बेर पॉलीसेकेराइड्स क्रोनिक किडनी डिजीज के साथ चूहों में एनीमिया को कम करते हैं

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शियांग हुआंग, एट अल

सार

जुजुब पॉलीसेकेराइड्स (जेपी) ज़िज़िफस जुजुबा के आहार फल में सक्रिय खाद्य-स्रोत वाले ग्लाइकान में से एक है, जिसे रक्त की कमी के उपचार के लिए माना जाता है। इस अध्ययन में, एदीर्घकालिकगुर्दाबीमारी(सीकेडी) चूहे के मॉडल का इस्तेमाल सीकेडी से जुड़े एनीमिया पर जेपी और इसके तंत्र के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। सीकेडी चूहों में, जेपी उपचार में काफी सुधार हुआगुर्दासमारोह, गुर्दारोगचोट, और हेमटोलॉजिकल पैरामीटर, जिसमें लाल रक्त कोशिकाओं में वृद्धि, हीमोग्लोबिन, हेमटोक्रिट और प्लेटलेट काउंट शामिल हैं। इसके अलावा, एलसी-एमएस / एमएस लक्षित चयापचय परिणामों से पता चला है कि जेपी ने सीकेडी चूहों में शॉर्ट-चेन फैटी एसिड (एससीएफए) रिलीज को बढ़ावा दिया। इसके अलावा, जेपी ने सीरम एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ) स्तर, किडनी ईपीओ एमआरएनए, औरगुर्दाएचआईएफ-सिग्नलिंग के माध्यम से ईपीओ प्रोटीन। सामूहिक रूप से, ये परिणाम इस बात का प्रमाण देते हैं कि सीकेडी से जुड़े एनीमिया पर जेपी का प्रभाव एससीएफए रिलीज और एरिथ्रोपोइटिन उत्पादन के नियमन में शामिल हो सकता है, सीकेडी से जुड़े एनीमिया के इलाज में जेपी के भोजन की खुराक के रूप में आगे के विकास का समर्थन करता है।

कीवर्ड: बेर पॉलीसेकेराइड्सदीर्घकालिकगुर्दा बीमारीएनीमिया एरिथ्रोपोइटिन हाइपोक्सिया-प्रेरक कारक- लघु-श्रृंखला फैटी एसिड

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1 परिचय

दीर्घकालिकगुर्दा बीमारी(सीकेडी) को गुर्दे की संरचनात्मक असामान्यताओं या कार्यात्मक हानि के नैदानिक ​​सिंड्रोम के रूप में परिभाषित किया गया है और यह दुनिया भर में एक तेजी से सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ बन रहा है (वेबस्टर, नागलर, मॉर्टन, और मैसन, 2017)। गुर्दे की कमी सीकेडी की सबसे आम जटिलताओं में से एक है जो मृत्यु के बढ़ते जोखिम में योगदान करती है (लोकाटेली एट अल।, 2019)। एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ) उत्पादन की अपर्याप्तता सीकेडी (पप्पा, डौनूसी, दूनी, और काटोपोडिस, 2015) में एनीमिया का एक मान्यता प्राप्त प्रमुख ड्राइविंग कारक है। ईपीओ का निर्माण लीवर में होता है औरगुर्दा, जो एरिथ्रोसाइट उत्पादन के लिए आवश्यक है (लापिन एंड ली, 2019)। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल फैक्टर (HIF) ईपीओ (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019) की अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकता है। ईपीओ उत्पादन को प्रेरित करने के लिए एचआईएफ को लक्षित करना इस प्रकार सीकेडी से जुड़े एनीमिया के इलाज के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय रणनीति माना गया है।

बेर ज़िज़ीफस जुजुबा मिल का फल है। (Rhamnaceae), जिसे चीनी तिथि के रूप में भी जाना जाता है। औषधीय जड़ी बूटी और भोजन के पूरक के रूप में बेर का हजारों वर्षों से एक लंबा पारंपरिक उपयोग है। बेर का उपयोग उन लोगों के लिए स्वास्थ्य पूरक के रूप में किया जाता है जिनके पास हेमेटोजेनिक है या पुराने कुपोषण से पीड़ित हैं। जुज्यूब पॉलीसेकेराइड्स (जेपी), एक पानी में घुलनशील घटक है जो मोनोसैकराइड और यूरोनिक एसिड (जी, होउ, यान, शि, और लियू, 2020) के विभिन्न अनुपातों के साथ मिश्रित है, बेर के भीतर सक्रिय अवयवों में से एक है (जी एट अल।, 2017) ), जिसे हेपेटोप्रोटेक्टिव प्रभाव और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि को प्रदर्शित करने और आंतों के अवरोध समारोह (लियू एट अल।, 2015, यू एट अल।, 2015) को बढ़ाने के लिए अच्छी तरह से स्वीकार किया गया है। दरअसल, जेपी को आमतौर पर एनीमिया पर संभावित प्रभाव भी माना जाता है। हालांकि, एनीमिया के इलाज में जेपी का आणविक तंत्र अभी भी कम ज्ञात है।

हाल के वर्षों में, रोग की प्रगति में योगदान करने वाले संभावित कारकों को समझने के लिए मेटाबोलामिक्स का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। सीकेडी जैसे जटिल मानव रोगों के आणविक मार्करों की पहचान करने में लक्षित चयापचयों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इंडोक्सिल सल्फेट (आईएस) और पी-क्रेसिल सल्फेट (पीसीएस) को सीकेडी प्रगति के बायोमार्कर के रूप में सत्यापित किया गया था (मीजर्स एंड इवनपोल, 2011), और ट्राइमेथिलैमाइन-एन-ऑक्साइड (टीएमएओ) की बढ़ी हुई डिग्री सीधे वृक्क ट्यूबलोइंटरस्टीशियल फाइब्रोसिस और शिथिलता का कारण बन सकती है। (तांग एट अल।, 2015)। शॉर्ट-चेन फैटी एसिड (एससीएफए), आंत माइक्रोबियल-आश्रित मेटाबोलाइट्स, विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं (लेब्लांक एट अल।, 2017) को प्रभावित करने की क्षमता वाले ऊर्जा सब्सट्रेट हैं, और सीकेडी प्रगति में योगदान करने के लिए एससीएफए की कमी की सूचना दी गई है। (कोह, डी वाडर, कोवाचेवा-डैचरी, और बी¨ एकेड, 2016, वांग एट अल।, 2019)। इसके अलावा, एससीएफए ऑक्सीडेटिव तनाव (ली, मा, और फू, 2017) के निषेध के माध्यम से गुर्दे की संरचना को नुकसान से बचाने में सक्षम थे। सहवर्ती रूप से, एससीएफए को लोहे के अवशोषण पर लाभकारी प्रभाव दिखाने और भ्रूण/भ्रूण ग्लोबिन जीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड करने के लिए पाया गया है, जो एरिथ्रोपोएसिस को प्रेरित करता है और एनीमिया को ठीक करता है (टाको, ग्लैन, नेज़, और स्टैंगोलिस, 2014)। वृक्क रक्ताल्पता में एससीएफए के तंत्र को अभी भी स्पष्ट करने की आवश्यकता है।

इस अध्ययन में, हम अनुमान लगाते हैं कि जेपी एससीएफए की रिहाई को विनियमित कर सकता है और एचआईएफ-मध्यस्थता वाले ईपीओ उत्पादन को प्रोत्साहित कर सकता है, जिसका परिणाम गुर्दे की एनीमिया को ठीक करना है। यहां, हम 5/6 नेफ्रक्टोमाइज्ड-प्रेरित सीकेडी चूहों में गुर्दे के एनीमिया को कम करने में जेपी के प्रभाव की जांच करेंगे, जिसमें गुर्दे के कार्य और हेमटोलॉजिकल पैरामीटर शामिल हैं। एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करते हुए एक लक्षित मेटाबोलामिक्स दृष्टिकोण को एसिटिक एसिड, प्रोपेनोइक एसिड, आइसोब्यूट्रिक एसिड, ब्यूटिरिक एसिड, 2-मिथाइल ब्यूटिरिक एसिड, आइसोवालेरिक एसिड, वैलेरिक एसिड, और हेक्सानोइक एसिड सहित आठ एससीएफए निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है। स्वस्थ और सीकेडी चूहों में गुर्दे के नमूने और लक्षित एससीएफए के स्तर का मूल्यांकन किया जाता है। इसके अलावा, जेपी-उपचारित चूहों में एचआईएफ सिग्नलिंग की भागीदारी भी सामने आई है।

अंजीर। 1. जेपी की विशिष्ट जीसी-एमएस क्रोमैटोग्राफी। (ए) एल्डोनोनिट्राइल एसीटेट व्युत्पन्नकरण के बाद मोनोसैकराइड संरचनात्मक सूत्र; (बी) प्रतिनिधि जीसी-एमएस मिश्रित आयन क्रोमैटोग्राफी (एमआईसी) मानक मोनोसेकेराइड मिश्रण और जेपी हाइड्रोलाइज्ड मोनोसेकेराइड के प्रोफाइल। क्रोमैटोग्राफी प्रोफाइल में चोटियों को (ए) में दिखाए गए रासायनिक मार्कर के अनुरूप किया गया था: 1. रमनोज, 2. अरबी, 3. फ्यूकोस, 4. जाइलोज, 5. मैनोज, 6. ग्लूकोज, 7. गैलेक्टोज, 8. इनोसिटोल (आईएसटीडी) )

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. बेर पॉलीसेकेराइड की तैयारी

Z. jujuba के फल शेन्ज़ेन हुआहुई फार्मास्युटिकल कं, लिमिटेड से खरीदे गए थे। सामग्री को पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना 2015 संस्करण के फार्माकोपिया के अनुसार डॉ। जियानपिंग चेन द्वारा प्रमाणित किया गया था। वाउचर के नमूने 18100601 नंबर के साथ शेनझेन ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन हॉस्पिटल में रखे गए थे।

क्रूड जेपी को बेर से निकाला गया था जैसा कि पहले बताया गया था, मामूली संशोधनों के साथ (जी एट अल।, 2020)। संक्षेप में, बेर को 3 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10 वोल्ट पानी (वी/डब्ल्यू) के साथ ऊष्मायन किया गया और 3 बार निकाला गया। छानने के बाद, निस्यंदों को मिलाएं और इस संयोजन को एक नियंत्रित वैक्यूम के तहत एक रोटरी बाष्पीकरण में संघनित करें। 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल (v/v) के चार गुना जोड़कर सांद्र समाधान को आगे बढ़ाया गया था। अवक्षेप को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया था और क्रूड जेपी प्राप्त करने के लिए कम दबाव में सूखापन के लिए सुखाया गया था। कैलोरीमेट्री का उपयोग करके जेपी की शुद्धता 80 प्रतिशत निर्धारित की गई थी।

2.2. बेर पॉलीसेकेराइड की मोनोसैकराइड संरचना की विशेषता

एक शिमदज़ू जीसी-एमएस सिस्टम (शिमदज़ू जीसी-एमएस टीक्यू8040 शिमदज़ू जीसी 2010 प्लस के साथ इंटरफेस किया गया) ईआई स्रोत, एसएच-आरएक्सआई-5सिल एमएस केशिका स्तंभ (30 मीटर) से लैस है। × 0.25 मिमी आईडी, 0.25 माइक्रोन फिल्म मोटाई, शिमदज़ु) का उपयोग 10:1 के विभाजन अनुपात के साथ व्युत्पन्न हाइड्रोलाइज्ड मोनोसेकेराइड को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इंजेक्शन, आयन स्रोत और इंटरफ़ेस का तापमान 250 C, 200 C, और 250 C था। स्तंभ का प्रारंभिक तापमान 1 मिनट के लिए 120 C पर आयोजित किया गया था, फिर 15 C / मिनट से 160 C पर रैंप किया गया और 4 मिनट, 2 C / मिनट से 165 C तक आयोजित किया गया और 2 मिनट, 20 C के लिए आयोजित किया गया /

न्यूनतम से 195 C, 5 C/मिनट से 250 C, और 3 मिनट के लिए आयोजित। हीलियम वाहक गैस प्रवाह दर 46 सेमी/सेकंड पर रखी गई थी और प्रत्येक नमूने के 2 μL को उपकरण में इंजेक्ट किया गया था। एनालिटिक्स को चयनित आयन मॉनिटरिंग (सिम) मोड में निर्धारित किया गया था, लक्ष्य आयन: रमनोज (एम/जेड 129.00), अरेबिनोज (एम/जेड 115.00), फ्यूकोस (एम/ z 103.00), xylose (m/z 115.00), mannose (m/z 115.00), ग्लूकोज (m/z 115.00 ), गैलेक्टोज (एम/जेड 115.00), इनोसिटोल (एम/जेड 126.00)। मोनोसेकेराइड मानकों को निम्नानुसार सूचीबद्ध किया गया था: एल (प्लस) -अरबिनोज (1506-200202), फ्यूकोस (112014-201902), डी-जाइलोज (111508-201605), डी-ग्लूकोज (110833-201908), रमनोज (111683-201502) ), गैलेक्टोज (100226-201807), डी-मैननोज (140651-201805) राष्ट्रीय खाद्य एवं औषधि नियंत्रण संस्थान से खरीदे गए थे। Inositol सिग्मा (I7508-50 g) से प्राप्त किया गया था।

निकाले गए जेपी (10 मिलीग्राम) को 105 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 2 मोल/एल ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 10 एमएल के साथ मोनोसेकेराइड में हाइड्रोलाइज्ड किया गया था, और जेपी से हाइड्रोलाइज्ड मोनोसेकेराइड को 60 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव में केंद्रित और धोया गया था। TFA को हटा दें, और निवासों को 2 mL पानी द्वारा पुनर्गठित किया गया। 100 µ एल हाइड्रोलाइज्ड मोनोसैकेराइड्स घोल में 20 मिलीग्राम/एमएल हाइड्रॉक्सिलमाइन हाइड्रोक्लोराइड/पाइरीडीन घोल के 250 µ एल को जोड़ा गया और 45 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा गया। और फिर 250 µ एल एसिटिक एनहाइड्राइड जोड़ा गया और एक और 45 मिनट के लिए 90 C पानी के स्नान में रखा गया। प्रतिक्रिया के अंत में, मिश्रण को 5 बार साइक्लोहेक्सेन के 1 एमएल द्वारा निकाला गया था, और साइक्लोहेक्सेन परत को 1 एमएल तक केंद्रित किया गया था। विश्लेषण के लिए GC-MS में 1 µ l supernatant को इंजेक्ट किया (Li & Shi, 2013)।

2.3. जानवरों

सभी प्रयोग गुआंगज़ौ विश्वविद्यालय चीनी चिकित्सा की संस्थागत पशु देखभाल उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ किए गए थे। स्प्राग-डावले चूहों, नर और मादा, जिनका वजन 180-220 ग्राम है, को ग्वांगडोंग मेडिकल लेबोरेटरी एनिमल सेंटर (फोशान, चीन, अनुमति संख्या एससीएक्सके (यू) 2008-0002) से प्राप्त किया गया था और एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ़) में बनाए रखा गया था। ) 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र के तहत पशु सुविधा, भोजन और पानी के साथ स्वतंत्र रूप से।

गुर्दे की विफलता को प्रेरित करने के लिए, पिछले विवरण (चेन एट अल।, 2019) के अनुसार 5/6 नेफरेक्टोमी किया गया था। सभी सर्जिकल ऑपरेशन 10 प्रतिशत क्लोरल हाइड्रेट के साथ एनेस्थीसिया के तहत किए गए थे। शम ऑपरेशन ग्रुप (n=6) ने उदर गुहा को खोलने और गुर्दे को उजागर करने के लिए वही कदम उठाए। 5/6 नेफरेक्टोमी चूहों को बेतरतीब ढंग से दो समूहों में विभाजित किया गया था। उपचार के बिना चूहे (सीकेडी समूह, एन=6), और जेपी (सीकेडी प्लस जेपी समूह, एन=6) ​​प्राप्त करने वाले चूहों को मौखिक रूप से 1.2 ग्राम / किग्रा / डी की खुराक पर। 90 दिनों के ऑपरेशन के बाद, 90 दिनों का प्रशासन शुरू हुआ। 90 वां दिन चूहों के लिए जेपी का अंतिम प्रशासन समय था, और 24 घंटे के बाद पेट की महाधमनी से रक्त लेकर जानवरों की बलि दी गई, और प्रत्येक चूहे से मूत्र, मल, सीरम और गुर्दे के नमूने एकत्र किए गए। सभी नमूनों को आगे के विश्लेषण से पहले −80 C पर संग्रहीत किया गया था।

2.4. जैव रासायनिक विश्लेषण

निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, रक्त यूरिया नाइट्रोजन (BUN) और सीरम क्रिएटिनिन (Scr) को क्रिएटिनिन सीरम डिटेक्शन किट और BUN डिटेक्शन किट (WAKO, गिन्ज़ा, जापान) द्वारा मापा गया, और मूत्र प्रोटीन को एलिसा किट (नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूशन) द्वारा मापा गया। नानजिंग, चीन)। लाल रक्त कोशिका (आरबीसी), हीमोग्लोबिन (एचबी), हेमटोक्रिट (एचसीटी), और प्लेटलेट काउंट (पीएलटी) का विश्लेषण निर्माता के निर्देशों के अनुसार हेमटोलॉजी सिस्टम्स (सीमेंस 2021i, एर्लांगेन, जर्मनी) द्वारा किया गया था।

2.5. हिस्टोलॉजिकल परीक्षा

गुर्दे की बीमारी की चोट का आकलन करने के लिए आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) और मेसन धुंधला का उपयोग किया गया था, उनमें से, पीएएस धुंधला को वृक्क ट्यूबलर शोष और ग्लोमेरुलर क्षेत्र को प्रकट करने के लिए नियोजित किया गया था, और मैसन धुंधला वृक्क अंतरालीय फाइब्रोसिस (ज़ी एट अल। , 2020)। मात्रात्मक विश्लेषण पद्धति पिछले अध्ययनों (चेन एट अल।, 2019) के अनुसार आयोजित की गई थी। संक्षेप में, पीएएस धुंधला में ट्यूबलर शोष स्कोर निम्नानुसार परिभाषित किया गया था: 1. दुर्लभ एकल एट्रोफिक ट्यूब्यूल; 2. एट्रोफिक नलिकाओं के कई समूह; 3. बड़े पैमाने पर शोष। ग्लोमेरुलर क्षेत्र को ZEN 3.1 सॉफ्टवेयर (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Germany) द्वारा मापा गया था। मैसन धुंधला में फाइब्रोटिक क्षेत्र को इमेज जे सॉफ्टवेयर (एनआईएच, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। प्रत्येक सूक्ष्म क्षेत्र में कम से कम एक ग्लोमेरुलस के साथ, शोष स्कोर, ग्लोमेरुलर क्षेत्र और फाइब्रोटिक क्षेत्र को मापने के लिए प्रति समूह 6 चूहों के कम से कम दस सूक्ष्म क्षेत्रों (200 ×) को बेतरतीब ढंग से पकड़ा गया था।

2.6. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण

प्रत्येक नमूने से वृक्क पैराफिन खंड (4 सुक्ष्ममापी) ज़ाइलीन द्वारा दो बार क्रमिक निर्जलीकरण था, और ढाल इथेनॉल (100-95-90-80-70 प्रतिशत), प्रतिजन साइट्रिक एसिड बफर (पीएच 6.0) के साथ पुनर्प्राप्त किया गया था। ) 30 मिनट के लिए, 10 मिनट के लिए 3 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्साइड और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बकरी सीरम द्वारा अवरुद्ध। ऊतक वर्गों को प्राथमिक एंटीबॉडी एचआईएफ -1 (बायोस, बीएस -0737 आर, 1: 500, लॉट: बीए01279129), एचआईएफ -2 (बायोस, बीएस {{18}) द्वारा अलग से ऊष्मायन किया गया था। आर, 1: 500, लॉट: बीजे 2044786) 10 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और एचआरपी संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (एबीकैम, एबी 6712, 1: 1000) 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, डीएबी (डायमिनोबेजिड इन) का उपयोग किया गया था एचआरपी गतिविधि का पता लगाने के लिए, नाभिक को हेमटॉक्सिलिन द्वारा उलट दिया गया था। द. प्रत्येक समूह से 400 × सूक्ष्म क्षेत्रों के तहत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का विश्लेषण किया गया था और एक्सियो स्कोप A1, ZEISS, जेना, जर्मनी द्वारा स्केल बार=20 माइक्रोन तय किया गया था। हेमेटोक्सिलिन द्वारा परमाणु नीला धुंधला था और डीएबी की प्रतिरक्षात्मकता भूरी थी, गहरे डीएबी धुंधला का अर्थ है मजबूत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सकारात्मक।

2.7. ईपीओ डिटेक्शन

सीरम ईपीओ सामग्री का पता एलिसा किट (Abcam, ab274398) द्वारा लगाया गया था, और प्रयोग एलिसा किट प्रोटोकॉल की बात कर रहा था। संक्षेप में, नमूने में ईपीओ एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, 3 बार धो बफर द्वारा प्रत्येक कुएं को धोया, 15 मिनट के लिए दूसरे इनक्यूबेट में टीएमबी जोड़ा और प्रतिक्रिया बंद कर दी।

किडनी टोटल एमआरएनए को ट्राईजोल का उपयोग करके जमे हुए किडनी के ऊतकों से निकाला गया और एमआरएनए का सीडीएनए में अनुवाद किया गया। निर्माताओं के प्रोटोकॉल के अनुसार मैक्सिमा SYBR ग्रीन / ROX qPCR मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए यूएसए, K0223) के साथ रीयल-टाइम पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। SYBR ग्रीन सिग्नल को ABI प्रिज्म 7300 सीक्वेंस डिटेक्शन सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर सिटी, CA) द्वारा अधिग्रहित और मापा गया था। प्राइमर थे: 5′-सीसीजी टीसीसी सीएजी एटीए सीसीए एएजी टीसी -3′ और 5′-एसीसी सीजीए एजीसी एजीटी जीएए जीटीजी-3′ चूहों के लिए ईपीओ (214 बीपीएस, एनएम_017001। 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ और 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ GAPDH के लिए (181 bps, NM_017008.3), हाउसकीपिंग जेन्स सभी मामलों में आंतरिक नियंत्रण के रूप में। और जीन अभिव्यक्ति के सापेक्ष परिमाणीकरण की गणना सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति विधि (2− CT) द्वारा की गई थी।

किडनी कॉर्टेक्स लाइसेट्स के प्रोटीन की एक समान मात्रा को 10 प्रतिशत एसडीएस जेल द्वारा लोड और अलग किया गया और फिर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 5 प्रतिशत नॉनफैटी दूध में अवरुद्ध होने के बाद, झिल्लियों को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। तब झिल्लियों को एचआरपी (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) -संयुग्मित एंटी-माउस आईजीजी (लाइफ टेक्नोलॉजीज) के साथ कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। क्लैरिटी वेस्टर्न ईसीएल सबस्ट्रेट का उपयोग करके एचआरपी गतिविधि की कल्पना की गई और टैनन इमेजिंग सिस्टम द्वारा विश्लेषण किया गया। इस अध्ययन में निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था: चूहों से मोनोक्लोनल ईपीओ (बी - 4) (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, एससी -5290, 1/500 कमजोर पड़ने), चूहों से मोनोक्लोनल -एक्टिन (सेल सिग्नलिंग तकनीक, 8H10D10, 1/1000 कमजोर पड़ने)।

2.8. शॉर्ट-चेन फैटी एसिड विश्लेषण

एक शिमदज़ू यूएचपीएलसी-एलसीएमएस/एमएस सिस्टम (शिमदज़ू एलसी-एमएस 8045 शिमदज़ू एलसी-20एडी के साथ इंटरफेस किया गया) जो ईएसआई स्रोत से लैस है।

क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण शिम-पैक GIST C18 (2.1 × 1 0 0 मिमी, 2 माइक्रोन) कॉलम पर {{1 0}} का उपयोग करके किया गया था। पानी में 1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड ( विलायक ए) और एसीटोनिट्राइल (विलायक बी) एक ढाल रेफरेंस द्वारा 0.3 मिलीलीटर/मिनट की प्रवाह दर पर: 0-9 मिनट, 25-30 प्रतिशत बी; 9-11 मिनट, 30-40 प्रतिशत बी; 11-20 मिनट, 40-50 प्रतिशत बी; 20-20.1 मिनट, 50-100 प्रतिशत बी; 20.1-23 मिनट, 100 प्रतिशत बी; 23.1 मिनट -25 प्रतिशत बी पुन: संतुलन के लिए। स्तंभ का तापमान 35 C था, और विश्लेषण के दौरान ऑटोसैम्पलर को 4 C पर रखा गया था, प्रत्येक नमूने के 1 μL को उपकरण में इंजेक्ट किया गया था। विश्लेषण का पता सकारात्मक आयन मोड में संचालित बहु-प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) मोड में किया गया था। एमएस पैरामीटर: नेबुलाइजिंग गैस प्रवाहित: 3.0 एल/मिनट; सुखाने वाली गैस बह रही है: 10 एल / मिनट; ताप गैस बह रही है: 10 एल / मिनट; डीएल तापमान: 250 C; इंटरफ़ेस तापमान: 300 C; ताप ब्लॉक: 400 C. एमआरएम संक्रमण और टक्कर ऊर्जा (सीई) को प्रत्येक मानक व्युत्पन्न के प्रत्यक्ष जलसेक द्वारा चुना और अनुकूलित किया गया था। विश्लेषण मात्रा MRM संक्रमणों को तालिका S1 में संक्षेपित किया गया था।

फेकल एससीएफए: 50 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल के 100 μL को lyophilized मल के 3 मिलीग्राम में जोड़ा गया और 2 मिनट के लिए भंवर में डाला गया। फिर मिश्रण को 12000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और सतह पर तैरनेवाला पिपेट किया गया।

गुर्दा SCFAs: ऊतक समरूप तैयार करने के लिए 100 मिलीग्राम गुर्दे के ऊतकों को भारित किया जाता है और 4 गुना सामान्य खारा (100 मिलीग्राम/400 μL) के साथ बर्फ पर भंवर किया जाता है। 300 μL ऊतक समरूप में 3 गुना ठंडा मेथनॉल जोड़ा गया और 2 मिनट के लिए भंवर में डाला गया, फिर मिश्रण को 12000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और सतह पर तैरनेवाला पिपेट किया गया। सतह पर तैरनेवाला N2 द्वारा सुखाया गया और 100 μL 50 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल द्वारा पुनर्गठित किया गया।

जोड़ा गया 500 mmol/L N-(3-डाइमिथाइल एमिनोप्रोपाइल)-Ń-एथिल कार्बोडायमाइड हाइड्रोक्लोराइड (EDC, अलादीन, शंघाई, चीन), 50 mmol/L 3एच- [1,2,3]-ट्रायज़ोलो [4 5-b] पाइरीडीन-3-ओल (HOAT, अलादीन, शंघाई, चीन) और 50 mg/mL 12C-Dansylhydrazine (12C-DnsHz, J&K, बीजिंग, चीन) में नमूना निष्कर्षण के 20 μL में समान मात्रा के साथ अनुक्रम। EDC और HOAT को 500 mmol/L 2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES, Macklin, शंघाई, चीन) के साथ तैयार किया गया था। 90 मिनट के लिए 20 C पर ऊष्मायन के बाद, 30 मिनट (झाओ और ली, 2018) के लिए 40 C पर व्युत्पन्न प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए मिश्रण में 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (मैकलिन, शंघाई, चीन) मिलाया गया। व्युत्पत्ति के अंत में, मिश्रण को 25 प्रतिशत एसीटोनिट्राइल द्वारा 10 गुना पतला किया गया था। विश्लेषण से पहले, 100 μL सतह पर तैरनेवाला एक 100 μL आंतरिक मानक समाधान के साथ मिलाया गया था। 13C-DnsHz लेबल का उपयोग समान व्युत्पत्ति प्रतिक्रिया के अनुसार आंतरिक मानकों (ISTD 1-8) के रूप में किया गया था। SCFAs मानक: एसिटिक एसिड (AA, A116173), प्रोपेनोइक एसिड (PA, P110446), आइसोब्यूट्रिक एसिड (IBA, I103524), ब्यूटिरिक एसिड (BA, B110438), 2-मिथाइल ब्यूटिरिक एसिड (2- अलादीन (शंघाई, चीन) से बीए, एम107377, आइसोवालेरिक एसिड (आईवीए, आई108280), वैलेरिक एसिड (वीए, वी108271), हेक्सानोइक एसिड (एचए, एच103632) की आपूर्ति की गई।

2.9. सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रत्येक समूह के डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था। समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व छात्र-न्यूमैन-केल्स (एसएनके) परीक्षण या डननेट के टी 3 परीक्षण के साथ एकतरफा एनोवा और पोस्ट हॉक विश्लेषण द्वारा किया गया था। P <0.05 का="" मान="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="" था।="" सभी="" डेटा="" spss="" सांख्यिकी="" सॉफ़्टवेयर="" (संस्करण="" 22.0,="" spss="" inc.,="" शिकागो,="" il,="" usa)="" का="" उपयोग="" करके="" किए="" गए="">

3। परिणाम

3.1. जेपी ने सीकेडी चूहों के गुर्दा समारोह में सुधार किया

जेपी के मोनोसेकेराइड को जानवरों पर इलाज से पहले चित्रित किया गया था। वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया जेपी सात मोनोसेकेराइड्स से बना था, जो कि रमनोज (1.62 प्रतिशत), अरेबिनोज (15.79 प्रतिशत), फ्यूकोस (0.21 प्रतिशत), जाइलोज (4.56 प्रतिशत), मैनोस (3. 00 प्रतिशत), ग्लूकोज (73.44 प्रतिशत), और गैलेक्टोज (4.99 प्रतिशत) (चित्र 1)। हमारी विश्लेषण पद्धति को रैखिकता, सटीकता, दोहराव, स्थिरता और पुनर्प्राप्ति (टेबल्स S2-S3) द्वारा मान्य किया गया था। विश्लेषण 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर होने की पुष्टि की गई। जेपी की उपज 8.63 प्रतिशत से अधिक और शुद्धता 77.16 प्रतिशत से कम नहीं होनी चाहिए। जेपी के पूर्वोक्त रासायनिक विश्लेषण ने गुणवत्ता नियंत्रण दृष्टिकोण के रूप में कार्य किया ताकि नीचे के पशु अध्ययनों की पुनरुत्पादन क्षमता सुनिश्चित हो सके।

Scr, BUN, और मूत्र प्रोटीन गुर्दे के कार्यों के सबसे अधिक प्रतिनिधि थे। CKD चूहों में Scr, BUN और मूत्र प्रोटीन का स्तर शम समूह (P <{0}}.01) की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" था।="" jp="" के="" साथ="" 90="" दिनों="" के="" उपचार="" के="" बाद,="" ckd="" समूह="" (p=""><0.01) (चित्र="" 2a-c)="" की="" तुलना="" में="" scr,="" bun="" और="" मूत्र="" प्रोटीन="" के="" स्तर="" में="" कमी="">

3.2. जेपी ने सीकेडी चूहों में गुर्दे की रोग संबंधी चोट को ठीक किया

शम समूह के लिए पूरे दाहिने गुर्दे का वजन और सीकेडी और सीकेडी प्लस जेपी समूह के लिए शेष दाहिनी किडनी का उपयोग गुर्दे के वजन (KW) और गुर्दे के वजन / शरीर के वजन (KW / BW) द्वारा गुर्दे की आकृति विज्ञान के आकलन के लिए किया गया था। प्रयोगों के अंत में, CKD समूह के KW और KW/BW को शम समूह (सभी P <{0}}.05) की="" तुलना="" में="" बढ़ाया="" गया="" था।="" 5/6="" नेफरेक्टोमी-प्रेरित="" सीकेडी="" मॉडल="" में,="" वृक्क="" प्रोटीनएज="" गतिविधियों="" में="" कमी="" के="" कारण="" प्रतिपूरक="" वृक्क="" वृद्धि="" हुई,="" वृक्क="" अतिवृद्धि="" वाली="" कंपनियां="" (मॉर्टन="" एंड="" ग्रिफिथ्स,="" 1985),="" और="" हमने="" इस="" कथन="" की="" पुष्टि="" की।="" जेपी="" उपचार="" के="" बाद,="" केडब्ल्यू="" में="" काफी="" कमी="" आई="" (पी=""><0.05) और="" एक="" दिखावा="" समूह="" (पी="" ˃="" 0.05)="" के="" लिए="" बंद="" कर="" दिया="" गया;="" जबकि="" kw/bw="" थोड़ा="" कम="" हो="" गया="" था="" (p="" 0.05)।="" (चित्र="">

अंजीर। 2. जेपी ने सीकेडी चूहों में गुर्दे के कार्य की रक्षा की। विभिन्न समूहों में Scr (A), BUN (B) और मूत्र प्रोटीन (C) का स्तर। (डी) गुर्दे का वजन, (ई) किलोवाट / बीडब्ल्यू। डेटा को माध्य ± SD, n=6 प्रति समूह (**P <0.01 sham="" group="" के="" साथ="" तुलना="" में;="" #p="">< 0.05="" के="" रूप="" में="" प्रस्तुत="" किया="" गया="" था।="" ,="" ##p=""><0.01 सीकेडी="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="">

सीकेडी समूह में, रेनल ट्यूबलर को शम समूह (पी <{0}}.01) की="" तुलना="" में="" बड़े="" पैमाने="" पर="" शोष="" दिखाया="" गया="" था,="" और="" ग्लोमेरुलस="" क्षेत्र="" और="" रीनल="" इंटरस्टिशियल="" फाइब्रोसिस="" की="" तुलना="" में="" लगभग="" दोगुना="" अधिक="" था।="" मात्रात्मक="" विश्लेषण="" में="" नकली="" समूह="" का="" (पी=""><0.01)। जेपी="" उपचार="" के="" बाद,="" ट्यूबलर="" एट्रोफी="" स्कोर="" लगभग="" दो="" बार="" (पी=""><0.01) से="" कम="" हो="" गया="" था,="" ग्लोमेरुलस="" क्षेत्र="" लगभग="" एक="" शम="" समूह="" (पी=""><0.01) में="" वापस="" आ="" गया="" था,="" और="" रीनल="" इंटरस्टिशियल="" फाइब्रोसिस="" एक="" तिहाई="" (पी=""><0.01) से="" कम="" हो="" गया="" था।="" सीकेडी="" समूह="" की="" तुलना="" में="" (चित्र="">

अंजीर। 3. जेपी ने सीकेडी चूहों में गुर्दे की संरचना की रक्षा की। (ए) पीएएस धुंधला हो जाना। (बी) मेसन धुंधला हो जाना। (सी) ट्यूबलर एट्रोफी स्कोर। (डी) ग्लोमेरुलर क्षेत्र (ई) फाइब्रोटिक क्षेत्र। सभी छवियों को समान आवर्धन, 200×, स्केल बार=100 माइक्रोन पर प्रस्तुत किया जाता है। डेटा को ± एसडी, एन=6 प्रति समूह (** पी <0.01 शम="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="" में="" प्रस्तुत="" किया="" गया="" था;="" #="" पी=""><0.05, ##="" पी=""><0.01 सीकेडी="" समूह="" की="" तुलना="" में="">

3.3. जेपी ने सीकेडी चूहों में हेमटोलॉजिकल मापदंडों को संशोधित किया

हेमटोलॉजिकल मापदंडों के लिए जैव रासायनिक विश्लेषण, आरबीसी, एचबी, एचसीटी और पीएलटी को मापा गया। CKD चूहों में, RBC का स्तर 9.06 से 7.20 × 1012/L, Hb 15.28 से 13.22 g/dL, HCT 47.1 से 40.4 प्रतिशत तक गिर गया था, और PLT बढ़ा दिया गया था। 1012 से 1526 × 109 / एल तक एक नकली समूह (पी <0.01) की="" तुलना="" में,="" जिसने="" संकेत="" दिया="" कि="" सीकेडी="" चूहों="" में="" एनीमिया="" के="" लक्षण="" देखे="" गए="" थे।="" जेपी-उपचारित="" सीकेडी="" चूहों="" में="" आरबीसी,="" एचबी,="" एचसीटी="" और="" पीएलटी="" के="" घटे="" हुए="" स्तर="" को="" बहाल="" किया="" गया="" (पी=""><0.01) (चित्र="">

अंजीर। 4. जेपी ने सीकेडी चूहों में हेमटोलॉजिकल मापदंडों का पुनर्वास किया। पीएलटी (ए), आरबीसी (बी), एचबी (सी), एचसीटी (डी) का स्तर। डेटा को माध्य ± SD, n=6 प्रति समूह (**P <0.01 sham="" group="" के="" साथ="" तुलना="" में;="" #p="">< 0.05="" के="" रूप="" में="" प्रस्तुत="" किया="" गया="" था।="" ,="" ##p=""><0.01 सीकेडी="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="">

3.4. जेपी ने ईपीओ अभिव्यक्ति को प्रेरित किया

शम समूह की तुलना में, सीकेडी-एनीमिया चूहों (पी <0.01) में="" सीरम="" ईपीओ="" स्तर="" और="" किडनी="" ईपीओ="" एमआरएनए="" राशि="" में="" काफी="" कमी="" आई="" थी।="" पश्चिमी="" सोख्ता="" विश्लेषण="" से="" पता="" चला="" है="" कि="" सीकेडी="" समूह="" में="" महत्वपूर्ण="" अंतर="" के="" बिना="" ईपीओ="" प्रोटीन="" स्तर="" थोड़ा="" कम="" हो="" जाता="" है।="" जेपी="" उपचार="" के="" बाद,="" सीकेडी="" समूह="" (पी=""><0.01 या="" पी=""><0.05) (छवि="" 5ए-बी)="" की="" तुलना="" में="" सीरम="" ईपीओ="" स्तर,="" किडनी="" ईपीओ="" एमआरएनए="" और="" प्रोटीन="" को="" काफी="" उन्नत="" किया="" गया="">

किडनी कॉर्टेक्स में, HIF-1 मुख्य रूप से रीनल ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा निर्मित किया गया था, HIF-2 मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं और रीनल इंटरस्टिशियल फ़ाइब्रोब्लास्ट्स (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019) में व्यक्त किया गया था। इम्यूनोहिस्टो रसायन विज्ञान विश्लेषण से पता चला है कि, एचआईएफ -1 के लिए, सीकेडी चूहों में, ट्यूबलर शम समूह की तुलना में अधिक मजबूत दाग थे। जेपी उपचार के बाद, गुर्दे के ट्यूबलर में सीकेडी समूह की तुलना में अधिक मजबूत और बड़ा क्षेत्र धुंधला था, जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 5E। HIF -2 ने शाम समूह में वृक्क अंतरालीय में अपेक्षाकृत कमजोर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को सकारात्मक दिखाया। सीकेडी समूह में, एचआईएफ -2 ने इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को सकारात्मक दिखाया। जेपी उपचार के बाद, एचआईएफ -2 ने सीकेडी समूह (छवि 5 एफ) की तुलना में मजबूत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री दिखाई।

अंजीर। 5. जेपी ने ईपीओ अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। (ए) सीरम ईपीओ सामग्री। (बी)गुर्दाईपीओ सापेक्ष एमआरएनए। GAPDH को हाउसकीपिंग जीन माना जाता था। (सी) ईपीओ प्रोटीन अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि संवेदनशील पश्चिमी धब्बा चित्र। (डी) ईपीओ का डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण। (ई) एचआईएफ की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री {{0}}। (एफ) एचआईएफ की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री - 2 -एक्टिन सामग्री के लिए सामान्यीकृत। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियों को समान आवर्धन, 4 0 0 ×, स्केल बार=20 माइक्रोन पर प्रस्तुत किया जाता है। हेमेटोक्सिलिन द्वारा परमाणु नीला धुंधला था और डीएबी की प्रतिरक्षात्मकता भूरी थी, गहरे डीएबी धुंधला का अर्थ है मजबूत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सकारात्मक। लाल तीर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री पॉजिटिव की ओर इशारा करता है। डेटा को ± एसडी, एन=6 प्रति समूह (* पी <0.05 शम="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="" में;="" #="" पी=""><0.05, ##="" पी=""><0.01 सीकेडी="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="" में)="" के="" रूप="" में="" प्रस्तुत="" किया="" गया="">

3.5. जेपी ने एससीएफए जारी करने के लिए प्रेरित किया

मल के नमूनों में आठ एससीएफए की रिहाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक एलसी-एमएस-आधारित लक्षित चयापचय दृष्टिकोण विकसित किया गया था। स्थापित विधि को रैखिकता, संवेदनशीलता, सटीकता, मैट्रिक्स प्रभाव, सटीकता और स्थिरता का आकलन करके मान्य किया गया था। संवेदनशीलता, सटीकता, सटीकता और स्थिरता सत्यापन के लिए निम्न, मध्यम और उच्च एकाग्रता गुणवत्ता नियंत्रण नमूने (एलक्यूसी, क्यूएमसी, एचक्यूसी) मैट्रिक्स मानक वक्र के निम्नतम, मध्यम और उच्चतम एकाग्रता बिंदुओं और परिणामों के अनुसार चुने गए थे। टेबल्स S4-S6 में दिखाए गए थे। विश्लेषण 48 घंटे के लिए 4 C पर स्थिर होने की पुष्टि की गई । SCFA का LC-MS/MS क्रोमैटोग्राम चित्र 6 में दिखाया गया था।

अंजीर। 6. SCFA की UHPLC-MS/MS क्रोमैटोग्राफी। (ए) ऊपरी एससीएफए व्युत्पन्न रासायनिक समीकरण था; dansylhydrazine derivatization के बाद SCFAs संरचनात्मक सूत्र के तहत था; (बी) मिश्रण मानकों और मल नमूने के यूएचपीएलसी/एमआरएम-एमएस क्रोमैटोग्राम, (बी) में क्रोमैटोग्राफिक चोटियों को (ए) में दिखाए गए रासायनिक मार्कर के लिए प्रतिक्रिया दी गई थी: 1। 12C-एसिटिक एसिड; 2. 13C-एसिटिक एसिड (ISTD1); 3. 12C-propanoic एसिड; 4. 13C-propanoic एसिड (ISTD2); 5. 12C-आइसो ब्यूटिरिक एसिड; 6. 12C-ब्यूटिरिक एसिड; 7. 13C-आइसोब्यूट्रिक एसिड (ISTD3); 8. 13C-ब्यूटिरिक एसिड (ISTD4); 9. 12C-2-मिथाइलब्यूट्रिक एसिड; 10. 12C-isovaleric एसिड; 11. 12C वैलेरिक एसिड; 12. 13C-2-मिथाइलब्यूट्रिक एसिड (ISTD5); 13. 13C-isovaleric एसिड (ISTD6); 14. 13C-वैलेरिक एसिड (ISTD7); 15. 12C-हेक्सानोइक एसिड; 16. 13C-हेक्सानोइक एसिड (ISTD8)।

जहां तक ​​मल के नमूने का सवाल है, सीकेडी समूह में, एए और पीए का स्तर एक नकली समूह (पी <0.01) की="" तुलना="" में="" लगभग="" 4="" गुना="" और="" 5="" गुना="" कम="" हो="" गया="" था;="" जबकि="" जेपी="" उपचार="" के="" बाद,="" एए="" और="" पीए="" की="" मात्रा="" को="" शम="" समूह="" (पी=""><{{10}}.01) के="" 4/5="" में="" वापस="" बहाल="" कर="" दिया="" गया="" था।="" इसी="" तरह,="" ba="" और="" va="" के="" स्तर="" में="" लगभग="" 3="" 0="" बार="" और="" सीकेडी="" समूह="" में="" 4="" गुना="" की="" कमी="" आई,="" जबकि="" एक="" दिखावा="" समूह="" (p=""><0.01) की="" तुलना="" में।="" जेपी="" उपचार="" ने="" एक="" बढ़ती="" हुई="" प्रवृत्ति="" दिखाई,="" लेकिन="" कोई="" महत्वपूर्ण="" सुधार="" नहीं="" हुआ।="" iba,="" iva,="" और="" 2-ba="" की="" सामग्री="" में="" ckd="" और="" शम="" समूह="" के="" बीच="" कोई="" उल्लेखनीय="" परिवर्तन="" नहीं="" दिखा।="" जेपी="" उपचार="" के="" बाद,="" आईबीए,="" आईवीए,="" और="" 2-बीए="" स्तर="" बढ़ाया="" गया="" था="" (पी=""><0.01)। हालाँकि,="" ha="" ने="" तीन="" समूहों="" (चित्र="" 7a)="" के="" बीच="" स्पष्ट="" परिवर्तन="" नहीं="" दिखाया।="" इसके="" अलावा,="" गुर्दे="" के="" ऊतकों="" के="" लिए,="" सीकेडी="" समूह="" में,="" आठ="" एससीएफए="" की="" मात्रा="" में="" काफी="" कमी="" आई="" थी="" (पी=""><0.01), जबकि="" जेपी="" उपचार="" के="" बाद,="" बीए="" और="" एचए="" (पी=""><0.01 या="" पी=""><) को="" छोड़कर="" एससीएफए="" के="" स्तर="" में="" वृद्धि="" हुई="" थी।="" 0.5)।="" बीए="" को="" बिना="" महत्वपूर्ण="" रूप="" से="" थोड़ा="" बढ़ा="" दिया="" गया="" था,="" और="" जेपी="" उपचार="" (छवि="" 7="" बी)="" के="" बाद="" एचए="" ने="" बदलाव="" नहीं="">

अंजीर। 7. विभिन्न समूहों में एससीएफए की सामग्री। (ए) फेकल एससीएफए। (बी) किडनी एससीएफए। डेटा को ± SD, n=6 प्रति समूह (**P <0.01 शम="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="" में;="" ##p="">< 0="" के="" रूप="" में="" प्रस्तुत="" किया="" गया="" था।="" 01,="" #p=""><0.05 सीकेडी="" समूह="" के="" साथ="" तुलना="">

4। चर्चा

वर्तमान 5/6 नेफरेक्टोमी सीकेडी चूहा मॉडल में,गुर्दासमारोहसंकेतक (स्क्रैच, बीयूएन, और मूत्र प्रोटीन) में काफी वृद्धि हुई थी, अवशेष वृक्क अतिवृद्धि और गुर्दे की रोग संबंधी चोट दिखाई दी, साथ में हेमटोलॉजिकल पैरामीटर बदल गए। ये डेटा पिछले अध्ययनों (गैरिडो एट अल।, 2015, मॉर्टन एंड ग्रिफिथ्स, 1985) के अनुरूप थे। उपरोक्त संकेतकों से पता चला है कि 5/6 नेफरेक्टोमी से प्रेरित सीकेडी-एनीमिया चूहों को सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था और सीकेडी-एनीमिया चूहों के इलाज में जेपी के लाभकारी प्रभाव के लिए सत्यापित किया जा सकता है। साथगुर्दासमारोहएनीमिया को एक ज्ञात अवसरवादी सीकेडी जटिलता के रूप में मान्यता दी गई है, जिसने रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया है (लोकाटेली, फिशबेन, ब्लॉक, और मैकडॉगल, 2017)। गुर्दे की एनीमिया की प्रगति से संबंधित जोखिम कारकों को समझने से चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद मिलेगी। आजकल, रोग और आंत माइक्रोबायोटा चयापचय के बीच की कड़ी ने तेजी से ध्यान आकर्षित किया है, जबकि एससीएफए और गुर्दे की एनीमिया के बीच संबंध अभी भी कम ज्ञात हैं। एससीएफए, मुख्य रूप से क्लोस्ट्रीडियम, कोप्रोकोकस और बैक्टेरॉइड्स (कोह एट अल।, 2016) द्वारा मेटाबोलाइज़ किए गए, विशिष्ट झिल्ली-बाध्य रिसेप्टर्स को लक्षित कर रहे हैं, जो आंत पर्यावरण संतुलन और पूरे शरीर के स्वास्थ्य को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एससीएफए का पहले से ही सीकेडी के साथ एक अविभाज्य संबंध साबित हो चुका है, और सीकेडी (वांग एट अल।, 2019) में एसिटिक एसिड, प्रोपियोनिक एसिड, ब्यूटिरिक एसिड के स्तर को कम कर दिया गया था। एडेनिन-प्रेरित सीकेडी चूहों में, आंत माइक्रोबायोटा बहुतायत और विविधता में महत्वपूर्ण रूप से बदलाव किया गया था, कंपनियों ने प्रोपेनोइक एसिड, ब्यूटिरिक एसिड और वैलेरिक एसिड (लक्ष्मणन, अल, अली, और टेरानेग्रा, 2021) के स्तर को कम कर दिया था। हमारे पिछले अध्ययन के आधार पर, 16S rDNA अनुक्रमण ने दिखाया कि आंत माइक्रोबायोटा डिस्बिओसिस को शम समूह की तुलना में 5/6 नेफरेक्टोमाइज्ड-प्रेरित सीकेडी चूहों में प्रदर्शित किया गया था। क्लोस्ट्रीडियम, कोप्रोकोकस से जेनेरा विशेष रूप से ब्यूटिरिक एसिड का उत्पादन करने वाले कुछ एससीएफए ने सीकेडी चूहों (झेंग एट अल।, 2020) में अंतर प्रदर्शित किया। इसके अनुरूप, हमारे परिणामों से पता चला है कि सीकेडी चूहों में एसिटिक एसिड, प्रोपियोनिक एसिड, ब्यूटिरिक एसिड, वैलेरिक एसिड की मात्रा में लगभग 60 प्रतिशत, 80 प्रतिशत, 85 प्रतिशत और 60 प्रतिशत की कमी आई है, जो दर्शाता है कि, एससीएफए की कमी के अनुरूप है। आंत पर्यावरण असंतुलन के साथ। ध्यान दें, सीकेडी-प्रेरित आंत पर्यावरण विकार ने आंत माइक्रोबायोटा चयापचय असामान्य (फेंग एट अल।, 2019) को ट्रिगर किया। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि, सीकेडी-एनीमिया चूहों में, आठ प्रकार के एससीएफए के स्तर में कमी आई थी। उदाहरण के लिए, चयापचय अंत उत्पादों की असामान्यता, यानी एससीएफए सीकेडी प्रगति के परिणामस्वरूप हो सकती है।

पॉलीसेकेराइड, सक्रिय अवयवों में से एक विभिन्न जड़ी-बूटियों में पाया गया है, जैसे कि डायोस्कोरे राइजोमा, शिसांद्रा चिनेंसिस, एस्ट्रागली रेडिक्स और जुजुबे फ्रुक्टस। पॉलीसेकेराइड को आंत माइक्रोबायोटा द्वारा किण्वित और अवक्रमित किया जा सकता है। नतीजतन, पॉलीसेकेराइड को एससीएफए में मेटाबोलाइज करने के लिए आंत माइक्रोबायोटा के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में प्रस्तुत किया जाता है या एससीएफए उत्पादन (कै एट अल।, 2019) की सुविधा के लिए आंत माइक्रोबायोटा की संरचना को संशोधित करने के लिए एक प्रीबायोटिक जैसा प्रभाव माना जाता है। इस अध्ययन में, हमारे निष्कर्षों से पता चला है कि बेर से पॉलीसेकेराइड ने एससीएफए के आंत माइक्रोबायोटा रिलीज को उत्तेजित किया, जैसे कि एसिटिक एसिड, प्रोपेनोइक एसिड, आइसोब्यूट्रिक एसिड, 2- सीकेडी चूहों में मिथाइल ब्यूटिरिक एसिड। इसके अलावा, जेपी उपचार के बाद, सीकेडी-एनीमिया चूहे के गुर्दे में एससीएफए के स्तर में सुधार हुआ था, और परिवर्तन की प्रवृत्ति मल के नमूने के अनुरूप थी। मौजूदा शोध के आधार पर, एससीएफए और सीकेडी के बीच संबंध धीरे-धीरे स्पष्ट हो गया था। उदाहरण के लिए, एसिटिक एसिड को प्रतिरक्षा प्रणाली को संशोधित करने और तीव्र सुधार करने के लिए सूचित किया गया थागुर्दाचोटटी कोशिकाओं में एनएडीपीएच ऑक्सीडेज सिग्नलिंग को रोककर (अल-हरबी एट अल।, 2018)। प्रोपेनोइक एसिड मुक्त फैटी एसिड रिसेप्टर 2 (FFA2) और FFA3 (मिकामी एट अल।, 2020) के माध्यम से एडेनिन-प्रेरित सीकेडी की प्रगति को रोकने के लिए सिद्ध हुआ है। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि एक रोगग्रस्त किडनी के लिए एससीएफए स्तर फिर से आना फायदेमंद था। यह बताया गया है कि जेपी ने आंत माइक्रोबायोटा विविधता में वृद्धि की और कोलोरेक्टल कैंसर चूहों (जी एट अल।, 2020) में एससीएफए सक्रिय माइक्रोबायोटा (बैक्टेरॉइड्स) के सापेक्ष बहुतायत में वृद्धि की। इसके अलावा, जेपी ने मल के नमूनों में कुल एससीएफए की एकाग्रता में वृद्धि की (जी एट अल।, 2019)। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि जेपी सीकेडी की प्रगति को धीमा करने के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए एससीएफए के उत्पादन को प्रोत्साहित कर सकता है। जेपी सीकेडी में एससीएफए के उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए एससीएफए के प्रमुख माइक्रोबायोटा के लिए एक चयापचय सब्सट्रेट हो सकता है, या आंत के वातावरण को बहाल करने के लिए एक प्रीबायोटिक जैसा घटक हो सकता है, विशेष रूप से एससीएफए प्रमुख माइक्रोबायोटा की विविधता, और आगे एससीएफए की रिहाई को बढ़ावा देता है, ताकि सीकेडी की प्रगति को रोकें।

सामान्य तौर पर, छोटे आणविक भार और उच्च रासायनिक ध्रुवता वाले एससीएफए (6 से कार्बन रहित) का क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण द्वारा सीधे विश्लेषण करना मुश्किल होता है। एससीएफए रणनीति का एक आइसोटोप-लेबल रासायनिक व्युत्पन्नकरण उपकरण संवेदनशीलता में सुधार कर सकता है और विश्लेषण त्रुटियों को कम कर सकता है, जिसने एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण (हिगाशी और ओगावा, 2016) में एससीएफए निर्धारण के लिए एक उपयोगी रणनीति प्रदान की। हाल ही में, कार्बोक्जिलिक एसिड (चेन एंड झांग, 2020) युक्त लक्ष्य मानव प्लाज्मा मेटाबोलाइट्स का पता लगाने में डैनसिल हाइड्राज़िन-लेबल दृष्टिकोणों का संतोषजनक ढंग से उपयोग किया गया है। इसके समर्थन में, इस अध्ययन में, हमने चूहे के मल में 8 एससीएफए के निर्धारण के लिए एलसी-एमएस/एमएस दृष्टिकोण के आधार पर रासायनिक व्युत्पन्नकरण विकसित किया। एससीएफए आंत माइक्रोबायोटा द्वारा निर्मित होते हैं, और लगभग 10 प्रतिशत एससीएफए मल के माध्यम से उत्सर्जित होते हैं (बोएट्स एट अल।, 2015)। इसलिए, एससीएफए का एक मल नमूना विश्लेषण सीधे आंत के वातावरण में परिवर्तन को प्रतिबिंबित कर सकता है और एससीएफए और आंत माइक्रोबायोटा के बीच बहु-ओमिक्स संयुक्त विश्लेषण में अधिक संदर्भित है। विशेष रूप से, अस्थिरता सत्यापन, हमने पाया कि डैनसिल हाइड्राज़िन-लेबल वाले एससीएफए कमरे के तापमान पर अस्थिर थे, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम पर उनकी तीव्रता ने समय के साथ नीचे की प्रवृत्ति दिखाई, लेकिन यह 4 C पर 48 घंटे के लिए स्थिर रह सकता है। इस प्रकार, एससीएफए व्युत्पत्ति के बाद, विश्लेषणों को विश्लेषण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।

उन्नत सीकेडी चरणों 4-5 में, ईपीओ उत्पादन की कमी एरिथ्रोपोएसिस को प्रतिबंधित करती है, जो वृक्क रक्ताल्पता (सकाशिता, तनाका, और नांगकू, 2019) के विकास में सबसे महत्वपूर्ण कारक में योगदान करती है। एनीमिया के लिए एरिथ्रोपोएसिस-उत्तेजक एजेंटों (ईएसए) के साथ नियमित उपचार नैदानिक ​​​​अभ्यास दिशानिर्देशों द्वारा सुझाया गया है। हालांकि, ईएसए की सुरक्षा जो मृत्यु के बढ़ते जोखिम और हृदय संबंधी घटनाओं से जुड़ी है, का संबंध होना चाहिए (थवरजाह और चोई, 2019)। गुर्दे की एनीमिया के रोगियों में, स्वस्थ शरीर (बैबिट एंड लिन, 2012) की तुलना में ईपीओ अभिव्यक्ति सुसंगत या उच्च दृष्टि से होनी चाहिए। प्रारंभिक चरण में, ईपीओ स्तर ने उन्नयन की प्रवृत्ति प्रस्तुत की, जबकि देर से चरण में, ईपीओ स्तर ने प्रारंभिक चरण की तुलना में नीचे की ओर रुझान दिखाया, यहां तक ​​कि सामान्य से भी कम (पंजता, ताहिरोविक, सोफी, ´ कोरी, और डर्विससेवी) सी, 2017)। पिछले प्रयोगों (चेन एट अल।, 2019; वांग एट अल।, 2020) के अनुरूप, हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि सीकेडी-एनीमिया चूहों में सीरम ईपीओ स्तर कम हो गया था। हमने क्रमशः सीकेडी चूहों में किडनी ईपीओ एमआरएनए और प्रोटीन स्तर का पता लगाया, और किडनी ईपीओ प्रोटीन का स्तर शम समूह की तुलना में थोड़ा कम हो गया था, जबकि किडनी ईपीओ एमआरएनए राशि कम हो गई थी और इसकी डिग्री सीरम ईपीओ स्तर से बड़ी थी। किडनी वयस्कों और ईआरएसडी रोगियों में ईपीओ संश्लेषण का प्राथमिक स्रोत है।गुर्देअभी भी एरिथ्रोपोइटिन (बर्नहार्ट एट अल।, 2010) का उत्पादन करने की क्षमता बरकरार रखता है। अंतर्जात सीरम ईपीओ स्तरों को ठीक करने और गुर्दे की एनीमिया के अनुकूल होने के लिए, किडनी ईपीओ उत्पादन सक्रिय किया गया था, हालांकिगुर्दाचोटकम ईपीओ एमआरएनए अभिव्यक्ति (शो ओडेल एंड रैटक्लिफ, 2019)। जेपी उपचार के बाद, सीरम ईपीओ स्तर में वृद्धि हुई, साथ ही किडनी ईपीओ एमआरएनए और प्रोटीन स्तर दोनों को उन्नत किया गया। हमारे पिछले अध्ययन में, जेपी एचआरई ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को उत्तेजित कर सकता है और ईपीओ जीन (चेन एट अल।, 2014) को बढ़ाया है। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि जेपी सीकेडी चूहा सीरम ईपीओ स्तर को विनियमित गुर्दे की एनीमिया में पुनर्प्राप्त कर सकता है, जो कि एमआरएनए स्तर पर उत्तेजित किडनी ईपीओ जीन अभिव्यक्ति द्वारा योगदान दिया जा सकता है।

कोर्टेक्स में, HIF-1 मुख्य रूप से ट्यूबलर में और HIF-2 रीनल इंटरस्टिटियम में पाया जाता है। क्योंकि ईपीओ मुख्य रूप से फाइब्रोब्लास्ट द्वारा निर्मित होता है जिसमें एचआईएफ -2 सह-स्थित होता है, यह समर्थन करता है कि एचआईएफ -2 ईपीओ उत्पादन (मैक्सवेल, 2003) को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हो सकता है। हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि सीकेडी द्वारा एचआईएफ -1 और एचआईएफ -2 को सक्रिय किया जा सकता है, और जेपी उपचार सीकेडी चूहों की तुलना में एचआईएफ -1 और एचआईएफ -2 गतिविधि को उत्तेजित कर सकता है। . यह साबित हो गया था कि एचआईएफ -2 की ईपीओ उत्पादन (कपिट्सिनो एट अल।, 2010) के नियमन में एक प्रमुख भूमिका है, जबकि एचआईएफ -1 अपग्रेडेशन गुर्दे में गुर्दे की सुरक्षा प्रभाव निभा सकता है (जियांग एट) अल।, 2020), जो अप्रत्यक्ष रूप से ईपीओ उत्पादन में सुधार करता है। किडनी ईपीओ उत्पादन को पहले एमआरएनए स्तर पर विनियमित किया गया था, एनीमिया या हाइपोक्सिया के तहत, एचआईएफ प्रोटीन उत्तेजना द्वारा ईपीओ एमआरएनए अभिव्यक्ति को बढ़ाया जा सकता है। पहले, औषधीय अनुसंधान से पता चला है कि बेर ने सेलुलर मॉडल (चेन एट अल।, 2014, लैम एट अल।, 2016) में एचआईएफ-प्रोटीन स्तर के विनियमन के माध्यम से ईपीओ अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि जेपी गुर्दे की एनीमिया को कम करने के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए एचआईएफ-प्रोटीन के माध्यम से ईपीओ एमआरएनए अभिव्यक्ति को अपग्रेड कर सकता है।

इसके अलावा, वर्तमान परिणामों के आधार पर, हम अनुमान लगाते हैं कि एससीएफए में कमी की एचआईएफ-मध्यस्थता ईपीओ अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है, जो सीकेडी-एनीमिया में योगदान करती है। इसके विपरीत, यह दिखाया गया है कि एसिटिक एसिड का बढ़ा हुआ स्तर एचआईएफ -2 एसिटिलीकरण और सीआरईबी-बाइंडिंग प्रोटीन-एचआईएफ 2 जटिल पीढ़ी के लिए फायदेमंद था, और आगे ईपीओ अभिव्यक्ति को प्रेरित किया (जू एट अल।, 2014)। प्रोपियोनिक एसिड ने एचआईएफ -1 / ईआरके मार्ग (चेंग एट अल।, 2019) के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल व्यवधान, हिप्पोकैम्पस एपोप्टोसिस और न्यूरोलॉजिकल घाटे को कम किया। इसके अतिरिक्त, ब्यूटिरिक एसिड को एचआईएफ -1, कोलन सेल पर सक्रिय एचआईएफ लक्ष्य जीन को स्थिर करने और बृहदान्त्र सूजन प्रतिक्रिया को कम करने के लिए पाया गया था (केली एट अल।, 2015)। हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि एचआईएफ-प्रोटीन असामान्य अभिव्यक्ति सीकेडी चूहों के साथ एसिटिक एसिड, प्रोपेनोइक एसिड और ब्यूटिरिक एसिड के स्तर में काफी कमी आई थी, जिसने संकेत दिया कि एचआईएफ- की स्थिरता एससीएफए में कमी से संबंधित हो सकती है, और एससीएफए हो सकता है ईपीओ अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एचआईएफ को स्थिर करने का प्रभाव।

5। निष्कर्ष

निष्कर्ष में, हमने साबित किया कि जेपी ने सीकेडी और उससे जुड़े एनीमिया में सुधार किया, जिसका तंत्र एससीएफए रिलीज और ईपीओ उत्पादन के नियमन में शामिल था। और जेपी एनीमिया के इलाज के लिए बेर का जैव सक्रिय घटक हो सकता है। ये निष्कर्ष सीकेडी से जुड़े एनीमिया के इलाज के लिए खाद्य पूरक के रूप में जेपी के आगे विकास के लिए सबूत प्रदान कर सकते हैं।

नैतिक कथन

हमारे शोध में सभी पशु प्रयोगों को चीनी चिकित्सा के गुआंगज़ौ विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थान (एनआईएच प्रकाशन संख्या 80-23, के अनुसार आयोजित किया गया था। संशोधित 1996)। हमारे शोध में उपरोक्त दिशानिर्देशों का कोई उल्लंघन नहीं है।

स्वीकृतियाँ

यह काम ग्वांगडोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2018A030313305), चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81804052, 81973577, और 82004248), शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (JSGG20191129102216637 और ZDSYS201606081515458), ग्वांगडोंग प्रांत के पारंपरिक चीनी चिकित्सा ब्यूरो द्वारा समर्थित है। 20201320)।

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