी-1), 114.7 (सी-200 ), 115.3 (सी-800 ), 116.3 (सी-500 ), 116.5 (सी-2), 117.1 (सी-5), 121.3 (सी-6), 123.3 (सी-600 ), 127.6 (सी-100 ), 131.5 (सी-1), 144.7 (सी-3), 146.1 (सी-4), 146.9 (सी-400 ), 148.2 (सी-700 ), 149.8 (सी-300 ), 168.5 (सी-900 ) (चित्र एस3-एस5)।

एक्टियोसाइड (2): सफेद पाउडर; ईएसआई−एमएस एम/जेड: 623 [एम−एच]−; 1H एनएमआर (DMSO-d6, 500 मेगाहर्ट्ज): δ 0.94 (3H, d, J =5.9 हर्ट्ज, H-6000 ), 2.68 (2H, m, H-7), 4.33 (1H, d, J=7.8 हर्ट्ज, H-100 ), 4.70 (1H, t, J=9.{{160}} हर्ट्ज, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H-1000 ), 6.18 (1H, d, J=15.9 हर्ट्ज, H-80 ), 6.48 (1H, dd, J=7.9, 1.4 हर्ट्ज, एच-6), 6.62 (1एच, डी, जे=7.1 हर्ट्ज, एच-5), 6.73 (1एच, डी, जे=2.0 हर्ट्ज, एच-2), 6.75 (1एच, डी, जे=7.9 हर्ट्ज, एच-50 ), 6.97 (1एच, डी, जे=8.1 हर्ट्ज, एच-60 ), 7.01 (1एच, एस, एच-20 ), 7.44 (1एच, डी, जे=15.8 हर्ट्ज, एच-70 ); 13सी एनएमआर: (डीएमएसओ-डी6, 125 मेगाहर्ट्ज): δ 18.2 (सी-6000 ), 35.1 (सी-7), 60.8 (सी-600 ), 68.8 (सी-5000 ), 69.2 (सी-400 ), 70.3 (सी-3000 ), 70.3 (सी-8), 70.4 (सी-2000 ), 70.6 (सी-4000 ), 71.7 (सी-500 ), 74.5 (सी-200 ), 79.2 (सी-300 ), 101.3 (सी-1000 ), 102.3 (सी-100 ), 113.6 (सी-80 ), 114.7 (सी-20 ), 115.5 (सी-5), 115.8 (सी-50 ), 116.3 (सी-2), 119.6 (सी-6), 121.5 (सी-60 ), 125.6 (सी-10 ), 129.2 (सी-1), 143.6 (सी-4), 145.0 (सी-3), 145.0 (सी-30 ), 145.6 (सी-70 ), 148.5 (सी-40 ), 165.7 (सी-90 ) (आंकड़े S6-S8)। आइसोएक्टोसाइड (3): सफेद पाउडर; ईएसआई−एमएस एम/जेड: 623 [एम - एच]-; 1H एनएमआर (DMSO-d6, 500 मेगाहर्ट्ज): δ 1.07 (3H, d, J=6.1 हर्ट्ज, H-6000 ), 2.65 (2H, m, H-7), 4.35 (1H, d, J=10.0 हर्ट्ज, H-100 ), 5.10 (1H, s, H-1000 ), 6.27 (1H, d, J=15.9 हर्ट्ज, H-80 ), 6.45 (1H, dd, J=8.0, 1.8 हर्ट्ज, H-6), 6.58 (1H, d, J=8.8 हर्ट्ज, H-5), 6.73 (1H, डी, जे=1.6 हर्ट्ज, एच-2), 6.74 (1एच, डी, जे=8.1 हर्ट्ज, एच-50 ), 6.94 (1एच, डी, जे=8.2 हर्ट्ज, एच-60 ), 7.04 (1एच, एस, एच-20 ), 7.46 (1एच, डी, जे=15.8 हर्ट्ज, एच-70 ); 13सी एनएमआर (डीएमएसओ-डी6, 125 मेगाहर्ट्ज): δ 17.9 (सी-6000 ), 35.2 (सी-7), 63.5 (सी-600 ), 68.2 (सी-5000 ), 70.4 (सी-400 ), 70.6 (सी-3000 ), 71.7 (सी-8), 72.1 (सी-2000 ), 73.7 (सी-4000 ), 74.1 (सी-500 ), 74.5 (सी-200 ), 80.9 (सी-300 ), 100.7 (सी-1000 ), 102.7 (सी-100 ), 113.9 (सी-20 ), 114.9 (सी-80 ), 115.5 (सी-5), 115.8 (सी-50 ), 116.3 (सी-2), 119.6 (सी-6), 121.5 (सी-60 ), 125.5 (सी-10 ), 129.2 (सी-1), 143.5 (सी-4), 145.0 (सी-3), 145.3 (सी-30 ), 145.6 (सी-70 ), 148.5 (सी-40 ), 165.6 (सी-90 ) (आंकड़े एस9-एस11)

4.4. सी. ट्यूबुलोसा जलीय अर्क (सीटीई) की तैयारी

सी. ट्यूबुलोसा पाउडर के तने को 1.5 घंटे के लिए पानी के साथ रिफ्लक्स करके दो बार निकाला गया, और अर्क के घोल को फ़िल्टर किया गया। फ़िल्टर किए गए जलीय अर्क (CTE) को उपयोग से पहले 4 ◦C पर संग्रहीत किया गया।

4.5. पशु मॉडल और प्रायोगिक अनुसूची

इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया AD-जैसा चूहा मॉडल और प्रायोगिक कार्यक्रम हमारे पिछले अध्ययन [19] में बताए गए अनुसार था। कम से कम दो सप्ताह या उससे अधिक समय तक सेरेब्रल वेंट्रिकल में A 1-42 (300 pmol/day) डालने के बाद, AD-जैसे चूहों को अगले दिन मौखिक प्रशासन द्वारा CTE (200 mg/mL) दिया गया। प्रशासन के 14 दिनों के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए चूहों की बलि दी गई। अत्यधिक प्रयोगात्मक त्रुटियों से बचने के लिए, चार अलग-अलग चूहों के नमूनों को एक नमूने में मिलाया गया। प्रत्येक समूह के लिए तीन नमूने थे।

4.6. रसायन और अभिकर्मक

मेथनॉल (एचपीएलसी ग्रेड) मर्क (डार्मस्टाट, जर्मनी) से खरीदा गया था। फॉर्मिक एसिड (विश्लेषण के लिए 98%, एसीएस) पैनरेक (बार्सिलोना, स्पेन) से खरीदा गया था। एसीटोनिट्राइल (एचपीएलसी ग्रेड) जेटी बेकर (फिलिप्सबर्ग, एनजे, यूएसए) से खरीदा गया था। शुद्ध पानी ईएलजीए सिस्टम (वुड्रिज, यूके) का उपयोग करके तैयार किया गया था। हेस्परिडिन को क्रोमैडेक्स से खरीदा गया था और यूपीएलसी विश्लेषण के लिए आंतरिक मानक (आईएस) के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

4.7. यूपीएलसी/एमएस/एमएस उपकरण

UPLC/MS/MS विश्लेषण के लिए वाटर्स एक्विटी TQD अल्ट्रा-परफॉरमेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (UPLC)/MS/MS सिस्टम (मिलफोर्ड, MA, USA) का इस्तेमाल किया गया। क्रोमैटोग्राफ़िक प्रयोग एक्विटी UPLC BEH C18 कॉलम (2.1 × 100 mm, 1.7 µm, वाटर्स) पर 0.4 mL/min प्रवाह दर पर ग्रेडिएंट एल्यूशन के तहत किए गए थे। मोबाइल चरण फॉर्मिक एसिड-पानी (1: 1000, v/v) (A) और फॉर्मिक एसिड-एसिटोनाइट्राइल (1: 1000, v/v) (B) से बना था। समय कार्यक्रम इस प्रकार था: 0–5 मिनट, A–B (92:8, v/v) को A–B (62:38, v/v) में बदला गया; 5–7 मिनट, AB (62:38, v/v); 7-7.1 मिनट, AB (62:38, v/v) को A–B (92: 8, v/v) में बदला गया; 7.1–9 मिनट, (92: 8, v/v)। UPLC/MS/MS सिस्टम में नेगेटिव इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) आयन स्रोत के साथ इंजेक्शन की मात्रा 5 µL थी। 1–3 के लिए कुल आयन क्रोमैटोग्राम (TIC) को मल्टीपल-रिएक्शन मॉनिटरिंग (MRM) मोड का उपयोग करके किया गया था। द्रव्यमान मापदंडों को सबसे स्पष्ट, उच्च-तीव्रता वाले संकेतों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। मापदंडों का सबसे अच्छा विकल्प 3000 V केशिका वोल्टेज, 20 V शंकु वोल्टेज, 125 ◦C स्रोत तापमान, 400 ◦C विलीनीकरण तापमान, 50 L/h शंकु गैस प्रवाह, 900 L/h विलीनीकरण गैस प्रवाह और 38 eV टक्कर ऊर्जा के रूप में वर्णित किया गया था। डेटा को MassLynx 4.1 (मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित किया गया था।

4.8. नमूना तैयार करना

चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में होमोजीनाइजेशन के लिए 50% मेथनॉल का इस्तेमाल किया गया (5 एमएल मेथनॉल के लिए 1 ग्राम ऊतक)। होमोजीनट को 10 मिनट के लिए 4 ◦C पर 10,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। 10 µL IS (100 µg/mL) के साथ सुपरनेटेंट (50 µL) ने 1 mL में शुद्ध पानी मिलाया। मिश्रण को ओएसिस HLB (हाइड्रोफिलिक-लिपोफिलिक संतुलित) कार्ट्रिज (वाटर्स, मिलफोर्ड, MA, USA) पर सावधानीपूर्वक लोड किया गया, जिसे पहले से ही 1mL मेथनॉल के साथ निकाला गया था और फिर वैक्यूम स्थितियों के तहत 1 mL पानी के साथ संतुलित किया गया था। कार्ट्रिज को धोने के लिए 10% मेथनॉल के 1 mL का उपयोग करने के बाद, विश्लेषित नमूने को प्राप्त करने के लिए 1 mL मेथनॉल का उपयोग किया गया अंत में, विश्लेषण किए गए नमूने के अवशेष को विश्लेषण के लिए 50% मेथनॉल के 200 µL में घोला गया।

4.9. अंशांकन मानक वक्र की तैयारी

यौगिक 1–3 का उपयोग अंशांकन मानकों को तैयार करने के लिए किया गया था, जिन्हें अंतिम अंशांकन मानक सांद्रता प्राप्त करने के लिए क्रमशः मस्तिष्क ऊतक होमोजीनट और हेस्परिडिन में आंतरिक मानक के रूप में जोड़ा गया था, जो 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, और 100.0 एनजी/एमएल थे।

4.10. सत्यापन

अंशांकन मानक वक्र 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, और 100.0 एनजी/एमएल की श्रेणियों में 1-3 की पांच अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करके रैखिकता परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, और इसे 0.99 से अधिक निर्धारण गुणांक (आर-स्क्वायर) के साथ रैखिक माना गया था। जांच की निचली सीमा (एलएलओक्यू), जिसे परीक्षण नमूने की सांद्रता के ± 20% के रूप में परिभाषित किया गया है, ने शोर के बजाय एक संकेत शिखर का उत्पादन किया। विश्लेषण पद्धति की विश्वसनीयता और सटीकता का मूल्यांकन 1-3 के 10 एनजी/एमएल पर रिकवरी टेस्ट का उपयोग करके किया गया था।

4.11. धातु चेलेटिंग गतिविधि परख

धातु केलेटिंग प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए UPLC का उपयोग CTE फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स 1–3 के 50 µg/mL घोल का उपयोग करके किया गया था जिसमें कॉपर, कैल्शियम, मैग्नीशियम, जिंक, आयरन या चूहे के सीरम का 10 µg/mL धातु घोल शामिल था। प्रत्येक धातु घोल या सीरम के साथ प्रत्येक यौगिक का विश्लेषण UPLC द्वारा किया गया था। धातु केलेटिंग प्रभाव तरल क्रोमैटोग्राफी में 1–3 के लिए अवधारण समय को बदल देगा। धातु केलेटिंग प्रभाव का प्रतिशत नीचे दिए अनुसार परिकलित किया गया था और डेटा औसत ± SD (n=3) दर्शाता था।

प्र. 5। निष्कर्ष

इस अध्ययन ने दर्शाया कि 1-3 एंटी-एडी गतिविधि के लिए सीटीई के सक्रिय घटक हैं। आयरन केलेशन एडी के उपचार के लिए नई पीढ़ी की दवाओं को डिजाइन करने की नई अवधारणा बन गई है।सीटीई एक संभावित वनस्पति एंटी-एडी चीनी दवा हैआयरन केलेशन-प्रेरित ए एकत्रीकरण और जमाव को लक्षित करना। इसके अलावा, हमने आगे साबित किया कि 1–3 रक्त के माध्यम से मस्तिष्क तक पहुँचेगा - रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी)। सीटीई के सक्रिय घटक और अंतर्निहित तंत्र की पुष्टि भविष्य में उत्पाद अध्ययनों की गुणवत्ता नियंत्रण और जैव उपलब्धता में बहुत मदद करेगी। साथ ही, प्रस्तुत उन्नत और कुशल विश्लेषण विधि रासायनिक फिंगरप्रिंट और फार्माकोकाइनेटिक अनुसंधान के लिए पौधों, खाद्य पदार्थों, रक्त और मस्तिष्क के ऊतकों में 1–3 का निर्धारण करने में उपयोगी होगी।

अल्जाइमर रोग के इलाज के लिए प्राकृतिक सिस्टेन्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%