JAK इनहिबिटर ग्लोमेरुलर कोशिकाओं में साइटोकाइन-प्रेरित JAK-STAT-APOL1 सिग्नलिंग और मानव किडनी ऑर्गेनॉइड में पोडोसाइटोपैथी को रोकता है।

अमूर्त

COVID-19 संक्रमण का कारण बनता हैग्लोमेरुलर केशिकाओं का पतनऔरपोडोसाइट्स की हानि, ए में समाप्त हो रहा हैगुर्दे की गंभीर बीमारीबुलायाकोविड से संबंधित नेफ्रोपैथी(COVAN)। COVID-19 का अंतर्निहित तंत्र अज्ञात है। हमने अनुमान लगाया कि COVID से प्रेरित साइटोकिन्स JAK-STAT सिग्नलिंग के माध्यम से रोगजनक APOL1 की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पोडोसाइट हानि और COVAN फेनोटाइप होता है। यहां, नौ बायोप्सी-सिद्ध COVAN मामलों के आधार पर, हमने पहली बार प्रदर्शित किया कि एपीOL1 प्रोटीन पोडोसाइट्स और में प्रचुर मात्रा में व्यक्त होता हैग्लोमेरुलर एंडोथेलियलCOVAN किडनी की कोशिकाएं (GECs) लेकिन नियंत्रण में नहीं। इसके अलावा, अधिकांश (77.8%) COVAN रोगियों में दो थेAPOL1जोखिम एलील. हमने दिखाया कि SARS-CoV-2 से प्रेरित पुनः संयोजक साइटोकिन्स ड्राइव करने के लिए सहक्रियात्मक रूप से कार्य करते हैंAPOL1प्राथमिक मानव पोडोसाइट्स, जीईसी और में जेएके-एसटीएटी मार्ग के माध्यम से अभिव्यक्तिगुर्दे के सूक्ष्म जीवदो के वाहक से व्युत्पन्नAPOL1जोखिम एलील लेकिन JAK1/2-अवरोधक, बारिसिटिनिब द्वारा अवरुद्ध कर दिए गए थे। हमने पहली बार प्रदर्शित किया कि साइटोकाइन-प्रेरित JAK-STAT-APOL1 सिग्नलिंग ने किडनी ऑर्गेनॉइड पोडोसाइट्स की व्यवहार्यता को कम कर दिया, लेकिन बारिसिटिनिब द्वारा बचा लिया गया। साथ में, हमारे परिणाम इस निष्कर्ष का समर्थन करते हैंकोविड से प्रेरित साइटोकिन्सJAK-STAT-APOL1 सिग्नलिंग के माध्यम से COVAN-संबंधित पोडोसाइटोपैथी को चलाने के लिए पर्याप्त हैं और JAK-अवरोधक इस रोगजनक प्रक्रिया को अवरुद्ध कर सकता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि JAK-अवरोधकों के पास साइटोकिन-प्रेरित एपीओएल 1-मध्यस्थ पोडोसाइटोपैथी के प्रबंधन के लिए चिकित्सीय लाभ हो सकते हैं।

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परिचय

गुर्दे की विफलता एक विनाशकारी जटिलता हैकोविड-19 संक्रमण. 50% तक आंतरिक रोगी और 70% गहन देखभाल इकाई में कोविड -19 प्रवेश तीव्र गुर्दे की चोट (एकेआई) के कारण जटिल होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर में 30-50% (1, 2) की वृद्धि होती है। किडनी बायोप्सी केस श्रृंखला से पता चला कि कोलैप्सिंग ग्लोमेरुलोपैथी, सीओवीआईडी ​​​​से संबंधित AKI (3) में सबसे आम हिस्टोपैथोलॉजिक निदान है। कोविड से जुड़े कोलैप्सिंग ग्लोमेरुलोपैथी (संक्षिप्त रूप में COVAN) की एक विशिष्ट विशेषता अफ्रीकी अमेरिकियों या अश्वेतों के लिए इसकी लगभग विशेष प्रवृत्ति है, जो एपोलिपोप्रोटीन L1 (APOL1) (3, 4) के दो जोखिम एलील ले जाते हैं। दो जोखिम एलील (जिन्हें G1 और G2 नाम दिया गया है) APOL1 जीन में कोडिंग वेरिएंट के रूप में उभरे और अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करते हैं। हालाँकि, G1G1, G2G2, या G1G2 (जिन्हें उच्च जोखिम वाले जीनोटाइप कहा जाता है) के वहन से गुर्दे की बीमारी के एक स्पेक्ट्रम का खतरा बढ़ जाता है और अफ्रीकी अमेरिकियों (5-8) के बीच गैर-मधुमेह गुर्दे की बीमारी के अतिरिक्त जोखिम की व्याख्या करता है। अनुमानतः 13% अफ़्रीकी अमेरिकी उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप (7) रखते हैं। कोविड महामारी के दौरान, अध्ययनों से पता चला कि उल्लेखनीय 92% बायोप्सी-सिद्ध COVAN मामले उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप के वाहक थे, जिनमें से 61% को प्रस्तुति के समय डायलिसिस की आवश्यकता थी (3, 9)। ये निष्कर्ष APOL1 वेरिएंट को COVID स्वास्थ्य परिणामों में नस्लीय असमानता के प्रमुख योगदानकर्ता के रूप में स्थापित करते हैं। इस प्रभावशाली जुड़ाव के बावजूद, सेलुलर तंत्र जो उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप को SARS CoV -2 संक्रमण से जोड़ता है और COVAN के ढहने वाले ग्लोमेरुलोपैथी का रोगजनन अज्ञात बना हुआ है।

उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप और COVAN के बीच मजबूत महामारी विज्ञान संबंध ने इस परिकल्पना को जन्म दिया है कि COVID ने पोडोसाइट्स और ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में APOL1 G1 या G2 की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया है - गुर्दे की कोशिकाएं ग्लोमेरुलोपैथी को ढहने में प्रभावित करती हैं - रोगजनन को प्रेरित करती हैं कोवन. इस परिकल्पना को हाल की रिपोर्टों द्वारा समर्थित किया गया था कि माउस पोडोसाइट्स या ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में APOL1 जोखिम एलील्स के ट्रांसजेनिक ओवरएक्प्रेशन के कारण पोडोसाइटोपैथी, एंडोथेलियोपेथी, ग्लोमेरुलोपैथी और गुर्दे की विफलता की नैदानिक ​​​​अभिव्यक्तियाँ हुईं (10-14)। ये म्यूरिन रोग मॉडल सुझाव देते हैं कि जो तंत्र COVID से प्रेरित APOL1 अभिव्यक्ति को रेखांकित करता है, वह COVID के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य होगा। हालाँकि, दो महत्वपूर्ण अज्ञात हैं। एक, यह अज्ञात है कि COVAN वाले रोगियों के ग्लोमेरुली में APOL1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति विनियमित है या नहीं। दो, यह अज्ञात है कि क्या SARS-CoV-2 गुर्दे की कोशिकाओं के वायरल संक्रमण द्वारा सीधे APOL1 अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है या अप्रत्यक्ष रूप से SARS-CoV-2- प्रेरित साइटोकिन तूफान के प्रभाव के माध्यम से।

SARS-CoV-2 का पता लगाने में विफलताCOVAN की किडनी बायोप्सीमरीज़ इस परिकल्पना के लिए अप्रत्यक्ष समर्थन प्रदान करते हैं कि COVAN संभवतः किडनी पैरेन्काइमा के प्रत्यक्ष वायरल संक्रमण के बजाय साइटोकिन तूफान के प्रभाव से उत्पन्न होता है। SARS-CoV -2 वायरल कणों का कभी-कभार पता शव परीक्षण गुर्दे के नमूनों में लगाया गया है, जिसमें ऊतक ऑटोलिसिस के जटिल प्रभाव को खारिज नहीं किया जा सकता है (3, 4, 15, 16)। कई सूजन संबंधी साइटोकिन्स और केमोकाइन को इसमें अपग्रेड किए जाने का उल्लेख किया गया हैCOVID के रोगियों का सीरा-19और/या COVAN (4, 17, 18)। इस सूची में इंटरफेरॉन अल्फा, बीटा, गामा और टीएनएफ जैसे साइटोकिन्स शामिल हैं जिन्हें पहले APOL1 अभिव्यक्ति को अपग्रेड करने के लिए जाना जाता है। हालाँकि, सूची में कई सूजन संबंधी साइटोकिन्स भी शामिल हैं जो कि COVID संक्रमण द्वारा अत्यधिक नियंत्रित होते हैं। यह अज्ञात है कि क्या इन साइटोकिन्स का APOL1 अभिव्यक्ति और संबंधित पोडोसाइटोपैथी पर योगात्मक, सहक्रियात्मक या विरोधी प्रभाव है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने COVAN और दो मानव नियंत्रण किडनी वाले नौ रोगियों से प्राप्त किडनी बायोप्सी का लाभ उठाकर इन ज्ञान अंतरालों को संबोधित किया ताकि यह जांच की जा सके कि APOL1 प्रोटीन COVAN और नियंत्रण किडनी में व्यक्त होता है या नहीं। हमने आठ साइटोकिन्स की पहचान करने के लिए अठारह COVID-प्रेरित साइटोकिन्स की प्रोफाइल तैयार की, जो SARS-CoV की अनुपस्थिति में पर्याप्त थे, प्राथमिक मानव ग्लोमेरुलर कोशिकाओं में APOL1 अभिव्यक्ति को सहक्रियात्मक रूप से प्रेरित करने और मानव किडनी सूक्ष्म में पोडोसाइटोपैथी का कारण बनने के लिए पर्याप्त थे। ऑर्गेनोइड्स यह अध्ययन न केवल मानव-व्युत्पन्न प्रयोगात्मक मॉडल में पहला प्रमाण प्रदान करता है कि COVID -19 साइटोकिन तूफान APOL1 अभिव्यक्ति और पोडोसाइटोपैथी को प्रेरित करता है, यह सामान्य सिग्नलिंग मार्ग की भी पहचान करता है जो रोगजनक प्रभावों की मध्यस्थता करता है। इस अध्ययन के निहितार्थ हैं जो काले और हिस्पैनिक रोगियों में COVID की जांच और उपचार की रणनीतियों को प्रभावित कर सकते हैं। यह उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप (19, 20) वाले काले और हिस्पैनिक व्यक्तियों में COVID थेरेपी के रूप में पूरक इंटरफेरॉन की सुरक्षा के बारे में सवाल उठाता है।

परिणाम

COVAN रोगियों के पोडोसाइट्स और ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में APOL1 अभिव्यक्ति को अपग्रेड किया गया है। यह जांचने के लिए कि क्या COVAN के बायोप्सी-सिद्ध निदान वाले रोगियों में उनके पोडोसाइट्स और ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (जीईसी) में APOL1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति बढ़ी है, हमने APOL1, सिनैप्टोपोडिन (विभेदित पोडोसाइट्स का एक एक्टिन-जुड़े प्रोटीन) का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल सह-स्टेनिंग किया, और COVAN निदान वाले दो रोगियों की किडनी बायोप्सी पर CD31 (एक एंडोथेलियल सेल मार्कर) (चित्र 1)। APOL1 की अभिव्यक्ति दोनों केस 1 के ग्लोमेरुली में प्रचुर मात्रा में थी, जिसकी बायोप्सी COVID निदान के दस महीने बाद की गई थी (चित्र 1A-F), और केस 6, जिसकी बायोप्सी COVID निदान के नौ दिन बाद की गई थी (चित्र 14%) 1जी-एल). दोनों रोगियों में, सिनैप्टोपोडिन-पॉजिटिव पोडोसाइट्स (तीर; चित्र 1बी, ई, एच, और के) और सीडी के साथ-साथ पॉजिटिव ग्लोमेरुलर एंडोथेलियम (एरोहेड; चित्र 1सी, एफ, आई और एल) में मजबूत एपीओएल1 धुंधलापन था। ). पोडोसाइट्स और जीईसी में एपीओएल1 प्रोटीन की उपस्थिति, कभी-कभी कोविड संक्रमण के निदान के 9 दिन और 10 महीनों के बाद पता चलता है कि एपीओएल1 अभिव्यक्ति जल्दी प्रेरित होती है और ग्लोमेरुली में कई महीनों तक बनी रह सकती है, जो कि सीओवीआईडी ​​​​को ट्रिगर करने के लंबे समय बाद तक बनी रह सकती है। 27%) संक्रमण ठीक हो गया है।

APOL1 अभिव्यक्ति को COVAN मामलों के बायोप्सी ऊतक में अपग्रेड किया गया है लेकिन नियंत्रण में नहीं। इन इम्यूनोहिस्टोकेमिकल निष्कर्षों की सामान्यता का और अधिक मूल्यांकन करने के लिए, हमने जीनोटाइपिंग और आईएचसी (चित्रा 2) के लिए उपलब्ध बायोप्सी ऊतक के साथ कुल नौ सीओवीएएन मामलों की पहचान की, साथ ही दो नियंत्रण रोगियों की भी पहचान की, जिसमें एक मरीज का शव परीक्षण नियंत्रण भी शामिल है, जो सीओवीआईडी ​​​​से पीड़ित था। }} संक्रमण लेकिन AKI विकसित नहीं हुआ (चित्र 2B और 2C)। COVAN की क्लासिक हिस्टोपैथोलॉजिक विशेषताओं में आसन्न पोडोसाइट हाइपरट्रॉफी और प्रसार के साथ ग्लोमेरुलर केशिका टफ्ट पतन शामिल है, अक्सर ग्लोमेरुलर प्रोटीनूरिया (सप्लीमेंट अंजीर 1 और सप्लीमेंट फिगर 2) से जुड़े पोडोसाइट प्रोटीन पुनर्अवशोषण बूंदों के साथ। APOL1 IHC धुंधला नियंत्रण के सभी ग्लोमेरुली में अनुपस्थित था (चित्र AC) लेकिन सभी नौ COVAN रोगियों के ग्लोमेरुली में मौजूद था (चित्र 2D-X)। APOL1 धुंधलापन पोडोसाइट्स, GECs और कुछ पार्श्विका उपकला कोशिकाओं (चित्र 2N, हैशेड सर्कल) (चित्र 1, चित्र 2 और पूरक चित्र 3) के साइटोप्लाज्म में प्रचुर मात्रा में था। APOL1 प्रोटीन ग्लोमेरुली में खुली केशिकाओं के साथ-साथ ग्लोमेरुलर पतन के क्षेत्रों में भी देखा जा सकता है। कुछ केशिका लुमेन के भीतर एपीओएल1 प्रोटीन की स्पष्ट उपस्थिति संभवतः एपीओएल1 को प्रसारित करने का प्रतिनिधित्व करती है, जो मुख्य रूप से यकृत (21) द्वारा निर्मित होता है। इसके अलावा, APOL1 को पेरिटुबुलर केशिकाओं और घायल ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (तारांकन) में भी देखा गया था। इस बाद की खोज की विशिष्टता और महत्व स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से, नौ COVAN मामलों में से सात में उच्च जोखिम वाला APOL1 जीनोटाइप (चित्र 2D-V) था। अन्य दो मामले, केस 9 और केस 4, कम जोखिम वाले जी 0 जी 0 जीनोटाइप (चित्र 2W और 2X) ले गए। कम जोखिम वाले जीनोटाइप के होने के बावजूद, केस 9 एपीओएल1 की अभिव्यक्ति सात उच्च जोखिम वाले मामलों (चित्रा 2डब्ल्यू) के बराबर थी। केस 4 किडनी बायोप्सी स्लाइड में केवल दो ग्लोमेरुली थे, और इन ग्लोमेरुली में एपीओएल1 की अभिव्यक्ति कम थी (चित्र 2एक्स)। साथ में, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ग्लोमेरुलर चोट के बिना व्यक्तियों के ग्लोमेरुली में बेसल किडनी APOL1 अभिव्यक्ति कम है, भले ही व्यक्ति को COVID संक्रमण हो; जबकि APOL1 अभिव्यक्ति हमारे 89% मामलों में COVAN की सेटिंग में पोडोसाइट्स और GECs में अपग्रेड हो जाती है।

जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, बायोप्सी-सिद्ध COVAN वाले नौ रोगियों में से सात (77.8%) ने स्वयं को अफ्रीकी अमेरिकी के रूप में पहचाना। इन सात रोगियों में से छह (85.7%) में उच्च जोखिम वाले एपीओएल1 जीनोटाइप (चार जी1जी1, एक जी1जी2, एक जी2जी2) थे। तुलनात्मक रूप से, 13% अफ़्रीकी अमेरिकियों में उच्च जोखिम वाला APOL1 जीनोटाइप है। शेष दो मरीज़ों ने अपनी पहचान श्वेत हिस्पैनिक के रूप में बताई, लेकिन विशेष रूप से, उनमें से एक में उच्च जोखिम वाला APOL1 जीनोटाइप भी था। कुल मिलाकर, नौ COVAN रोगियों में से सात (77.8%) में उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप थे। मामलों की औसत आयु 51 वर्ष (सीमा {{26%) थी। सभी नौ मामलों में तीव्र गुर्दे की चोट विकसित हुई और उनमें प्रोटीनूरिया की अलग-अलग डिग्री थी, जो सबनेफ्रोटिक से लेकर नेफ्रोटिक रेंज (1.4- 14 ग्राम/24 घंटे) तक थी। अधिकांश बायोप्सी कोविड संक्रमण के कम से कम 1 महीने बाद की गईं, मामले 6 को छोड़कर, जिसकी बायोप्सी सकारात्मक पीसीआर परीक्षण के 9 दिन बाद की गई थी। अपूर्ण रिकवरी के कारण संक्रमण के 10 महीने बाद तक एक मरीज की बायोप्सी नहीं की गई। सभी नौ रोगी बायोप्सी में ढहने वाली ग्लोमेरुलोपैथी, ट्यूबलर चोट और अंतरालीय सूजन का प्रदर्शन हुआ। किसी भी मामले में एंडोथेलियल ट्यूबलर रेटिकुलर समावेशन नहीं देखा गया। विशेष रूप से, दो COVAN बायोप्सी में जिनका IHC द्वारा प्रत्यक्ष SARS-CoV -2 वायरल संक्रमण और स्वस्थानी संकरण के लिए परीक्षण किया गया था, कोई वायरस नहीं पाया गया (डेटा नहीं दिखाया गया)।

पुनः संयोजक COVID-19-प्रेरित साइटोकिन्स प्राथमिक मानव ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और पोडोसाइट्स में APOL1 अभिव्यक्ति को सहक्रियात्मक रूप से बढ़ाते हैं। यह जांचने के लिए कि क्या मानव ग्लोमेरुलर कोशिकाओं में एपीओएल1 अभिव्यक्ति को ट्रिगर करने के लिए सीओवीआईडी ​​प्रेरित साइटोकिन तूफान पर्याप्त है, हमने पहले 18 साइटोकिन्स और केमोकाइन में से 1 में मृत दाता किडनी और प्राथमिक मानव ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (जीईसी) से पृथक प्राथमिक मानव पोडोसाइट्स का संवर्धन किया। SARS-CoV के रोगियों के सीरम में वृद्धि की सूचना दी गई है। (चित्र 3ए) (4, 17)। पोडोसाइट पहचान की पुष्टि विल्म्स ट्यूमर1, सिनैप्टोपोडिन, नेफ्रिन और पोडोकैलिक्सिन (चित्र 3बी और सप्ल चित्र 4ए-बी) सहित कई पोडोसाइट मार्करों से की गई थी। GEC पहचान की पुष्टि PECAM1 के सापेक्ष अभिव्यक्ति द्वारा की गई थीमानव भ्रूण की किडनी293 cells (HEK) (Figure 3C). Induced APOL1 expression was quantitated by qPCR and immunoblot after 48hr treatment in GECs (Figure 3D and 3F) and podocytes (Figure 3E and 3G). Consistent with prior report (22), we found that interferons (gamma > beta > alpha) robustly induced expression of APOL1 in both GECs and in podocytes. Similarly, we found that TNF also induced a modest APOL1 expression in GECs and podocytes. Unexpectedly, we found that three cytokines-IL-6, IL-1β, and IL-18, which were previously unrecognized as inducers of APOL1 expression, also individually induced modest APOL1 expression in GECs or podocytes. Notably, the combination of all 18 recombinant cytokines produced a synergistic upregulation of APOL1 that was an order of magnitude higher than that produced by any of the interferons alone (Figure 3D). These effects were not only observed with cytokine concentration of 50ng/mL (Figures 3D and 3E) but also at 20ng/mL and 10ng/mL (Supplemental Figure 5). Cytokine conditions inducing >मीडिया-उपचारित नियंत्रण की तुलना में 1.5 गुना एपीओएल1 प्रतिलेख का महत्व के लिए और अधिक विश्लेषण किया गया। कई तुलनाओं के लिए होल्म-सिडक सुधार के साथ एक अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके महत्व का आकलन किया गया था। रिपोर्ट किए गए पी-मान समायोजित पी-मान हैं। ये परिणाम फिजियोलॉजिकल साइटोकिन्स की सूची का विस्तार करते हैं जो अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त इंटरफेरॉन और टीएनएफ से परे एपीओएल 1 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में सक्षम हैं। महत्वपूर्ण रूप से, निष्कर्ष यह भी बताते हैं कि अकेले पृथक साइटोकिन के प्रभाव की तुलना में APOL1 विनियमन के लिए COVID प्रेरित साइटोकिन्स का तालमेल अधिक प्रासंगिक हो सकता है।

JAK-STAT सिग्नलिंग मध्यस्थता करता हैCOVID-19-साइटोकिन-प्रेरित APOL1 अभिव्यक्ति. हमने अगली जांच की कि क्या कोविड प्रेरित साइटोकिन्स एक सामान्य इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से APOL1 अभिव्यक्ति को अपग्रेड करते हैं जिसका उपयोग चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में किया जा सकता है। पहले यह बताया गया था कि APOL1 का इंटरफेरॉन प्रेरण JAK-STAT1/2 (22, 23) द्वारा मध्यस्थ है। IL-6 रिसेप्टर के माध्यम से सिग्नलिंग को STAT3 द्वारा मध्यस्थ दिखाया गया है, और IL-1 और TNF दोनों को अप्रत्यक्ष रूप से STAT3 (24, 25) को सक्रिय करने की सूचना दी गई है। दिलचस्प बात यह है कि, मेलियाम्ब्रो एट अल ने हाल ही में नियंत्रण (26) की तुलना में COVAN और एचआईवी से जुड़े नेफ्रोपैथी (HIVAN) के एक मामले के बायोप्सी ऊतक में फॉस्फो-STAT3 के अपग्रेडेशन की सूचना दी है। इस पृष्ठभूमि जानकारी के आधार पर, हमने अनुमान लगाया कि JAK1/2-STAT1/2/3 मार्ग APOL1 अभिव्यक्ति को चलाने में COVID प्रेरित साइटोकिन्स के प्रभावों के प्राथमिक मध्यस्थ हैं। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने 48 घंटों के लिए व्यक्तिगत या संयुक्त साइटोकिन्स में संवर्धन के बाद जीईसी के लाइसेट्स में फॉस्फोराइलेटेड एसटीएटी1, 2, और 3 को मापकर इन सिग्नलिंग मार्गों की स्थिति निर्धारित की (चित्रा 3एफ)। टाइप I इंटरफेरॉन (आईएफएन और आईएफएन) ने एसटीएटी के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ा दिया। संयुक्त साइटोकिन्स ने STAT के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ा दिया। यह जानते हुए कि JAK1 और JAK2 प्राथमिक अपस्ट्रीम प्रोटीन किनेसेस हैं जो STAT को फॉस्फोराइलेट करते हैं1-3, हमने अनुमान लगाया कि JAK1/2 का निषेध "सभी साइटोकिन्स" से प्रेरित APOL1 अभिव्यक्ति को अवरुद्ध कर देगा। इस भविष्यवाणी के अनुरूप, हमने पाया कि एक JAK1/2- विशिष्ट अवरोधक, बारिसिटिनिब, ने सभी-साइटोकाइन-उपचारित GECs और प्राथमिक पोडोसाइट्स (चित्र 3D G) द्वारा APOL1 mRNA और APOL1 अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया है। साथ में, ये परिणाम दर्शाते हैं कि JAK-STAT सिग्नलिंग प्राथमिक मार्ग है जो COVID-19-साइटोकाइन-प्रेरित APOL1 अभिव्यक्ति की मध्यस्थता करता है।

JAK-STAT मार्ग के माध्यम से मानव IPSC-व्युत्पन्न किडनी माइक्रो-ऑर्गेनोइड में APOL1 अभिव्यक्ति को चलाने के लिए COVID से प्रेरित साइटोकिन्स पर्याप्त हैं। मानव किडनी माइक्रो-ऑर्गनॉइड मानव किडनी रोग के मॉडलिंग और नैदानिक ​​​​अनुवाद की सुविधा के लिए एक सिद्ध मंच है। हमने पूछा कि क्या प्राथमिक मानव पोडोसाइट्स और जीईसी से प्राप्त परिणाम मानव-व्युत्पन्न किडनी माइक्रो-ऑर्गनॉइड मॉडल द्वारा सामान्यीकृत और मान्य थे। इसलिए, हमने इस मॉडल में APOL1 विनियमन, अभिव्यक्ति और परिणामों की जांच करने के लिए G1G2 APOL1 जीनोटाइप के एक अफ्रीकी अमेरिकी वाहक के प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (IPSC) से किडनी माइक्रो-ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किया (चित्र 4A)। हमने IFN 10ng/mL या आठ साइटोकिन्स (IFN, IFN, IFN, IL-18, IL-8, IL{17}}, TNF, IL{{18) के संयोजन में किडनी के सूक्ष्म ऑर्गेनोइड का संवर्धन किया। }} ) प्रत्येक 10ng/mL पर या तो बैरिसिटिनिब की अनुपस्थिति या उपस्थिति में, 24 घंटे के लिए 10µM। इन आठ साइटोकिन्स को पिछले प्रयोगों में APOL1 अभिव्यक्ति के उनके देखे गए विनियमन के कारण चुना गया था। गुर्दे के सूक्ष्म जीवों में पोडोसाइट्स और ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाएं मार्कर-पुष्टि की गईं (चित्र 4बी)। साहित्य (27) के अनुरूप, गुर्दे के सूक्ष्म-ऑर्गेनोइड्स में एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व कम था (डेटा नहीं दिखाया गया)। हमने पाया कि सूक्ष्म ऑर्गेनोइड्स में बेसल APOL1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति कम थी। IFN उपचार ने पर्याप्त APOL1 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जिसमें उच्चतम तीव्रता पोडोसाइट मार्कर, पोडोकैलिक्सिन के क्षेत्रों में सह-स्थानीयकृत थी। अन्य उपचारों की तुलना में साइटोकिन्स के कॉकटेल ने संपूर्ण सूक्ष्म-ऑर्गनॉइड संरचना में एक बड़ी और मजबूत APOL1 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। आईएफएन प्लस बारिसिटिनिब और सभी साइटोकिन्स प्लस बारिसिटिनिब से उपचारित समूहों में कोई एपीओएल1 अभिव्यक्ति नहीं दिखी, जो साइटोकिन प्रभाव के पूर्ण निषेध के अनुरूप है। किडनी माइक्रो-ऑर्गनॉइड पोडोसाइट्स में APOL1 अभिव्यक्ति COVAN रोगियों के पोडोसाइट्स में देखी गई अभिव्यक्ति की याद दिलाती थी। हालाँकि, COVAN किडनी के विपरीत, जिसमें स्वस्थ ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं में कोई महत्वपूर्ण APOL1 अभिव्यक्ति नहीं देखी गई, किडनी माइक्रो-ऑर्गनॉइड ई-कैडरिन-पॉजिटिव ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं ने APOL1 व्यक्त किया। यह अंतर झिल्ली साइटोकिन रिसेप्टर्स या एपिजेनेटिक कारकों में अंतर के कारण हो सकता है जो गुर्दे के सूक्ष्म-ऑर्गेनोइड के अपरिपक्व नलिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं। संक्षेप में, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न किडनी माइक्रो-ऑर्गेनोइड्स को सीओवीआईडी ​​​​प्रेरित साइटोकिन्स के साथ संवर्धित किया गया, जो रोगजनक जी 1 जी 2 एपीओएल 1 प्रोटीन का मजबूत अपग्रेडेशन दिखाता है और अभिव्यक्ति जेएके-एसटीएटी सिग्नलिंग के निषेध द्वारा अवरुद्ध हो गई थी।

साइटोकाइन-प्रेरित JAK-STAT-APOL1 सिग्नलिंग ने किडनी माइक्रो-ऑर्गनॉइड पोडोसाइट्स की व्यवहार्यता को कम कर दिया, जिसे JAK-अवरोधक द्वारा बचाया गया था। अंत में, हमने पूछा कि क्या गुर्दे के सूक्ष्मजीवों में व्यक्त G1G2 APOL1 पोडोसाइट व्यवहार्यता को ख़राब करता है। हमने अनुमान लगाया कि साइटोकिन-प्रेरित वैरिएंट APOL1 प्रोटीन पोडोसाइट हानि का कारण बनेगा - COVAN का एक हॉलमार्क फेनोटाइप। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने G1G2 के वाहक के iPSCs से उत्पन्न किडनी माइक्रो-ऑर्गेनोइड से पोडोसाइट्स को अलग किया। पोडोसाइट्स को IFN (10ng/mL), या आठ साइटोकिन्स (प्रत्येक 10ng/mL) के संयोजन में, बैरिसिटिनिब (10µM) की उपस्थिति और अनुपस्थिति दोनों में 96 घंटों के लिए सुसंस्कृत किया गया था (चित्र 5A और B)। साइटोकाइन उपचार ने APOL1 अभिव्यक्ति को मजबूती से प्रेरित किया और इस अभिव्यक्ति को हमारे पहले प्रयोगों (चित्र 5C) के अनुरूप, बारिसिटिनिब द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया था। तदनुसार, साइटोकिन उपचार के कारण महत्वपूर्ण पोडोसाइट हानि हुई, जैसा कि व्यवहार्यता परख और कुल सेलुलर एटीपी (चित्रा 5डी और 5ई) से संकेत मिलता है। उल्लेखनीय रूप से, बारिसिटिनिब ने साइटोकिन-प्रेरित पोडोसाइट हानि को पूरी तरह से बचाया। साथ में, ये परिणाम इस निष्कर्ष का समर्थन करते हैं कि COVID से प्रेरित साइटोकिन्स JAK-STAT-APOL1 सिग्नलिंग को ट्रिगर करते हैं जो बदले में पोडोसाइट की चोट और हानि का कारण बनता है। पोडोसाइट व्यवहार्यता पर जेएके-निषेध का सुरक्षात्मक प्रभाव इस परिकल्पना का दृढ़ता से समर्थन करता है।

बहस

वर्तमान अध्ययन के प्रमुख निष्कर्ष यह हैं कि इंटरफेरॉन से परे कई COVID प्रेरित साइटोकिन्स रोगजनक APOL1 अभिव्यक्ति को चलाने के लिए JAK-STAT सिग्नलिंग के माध्यम से सहक्रियात्मक रूप से कार्य करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पोडोसाइट चोट और हानि होती है जो JAK अवरोध द्वारा अवरुद्ध होती है। केस श्रृंखला के आधार पर, हमने पहली बार प्रदर्शित किया है कि APOL1 प्रोटीन प्रचुर मात्रा में COVID से पीड़ित रोगियों के पोडोसाइट्स और GECs में व्यक्त होता है, लेकिन स्वस्थ नियंत्रण के ग्लोमेरुली में नहीं और न ही COVID पॉजिटिव के ग्लोमेरुली में। COVAN-नकारात्मक नियंत्रण। तीन प्रयोगात्मक मॉडलों में, हम प्रदर्शित करते हैं कि COVID संक्रमण में अपग्रेड किए गए पुनः संयोजक साइटोकिन्स मजबूत APOL1 अभिव्यक्ति को चलाने के लिए पर्याप्त हैं, और अप्रत्याशित रूप से, कि साइटोकिन्स के संयोजन से उत्पन्न मजबूत तालमेल मुख्य रूप से एक सामान्य इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से मध्यस्थ था। सामूहिक रूप से, हमारे प्रायोगिक साक्ष्य साइटोकिन-प्रेरित JAK-STAT-APOL1 सिग्नलिंग और विवो COVAN ग्लोमेरुलर फेनोटाइप के बीच एक कारण संबंध का दृढ़ता से समर्थन करते हैं और इस चिकित्सीय लक्ष्य में आगे की जांच का समर्थन करते हैं।

COVAN के रोगियों के बीच उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप (77.8%) की बढ़ी हुई आवृत्ति, जिसकी हम यहां रिपोर्ट कर रहे हैं, हाल ही में अंतरराष्ट्रीय मल्टी-सेंटर पैथोलॉजी समीक्षा से संबंधित है, जिसमें 91.7% COVAN रोगियों में उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप की सूचना दी गई है (3)। यह देखते हुए कि सामान्य अफ़्रीकी अमेरिकी आबादी में उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप की आवृत्ति 13% (28) है, COVAN में 77-90% की आवृत्ति की खोज गहन है और रिपोर्ट की गई 60-70% आवृत्ति के तुलनीय है। एचआईवी-संबंधित नेफ्रोपैथी (एचआईवीएएन) (28-31)। शेष 20-30% COVAN (और HIVAN) मामलों का अस्तित्व, जिनमें उच्च जोखिम वाले APOL1 जीनोटाइप नहीं हैं, एक APOL{{20}}स्वतंत्र पैथोमैकेनिज्म की संभावना या संभावना का सुझाव देते हैं कि कुछ में कोविड के मामलों में जी0 एपीओएल1 की प्रेरित सुपरफिजियोलॉजिकल अभिव्यक्ति भी पॉडोसाइटोपैथी का कारण बन सकती है। इन संभावनाओं को पार्स करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होगी। फिर भी, हमने पहले प्रदर्शन किया थामानव भ्रूण की किडनी(HEK) टेट्रासाइक्लिन-इंड्यूसिबल APOL1 अभिव्यक्ति प्रणाली वाली कोशिकाएं जो APOL1 की साइटोटोक्सिसिटी भिन्न और खुराक पर निर्भर (32, 33) दोनों हैं। समान कोशिका-आधारित प्रणालियों (34) में अन्य जांचकर्ताओं द्वारा खुराक पर निर्भर एपीओएल1 साइटोटॉक्सिसिटी की भी सूचना दी गई थी। इसके अलावा, APOL1 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल ने न केवल APOL1 जोखिम एलील्स और पोडोसाइट चोट के बीच कारण लिंक को मान्य किया है, बल्कि यह भी प्रदर्शित किया है कि पोडोसाइटोपैथी की डिग्री APOL1 अभिव्यक्ति स्तर (1 0, 12-14, 35) के साथ सहसंबद्ध है। . हमारी खोज कि नौ COVAN मामलों में से आठ ने नियंत्रण के सापेक्ष मजबूत ग्लोमेरुलर APOL1 अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया और सबूत है कि अंतर्जात APOL1 जोखिम एलील की अभिव्यक्ति मानव गुर्दे के सूक्ष्म-ऑर्गेनॉइड में पोडोसाइटोपैथी का कारण बनती है, APOL1 और पोडोसाइटोपैथी के बीच कारण लिंक का समर्थन करती है। इसके विपरीत, COVID के ग्लोमेरुली में APOL1 की कमी-19 लेकिन AKI-नकारात्मक G{25}}G0 शव परीक्षण नियंत्रण से पता चलता है कि APOL1 प्रेरण के बिना COVID{26}} संक्रमण पर्याप्त चालक नहीं हैकोवन रोग.