सेंसर MDA5 का ISG {{0}आश्रित सक्रियण SARS-CoV द्वारा विरोधी है-2 मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा से बचने के लिए पपेन जैसा प्रोटीज़

आरआईजी-आई-जैसे रिसेप्टर्स, रेटिनोइक-एसिड इंड्यूसिबल जीन I (आरआईजी-आई), और मेलेनोमा विभेदन-संबंधित प्रोटीन 5 (एमडीए5) का सक्रियण इंटरफेरॉन (आईएफएन)-उत्तेजित जीन (आईएसजी) को अपग्रेड करके एक एंटीवायरल स्थिति स्थापित करता है। इनमें ISG15 भी शामिल है, जिसकी जन्मजात प्रतिरक्षा में यंत्रवत भूमिका अभी भी रहस्यमय बनी हुई है। वर्तमान अध्ययन में, हम रिपोर्ट करते हैं कि वायरल आरएनए सेंसर एमडीए5 द्वारा मध्यस्थता वाले एंटीवायरल आईएफएन प्रतिक्रियाओं के लिए आईएसजी15 संयुग्मन आवश्यक है। एमडीए5 के कैस्पेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन का आईएसजीलेशन इसके ओलिगोमेराइजेशन को बढ़ावा देता है और इस तरह कोरोनविर्यूज़, फ्लेविवायरस और पिकोर्नवायरस सहित कई प्रकार के वायरस के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा के सक्रियण को ट्रिगर करता है। MDA5 के ISG {{12} निर्भर सक्रियण को SARS-CoV -2 के पपेन-जैसे प्रोटीज द्वारा मध्यस्थ प्रत्यक्ष डी-आईएसजीलेशन के माध्यम से विरोध किया जाता है, जो हाल ही में उभरा एक कोरोनोवायरस है जो COVID -19 महामारी का कारण बना है। . हमारा काम एमडीए की मध्यस्थता वाली एंटीवायरल प्रतिक्रिया में आईएसजी15 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका को दर्शाता है और SARS-CoV के एक प्रमुख प्रतिरक्षा चोरी तंत्र की भी पहचान करता है, जिसे नए एंटीवायरल और टीकों के विकास के लिए लक्षित किया जा सकता है। कोविड से मुकाबला करें-19।

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मेजबान प्रतिरक्षा होमियोस्टैसिस के वायरल गड़बड़ी की निगरानी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा की जाती है, जो रिसेप्टर्स पर निर्भर करती है जो खतरे को महसूस करते हैं- या रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) 1-3। RIG-I जैसे रिसेप्टर्स (RLRs) RIG-I और MDA5 वायरल या होस्ट-व्युत्पन्न इम्यूनोस्टिमुलेटरी RNA4 के लिए साइटोप्लाज्म का सर्वेक्षण करके वायरस का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आरएनए को सी-टर्मिनल डोमेन (सीटीडी) और आरआईजी-आई और एमडीए5 के हेलिकेज़ से बांधने से उनकी सिग्नलिंग-प्राइमेड संरचना होती है जो कई एंजाइमों की भर्ती की अनुमति देती है। ये एंजाइम कई डोमेन और साइटों पर आरएलआर को संशोधित करते हैं, और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) का विशेष रूप से कैस्पेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (सीएआरडी), सिग्नलिंग मॉड्यूल के लिए अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। प्रोटीन फॉस्फेटस 1 (पीपी1) / आरआईजी-आई और एमडीए5 कार्ड6 को डिफॉस्फोराइलेट करता है। RIG-I के मामले में, डिफॉस्फोराइलेशन TRIM25 (25 युक्त त्रिपक्षीय रूपांकन) और अन्य E3 लिगेज7,8 द्वारा कार्ड के Lys{22}}लिंक्ड पॉलीयूबिकिटेशन को बढ़ावा देता है, जो RIG-I के ऑलिगोमेरिक रूप को स्थिर करता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल एंटीवायरल सक्षम होता है। -सिग्नलिंग प्रोटीन (एमएवीएस) बाइंडिंग। RIG-I की तुलना में, MDA5 सक्रियण के व्यक्तिगत चरण और इसमें शामिल महत्वपूर्ण PTM को कम अच्छी तरह से समझा गया है। आरएलआर सक्रियण प्रकार I और III IFN के उत्पादन को प्रेरित करता है, जो बदले में, ISG9,10 को अपग्रेड करके एंटीवायरल सिग्नलिंग का प्रसार करता है। उनमें से ISG15 है, एक यूबिकिटिन जैसा प्रोटीन जिसे लक्ष्य प्रोटीन के लाइसिन अवशेषों के साथ सहसंयोजक रूप से संयुग्मित किया जा सकता है, एक PTM प्रक्रिया जिसे ISGylation11 कहा जाता है। हालाँकि ISG15 संयुग्मन को व्यापक रूप से एंटीवायरल रूप से कार्य करने के लिए मान्यता दी गई है, मेजबान प्रोटीन ISGylation के तंत्र जो ISG15 की व्यापक एंटीवायरल प्रतिबंध गतिविधि की व्याख्या कर सकते हैं, वर्तमान में अज्ञात हैं। वर्तमान में चल रही कोविड महामारी का प्रेरक एजेंट, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोना वायरस 2 (एससीओवी2), कोरोनाविरिडे परिवार से संबंधित है जिसमें कई अन्य मानव रोगजनक शामिल हैं। कोरोना वायरस में IFN-मध्यस्थता वाली एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं को दबाने की असाधारण क्षमता होती है, और SCoV संक्रमित रोगियों में कम IFN उत्पादन गंभीर बीमारी13 से संबंधित होता है। कोरोनावायरल आईएफएन प्रतिपक्षी में पपैन-जैसा प्रोटीज़ (पीएलप्रो) है जिसमें डिबिकिटेटिंग और डी-आईएसगिलेटिंग गतिविधियां 14,15 हैं। वर्तमान अध्ययन में, हम MDA5 सक्रियण में ISGylation के लिए एक आवश्यक भूमिका की पहचान करते हैं। हम आगे दिखाते हैं कि SCoV2 PLpro MDA5 के साथ इंटरैक्ट करता है और सक्रिय डी-आईएसजीलेशन के माध्यम से ISG पर निर्भर MDA5 सक्रियण को रोकता है, जिससे पता चलता है कि MDA5 द्वारा प्रतिरक्षा निगरानी से बचने के लिए SCoV2 पहले ही विकसित हो चुका है।

परिणाम

MDA5, लेकिन RIG-I नहीं, सिग्नलिंग के लिए ISG15 की आवश्यकता होती है।

एमडीए5 कार्ड के पीटीएम की पहचान करने के लिए जो एमडीए5 सक्रियण को नियंत्रित कर सकते हैं, हमने ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड), या अकेले जीएसटी से जुड़े आत्मीयता-शुद्ध एमडीए5-2कार्ड को टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी) के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया। -एमएस/एमएस), और पाया कि, विशेष रूप से, जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड को आईएसजी15 के साथ सह-शुद्ध किया गया है, जो दो बैंड के रूप में दिखाई देता है जो असंशोधित जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड (विस्तारित डेटा) की तुलना में अधिक धीरे-धीरे (~15 और 30 केडीए तक) स्थानांतरित होता है। चित्र 1ए)। इम्यूनोब्लॉटिंग (आईबी) ने पुष्टि की कि जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड को आईएसजी15 (विस्तारित डेटा चित्र 1बी) द्वारा संशोधित किया गया है। इसके बाद हमने एमडीए प्रेरित सिग्नलिंग के लिए आईएसजी15 की प्रासंगिकता निर्धारित की। जबकि वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) माउस भ्रूणीय फ़ाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) में FLAG-MDA5 अभिव्यक्ति ने IFN-मैसेंजर आरएनए और प्रोटीन के साथ-साथ खुराक-निर्भर तरीके से Ccl5 प्रतिलेखों को प्रेरित किया, Isg15 -/- MEFs में FLAG-MDA5 अभिव्यक्ति को समाप्त कर दिया गया एंटीवायरल जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्र 1ए और विस्तारित डेटा चित्र 1सी)। इसी प्रकार, डब्ल्यूटी नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 1 बी और विस्तारित डेटा छवि 1 डी) की तुलना में आईएसजी 15 नॉकआउट (केओ) हेला (मानव) कोशिकाओं में एंटीवायरल जीन प्रेरण दृढ़ता से कम हो गया है, जिससे प्रजाति-विशिष्ट प्रभाव को खारिज कर दिया गया है। इसके विपरीत, FLAG-RIG-I ने Isg15 -/- और WT MEFs (छवि 1 ए और विस्तारित डेटा छवि 1 सी) में स्रावित आईएफएन- प्रोटीन के साथ-साथ आईएफएनबी 1 और सीसीएल 5 प्रतिलेखों की तुलनीय मात्रा को प्रेरित किया। IFNB1 और CCL5 प्रतिलेखों के साथ-साथ FLAG-RIG-I द्वारा IFN- प्रोटीन का उत्पादन ISG15 KO हेला कोशिकाओं में WT कोशिकाओं (छवि 1 बी और विस्तारित डेटा छवि 1 डी) की तुलना में समान या थोड़ा बढ़ा हुआ था, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है कि ISGylation नकारात्मक है। RIG-I सिग्नलिंग16,17 को प्रभावित करता है

चित्र 1|MDA5 के लिए ISGylation आवश्यक है, लेकिन RIG-I, सिग्नलिंग के लिए नहीं। ए, बी, आईएफएन का एलिसा- एमईएफ (डब्ल्यूटी या आईएसजी15-/-) (ए) और हेला कोशिकाओं (डब्ल्यूटी या आईएसजी15 केओ) के सतह पर तैरने वालों से (बी) के लिए फ्लैग-टैग एमडीए5 या आरआईजी-आई की बढ़ती मात्रा के साथ क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। 40 घंटा. संपूर्ण-कोशिका लाइसेट्स (डब्ल्यूसीएल) की जांच आईबी द्वारा एंटी-आईएसजी15, एंटी-फ्लैग और एंटी-एक्टिन (लोडिंग कंट्रोल) के साथ की गई थी। सी, आईएफएन का एलिसा- डब्ल्यूटी या आईएसजी15 -/- एमईएफ के सतह पर तैरने वालों से जो ईएमसीवी आरएनए (0.1 या {{23%).4 माइक्रोग्राम एमएल-1), एचएमडब्ल्यू-पॉली के साथ नकली उत्तेजित या ट्रांसफ़ेक्ट किए गए थे। (I: C) ({{36%).5 µg ml−1 ) या RABVLe (1 pmol ml−1 ), या 24 के लिए SeV (1{{49%) हेमाग्लुटिनेशन यूनिट्स (HAU) ml−1 ) से संक्रमित एच। d, WT और Isg15 -/- MEFs में IFnb1, Ccl5, और Tnf mRNA का RT-qपीसीआर विश्लेषण c के रूप में उत्तेजित किया गया। ई, एनएचएलएफ के डब्ल्यूसीएल में आईआरएफ3 फॉस्फोराइलेशन जिन्हें 30 घंटे के लिए संकेतित siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और फिर 6 घंटे के लिए ईएमसीवी आरएनए (0.4 माइक्रोग्राम एमएल−1) या आरएबीवीएलई (1 पीएमओएल एमएल−1) के साथ नकली उत्तेजित या ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, द्वारा मूल्यांकन किया गया एंटी-पीएसर के साथ आईबी396-आईआरएफ3 और एंटी-आईआरएफ3। एफ, आईएफएन का एलिसा- एनएचएलएफ के सतह पर तैरने वालों से जिन्हें 30 घंटे के लिए संकेतित सीआरएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और फिर ईएमसीवी आरएनए (0.4 माइक्रोग्राम एमएल -1) या आरएबीवीएलई (1 पीएमओएल एमएल -1) के साथ नकली उत्तेजित या ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, या एसईवी से संक्रमित किया गया था। (10 HAU ml−1 ) 16 घंटे के लिए। जी, आईएफएन का एलिसा- पीबीएमसी के सतह पर तैरने वालों से जिन्हें संकेतित shRNA लेंटिवायरल कणों के साथ 40 घंटे के लिए ट्रांसड्यूस किया गया था और फिर 8 घंटे के लिए mutEMCV (MOI=10) या SeV (200 HAU ml−1) से संक्रमित किया गया था। एच, पीबीएमसी में आईएफएनए2 और आईएल-6 एमआरएनए का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण, जिन्हें जी के रूप में ट्रांसड्यूस और संक्रमित किया गया था। डेटा समान परिणामों के साथ कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है (ए-डी और एफ में एन=3 जैविक प्रतिकृति का मतलब ± एसडी, और जी और एच में एन=2 जैविक प्रतिकृति का मतलब)। *पी< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

हमने अगली बार उनके संबंधित लिगेंड्स द्वारा अंतर्जात एमडीए5 और आरआईजी-आई के सक्रियण पर आईएसजी15 जीन विलोपन के प्रभाव का परीक्षण किया। IFN- उत्पादन के साथ-साथ IFNB1, CCL5, और TNF जीन अभिव्यक्ति एन्सेफैलोमोकार्डिटिस वायरस (EMCV) RNA या उच्च-आणविक-भार (HMW)-पॉली (I: C) के संक्रमण से प्रेरित है, दोनों को मुख्य रूप से MDA5 द्वारा महसूस किया जाता है। Isg15 -/- MEF, ISG15 KO हेला और ISG15 KO HAP -1 कोशिकाओं में उनके संबंधित नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 1 सी, डी और विस्तारित डेटा छवि 1 ई-जी) की तुलना में गहराई से क्षीण किया गया था। महत्वपूर्ण बात यह है कि ISG15 KO कोशिकाओं में EMCV RNA या HMW-poly(I: C) द्वारा एंटीवायरल जीन इंडक्शन का उन्मूलन निरस्त MDA5 जीन अभिव्यक्ति के कारण नहीं था; इसके विपरीत, WT कोशिकाओं (विस्तारित डेटा छवि 1f,g) की तुलना में ISG15 KO कोशिकाओं में MDA5 mRNA अभिव्यक्ति को बढ़ाया गया था। एमडीए5 एगोनिस्ट के साथ उत्तेजना के विपरीत, रेबीज वायरस लीडर आरएनए (आरएबीवीएलई) ट्रांसफेक्शन या सेंडाई वायरस (एसईवी) संक्रमण द्वारा आईएसजी15-/- एमईएफ और आईएसजी15 केओ हेला कोशिकाओं की उत्तेजना, जो आरआईजी-आई उत्तेजनाएं हैं, ने आईएफएन-उत्पादन का नेतृत्व किया और एंटीवायरल जीन अभिव्यक्ति डब्ल्यूटी कोशिकाओं (छवि 1 सी, डी और विस्तारित डेटा छवि 1 ई) के बराबर है। ISG15 जीन-हटाए गए कोशिकाओं से जुड़े संभावित क्लोनल प्रभावों को दूर करने के लिए, हमने प्राथमिक सामान्य मानव फेफड़े के फ़ाइब्रोब्लास्ट (NHLFs) में क्षणिक जीन-साइलेंसिंग प्रयोग किए। एमडीए5 नॉकडाउन के समान आईएसजी15 साइलेंसिंग से आईएफएन-नियामक कारक 3 (आईआरएफ3) के फॉस्फोराइलेशन का लगभग पूरा नुकसान हुआ - जो आरएलआर-सिग्नल सक्रियण की एक पहचान है - ईएमसीवी आरएनए के साथ उत्तेजना के बाद, लेकिन आरएबीवीएलईशेड आईएफएन-उत्पादन के साथ-साथ नहीं। एनएचएलएफ में एंटीवायरल ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति ईएमसीवी आरएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट होती है, लेकिन आरएबीवीएलई या एसईवी (छवि 1 एफ और विस्तारित डेटा छवि 1 एच) से प्रेरित कोशिकाओं में नहीं। प्राथमिक मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) में आईएसजी 15 या एमडीए 5 की छोटी हेयरपिन (एसएच) आरएनए-मध्यस्थता वाली साइलेंसिंग ने एमडीए 5 प्रतिपक्षी 18,19 की कमी वाले पुनः संयोजक उत्परिवर्ती ईएमसीवी (म्यूटईएमसीवी) के साथ संक्रमण के बाद एंटीवायरल प्रोटीन और ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति को काफी हद तक कम कर दिया है। संक्रमित पीबीएमसी को गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण shRNA (छवि 1 जी, एच और विस्तारित डेटा छवि 1i) के साथ स्थानांतरित किया गया। इसके विपरीत, ISG15 या MDA5 की कमी ने SeV संक्रमण के बाद PBMCs में साइटोकिन प्रतिक्रियाओं को प्रभावित नहीं किया (चित्र 1g,h और विस्तारित डेटा चित्र 1i)। ये नतीजे बताते हैं कि एमडीए5 द्वारा प्रतिरक्षा सिग्नलिंग के लिए आईएसजी15 आवश्यक है, लेकिन आरआईजी-आई नहीं। MDA5 कार्ड Lys23 और Lys43 पर ISGylated हैं।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

MDA5–2CARD ISGylation की पहचान करने वाले हमारे MS विश्लेषण की पुष्टि करने के लिए, हमने पहले परीक्षण किया कि क्या अंतर्जात MDA5 को भी ISG15 द्वारा संशोधित किया गया है। अंतर्जात MDA5 को HMW-पॉली (I: C) से ट्रांसफ़ेक्ट की गई या डेंगू (DENV) या ज़िका (ZIKV) वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में मजबूती से ISGylated किया गया था, जिन्हें MDA5 (रेफरी 5) (चित्र 2a) द्वारा महसूस किया जाता है। विशेष रूप से, अंतर्जात एमडीए5 को असंक्रमित कोशिकाओं में भी आईएसगिलेटेड किया गया था, हालांकि बहुत कम स्तर पर (विस्तारित डेटा चित्र 2 ए), जो पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है कि कई मेजबान प्रोटीन भी सामान्य (असंक्रमित) स्थितियों में निम्न स्तर पर आईएसगिलेटेड होते हैं। IFNAR-सिग्नलिंग-मध्यस्थता वाले ISG अपग्रेडेशन को रोकने के लिए एंटी-IFNAR2 से उपचारित कोशिकाओं में, ISG15 या MDA5 साइलेंसिंग के कारण mutEMCV संक्रमण (विस्तारित डेटा छवि 2 बी) के बाद IFNB1 जीन अभिव्यक्ति में तुलनीय कमी आई, जो दर्शाता है कि ISG 15- निर्भर है IFNAR सिग्नलिंग की अनुपस्थिति में भी MDA5 सिग्नलिंग होती है।

t MDA5Δ2CARD (हेलिकेज़ और CTD युक्त), MDA5 ISGylation की प्राथमिक साइट है जो ISGylated 2CARD (चित्र 2b) के लिए दो प्रमुख बैंड दिखाती है। ISG15 KO हेला कोशिकाओं का WT ISG15, या एक गैर-संयुग्मनीय ISG15 उत्परिवर्ती के साथ पुनर्गठन, जिसमें संयुग्मन के लिए आवश्यक दो ग्लाइसीन को एलेनिन (ISG15-AA)21 से प्रतिस्थापित किया गया था, सहसंयोजक ISG15 संयुग्मन प्रदर्शित किया गया (चित्र 2c) . जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड में व्यक्तिगत लाइसिन अवशेषों के आर्जिनिन में उत्परिवर्तन से पता चला कि Lys23 और Lys43 के एकल-साइट उत्परिवर्तन ने ISGylation (विस्तारित डेटा चित्र 2c) को काफी कम कर दिया है, जबकि उनके संयुक्त उत्परिवर्तन (Lys23Arg/Lys43Arg) ने ISGylation को लगभग समाप्त कर दिया है (चित्र 2d)। ). पूर्ण-लंबाई वाले FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ने भी स्पष्ट रूप से कम ISGylation (छवि 2e और विस्तारित डेटा छवि 2d) दिखाया; FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg में देखा गया अवशिष्ट ISGylation संभवतः 2CARD और/या Δ2CARD में अतिरिक्त छोटी साइटों के कारण है। ध्यान दें, Lys23Arg/Lys43Arg उत्परिवर्तन ने MDA5–2CARD SUMOylation5 (विस्तारित डेटा चित्र 2e) को प्रभावित नहीं किया। इसके अलावा, जबकि RIG-I-2CARD को दृढ़ता से सर्वव्यापी किया गया था (जो सहसंयोजक Lys 63- से जुड़े ubiquitination7 का प्रतिनिधित्व करता है), न तो MDA5–2CARD WT और न ही Lys23Arg/Lys43Arg उत्परिवर्ती ने सर्वव्यापीकरण का पता लगाने योग्य स्तर दिखाया (विस्तारित डेटा छवि 2f)। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि MDA5 कार्ड दो प्रमुख साइटों, Lys23 और Lys43 पर ISGylation से गुजरते हैं।

MDA5 सक्रियण के लिए CARD ISGylation आवश्यक है।

उनकी सिग्नल-ट्रांसड्यूसिंग क्षमता की तुलना करने पर, MDA5–2CARD Lys23Arg और Lys43Arg सिंगल-साइट म्यूटेंट ने WT MDA5–2CARD की तुलना में IFN- प्रमोटर सक्रियण को आंशिक रूप से कम दिखाया, जबकि Lys23Arg/Lys43Arg म्यूटेंट में सिग्नलिंग गतिविधि बहुत कम थी, जो लगभग उतनी ही मजबूत थी। सिग्नलिंग-दोषपूर्ण म्यूटेंट Ser88Glu और Ser88Asp6 (विस्तारित डेटा छवि 2 जी) के रूप में। इसके विपरीत, एक उत्परिवर्ती जिसमें Lys68, जो लाइसिन अवशेष है जो Lys43 और Lys23 के सबसे समीप है, को आर्जिनिन (Lys68Arg) के साथ प्रतिस्थापित किया गया था, जिसने WT 2CARD (विस्तारित डेटा छवि 2c,g) के लिए तुलनीय ISG15 संयुग्मन और सिग्नलिंग क्षमता दिखाई। MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, WT MDA5–2CARD के विपरीत, IRF3 डिमराइजेशन (विस्तारित डेटा चित्र 2h) को प्रेरित करने में भी विफल रहा। FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg या Lys23Arg/Lys43Arg ने भी FLAG-MDA5 WT (चित्र 2f) की तुलना में IFN- प्रमोटर-सक्रियण क्षमताओं को कम या लगभग समाप्त कर दिया है। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ने उच्च मात्रा में व्यक्त होने पर भी गहरा सिग्नलिंग दोष दिखाया, जबकि WT MDA5 ने खुराक पर निर्भर तरीके से एंटीवायरल ट्रांसक्रिप्ट को प्रेरित किया (चित्र 2g)। समझौते में, STAT1 फॉस्फोराइलेशन, IFNAR सिग्नलिंग की एक पहचान, साथ ही ISG प्रोटीन अभिव्यक्ति MDA5 WT द्वारा अत्यधिक प्रेरित थी, लेकिन Lys23Arg/Lys43Arg (छवि 2h) से नहीं। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg या Ser88Glu के साथ MDA जीन-संपादित मानव एस्ट्रोसाइट्स (SVGAs) के कार्यान्वयन से WT MDA5 व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में IFNB1, CCL5 और ISG प्रतिलेख बहुत कम हो गए (चित्र 2i और विस्तारित डेटा चित्र 2i) . ये परिणाम दर्शाते हैं कि Lys23 और Lys43 पर ISGylation MDA5-मध्यस्थ साइटोकिन प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक है।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

PP1 द्वारा डिफॉस्फोराइलेशन MDA5 ISGylation को नियंत्रित करता है।

RIG-I के समान, MDA5 को असंक्रमित कोशिकाओं में CARDs के भीतर फॉस्फोराइलेट किया जाता है, जो ऑटोएक्टिवेशन को रोकता है; PP1 / द्वारा RIG-I और MDA5 का डिफॉस्फोराइलेशन, RLR को उनके सिग्नलिंग-दमित राज्यों6,22–24 से मुक्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। RIG-I का डिफॉस्फोराइलेशन, कार्डों के Lys {{10}लिंक्ड सर्वव्यापीकरण की अनुमति देता है, जो RIG-I मल्टीमेराइजेशन और सिग्नलिंग5 को बढ़ावा देता है। CARD डिफॉस्फोराइलेशन (Ser88 पर) MDA5 सक्रियण को कैसे ट्रिगर करता है इसका विवरण मायावी बना हुआ है, और इसलिए हमने परीक्षण किया कि क्या डिफॉस्फोराइलेशन MDA5 ISGylation को नियंत्रित करता है। PP1 की साइलेंसिंग / दृढ़ता से कम MDA5–2CARD ISGylation (विस्तारित डेटा छवि 3 ए)। इसके अलावा, फॉस्फोमिमेटिक सेर88ग्लू और सेर88एएसपी म्यूटेंट ने ISGylation को कम कर दिया था, जबकि फॉस्फो-नल सेर88Ala म्यूटेंट ने WT MDA5–2CARD (विस्तारित डेटा छवि 3 बी) की तुलना में अधिक मजबूत ISGylation दिखाया था। इसके विपरीत, MDA5 WT और Lys23Arg/Lys43Arg में तुलनीय Ser88 फॉस्फोराइलेशन (विस्तारित डेटा चित्र 3c) था। साथ में, ये डेटा सुझाव देते हैं कि Ser88 पर MDA5 डिफॉस्फोराइलेशन CARD ISGylation से पहले होता है। इसके बाद हमने खसरा वायरस वी प्रोटीन (एमईवी-वी) का उपयोग किया, जो पीपी1/एंटागोनिज्म25 के माध्यम से एमडीए5 सेर88 डिफॉस्फोराइलेशन को रोकता है। MeV-V अभिव्यक्ति ने खुराक पर निर्भर तरीके से जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड या फ्लैग-एमडीए5 के सेर88 फॉस्फोराइलेशन (एब्लेटेड डीफॉस्फोराइलेशन का संकेत) को बढ़ाया, जैसा कि पहले दिखाया गया था। MeV-V द्वारा संवर्धित फॉस्फोराइलेशन ISGylation में गिरावट के साथ सहसंबद्ध है (विस्तारित डेटा चित्र 3डी,ई)। WT MeV-V के विपरीत, एक उत्परिवर्ती MeV-V जिसने PP{50}}बाइंडिंग और MDA{51}}डिफॉस्फोराइलेशन विरोध (MeV-VΔtail)25 को समाप्त कर दिया है, MDA5–2CARD ISGylation (विस्तारित डेटा) पर बहुत कम प्रभाव प्रदर्शित करता है चित्र 3f), MeV-V द्वारा मुख्य रूप से PP1 निषेध के कारण ISGylation के निषेध को मजबूत करना, न कि अन्य विरोधी प्रभावों के कारण। निपाह और हेंड्रा वायरस (NiV-V और HeV-V) के V प्रोटीन ने MDA5 Ser88 फॉस्फोराइलेशन को भी बढ़ाया और, तदनुसार, MDA5 ISGylation (विस्तारित डेटा चित्र 3g,h) को कम कर दिया, जिससे पता चलता है कि कई पैरामाइक्सोवायरल V प्रोटीन हेरफेर के माध्यम से MDA5 ISGylation को रोकते हैं। सेर88 फॉस्फोराइलेशन का, हालांकि व्यक्तिगत वी प्रोटीन के लिए सटीक तंत्र निर्धारित किया जाना बाकी है। कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से पता चलता है कि MDA5 CARD ISGylation, Ser88 पर डिफॉस्फोराइलेशन पर निर्भर है।

ISGylation उच्च-क्रम MDA5 असेंबलियों को बढ़ावा देता है।

आरएलआर सक्रियण के लिए आरएनए बाइंडिंग, आरएलआर ओलिगोमेराइजेशन और एमएवीएस5 के साथ बातचीत के लिए साइटोसोल से माइटोकॉन्ड्रिया में उनके स्थानांतरण की आवश्यकता होती है। उस तंत्र को स्पष्ट करने के लिए जिसके द्वारा ISGylation MDA5 गतिविधि को प्रभावित करता है, हमने पहले जांच की कि क्या ISGylation RNA बाइंडिंग को प्रभावित करता है। डब्ल्यूटी या आईएसजी15 से शुद्ध अंतर्जात एमडीए5 -/- एमईएफ ने इन विट्रो में एचएमडब्ल्यू-पॉली (आई: सी) के साथ समान रूप से अच्छी तरह से बातचीत की (विस्तारित डेटा छवि 4 ए)। MDA5 WT और Lys23Arg/Lys43Arg ने HMW-poly(I: C) के साथ तुलनीय बाइंडिंग दिखाई, जो दर्शाता है कि ISGylation MDA5 (विस्तारित डेटा छवि 4 बी) की आरएनए-बाइंडिंग क्षमता को प्रभावित नहीं करता है। जब हमने EMCV RNA उत्तेजना के बाद साइटोसोल से माइटोकॉन्ड्रिया में MDA5 के स्थानांतरण की निगरानी की, तो हमने पाया कि ISG15 साइलेंसिंग करता है, लेकिन ऐसा नहीं। C ट्रांसफ़ेक्शन ने, MDA5 ट्रांसलोकेशन को समाप्त कर दिया (चित्र 3 ए)। इसके विपरीत, RABVLe ट्रांसफ़ेक्शन के बाद RIG-I ट्रांसलोकेशन ISG 15- डिप्लेटेड और si दोनों में कुशल था। सी-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाएँ (चित्र 3बी)। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ISGylation MDA5 ट्रांसलोकेशन या इसके एक कदम ऊपर की ओर नियंत्रित करता है। चूँकि MDA5 के साइटोसोल-टू-माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसलोकेशन के लिए 14-3-3η26 के साथ इंटरेक्शन की आवश्यकता होती है, इसलिए हमने WT और उत्परिवर्ती MDA5 के बाइंडिंग 14-3-3η की तुलना की। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg की 14-3-3η को बांधने की क्षमता WT MDA5 या Lys68Arg म्यूटेंट (विस्तारित डेटा चित्र 4c) के समान थी। हालाँकि, जबकि EMCV RNA उत्तेजना ने WT MEFs में MDA5 ऑलिगोमेराइजेशन को प्रभावी ढंग से प्रेरित किया, ISG की कमी वाले MEFs (चित्र 3c) में MDA5 ऑलिगोमर्स का गठन समाप्त कर दिया गया। 293T कोशिकाओं में ISG15 नॉकडाउन ने FLAG-MDA5-2CARD (छवि 3 डी) के ऑलिगोमेराइजेशन को भी समाप्त कर दिया। इसके विपरीत, ISGylation मशीनरी घटकों, Ube1L और UbcH8 की सह-अभिव्यक्ति ने si में MDA5–2CARD ओलिगोमेराइजेशन को दृढ़ता से बढ़ाया। सी-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाएं, लेकिन आईएसजी 15- क्षीण कोशिकाओं में नहीं (चित्र 3डी), यह दर्शाता है कि एमडीए5 ऑलिगोमर गठन के लिए आईएसजीलेशन आवश्यक है। इस अवधारणा के समर्थन में, FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ने लगभग समाप्त ऑलिगोमेराइजेशन दिखाया, जबकि WT MDA5 ऑलिगोमेराइजेशन कुशलता से किया (चित्र 3e)। हमने Lys23 Arg/Lys43Arg उत्परिवर्तन के प्रभाव की तुलना ऑलिगोमेराइजेशन-विघटनकारी उत्परिवर्तन के साथ की है जो या तो MDA5 मोनोमर्स के बीच इंटरफ़ेस को स्थानीयकृत करता है और RNA-बाइंडिंग-मध्यस्थता MDA5 फिलामेंटेशन (Ile841Arg/Glu842Arg और Asp848Ala/Phe849Ala)27,28 को बाधित करता है। या CARDs (Gly74Ala/Trp75Ala) के लिए और 2CARD ओलिगोमेराइजेशन27 को बाधित करें। WT MDA5 के विपरीत, Lys23Arg/Lys43Arg उत्परिवर्ती, MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala के समान, ने अल्प ओलिगोमेराइजेशन दिखाया और, इसके अनुरूप, IFN- प्रमोटर-सक्रिय करने की क्षमता को समाप्त कर दिया (चित्र 3f,g)। Ile841Arg/Glu842Arg या Asp848Ala/Phe849Ala पृष्ठभूमि में Lys23Arg/Lys43Arg का परिचय, जिनमें से किसी ने भी MDA5 ऑलिगोमेराइजेशन और सिग्नलिंग को कम कर दिया, MDA5 ऑलिगोमेर गठन और IFN- इंडक्शन को भी समाप्त कर दिया (चित्र 3f,g)। चूंकि LGP2 डबल-स्ट्रैंडेड RNA पर MDA5 न्यूक्लिएशन की सुविधा देता है और इस तरह MDA5 ऑलिगोमेराइजेशन29,30, हमने MDA5 WT और Lys23Arg/Lys43Arg के LGP2 बाइंडिंग की तुलना की। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ने LGP2 के साथ WT MDA5 (विस्तारित डेटा चित्र 4d) जितनी कुशलता से बातचीत की, इस प्रस्ताव को मजबूत किया कि CARD ISGylation RNA-बाध्यकारी-मध्यस्थ फिलामेंटेशन से स्वतंत्र रूप से MDA5 ओलिगोमेराइजेशन को बढ़ावा देता है। सामूहिक रूप से, ये परिणाम स्थापित करते हैं कि ISGylation CARD ऑलिगोमेराइजेशन और उच्च-क्रम MDA5 असेंबली की सुविधा प्रदान करता है।

चित्र 2|MDA5 सक्रियण के लिए Lys23 और Lys43 पर ISGylation की आवश्यकता होती है। NHLFs में एक अंतर्जात MDA5 ISGylation जिसका नकली उपचार किया गया, 40 घंटे (बाएं) के लिए HMW-पॉली (I: C) (0.1 μg ml−1) से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया या DENV या ZIKV (MOI {{) से संक्रमित किया गया प्रत्येक के लिए 10%) 48 घंटे (दाएं) के लिए, एंटी-एमडीए5 (या एक आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण) के साथ आईपी और एंटी-आईएसजी15 के साथ आईबी द्वारा निर्धारित किया जाता है। बी, क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किए गए HEK293T कोशिकाओं में FLAG-टैग किए गए MDA5-2CARD और MDA5Δ2CARD का ISGylation, जो V5-ISG15, HA-Ube1L और FLAG-UbcH8 को भी व्यक्त करता है, ट्रांसफ़ेक्शन के 40 घंटे बाद एंटी-V5 के साथ FLAG PD और IB द्वारा मूल्यांकन किया गया। सी, ISG15 KO हेला कोशिकाओं में अंतर्जात MDA5 ISGylation को वेक्टर, WT ISG15 या ISG 15-AA के साथ स्थिर रूप से पुनर्गठित किया गया और IFN- उपचार के बाद HA-Ube1L और FLAG-UbcH8 के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया (1, 000 यू एमएल−1 ) 24 घंटे के लिए, एंटी-एमडीए5 के साथ आईपी और एंटी-आईएसजी15 के साथ आईबी द्वारा निर्धारित किया जाता है। डी, HEK293T कोशिकाओं में जीएसटी-एमडीए5-2कार्ड डब्ल्यूटी और Lys23Arg/ Lys43Arg का ISGylation जो 24 घंटे के लिए V5-ISG15, HA-Ube1L और FLAG-UbcH8 के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, जीएसटी पीडी और आईबी द्वारा एंटी-वी5 के साथ निर्धारित किया गया था। ई, HEK293T कोशिकाओं में FLAG-MDA5 WT और Lys23Arg/Lys43Arg का ISGylation जो V5-ISG15, HA-Ube1L और FLAG-UbcH8 के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, FLAG PD और IB द्वारा एंटी-V5 के साथ निर्धारित किया गया था। एफ, HEK293T कोशिकाओं में IFN-ल्यूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर गतिविधि जिन्हें वेक्टर, FLAG-MDA5 WT या म्यूटेंट के साथ 40 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। लूसिफ़ेरेज़ मानों को वेक्टर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के मानों के सापेक्ष गुना प्रेरण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिसे 1 पर सेट किया गया है। डब्ल्यूसीएल की जांच आईबी द्वारा एंटी-फ़्लैग और एंटी-एक्टिन के साथ की गई थी। जी, HEK293T कोशिकाओं में IFNB1 और CCL5 mRNA का RT-qपीसीआर विश्लेषण, जिन्हें वेक्टर या FLAG-MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg की बढ़ती मात्रा के साथ क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। h, STAT1 फॉस्फोराइलेशन और ISG (IFIT1 और -2) HEK293T कोशिकाओं के WCL में प्रोटीन की प्रचुरता, जिन्हें IB द्वारा निर्धारित वेक्टर या FLAG-MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg के साथ क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। I, MDA5 KO SVGAs में संकेतित एंटीवायरल जीन का RT-qपीसीआर विश्लेषण, जिन्हें या तो खाली वेक्टर या FLAG-टैग MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg या Ser88Glu के साथ क्षणिक रूप से पुनर्गठित किया गया था। डेटा समान परिणामों वाले कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है (मतलब n का ± sd=3 f, g, और i में जैविक प्रतिकृति)। *पी< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

चित्र 3|CARD ISGylation उच्च-क्रम MDA5 असेंबलियों के निर्माण को बढ़ावा देता है। ए, बी, एनएचएलएफ से डब्ल्यूसीएल का साइटोसोल-माइटोकॉन्ड्रिया विभाजन जो गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण siRNA (si. C) या ISG 15- विशिष्ट siRNA (si.ISG15) के साथ 3 0 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और फिर 16 घंटे के लिए ईएमसीवी आरएनए ({{24%).4 μg ml−1 ) (a) या RABVLe (1 pmol ml−1 ) (b) से मॉक-ट्रीट किया गया या ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। आईबी को एंटी-एमडीए5 (ए), एंटी-आरआईजी-आई (बी), एंटी-आईएसजी15 और एंटी-एक्टिन (ए और बी) के साथ प्रदर्शित किया गया था। -ट्यूबुलिन और एमएवीएस क्रमशः साइटोसोलिक और माइटोकॉन्ड्रियल अंश के लिए शुद्धता मार्कर के रूप में कार्य करते हैं (ए और बी)। सी, डब्ल्यूटी और आईएसजी15 -/- एमईएफ में अंतर्जात एमडीए5 ऑलिगोमेराइजेशन, जिन्हें 16 घंटे के लिए ईएमसीवी आरएनए (0.5 माइक्रोग्राम एमएल-1) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और एंटी-एमडीए5 के साथ एसडीडी-एजीई और आईबी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। डब्ल्यूसीएल का आगे एसडीएस-पेज द्वारा विश्लेषण किया गया और आईबी द्वारा एंटी-एमडीए5 और एंटी-एक्टिन के साथ जांच की गई। डी, HEK293T कोशिकाओं में FLAG-MDA5-2CARD का ओलिगोमेराइजेशन, जो संकेतित siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, या तो HA-Ube1L और FLAG-UbcH8 के साथ 48 घंटे के लिए, नेटिवपेज और IB द्वारा एंटी-फ़्लैग के साथ निर्धारित किया गया था। WCL का आगे SDS-PAGE द्वारा विश्लेषण किया गया और IB द्वारा एंटी-FLAG, एंटी-HA, एंटी-ISG15 और एंटी-एक्टिन के साथ जांच की गई। ई, क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट MDA5 KO HEK293 कोशिकाओं में FLAG-MDA5 WT और Lys23Arg/Lys43Arg का ओलिगोमेराइजेशन, SDD-AGE और IB द्वारा एंटी-फ़्लैग के साथ मूल्यांकन किया गया। डब्ल्यूसीएल का आगे एसडीएस-पेज और आईबी द्वारा एंटी-फ्लैग और एंटी-एक्टिन के साथ विश्लेषण किया गया। एफ, FLAG-टैग किए गए MDA5 WT और क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट MDA5 KO HEK293 कोशिकाओं में उत्परिवर्ती का ओलिगोमेराइजेशन, NativePAGE और IB द्वारा एंटी-MDA5 के साथ मूल्यांकन किया गया। डब्ल्यूसीएल का आगे एसडीएस-पेज द्वारा विश्लेषण किया गया और आईबी द्वारा एंटी-एमडीए5 और एंटी-एक्टिन के साथ जांच की गई। जी, एमडीए5 केओ एचईके293 कोशिकाओं में आईएफएन-ल्यूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर गतिविधि जिन्हें 24 घंटे के लिए खाली वेक्टर, या फ़्लैग-टैग एमडीए5 डब्ल्यूटी या म्यूटेंट के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि को वेक्टर-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के मूल्यों के सापेक्ष गुना प्रेरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है, जिसे 1 पर सेट किया गया है। डेटा समान परिणामों के साथ कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है (मतलब ± एसडी का एन=3 जी में जैविक प्रतिकृति)। ***पी< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

ISGylation-निर्भर MDA5 सिग्नलिंग वायरस प्रतिकृति को प्रतिबंधित करता है।

हमने अगला मूल्यांकन किया कि क्या वायरस प्रतिकृति को प्रतिबंधित करने की क्षमता के लिए MDA5 का ISGylation आवश्यक है। FLAG-MDA5 WT, लेकिन Lys23Arg/Lys43Arg नहीं, संभावित रूप से (~2log द्वारा) EMCV प्रतिकृति को बाधित करता है (चित्र 4a)। इसी तरह, MDA5 KO HEK293 कोशिकाओं को WT MDA5 के साथ पुनर्गठित किया गया, लेकिन Lys23Arg/ Lys43Arg उत्परिवर्ती के साथ पूरक कोशिकाएं नहीं, प्रभावी रूप से DENV प्रतिकृति को प्रतिबंधित करती हैं (छवि 4 बी)। हमने MDA5 KO एस्ट्रोसाइट SVGAs को भी पुनर्गठित किया, जो ZIKV संक्रमण के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक कोशिका प्रकार है, या तो वेक्टर के साथ, या MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg, और फिर 40- घंटे के समय के दौरान ZIKV प्रतिकृति का मूल्यांकन किया। वेक्टर-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में WT MDA5 के साथ पुनर्गठित कोशिकाओं में ZIKV प्रतिकृति को ~100- गुना कम किया गया था। इसके विपरीत, MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg से पूरक कोशिकाओं ने ZIKV को प्रतिबंधित नहीं किया, MDA5 Ser88Glu को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के समान (चित्र 4c)। WT MDA5, लेकिन Lys23Arg/Lys43Arg ने भी SCoV2 प्रतिकृति को प्रतिबंधित नहीं किया, हालाँकि परीक्षण किए गए अन्य वायरस की तुलना में कुछ हद तक कम (चित्र 4d)।

चित्र 4|MDA5 द्वारा वायरल प्रतिबंध के लिए ISGylation आवश्यक है। HEK293T कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला में EMCV टाइट्रेस जिन्हें वेक्टर, या FLAG-MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg के साथ 4 0 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और फिर 24 के लिए EMCV (MOI=0.001) से संक्रमित किया गया था। एच, टीसीआईडी50 परख द्वारा निर्धारित। बी, DENV-संक्रमित MDA5 KO HEK293 कोशिकाओं का प्रतिशत जिन्हें 24 घंटे के लिए वेक्टर, या FLAG-MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और फिर 48 घंटे के लिए DENV (MOI=5) से संक्रमित किया गया था। , एंटी-फ्लैविवायरस ई (4जी2) का उपयोग करके एफएसीएस द्वारा मूल्यांकन किया गया। एसएससी, साइड स्कैटर। c, MDA5 KO SVGAs के सतह पर तैरनेवाला में ZIKV टाइटर्स जिन्हें वेक्टर या FLAG-टैग MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg या Ser88Glu के साथ 30 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और फिर संकेतित समय के लिए ZIKV (MOI=0.1) से संक्रमित किया गया था। , प्लाक परख द्वारा निर्धारित किया जाता है। पीएफयू, प्लाक बनाने वाली इकाइयाँ; एचपीआई, संक्रमण के बाद के घंटे। डी, HEK293T-hACE2 कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला में SCoV2 टाइटर्स जिन्हें 24 घंटे के लिए खाली वेक्टर, या FLAG-MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और फिर 24 के लिए SCoV2 (MOI=0.5) से संक्रमित किया गया था। एच, पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किया गया। ई, एमडीए में आईएसजी15 की भूमिका को 'घटाने' के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की योजनाबद्ध आईएफएनएआर सिग्नलिंग को कमजोर करने में इसकी भूमिका से आईएफएन प्रेरण की मध्यस्थता की गई। सुपर., सतह पर तैरनेवाला. एफ, एनएचएलएफ 'दाता' कोशिकाओं को संकेतित siRNAs के साथ 40 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और फिर 16 घंटे के लिए mutEMCV (MOI=0.1) से संक्रमित किया गया। सेल सतह पर तैरनेवाला यूवी-निष्क्रिय थे और वेरो 'प्राप्तकर्ता' कोशिकाओं पर स्थानांतरित कर दिए गए थे। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए ZIKV (MOI {{53%).002-2) से संक्रमित किया गया, और ZIKV पॉजिटिव कोशिकाओं को एंटी-फ्लेविवायरस E (4G2) और ट्रूब्लू पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा निर्धारित किया गया। जी, RIG-I KO HEK293 'दाता' कोशिकाओं को si से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। C या si.ISG15 या तो वेक्टर या FLAG-MDA5 WT या Lys23Arg/Lys43Arg के साथ, 24 घंटे के लिए, इसके बाद 16 घंटे के लिए EMCV संक्रमण (MOI=0.001)। यूवी-निष्क्रिय सेल सतह पर तैरनेवाला को 24 घंटे के लिए वेरो 'प्राप्तकर्ता' कोशिकाओं पर स्थानांतरित किया गया, इसके बाद 40 घंटे के लिए ईएमसीवी (एमओआई=0.001–0.1) के साथ संक्रमण किया गया। ईएमसीवी-प्रेरित साइटोपैथिक प्रभावों की कल्पना कूमैसी ब्लू स्टेनिंग द्वारा की गई थी। डेटा समान परिणामों वाले कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है (मतलब ± sd of n= 3 a–d में जैविक प्रतिकृति)। *पी< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

हमने आगे एमडीए5 की वायरस प्रतिकृति को रोकने की क्षमता पर आईएसजी15 साइलेंसिंग के प्रभाव को निर्धारित किया। हालाँकि MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg ISG15 साइलेंसिंग की परवाह किए बिना EMCV प्रतिकृति को दबाने में विफल रहा, WT MDA5 ने si में EMCV प्रतिकृति को प्रभावी ढंग से प्रतिबंधित कर दिया। सी-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाएँ और, अप्रत्याशित रूप से, आईएसजी 15- क्षीण कोशिकाओं में भी (विस्तारित डेटा चित्र 5ए)। इन अप्रत्याशित परिणामों के अंतर्निहित तंत्र की खोज में, हमने पाया कि WT MDA5 व्यक्त करने वाली EMCV-संक्रमित कोशिकाओं में ISG प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई थी, जब ISG15 को WT MDA5 और si से संक्रमित संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में शांत किया गया था। सी (विस्तारित डेटा चित्र 5बी)। इसी प्रकार, आईएसजी की कमी वाली कोशिकाओं में उन्नत आईएसजी प्रतिलेख और प्रोटीन अभिव्यक्ति देखी गई, जिन्हें आईएफएन-प्रेरण (विस्तारित डेटा छवि 5 सी, डी) के निरस्तीकरण के बावजूद ईएमसीवी आरएनए से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था या म्यूटईएमसीवी से संक्रमित किया गया था। इसके विपरीत, MDA5 नॉकडाउन ने IFN- और ISG प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों को निरस्त कर दिया, जैसा कि अपेक्षित था (विस्तारित डेटा चित्र 5d)। हमने देखा कि यूएसपी18 की प्रोटीन प्रचुरता, एक डीयूबिकिटेटिंग एंजाइम जो आईएफएनएआर सिग्नलिंग31 को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है, सी से संक्रमित संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में ईएमसीवी संक्रमण के बाद आईएसजी क्षीण कोशिकाओं में बहुत कम हो गया था। सी या एमडीए 5- विशिष्ट siRNA (विस्तारित डेटा चित्र 5बी,डी), जो यूएसपी18 गिरावट32 को रोकने में आईएसजी15 की रिपोर्ट की गई भूमिका के अनुरूप है। साथ में, ये डेटा सुझाव देते हैं कि आईएसजी जीन लक्ष्यीकरण (यानी, साइलेंसिंग या केओ) की प्रयोगात्मक सेटिंग्स में एमडीए 5 आईएसजीलेशन का एंटीवायरल प्रभाव आईएफएनएआर सिग्नलिंग पर आईएसजी 15 के निरोधात्मक प्रभाव के उन्मूलन के कारण असामान्य आईएसजी अपग्रेडेशन द्वारा छिपा हुआ है।

चित्र 5|SCoV2 PLpro MDA5–2CARD से जुड़ता है और ISGylates को डी-आइज़ करता है। SCoV2 PLpro: ISG15 कॉम्प्लेक्स (प्रोटीन डेटा बैंक, परिग्रहण संख्या 6YVA) की क्रिस्टल संरचना का एक रिबन प्रतिनिधित्व। प्रमुख अवशेष जो PLpro में साइट 1 इंटरेक्शन (Asn156 और Arg166/Glu167) या साइट 2 इंटरेक्शन (Phe69) के साथ-साथ इसकी उत्प्रेरक रूप से सक्रिय साइट (Cys111) में मध्यस्थता करते हैं, संकेतित हैं। बी, HEK293T कोशिकाओं में GST-MDA5-2CARD का ISGylation जो कि FLAG-ISG15, HA-Ube1L और FLAG-UbcH8 के साथ वेक्टर या V 5- टैग किए गए SCoV2 PLpro WT या म्यूटेंट के साथ 20 घंटे के लिए सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, जीएसटी पीडी और आईबी द्वारा एंटी-फ्लैग और एंटी-जीएसटी के साथ निर्धारित किया गया। WCL की जांच IB द्वारा एंटी-V5, एंटी-HA, एंटी-FLAG और एंटी-एक्टिन के साथ की गई थी। सी, क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्टेड HEK293T कोशिकाओं में HA-टैग किए गए MDA5 या RIG-I को V5-टैग किए गए SCoV2- PLpro या FLAG-टैग किए गए MeV-V (सकारात्मक नियंत्रण) से बाइंडिंग, HA PD और IB द्वारा एंटी-V5 के साथ निर्धारित किया जाता है। या ध्वज-विरोधी, और-HA-विरोधी। WCL की जांच IB द्वारा एंटी-V5 और एंटी-FLAG के साथ की गई थी। डी, HEK293T कोशिकाओं में FLAG-MDA5-2CARD का ओलिगोमेराइजेशन, जो वेक्टर के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, या 24 घंटे के लिए V{51}}टैग SCoV2 PLpro WT या Cys111Ala, नेटिवपेज और IB द्वारा एंटी-फ़्लैग के साथ मूल्यांकन किया गया था। डब्ल्यूसीएल का एसडीएस-पेज द्वारा आगे विश्लेषण किया गया और आईबी द्वारा एंटी-फ्लैग, एंटी-वी5 और एंटी-एक्टिन के साथ जांच की गई। ई, HEK293T कोशिकाओं में GST-MDA5-2CARD का ISGylation जिसने FLAG-ISG15, HA-Ube1L, और FLAG-UbcH8 को भी व्यक्त किया, और वेक्टर या संकेतित V 5- टैग किए गए कोरोनावायरल PLpro के साथ 40 घंटे के लिए सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। प्रोटीन, जीएसटी पीडी और आईबी द्वारा एंटी-फ्लैग, एंटी-वी5 और एंटी-जीएसटी के साथ निर्धारित किया जाता है। डेटा समान परिणामों वाले कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है।

इसके बाद हमने एक वायरस सुरक्षा परख को नियोजित किया जो प्रायोगिक तौर पर वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में MDA5 सिग्नलिंग को उन्हीं कोशिकाओं में डाउनस्ट्रीम IFNAR सिग्नलिंग से अलग करता है (चित्र 4e)। म्यूटईएमसीवी-संक्रमित 'दाता' कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला जो या तो सी थे। C को ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, या ISG15 या MDA5 में से ख़त्म किया गया, पराबैंगनी (UV) निष्क्रिय किया गया और फिर असंक्रमित 'प्राप्तकर्ता' कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया गया। दाता कोशिकाओं द्वारा एमडीए-मध्यस्थ IFN उत्पादन के एंटीवायरल प्रभाव की सीधे निगरानी करने के लिए 'प्राइमेड' प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को ZIKV से संक्रमित किया गया था। जबकि सी से सतह पर तैरनेवाला. सी-ट्रांसफ़ेक्टेड 'दाता' कोशिकाओं ने ZIKV प्रतिकृति को संभावित रूप से बाधित कर दिया, और ISG15 या MDA5 नॉकडाउन कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला ने ZIKV संक्रमण को न्यूनतम रूप से प्रतिबंधित कर दिया (चित्र 4f)। इसी प्रकार, ईएमसीवी-संक्रमित दाता कोशिकाओं से संस्कृति सतह पर तैरनेवाला को सी के साथ डब्ल्यूटी एमडीए5 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। सी ने प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को डब्ल्यूटी एमडीए5 व्यक्त करने वाली और आईएसजी15 की कमी वाली कोशिकाओं की तुलना में वायरल चुनौती से अधिक सुरक्षा प्रदान की (चित्र 4जी)। सामूहिक रूप से, ये डेटा दर्शाते हैं कि ISGylation आरएनए वायरस की एक श्रृंखला के एमडीए-मध्यस्थ प्रतिबंध के लिए महत्वपूर्ण है।

चित्र 6|SCoV2 PLpro अपनी डी-ISGylase गतिविधि के माध्यम से ISG {{2}मध्यस्थता MDA5 सिग्नलिंग को रोकता है। ए, एनएचएलएफ में आईएफएनबी1, आईएफएनएल1, आईएसजी15, एमडीए5 और आरआईजी-आई प्रतिलेखों का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण, जिन्हें 40 घंटे के लिए संकेतित siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और फिर मॉक आरएनए या एससीओवी2 आरएनए (0.4 माइक्रोग्राम एमएल) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। −1 ) 24 घंटे के लिए। बी, A549-hACE2 कोशिकाओं में SCoV2 Nsp3 को अंतर्जात MDA5 से बांधना, जो 24 घंटे के लिए SCoV2 (MOI=0.5) से संक्रमित थे, IP द्वारा एंटी-MDA5 (या एक IgG आइसोटाइप नियंत्रण) के साथ निर्धारित किया जाता है, जिसके बाद IB होता है। एंटी-एनएसपी3 और एंटी-एमडीए5 के साथ। डब्ल्यूसीएल की जांच आईबी द्वारा एंटी-एनएसपी3 और एंटी-एक्टिन के साथ की गई थी। सी, ए549-एचएसीई2 कोशिकाओं में अंतर्जात एमडीए5 आईएसगिलेशन जो पीएलप्रो अवरोधक (जीआरएल-0617; 50 µM) या वाहन की उपस्थिति में 40 घंटे के लिए एससीओवी2 (एमओआई=0.5) से नकली संक्रमित या संक्रमित थे। नियंत्रण (डाइमिथाइलसल्फॉक्साइड), आईपी द्वारा एंटी-एमडीए5 (या एक आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण) के साथ निर्धारित किया जाता है, इसके बाद आईबी द्वारा एंटी-आईएसजी15 और एंटी-एमडीए5 के साथ निर्धारित किया जाता है। WCL में IFIT1, RSAD2, ISG15 और एक्टिन की प्रोटीन प्रचुरता की जांच IB द्वारा की गई थी। कुशल वायरस प्रतिकृति को आईबी द्वारा एंटी-एनएसपी3 और एंटी-स्पाइक (एस) के साथ सत्यापित किया गया था। डी, हेला कोशिकाओं में आईएफएनबी1, सीसीएल5, और आईएफआईटी1 प्रतिलेखों और ईएमसीवी जीनोमिक आरएनए (जीआरएनए) का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण, जिन्हें वेक्टर, या वी5-एससीओवी2 पीएलप्रो डब्ल्यूटी या म्यूटेंट के साथ 24 घंटे के लिए क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और फिर म्यूटईएमसीवी से संक्रमित किया गया था। (एमओआई=0.5) 12 घंटे के लिए। ई, RIG-I KO HEK293 कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला में EMCV टाइटर्स जिन्हें वेक्टर या FLAG-MDA5 के साथ 24 घंटे के लिए क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, साथ ही V 5- टैग किए गए SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala या Arg166Ser/Glu167Arg, और फिर संक्रमित किया गया था 16 घंटे के लिए ईएमसीवी (एमओआई {{73%).001) के साथ, प्लाक परख द्वारा निर्धारित। एफ, ई में प्रयोग से डब्ल्यूसीएल में संकेतित आईएसजी की प्रोटीन प्रचुरता, संकेतित एंटीबॉडी के साथ आईबी द्वारा निर्धारित की गई है। डेटा समान परिणामों वाले कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है (मतलब ± sd of n= 3 a, d, और e में जैविक प्रतिकृति)। *पी< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

SCoV2 PLpro डी-आईएसजीलेशन के लिए MDA5 को लक्षित करता है।

SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV और हाल ही में उभरे SCoV2 जैसे कोरोना वायरस एक PLpro को एनकोड करते हैं जो वायरल पॉलीप्रोटीन क्लीवेज33 की मध्यस्थता करता है। इसके अलावा, PLpro में डिबिकिटिनेटिंग और डी-आईएसगिलेटिंग गतिविधियां हैं। SCoV2 PLpro को हाल ही में मुख्य रूप से इसकी डी-आईएसजीलेज़ गतिविधि15 के माध्यम से एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया था। चूँकि MDA5 को कोरोना वायरस का पता लगाने के लिए एक प्रमुख सेंसर के रूप में जाना जाता है, और क्योंकि हमारे डेटा से पता चला है कि MDA मध्यस्थता वाले वायरस प्रतिबंध के लिए ISGylation आवश्यक है, हमने जांच की कि क्या SCoV2 PLpro जन्मजात प्रतिरक्षा को बाधित करने के लिए MDA5 ISGylation को एंजाइमेटिक रूप से हटा देता है। SCoV2 PLpro WT, लेकिन इसके उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय उत्परिवर्ती (PLpro Cys111Ala)15 को नहीं, ने GST-MDA5-2CARD और FLAG-MDA5 (चित्र 5a,b और विस्तारित डेटा चित्र 6a) के ISGylation को समाप्त कर दिया। PLpro Asn156Glu और Arg166Ser/Glu167Arg म्यूटेंट, जो क्रमशः 'साइट 1' इंटरफ़ेस पर ISG15 बाइंडिंग में मामूली और गंभीर रूप से कमजोर हैं, ने ISGylation को थोड़ा या नहीं, प्रभावित किया। इसके विपरीत, PLpro Phe69Ala, जिसमें 'साइट 2' इंटरफ़ेस जो अधिमानतः यूबिकिटिन के लिए बाइंडिंग निर्धारित करता है, लेकिन ISG15 नहीं, बाधित है14,36, MDA5 ISGylation को WT PLpro (छवि 5 ए, बी और विस्तारित डेटा छवि 6 ए) के रूप में संभावित रूप से कम कर दिया गया है। ). हालाँकि, SCoV2 PLpro ने RIG-I-2CARD सर्वव्यापीकरण (विस्तारित डेटा चित्र 6बी) को नहीं दबाया। हमने पाया कि PLpro ने विशेष रूप से MDA5 के साथ इंटरैक्ट किया, लेकिन RIG-I के साथ नहीं, जैसा कि MeV-V ने किया जो MDA5 को बांधता है और एक नियंत्रण37 के रूप में कार्य करता है (चित्र 5c)। पीएलप्रो की कम मात्रा ने एमडीए5 द्वारा सिग्नलिंग को बाधित किया, लेकिन आरआईजी-आई ने नहीं, जबकि पीएलप्रो की उच्च मात्रा ने दोनों आरएलआर (विस्तारित डेटा छवि 6 सी) द्वारा एंटीवायरल सिग्नलिंग को दबा दिया। यह MDA5 को PLpro का प्रत्यक्ष लक्ष्य होने के नाते मजबूत करता है। आईआरएफ3 का डी-आईएसजीलेशन संभवतः निरोधात्मक प्रभाव के लिए जिम्मेदार है जो पीएलप्रो की उच्च खुराक का आरएलआर सिग्नलिंग15,38 पर होता है। MDA5–2CARD ऑलिगोमेराइजेशन पर PLpro के प्रभाव की जांच करते समय, PLpro WT ने नहीं बल्कि Cys111Ala ने MDA5–2CARD ऑलिगोमेराइजेशन (छवि 5d) को कुशलता से अवरुद्ध कर दिया, यह दर्शाता है कि SCoV2 PLpro अपनी एंजाइमेटिक गतिविधि के माध्यम से ISGylation-निर्भर MDA5 ऑलिगोमर गठन को रोकता है। संबंधित -कोरोनावायरस, SCoV, MERS-CoV और म्यूरिन हेपेटाइटिस वायरस (MHV) के PLpro एंजाइम, साथ ही -कोरोनावायरस HCoV-NL63 (NL63) भी MDA5–2CARD ISGylation (चित्र 5e) से बंधे और कुशलतापूर्वक कम हो गए। , यह सुझाव देते हुए कि PLpro द्वारा MDA5 विरोध को कोरोना वायरस के बीच व्यापक रूप से संरक्षित किया जा सकता है।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

SCoV2 PLpro ISG15-आश्रित MDA5 सिग्नलिंग का विरोध करता है।

इसके बाद हमने SCoV2 द्वारा प्राप्त एंटीवायरल साइटोकिन इंडक्शन के लिए ISG 15- निर्भर MDA5 सिग्नलिंग की प्रासंगिकता निर्धारित की। चूंकि SCoV2 संक्रमण को प्रभावी वायरल प्रतिपक्षी39 के कारण प्रकार I IFNs को न्यूनतम रूप से प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, हमने SCoV संक्रमित कोशिकाओं से कुल आरएनए को अलग कर दिया और फिर जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग को उत्तेजित करने के लिए इसे कोशिकाओं में पुन: ट्रांसफ़ेक्ट किया। SCoV2 RNA, लेकिन मॉक-ट्रीटेड कोशिकाओं से RNA नहीं, मजबूती से प्रेरित IFN प्रतिलेख; हालाँकि, जब ISG15 या MDA5 को शांत कर दिया गया तो यह प्रेरण स्पष्ट रूप से कम हो गया (चित्र 6a)। RIG-I नॉकडाउन ने SCoV2 RNA द्वारा प्राप्त एंटीवायरल जीन अभिव्यक्ति पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डाला, यह दर्शाता है कि SCoV2 RNA-PAMPs को मुख्य रूप से ISG15-MDA5 अक्ष (छवि 6 ए) द्वारा महसूस किया जाता है।

हमने पाया कि SCoV2 गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 3 (Nsp3), जिसके भीतर PLpro निहित है, प्रामाणिक SCoV2 संक्रमण (छवि 6 बी) के दौरान अंतर्जात MDA5 के साथ आसानी से बातचीत करता है। अंतर्जात MDA5 ISGylation SCoV संक्रमित कोशिकाओं में पता नहीं चल सका, हालांकि वायरस ने ISG15 अभिव्यक्ति को ट्रिगर किया; हालाँकि, एक विशिष्ट PLpro अवरोधक15 से उपचारित संक्रमित कोशिकाओं में, MDA5 ISGylation और डाउनस्ट्रीम ISG इंडक्शन को दृढ़ता से बढ़ाया गया था (चित्र 6c), इस प्रस्ताव का समर्थन करते हुए कि PLpro लाइव SCoV2 संक्रमण के दौरान MDA5 ISGylation और सिग्नलिंग को प्रभावी ढंग से दबा देता है। हमने अगली बार म्यूटईएमसीवी संक्रमण के दौरान अंतर्जात एमडीए5 की सक्रियता पर डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती पीएलप्रो के प्रभाव की जांच की। MDA5 ISGylation (चित्र 5b और विस्तारित डेटा चित्र 6a) पर उनके प्रभाव के अनुरूप, SCoV2 PLpro WT और Phe69Ala ने एंटीवायरल ट्रांसक्रिप्ट इंडक्शन को रोका, जबकि MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, Cys111Ala म्यूटेंट के समान, एंटीवायरल जीन अभिव्यक्ति (छवि) को प्रभावित नहीं करता था। 6डी). इसके साथ समझौते में, PLpro WT या Phe69Ala व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में mutEMCV प्रतिकृति को बढ़ाया गया था, लेकिन PLpro Cys111Ala या Arg166Ser/Glu167Arg व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में नहीं (चित्र 6d)। इसी तरह, WT PLpro ने, लेकिन Arg166Ser/Glu167Arg या Cys111Ala म्यूटेंट ने नहीं, FLAG-MDA5 (चित्र 6e) द्वारा EMCV प्रतिबंध को अवरुद्ध किया; वायरस प्रतिकृति पर प्रभाव प्रेरित आईएसजी प्रोटीन (छवि 6 एफ) से संबंधित है। सामूहिक रूप से, यह SCoV2 PLpro को एक IFN प्रतिपक्षी के रूप में स्थापित करता है जो सक्रिय रूप से MDA5 को ISGylates से मुक्त करता है।

बहस

ISG15 संयुग्मन अनेक विषाणुओं को एंटीवायरल गतिविधि प्रदान करने के लिए जाना जाता है; हालाँकि, केवल कुछ वास्तविक सबस्ट्रेट्स की पहचान की गई है12। दूसरी ओर, ISG15 अपने असंयुग्मित रूप में यूएसपी 18-मध्यस्थ IFNAR-सिग्नल निषेध31,32,40 को मजबूत करके अनंतिम रूप से कार्य करता है। वर्तमान अध्ययन एमडीए की मध्यस्थता वाले आईएफएन प्रेरण में आईएसजीलेशन की महत्वपूर्ण भूमिका की पहचान करता है। हमारा काम प्रायोगिक डिजाइन के महत्व पर भी जोर देता है जिसमें एमडीए5 सक्रियण में आईएसजी15 की भूमिका को आईएफएनएआर सिग्नलिंग को कमजोर करने से अलग करना आईएसजी15 की शक्तिशाली एंटीवायरल गतिविधि को प्रकट करने के लिए आवश्यक है। एक संक्रमित जीव में, यह संभवतः कई ISGylation घटनाओं (मेजबान और वायरल प्रोटीन दोनों को प्रभावित करने वाला) का योग है जो संक्रमण और रोगजनन के परिणाम को निर्धारित करता है, जो संदर्भ-निर्भर12 हो सकता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के फायदे-प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि MDA5 का ISGylation RIG-I5 के Lys {{1} से जुड़े सर्वव्यापकता के समान कार्य करता है: दोनों PTMs (1) PP प्रेरित डिफॉस्फोराइलेशन द्वारा नियंत्रित होते हैं और (2) CARD ऑलिगोमेराइजेशन और RLR को उच्चतर बढ़ावा देते हैं -ऑर्डर असेंबली। हालाँकि, जबकि यूबिकिटिन असंक्रमित और संक्रमित दोनों कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में है, IFN उत्तेजना से ISG15 की अभिव्यक्ति दृढ़ता से बढ़ जाती है। फिर भी, बेसल स्तर पर भी, ISG15 कई मेजबान प्रोटीन20 से संयुग्मित होता है, जिसमें MDA5 भी शामिल है, जैसा कि हमारे काम से पता चला है, जो प्रारंभिक MDA5 सक्रियण के लिए पर्याप्त हो सकता है। वायरल संक्रमण के दौरान जो कई पीआरआर द्वारा महसूस किया जाता है, एमडीए5 आईएसजीलेशन एक 'प्राइमिंग' तंत्र हो सकता है जिसके तहत तत्काल जन्मजात सेंसर (उदाहरण के लिए, आरआईजी-आई)41 प्राइम्स एमडीए5 द्वारा आईएसजी15 को 'किक-स्टार्ट' मोड में प्रवेश करने के लिए अपग्रेड किया जाता है। चूंकि ISG15 RIG-I16,17 को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है, ISGylation 'सेंसर स्विचिंग' को ट्रिगर कर सकता है जहां ISG15 का स्तर बढ़ने पर MDA5 सक्रियण को बढ़ावा मिलता है, जबकि RIG-I गतिविधि कम हो रही है। हमने पहचाना कि SCoV2 PLpro सेंसर से जुड़ने के बाद अपनी एंजाइमेटिक गतिविधि के माध्यम से MDA5 ISGylation को रोकता है; यह रणनीति संभवत: कोरोना वायरस के बीच संरक्षित है, जिसके लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चला है कि कोरोनावायरल एनएसपी3 एक छिद्र परिसर का हिस्सा है जो एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम-व्युत्पन्न डबल-झिल्ली पुटिकाओं को फैलाता है और नए संश्लेषित वायरल आरएनए42 को निर्यात करता है। इस प्रकार, एमडीए5 पीएएमपी का पता लगाने की सुविधा के लिए खुद को वायरल आरएनए निर्यात की साइट के करीब स्थित कर सकता है; हालाँकि, Nsp3 का PLpro डोमेन (जो साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर है) सीधे डी-आईएसजीलेशन के माध्यम से MDA5 सिग्नलिंग को अवरुद्ध करता है। कुछ वायरस MDA5 फॉस्फोराइलेशन के अनियमित विनियमन के माध्यम से MDA5 ISGylation को भी रोक सकते हैं, जैसा कि MeV-V के लिए दिखाया गया है। संक्षेप में, हमारा अध्ययन एमडीए को सक्रिय करने में ISGylation की एक प्रमुख भूमिका को उजागर करता है, साथ ही SCoV2 द्वारा इसके निषेध के साथ-साथ, COVID के खिलाफ चिकित्सीय डिजाइन के लिए एक संभावित आणविक लक्ष्य का अनावरण करता है।

संदर्भ

1. लियू, जी. और गैक, एमयू जन्मजात रूप से आरएनए सेंसर के विशिष्ट और सुव्यवस्थित कार्य। प्रतिरक्षा 53, 26-42 (2020)।

2. वू, जे. और चेन, जेडजे इनेट इम्यून सेंसिंग और साइटोसोलिक न्यूक्लिक एसिड का सिग्नलिंग। अन्नू. रेव. इम्यूनोल. 32, 461-488 (2014)।

3. एंटीवायरल इम्युनिटी में चाउ, केटी, गेल, एम.जेआर और लू, वाईएम आरआईजी-आई और अन्य आरएनए सेंसर। अन्नू. रेव. इम्यूनोल. 36, 667-694 (2018)।

4. श्ली, एम. रोगजनक आरएनए-आरआईजी-आई जैसे रिसेप्टर्स के मास्टर सेंसर। इम्यूनोबायोलॉजी 218, 1322-1335 (2013)।

5. रेहविंकेल, जे. और गैक, एमयू रिग-आई-जैसे रिसेप्टर्स: आरएनए सेंसिंग में उनका विनियमन और भूमिकाएं। नेट. रेव. इम्यूनोल. 20, 537-551 (2020)।

6. विज़, ई. एट अल. फॉस्फेटेज़ PP1 द्वारा आरएनए सेंसर RIG-I और MDA5 का डीफॉस्फोराइलेशन जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग के लिए आवश्यक है। प्रतिरक्षा 38, 437-449 (2013)।

7. गैक, एमयू एट अल। TRIM25 रिंग-फिंगर E3 ubiquitin ligase RIG-I-मध्यस्थता एंटीवायरल गतिविधि के लिए आवश्यक है। प्रकृति 446, 916-920 (2007)।

8. चियांग, सी. और गैक, एमयू इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ सेंसिंग मार्गों का पोस्ट-ट्रांसलेशनल नियंत्रण। रुझान इम्यूनोल। 38, 39-52 (2017)।

9. लेज़र, एचएम, स्कोगिन्स, जेडब्ल्यू और डायमंड, एमएस टाइप I और टाइप III इंटरफेरॉन के साझा और विशिष्ट कार्य। प्रतिरक्षा 50, 907-923 (2019)।

10. शोगिन्स, जेडब्ल्यू इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन: वे सभी क्या करते हैं? अन्नू. आदरणीय विरोल। 6, 567-584 (2019)।

11. झांग, डी. और झांग, डीई इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन 15 और प्रोटीन ISGylation प्रणाली। जे. इंटरफेरॉन साइटोकिन रेस. 31, 119-130 (2011)।

12. एंटीवायरल इम्युनिटी और उससे आगे में परंग, वाईसी और लेन्सचो, डीजे आईएसजी15। नेट. रेव माइक्रोबायोल। 16, 423-439 (2018)। 13. हदजादज, जे. एट अल. बिगड़ा हुआ टाइप I गंभीर सीओवीआईडी ​​​​{7}} रोगियों में गतिविधि और सूजन प्रतिक्रियाओं को बाधित करता है। विज्ञान 369, 718-724 (2020)।

14. क्लेम, टी. एट अल. SARS-CoV के पपेन-जैसे प्रोटीज़, PLpro, का तंत्र और निषेध-2। ईएमबीओ जे. 39, ई106275 (2020)।

15. शिन, डी. एट अल। पपेन जैसा प्रोटीज़ SARS-CoV-2 वायरल प्रसार और जन्मजात प्रतिरक्षा को नियंत्रित करता है। प्रकृति 587, 657-662 (2020)।

16. किम, एमजे, ह्वांग, एसवाई, इमाइज़ुमी, टी. और यू, जेवाई इंटरफेरॉन-प्रेरित आईएसजी15 संयुग्मन द्वारा आरआईजी-आई-मध्यस्थता वाले एंटीवायरल सिग्नलिंग का नकारात्मक प्रतिक्रिया विनियमन। जे. विरोल. 82, 1474-1483 (2008)।

17. डू, वाई. एट अल. LRRC25 ऑटोफैजिक डिग्रेडेशन के लिए ISG15-संबद्ध RIG-I को लक्षित करके टाइप I IFN सिग्नलिंग को रोकता है। ईएमबीओ जे. 37, 351-366 (2018)।

18. हटो, एसवी एट अल। ते मेंगोवायरस लीडर प्रोटीन इंटरफेरॉन-अल्फा/बीटा जीन प्रतिलेखन को अवरुद्ध करता है और इंटरफेरॉन नियामक कारक 3 के सक्रियण को रोकता है। सेल माइक्रोबायोल। 9, 2921-2930 (2007)।

19. डेडौचे, ​​एस. एट अल. पिकोर्नावायरस-संक्रमित कोशिकाओं में एलजीपी2-संबद्ध एमडीए5 एगोनिस्ट की पहचान। ईलाइफ 3, ई01535 (2014)।

20. डर्फी, एलए, ल्योन, एन., एसईओ, के. और हुइब्रेग्त्से, जेएम ते आईएसजी15 संयुग्मन प्रणाली मोटे तौर पर नए संश्लेषित प्रोटीन को लक्षित करती है: आईएसजी15 के एंटीवायरल फ़ंक्शन के लिए निहितार्थ। मोल. सेल 38, 722-732 (2010)।

21. लेन्सचो, डीजे एट अल। विवो में सिंदबिस वायरस संक्रमण के दौरान एक एंटीवायरल अणु के रूप में इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन 15 की पहचान। जे. विरोल. 79, 13974-13983 (2005)।

22. गैक, एमयू, निस्टल-विलन, ई., इन, केएस, गार्सिया-सास्त्रे, ए. और जंग, जेयू फॉस्फोराइलेशन-मध्यस्थता आरआईजी-आई एंटीवायरल गतिविधि का नकारात्मक विनियमन। जे. विरोल. 84, 3220-3229 (2010)।

23. निस्टल-विलन, ई. एट अल। इंटरफेरॉन-बीटा उत्पादन के नियमन में RIG-I सेरीन 8 फॉस्फोराइलेशन की नकारात्मक भूमिका। जे. बायोल. रसायन. 285, 20252-20261 (2010)।

24. महाराज, एनपी, वीज़, ई., स्टोल, ए. और गैक, एमयू पारंपरिक प्रोटीन किनेज सी-अल्फा (पीकेसी-अल्फा) और पीकेसी-बीटा आरआईजी-आई एंटीवायरल सिग्नल ट्रांसडक्शन को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करते हैं। जे. विरोल. 86, 1358-1371 (2012)।

25. डेविस, एमई एट अल। खसरा वायरस वी प्रोटीन द्वारा फॉस्फेट पीपी1 का विरोध एमडीए5 की जन्मजात प्रतिरक्षा से बचने के लिए आवश्यक है। सेल होस्ट माइक्रोब 16, 19-30 (2014)।

26. लिन, जेपी, फैन, वाईके और लियू, एचएम ते 14-3-3एटा चैपरोन प्रोटीन एमडीए5 ऑलिगोमेराइजेशन और इंट्रासेल्युलर पुनर्वितरण की सुविधा के माध्यम से एंटीवायरल जन्मजात प्रतिरक्षा को बढ़ावा देता है। PLoS पैथोग. 15, ई1007582 (2019)।

27. वू, बी. एट अल. एमडीए5 द्वारा डीएसआरएनए पहचान, फिलामेंट निर्माण और एंटीवायरल सिग्नल सक्रियण के लिए संरचनात्मक आधार। सेल 152, 276-289 (2013)।

28. यू, क्यू., क्यू., के. और मोडिस, वाई. एटीपी हाइड्रोलिसिस के विभिन्न चरणों में एमडीए {2}} डीएसआरएनए फिलामेंट्स की क्रायो-ईएम संरचनाएं। मोल. सेल 72, 999-1012 (2018)।

29. ब्रून्स, एएम, लेसर, जीपी, लैम्ब, आरए और होर्वाथ, सीएम ते इननेट इम्यून सेंसर एलजीपी2 एमडीए5-आरएनए इंटरेक्शन और फिलामेंट असेंबली को विनियमित करके एंटीवायरल सिग्नलिंग को सक्रिय करता है। मोल. सेल 55, 771-781 (2014)।

30. उचिकावा, ई. एट अल। एंटी-वायरल पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स LGP2 और MDA5 के लिए dsRNA बाइंडिंग का संरचनात्मक विश्लेषण। मोल. सेल 62, 586-602 (2016)।

31. मालाखोवा, ओए एट अल। UBP43 अपनी ISG15 आइसोपेप्टिडेज़ गतिविधि से स्वतंत्र इंटरफेरॉन सिग्नलिंग का एक नया नियामक है। ईएमबीओ जे. 25, 2358-2367 (2006)।

32. झांग, एक्स. एट अल. मानव इंट्रासेल्युलर ISG15 इंटरफेरॉन-अल्फा/बीटा अति-प्रवर्धन और ऑटो-सूजन को रोकता है। प्रकृति 517, 89-93 (2015)।

33. हरकोर्ट, बीएच एट अल। गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस प्रतिकृति उत्पादों की पहचान और पपेन जैसी प्रोटीज गतिविधि का लक्षण वर्णन। जे. विरोल. 78, 13600-13612 (2004)।

34. रोथ-क्रॉस, जेके, बेंडर, एसजे और वीस, एसआर मुराइन कोरोना वायरस माउस हेपेटाइटिस वायरस को एमडीए5 द्वारा मान्यता प्राप्त है और यह मस्तिष्क के मैक्रोफेज/माइक्रोग्लिया में टाइप I इंटरफेरॉन को प्रेरित करता है। जे. विरोल. 82, 9829-9838 (2008)।

35. मेनाचेरी, वीडी एट अल। 2′-ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधि की कमी वाले गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस उत्परिवर्ती का क्षीणन और बहाली। जे. विरोल. 88, 4251-4264 (2014)।

36. बेकेस, एम. एट अल। Lys की पहचान48-सार्स कोरोनोवायरस पपेन-जैसे प्रोटीज की डि-यूबिकिटिन और डीयूबिकिटिनेटिंग गतिविधियों से जुड़ी हुई है। मोल. सेल 62, 572-585 (2016)।

37. चिल्ड्स, के. एट अल। mda-5, लेकिन RIG-I नहीं, पैरामाइक्सोवायरस V प्रोटीन के लिए एक सामान्य लक्ष्य है। वायरोलॉजी 359, 190-200 (2007)।

38. शि, एचएक्स एट अल। ISG15 संशोधन के माध्यम से Herc5 द्वारा इंटरफेरॉन नियामक कारक 3 सक्रियण का सकारात्मक विनियमन। मोल. सेल बायोल. 30, 2424-2436 (2010)।

39. ब्लैंको-मेलो, डी. एट अल। SARS-CoV के प्रति असंतुलित मेज़बान प्रतिक्रिया -2, COVID के विकास को प्रेरित करती है-19। सेल 181, 1036-1045 (2020)।

40. स्पीयर, एसडी एट अल। ISG15 की कमी और मनुष्यों में वायरल प्रतिरोध में वृद्धि, लेकिन चूहों में नहीं। नेट. कम्यून. 7, 11496 (2016)।

41. इरेट, जेएस, सुथार, एमएस, मैकमिलन, ए., डायमंड, एमएस और गेल, एम. जूनियर। वेस्ट नाइल वायरस संक्रमण का पता लगाने और नियंत्रित करने में आरआईजी-आई और एमडीए5 की आवश्यक, गैर-निरर्थक भूमिकाएँ। जे. विरोल. 87, 11416-11425 (2013)।

42. वुल्फ, जी. एट अल. एक आणविक छिद्र कोरोनोवायरस प्रतिकृति ऑर्गेनेल की दोहरी झिल्ली तक फैला हुआ है। विज्ञान 369, 1395-1398 (2020)।

43. मेजर, ईओ एट अल। मानव भ्रूण ग्लियाल कोशिकाओं की एक पंक्ति की स्थापना जो जेसी वायरस गुणन का समर्थन करती है। प्रोक. नेटल एकेड. विज्ञान. यूएसए 82, 1257-1261 (1985)।

44. हर्टज़ोग, जे. एट अल. ज़िका वायरस के ब्राज़ीलियाई आइसोलेट के संक्रमण से RIG-I उत्तेजक RNA और वायरल NS5 प्रोटीन ब्लॉक प्रकार I IFN प्रेरण और सिग्नलिंग उत्पन्न होता है। ईयूआर। जे. इम्यूनोल. 48, 1120-1136 (2018)।

45. सेरीकन, बी. एट अल. कोशिका-आंतरिक अनुकूलन एक प्रमुख rho GTPase नियामक के क्रोनिक एब्लेशन से उत्पन्न होता है। देव. सेल 39, 28-43 (2016)।

46. ​​चैन, वाईके और गैक, एमयू जन्मजात प्रतिरक्षा को नष्ट करने के लिए डेंगू वायरस का एक फॉस्फोमिमेटिक-आधारित तंत्र। नेट. इम्यूनोल. 17, 523-530 (2016)।

47. रीडल, डब्ल्यू. एट अल. ज़िका वायरस NS3 RIG-I- और MDA{{5}मध्यस्थता वाली जन्मजात प्रतिरक्षा का विरोध करने के लिए एक सेलुलर बाध्यकारी रूपांकन की नकल करता है। सेल होस्ट माइक्रोब 26, 493-503 (2019)।

48. उलेन, सीएम, रोड्रिग्ज, जेजे, पेरिसियन, जेपी और होर्वाथ, सीएम एसटीएटी3 मम्प्स वायरस द्वारा सर्वव्यापकता और गिरावट साइटोकिन और ऑन्कोजीन सिग्नलिंग को दबा देती है। जे. विरोल. 77, 6385-6393 (2003)।

49. औडशोर्न, डी. एट अल। HERC6 माउस कोशिकाओं में वैश्विक ISG15 संयुग्मन के लिए मुख्य E3 लिगेज है। प्लस वन 7, ई29870 (2012)।

50. किम, डीके एट अल। SARS-CoV-2 कोडिंग क्षेत्रों का एक व्यापक, लचीला संग्रह। जी3 (बेथेस्डा) 10, 3399-3402 (2020)।

51. चियांग, सी. एट अल। मानव पैपिलोमावायरस E6 ओंकोप्रोटीन RIG-I-मध्यस्थता वाले जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग को दबाने के लिए USP15 और TRIM25 को लक्षित करता है। जे. विरोल. 92, ई01737-17 (2018)।

52. गैक, एमयू एट अल। TRIM में RIG-I एन-टर्मिनल टेंडेम कार्ड और स्प्लिस वेरिएंट की भूमिकाएं 25-मध्यस्थ एंटीवायरल सिग्नल ट्रांसडक्शन। प्रोक. नेटल एकेड. विज्ञान. यूएसए 105, 16743-16748 (2008)।

53. चियांग, जे जे एट अल। सेलुलर 5एस आरआरएनए स्यूडोजेन ट्रांस्क्रिप्ट का वायरल अनमास्किंग आरआईजी-आई-मध्यस्थता प्रतिरक्षा को प्रेरित करता है। नेट. इम्यूनोल. 19, 53-62 (2018)।

54. स्पैरर, केएमजे एट अल। TRIM23 TBK1 के सक्रियण के माध्यम से वायरस-प्रेरित ऑटोफैगी की मध्यस्थता करता है। नेट. माइक्रोबायोल. 2, 1543-1557 (2017)।