TLR9 सक्रियण APRIL- और IL-6 के माध्यम से IgA नेफ्रोपैथी में Aberrant IgA ग्लाइकोसिलेशन को प्रेरित करता है।

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युको मकिता 1, हितोशी सुजुकी 1, तोशिकी कानो 1, अकीको ताकाहाता 1, ब्रूस ए जूलियन 2, 3, जान नोवाक 3 और युसुके सुजुकी 1

कीवर्ड: अप्रैल; गैलेक्टोज की कमी वाले IgA1; आईजीए नेफ्रोपैथी; आईएल-6; प्रतिरक्षा परिसर

गैलेक्टोज की कमी वाले IgA1 (Gd-IgA1) किसके विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं?आईजीए नेफ्रोपैथी(इगन)। हालाँकि, Gd-IgA1 उत्पादन को चलाने वाले रोगजनक तंत्र को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। टोल-जैसे रिसेप्टर 9 (TLR9) के माध्यम से जन्मजात-प्रतिरक्षा सक्रियण Gd-IgA1 उत्पादन में शामिल होने के लिए जाना जाता है। एक प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL) और IL-6 भी IgAN में Gd-IgA1 संश्लेषण को बढ़ाने के लिए जाने जाते हैं। इसे पृष्ठभूमि के रूप में, हमने जांच की कि कैसे IgA स्रावित कोशिकाओं में TLR9 सक्रियण के परिणामस्वरूप IgAN-प्रवण ddY माउस में और मानव IgA 1- स्रावित कोशिकाओं में नेफ्रिटोजेनिक IgA का अतिउत्पादन होता है। TLR9 लिगैंड CpG-ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के इंजेक्शन ने ddY चूहों में अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA प्रतिरक्षा परिसरों के उत्पादन में वृद्धि की, जो बदले में, तेज हो गएगुर्दे की चोट. CpG-ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-उत्तेजित चूहों ने APRIL के सीरम स्तर को ऊंचा कर दिया था जो कि अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA प्रतिरक्षा परिसरों के साथ सहसंबद्ध थे। कृत्रिम परिवेशीय,TLR9 सक्रियणनेफ्रिटोजेनिक IgA के साथ-साथ APRIL और IL-6 के उत्पादन को ddY चूहों के स्प्लेनोसाइट्स और मानव IgA1-स्रावित कोशिकाओं में बढ़ाया। हालाँकि, APRIL के siRNA नॉक-डाउन ने IL -6 से प्रेरित Gd-IgA1 के अतिउत्पादन को पूरी तरह से दबा दिया। आईएल के न्यूट्रलाइजेशन -6 ने Gd-IgA1 के CpG-ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-प्रेरित अतिउत्पादन को कम कर दिया। इसके अलावा, एपीआरआईएल और आईएल -6 प्रत्येक स्वतंत्र रूप से टीएलआर की मध्यस्थता करते हैं 9- जीडी-आईजीए 1 के अधिक उत्पादन को प्रेरित करते हैं। इस प्रकार, TLR9 सक्रियण ने अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के संश्लेषण को बढ़ाया, जो कि IgAN के एक माउस मॉडल में, गुर्दे की चोट को और बढ़ा देता है। इसलिए, APRIL और IL-6 सहक्रियात्मक रूप से, साथ ही स्वतंत्र रूप से, Gd-IgA1 के संश्लेषण को बढ़ाते हैं।

अनुवाद संबंधी वक्तव्य

गैलेक्टोज की कमी वाले IgA1 को लक्षित करने वाली रोग-विशिष्ट चिकित्सा भविष्य के उपचार का गठन कर सकती हैआईजीए नेफ्रोपैथी. इस अध्ययन के परिणाम, जो अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के अतिउत्पादन में एक प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL) और इंटरल्यूकिन -6 (IL -6) की भागीदारी का प्रदर्शन करते हैं, APRIL और IL को लक्षित करने के औचित्य का समर्थन करते हैं। {3}} IgA नेफ्रोपैथी (IgAN) में। वास्तव में, हाल ही के एक अध्ययन ने murine IgAN,1 में एंटी-APRIL मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के सकारात्मक प्रभावों का प्रदर्शन किया और APRIL एंटीबॉडी को बेअसर करने वाला एक नैदानिक ​​अध्ययन वर्तमान में IgAN के रोगियों में चल रहा है।

IgA नेफ्रोपैथी (IgAN), सबसे आम प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस, 2 इस बीमारी की शुरुआत के बाद 20 वर्षों के भीतर 20 प्रतिशत से 40 प्रतिशत रोगियों में अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी का कारण बनता है। 3 हालांकि IgAN का रोगजनन पूरी तरह से स्पष्ट, प्रासंगिक है ऊपरी श्वसन पथ के संक्रमण के साथ समवर्ती मैक्रोस्कोपिक हेमट्यूरिया से पता चलता है कि म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रणाली IgAN.4 की नैदानिक ​​​​अभिव्यक्तियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

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IgA का एबरेंट ग्लाइकोसिलेशनIgAN के रोगजनन में केंद्रीय है। IgAN वाले रोगियों में Glomerular IgA IgA1 उपवर्ग तक ही सीमित है और उन अणुओं के लिए समृद्ध है जिनमें गैलेक्टोज (गैलेक्टोज-कमी वाले IgA1 [Gd-IgA1]) में कुछ हिंज-क्षेत्र O-ग्लाइकेन्स की कमी है। इसके अलावा, Gd का सीरम स्तर -IgA1 और IgA1-युक्तप्रतिरक्षा परिसरों(ICs) Gd-IgA1- विशिष्ट स्वप्रतिपिंडों के साथ IgAN.7–9 के रोगियों में ऊंचा हो जाता है हालांकि, Gd-IgA1 के उत्पादन के तंत्र को अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है।

हमने इस अध्ययन में IgAN-prone ddY माउस मॉडल का उपयोग किया। ddY चूहों में IgAN.10 के साथ मनुष्यों की नकल करते हुए ग्लोमेरुलर चोटें विकसित होती हैं, हालांकि चूहों में मानव IgA1, मानव IgAN के लिए विशिष्ट O-ग्लाइकेन्स वाले IgA अणु नहीं होते हैं और यह IgAN-प्रवण ddY माउस मॉडल कुछ रोग-विशिष्ट विशेषताओं को साझा करते हैं, जैसे सीरम ऊंचाई अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA IC.6,11 वास्तव में, b1 की कमी के कारण असामान्य IgA ग्लाइकोसिलेशन, 4-N-ग्लाइकेन्स का गैलेक्टोसिलेशन उच्च आणविक भार के सीरम स्तर के बढ़ने के कारण murine IgAN को प्रेरित करता है। IgA और IgA युक्त IC उनके बाद के वृक्क जमाव और ग्लोमेरुलर चोट के साथ। 12 ddY चूहे ग्लोमेरुली में IgA और C3 के सह-बयान के साथ प्रोटीनुरिया और मेसेंजियल प्रोलिफ़ेरेटिव ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस दिखाते हैं। एक जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन ने ddY चूहों में IgAN की प्रगति से जुड़े उम्मीदवार लोकी की पहचान की। लोकी में कार्यात्मक रूप से मानव IgAN से जुड़े लोगों के समान जीन शामिल हैं। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ddY चूहों और मनुष्यों में IgAN प्रभावित हो सकता है। कम से कम उसी संवेदनशीलता जीन द्वारा भाग में। यद्यपि murine IgA और मानव IgA1 की आणविक विशेषताएं भिन्न होती हैं, अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA बहुलक IgA और IgG-IgA IC बनाने की प्रवृत्ति रखता है जो बाद में IgAN के ddY murine मॉडल के साथ-साथ मानव IgAN में गुर्दे की चोट की प्रगति को बढ़ाता है। इस प्रकार ddY चूहों के मॉडल में मानव IgAN के साथ कुछ सामान्य विशेषताएं हैं और IgAN की विभिन्न रोगजनक विशेषताओं के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में प्रमुख अणु होते हैं और उन्हें आईजीएएन के रोगजनन में फंसाया गया है। 16–20 रोगजनकों से प्राप्त बहिर्जात प्रतिजन टीएलआर को सक्रिय करते हैं 9- MyD88 सिग्नलिंग मार्ग। 21 यह प्रक्रिया निम्न की ओर ले जाती है इन्फ्लैमेटरी साइटोकिन्स के संश्लेषण में काफी वृद्धि हुई है, जैसे कि टाइप 1 इंटरफेरॉन और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6)। 22 हाल ही में हमने दिखाया कि टीएलआर 9 सक्रियण बढ़ गयागुर्दे की चोटIgAN-प्रवण ddY चूहों में, IgA और IgG-IgA IC के सीरम स्तर की ऊंचाई के साथ। इसके अलावा, विशिष्ट TLR9 बहुरूपता IgAN के साथ रोगियों में रोग की प्रगति से जुड़े हैं। ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए और आईएल के सीरम स्तर। 6}} IgAN.23 के रोगियों में बढ़े हुए हैं इसके अलावा, IL-6 और IL-4 IgA1 के उत्पादन को बढ़ाते हैं और गैलेक्टोज की कमी की डिग्री को बढ़ाते हैं, IgA द्वारा Gd-IgA1 संश्लेषण को बढ़ाते हैं{{13} }IgAN.24 के रोगियों से सेल लाइनों को स्रावित करना ये निष्कर्ष बताते हैं कि IL-6 इस प्रक्रिया का एक प्रमुख मध्यस्थ हो सकता है।24,25।

ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर लिगैंड सुपरफैमिली मेंबर 13 (TNFSF13) का जीन एक प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL) को एनकोड करता है जो बी कोशिकाओं की परिपक्वता और अस्तित्व के लिए एक केंद्रीय साइटोकाइन है। 26 अप्रैल कुछ सिग्नलिंग रिसेप्टर्स को बी-सेल विकास के लिए दूसरे के साथ साझा करता है। TNF सुपरफैमिली लिगैंड, बी-सेल एक्टिवेटिंग फैक्टर (BAFF)। BAFF भी B कोशिकाओं की आत्मीयता परिपक्वता में शामिल है। एक जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन ने TNFSF13 को IgAN से जुड़े उम्मीदवार जीनों में से एक के रूप में पहचाना।

लिगैंड CpG oligodeoxynucleotides (ODN) द्वारा TLR9 सक्रियण के माध्यम से अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के अतिउत्पादन में शामिल अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हमने IgAN-prone ddY चूहों और मानव IgA1-स्रावित कोशिकाओं का उपयोग किया।

परिणाम

TLR9 के सक्रियण ने नेफ्रिटोजेनिक IgA के उत्पादन में वृद्धि के माध्यम से ddY चूहों में गुर्दे की चोट को बढ़ा दिया

TLR9 को संबंधित लिगेंड्स द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जैसे कि CpG-ODN। IgAN के एक murine मॉडल में TLR9 सक्रियण के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने IgAN-prone ddY चूहों में लिगैंड के एक इंजेक्शन का उपयोग किया। CpG-ODN के साथ इंजेक्ट किए गए चूहे ने मेसेंजियल प्रसार और बाह्य मैट्रिक्स विस्तार (चित्रा 1 ए) विकसित किया। CpG-ODN के साथ इंजेक्शन चूहों में mesangial प्रसार और mesangial मैट्रिक्स विस्तार के आधार पर वृक्क हिस्टोलॉजिक स्कोर नियंत्रण चूहों (P <0। 01;="" चित्र="" 1a)="" की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" थे।="" cpg-odn="" के="" इंजेक्शन="" वाले="" चूहों="" में="" मूत्र="" संबंधी="" एल्ब्यूमिन="" का="" स्तर="" नियंत्रण="" चूहों="" (p=""><0.{{20}}1; चित्र="" 1a)="" की="" तुलना="" में="" काफी="" ऊंचा="" था।="" केवल="" cpg-odn="" के="" इंजेक्शन="" वाले="" चूहों="" ने="" iga,="" igg,="" और="" पूरक="" c3="" (चित्र="" 1b)="" के="" मेसेंजियल="" जमा="" विकसित="" किए।="" cpg-odn="" के="" इंजेक्शन="" वाले="" चूहे="" ने="" iga="" (p=""><0.01) और="" igg="" (p=""><0.01) के="" सीरम="" स्तर="" को="" नियंत्रित="" चूहों="" (चित्र="" 1c)="" की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" दिखाया।="" cpg-odn="" चूहों="" के="" साथ="" इंजेक्शन="" चूहों="" से="" सीरम="" iga="" में="" रिकिनस="" कम्युनिस="" एग्लूटीनिन-i="" (rca-i)="" और="" सांबुकस="" नाइग्रा="" एग्लूटीनिन="" लेक्टिन="" के="" साथ="" नियंत्रण="" चूहों="" (चित्र="" 1c)="" की="" तुलना="" में="" कम="" प्रतिक्रियाशीलता="" थी,="" जो="" n="" पर="" गैलेक्टोज="" और="" सियालिक="" एसिड="" की="" कम="" सामग्री="" को="" दर्शाता="" है।="" murine="" iga="" के="" -ग्लाइकान।="" इसके="" अलावा,="" cpg-odn="" के="" इंजेक्शन="" वाले="" चूहों="" में="" igg-iga="" ic="" का="" सीरम="" स्तर="" नियंत्रण="" चूहों="" (p=""><0.05; चित्र="" 1c)="" की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" था।="" इन="" निष्कर्षों="" ने="" संकेत="" दिया="">TLR9 सक्रियणCpG-ODN के परिणामस्वरूप अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA IC का अत्यधिक उत्पादन हुआ, जिससेप्रतिरक्षा-जटिलबयान और गुर्दे की चोट।

CpG-ODN प्रतिक्रियाओं में B कोशिकाएँ और वृक्ष के समान कोशिकाएँ शामिल थीं

हमने जांच की कि कौन से सेल प्रकार CpG-ODN के जवाब में अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के अतिउत्पादन को शामिल करने में शामिल हैं। B कोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) को क्रमशः FL प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई द्वारा एंटी-माउस CD19 और CD11c एंटीबॉडी का उपयोग करके ddY चूहों के तिल्ली से अलग किया गया था। पृथक बी कोशिकाओं के सीपीजी-ओडीएन उत्तेजना ने आईजीए के अतिउत्पादन को प्रेरित किया। इसके अलावा, CpG-ODN ने IgA उत्पादन में काफी वृद्धि की, जब B कोशिकाओं को DC (सप्लीमेंट्री फिगर S1) के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि CpG-ODN ने सीधे B कोशिकाओं को सक्रिय किया और DCS ने TLR9 सक्रियण पर IgA उत्पादन को और बढ़ाया।

एपीआरआईएल के अत्यधिक उत्पादन ने अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए और आईजीजी-आईजीए आईसी के संश्लेषण को बढ़ाया

हमने मूल्यांकन किया कि क्या APRIL और / या BAFF TLR9 सक्रियण से प्रेरित नेफ्रिटोजेनिक IgA के संश्लेषण में शामिल थे। DdY चूहों में CpG-ODN का इंजेक्शन APRIL और BAFF (चित्र 2a) के सीरम स्तर को काफी बढ़ा देता है। स्प्लेनोसाइट्स में एपीआरआईएल का अभिव्यक्ति स्तर अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के उत्पादन और आईजीजी-आईजीए आईसी (चित्रा 2 बी) के गठन के साथ सहसंबद्ध है। स्प्लेनोसाइट्स में BAFF का अभिव्यक्ति स्तर अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के उत्पादन के साथ सहसंबद्ध है, लेकिन IgG-IgA IC (चित्र 2b) के गठन के साथ नहीं। इसके अलावा, APRIL का सीरम स्तर, लेकिन BAFF नहीं, CpG-ODN-इंजेक्टेड चूहों (चित्र 2c) में अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA IC के ऊंचे सीरम स्तर के साथ सहसंबद्ध है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि APRIL और BAFF दोनों अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के उत्पादन में शामिल हो सकते हैं, हालाँकि APRIL IgG-IgA IC के उत्पादन में अधिक शामिल हो सकता है।

चित्र 1|CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) नेफ्रिटोजेनिक IgA का उत्तेजना-प्रेरित उत्पादन। CpG-ODN के साथ इंजेक्शन ने अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA इम्यून कॉम्प्लेक्स (IC) के रक्त स्तर को बढ़ा दिया और ddY चूहों में गुर्दे की चोट को बढ़ा दिया। (ए) डीडीवाई चूहों के विकास से पहलेआईजीए नेफ्रोपैथी(IgAN) को 12 सप्ताह के लिए साप्ताहिक रूप से तीन बार CpG-ODN के साथ आईपी इंजेक्ट किया गया। ग्लोमेरुलर घावों के एक हिस्टोलॉजिक विश्लेषण में, CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों ने मेसेंजियल सेल प्रसार और बाह्य मैट्रिक्स विस्तार दिखाया। दायां पैनल अर्ध-मात्रात्मक स्कोरिंग द्वारा गुर्दे की चोटों के मूल्यांकन को दर्शाता है। उपरोक्त घावों के साथ ग्लोमेरुली के प्रतिशत द्वारा मूल्यांकन किए गए गुर्दे के हिस्टोलॉजिक स्कोर से पता चला है कि CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों में गुर्दे की चोट तेज हो गई थी। CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों में मूत्र संबंधी एल्ब्यूमिन का स्तर नियंत्रण चूहों की तुलना में काफी बढ़ा हुआ था। नीचे के पैनल में बार्स मतलब ± SEM। (बी) ग्लोमेरुलर आईजीए, आईजीजी, और सी 3 जमा का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण। केवल CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों ने IgA, IgG, और C3 के मेसेंजियल जमा विकसित किए। (सी) 12 सप्ताह के लिए सीपीजी-ओडीएन उपचार के बाद आईजीए, आईजीजी, और आईजीजी-आईजीए आईसी के सीरम स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों में सीरम IgA ने नियंत्रण चूहों में IgA की तुलना में रिकिनस कम्युनिस एग्लूटीनिन-I (RCA-I) और सांबुकस नाइग्रा एग्लूटीनिन (SNA) लेक्टिन के साथ काफी कम प्रतिक्रियाशीलता दिखाई। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि CpG-ODN के इंजेक्शन ने अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के सीरम स्तर को बढ़ा दिया। व्यक्तिगत अंक दिखाए गए हैं। *पी < 0.05,="" **पी=""><0.01. आयुध="" डिपो,="" ऑप्टिकल="" घनत्व।="" इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" पर="">

चित्र 2|CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) के इंजेक्शन वाले चूहों में एक प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL) और अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के अतिउत्पादन के बीच संबंध। (ए) CpG-ODN के साथ ddY चूहों के इंजेक्शन से B-सेल एक्टिवेटिंग फैक्टर (BAFF) और APRIL के सीरम स्तर में वृद्धि हुई। (बी) पूरे स्प्लेनोसाइट्स में बीएएफएफ की अभिव्यक्ति का स्तर रिकिनस कम्युनिस एग्लूटीनिन-आई (आरसीए-आई) लेक्टिन के साथ कम प्रतिक्रियाशीलता के साथ सहसंबद्ध है, लेकिन आईजीजी-आईजीए प्रतिरक्षा परिसर (आईसी) के गठन के साथ संबंध नहीं था। इस बीच, एपीआरआईएल के अभिव्यक्ति स्तर अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के उत्पादन और आईजीजी-आईजीए आईसी के गठन से जुड़े थे। ( c ) CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों में, APRIL का सीरम स्तर RCA-I लेक्टिन के साथ IgA की कम प्रतिक्रियाशीलता और IgG-IgA IC के ऊंचे स्तर से जुड़ा था। BAFF का सीरम स्तर ग्लाइकोसिलेटेड IgA के उत्पादन और IgG-IgA IC के गठन से संबंधित नहीं था। बार्स माध्य - SEM। *पी < 0.05.="" आयुध="" डिपो,="" ऑप्टिकल="">

IL-6 अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA का उत्पादन प्रेरित करता है

CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों में IL {{0}} का सीरम स्तर नियंत्रण चूहों (P <0.05; चित्र="" 3a)="" की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" था।="" igan-प्रवण="" ddy="" चूहों="" के="" स्प्लेनोसाइट्स="" का="" उपयोग="" करते="" हुए,="" हमने="" जांच="" की="" कि="" क्या="" tlr="" 9-="" प्रेरित="" सेलुलर="" सक्रियण="" और="" अचानक="" ग्लाइकोसिलेटेड="" iga="" के="" अतिउत्पादन="" की="" मध्यस्थता="" il="" -6="" द्वारा="" की="" गई="" थी।="" cpg-odn="" उत्तेजना="" ने="" इन="" विट्रो="" में="" स्प्लेनोसाइट्स="" द्वारा="" il-6="" के="" उत्पादन="" को="" बढ़ाया।="" स्प्लेनोसाइट्स="" के="" संस्कृति="" माध्यम="" में="" आईएल="" -6="" के="" अतिरिक्त="" आईजीए="" उत्पादन="" में="" वृद्धि="" हुई।="" इसके="" अलावा,="" il="" -6="" ने="" अचानक="" ग्लाइकोसिलेटेड="" iga="" के="" संश्लेषण="" और="" igg-iga="" ic="" के="" गठन="" को="" बढ़ाया="" और="" april="" उत्पादन="" (चित्र="" 3a)="" में="" वृद्धि="" की।="" आईएल="" -6="" -="" न्यूट्रलाइज़िंग="" एंटीबॉडी="" ने="" cpg-odn-="" प्रेरित="" कुल="" iga,="" अचानक="" ग्लाइकोसिलेटेड="" iga="" उत्पादन,="" और="" igg-iga="" ic="" गठन="" (चित्र="" 3b)="" को="" कम="" कर="" दिया।="" इन="" निष्कर्षों="" से="" संकेत="" मिलता="" है="" कि="" tlr9="" सक्रियण="" की="" मध्यस्थता,="" कम="" से="" कम="" आंशिक="" रूप="" से,="" il="" -="" 6="" द्वारा="" की="" गई="" थी।="" इसके="" अलावा,="" एक="" अन्य="" tlr9-मध्यस्थ="" मार्ग="" (ओं)="" अचानक="" ग्लाइकोसिलेटेड="" iga="" के="" उत्पादन="" में="" शामिल="" हो="" सकता="">

सिस्टैंचेबेहतर हो सकता हैगुर्दासमारोह

APRIL और IL-6 मानव IgA में Gd-IgA1 का संवर्धित संश्लेषण1- स्रावित करने वाली कोशिकाएं

हमने आगे परीक्षण किया कि क्या APRIL और IL-6 प्रमुख मध्यस्थों के लिए सामान्य हैं जो मानव IgA1-स्रावित कोशिकाओं में नेफ्रिटोजेनिक IgA के उत्पादन को बढ़ाते हैं। CpG-ODN अनुपूरण ने IL-6 की वृद्धि, APRIL की अभिव्यक्ति, APRIL प्रोटीन के उत्पादन और IgA और Gd-IgA1 (चित्र 4a) के उत्पादन को बढ़ाया। IL-6 के साथ उत्तेजना और अप्रैल के साथ IgA और Gd-IgA1 (चित्र 4b, c) के उत्पादन में वृद्धि हुई। IgA और Gd-IgA1 के उत्पादन पर CpG-ODN उत्तेजना के प्रभाव को आंशिक रूप से IL -6- एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने (चित्र 4d) द्वारा कम किया गया था। इसके अलावा, APRIL छोटा, हस्तक्षेप करने वाला (si) RNA नॉकडाउन ने IL -6 उत्तेजना (चित्र 4b) से प्रेरित IgA और Gd-IgA1 के उत्पादन को भी कम कर दिया, यह दर्शाता है कि APRIL और IL -6 सहक्रियात्मक रूप से Gd की पीढ़ी को बढ़ावा देते हैं। -आईजीए1.

बहस

मानव IgAN में Mesangial IgA IgA1 उपवर्ग से अलग है जो असामान्य O-ग्लाइकोसिलेशन प्रदर्शित करता है। 29,30 मानव IgA1 में O-ग्लाइकेन्स के साथ एक हिंज क्षेत्र होता है जो murine IgA से अनुपस्थित होता है। हालांकि, N-ग्लाइकेन्स का असामान्य ग्लाइकोसिलेशन ddY चूहों में IgAN के एक murine मॉडल के रोगजनन में शामिल होता है, जिसमें एक अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgA युक्त IC.11,12 का उन्नयन O- या N-ग्लाइकेन्स में IgA कार्बोहाइड्रेट के एबरैंट संशोधन नेफ्रिटोजेनिक IgA युक्त IC के विशिष्ट गुण हैं।

कई अध्ययनों ने IgAN की प्रगति में TLR9 सक्रियण दिखाया है। 17-19 वर्तमान अध्ययन में, हमने दिखाया है कि ddY चूहों में CpG-ODN के आईपी इंजेक्शन द्वारा TLR9 की सक्रियता ग्लोमेरुलर IgA और IgG जमा के साथ गुर्दे की चोटों को बढ़ाती है, संभवतः क्योंकि अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA IC के सीरम स्तर में वृद्धि। इसके अलावा, हमने दिखाया कि TLR9 सक्रियण मानव IgA 1- सेल लाइनों को स्रावित करने में Gd-IgA1 के संश्लेषण में शामिल था।

चित्र 3|ddY चूहों के सुसंस्कृत स्प्लेनोसाइट्स पर CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) और इंटरल्यूकिन (IL)-6 का प्रभाव। ( ए ) CpG-ODN के इंजेक्शन वाले चूहों में IL -6 का सीरम स्तर नियंत्रण चूहों की तुलना में काफी अधिक था। CpG-ODN उत्तेजना ने संस्कृति में ddY चूहों के स्प्लेनोसाइट्स के IL -6 के उत्पादन में वृद्धि की। पुनः संयोजक IL-6 के साथ ddY चूहों के स्प्लेनोसाइट्स के ऊष्मायन ने कुल IgA और अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के उत्पादन में वृद्धि की, जिसके परिणामस्वरूप IgG-IgA प्रतिरक्षा परिसर (IC) का निर्माण हुआ। पुनः संयोजक IL-6 ने प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL) के अतिउत्पादन को बढ़ा दिया। (बी) संस्कृति में स्प्लेनोसाइट्स आईएल -6 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सीपीजी-ओडीएन से प्रेरित थे - एंटीबॉडी को निष्क्रिय करना। एंटी-आईएल -6 एंटीबॉडी ने कुल आईजीए और अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के उत्पादन को कम कर दिया और इसके परिणामस्वरूप, सीपीजी-ओडीएन द्वारा प्रेरित आईजीजी-आईजीए आईसी के गठन को कम कर दिया। बार्स मतलब ± SEM। * पी < 0।="" 0="" 5,="" **="" पी=""><0.01। आयुध="" डिपो,="" ऑप्टिकल="" घनत्व;="" पीबीएस,="" फॉस्फेट-बफर="" खारा="" समाधान;="" आरसीए-i,="" रिकिनस="" कम्युनिस="" एग्लूटीनिन-i;="" एसएनए,="" सांबुकस="" नाइग्रा="">

चित्र 4|मानव IgA पर CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) या एक प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL) पूरकता का प्रभाव1-IgA1, गैलेक्टोज-कमी वाले IgA1 (Gd-IgA1), और इंटरल्यूकिन (IL) पर सेल लाइनों को स्रावित करना {{ 9}} उत्पादन। (ए) सीपीजी-ओडीएन पूरकता ने आईएल के उत्पादन को बढ़ाया -6। CpG-ODN ने APRIL की जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाया। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि CpG-ODN ने APRIL के प्रोटीन स्तर को बढ़ा दिया। परिणामों का मूल्यांकन घनत्वमितीय रूप से किया गया। CpG-ODN के साथ उत्तेजना ने IgA और Gd-IgA1 के उत्पादन को प्रेरित किया। (बी) एपीआरआईएल छोटा, दखल देने वाला आरएनए (siRNA) नॉकडाउन ने IL-6 को कम कर दिया - IgA और Gd-IgA1 का अतिउत्पादन। (c) IgA{{2{{30}}}}पुनः संयोजक APRIL से प्रेरित कोशिकाओं का निर्माण करने से अधिक IgA और Gd-IgA1 उत्पन्न हुए। ( d ) IgA 1- स्रावी कोशिकाओं को CpG-ODN उत्तेजना के बाद एंटी-आईएल -6 एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया। CpG-ODN द्वारा प्रेरित IgA और Gd-IgA1 का बढ़ा हुआ उत्पादन एंटी-IL -6 एंटीबॉडी और APRIL के siRNA नॉकडाउन द्वारा कम किया गया था। बार्स मतलब ± SEM। * पी <0.05, **="" पी=""><0.01। gadph,="" ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट="" डिहाइड्रोजनेज;="" पीबीएस,="" फॉस्फेट-बफर="" खारा="">

हमने उस तंत्र का आकलन किया जिसके द्वारा टीएलआर 9 सक्रियण ने अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के बढ़े हुए उत्पादन की मध्यस्थता की। BAFF और APRIL को बी-सेल अस्तित्व और भेदभाव में उनकी भूमिका के लिए जाना जाता है। मैकार्थी एट अल। 33 ने प्रदर्शित किया कि बीएएफएफ-ओवरएक्सप्रेसिंग ट्रांसजेनिक चूहों में गुर्दे की चोट और मूत्र संबंधी असामान्यताओं के साथ मेसेंजियल आईजीए जमा विकसित होता है। हाल ही में हमने दिखाया कि एपीआरआईएल की जीन अभिव्यक्ति आईजीएएन के रोगियों के टॉन्सिलर जर्मिनल केंद्रों में बढ़ जाती है। इसके अलावा, टॉन्सिलर जर्मिनल केंद्रों में APRIL की अधिकता Gd-IgA1 के सीरम स्तर और IgAN के रोगियों में रोग की गंभीरता के साथ सहसंबद्ध है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि BAFF और APRIL दोनों IgAN के रोगजनन में शामिल हो सकते हैं। हालाँकि, BAFF/APRIL और TLR9 सक्रियण के बीच संबंध स्पष्ट नहीं है। वर्तमान अध्ययन में, TLR9 सक्रियण ने APRIL की जीन अभिव्यक्ति और सीरम स्तर में वृद्धि की। अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA का सीरम स्तर स्प्लेनोसाइट्स में BAFF और APRIL के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ सहसंबद्ध है। हालाँकि, IgG-IgA IC का सीरम स्तर APRIL के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ सहसंबद्ध है, लेकिन BAFF नहीं। इसके अलावा, एपीआरआईएल का सीरम स्तर टीएलआर 9- सक्रिय चूहों में अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए और आईजीजी-आईजीए आईसी के अतिउत्पादन से जुड़ा था। IgA1-स्रावित कोशिकाओं में, TLR9 सक्रियण ने APRIL के माध्यम से Gd-IgA1 के अति-उत्पादन को भी प्रेरित किया। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि एपीआरआईएल नेफ्रिटोजेनिक आईजीए के टीएलआर 9- प्रेरित अतिउत्पादन और आईजीजी-आईजीए आईसी के गठन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

बी और टी कोशिकाओं और डीसी की भूमिका निर्धारित करने के लिए सेल प्रकार द्वारा प्रतिक्रिया को स्पष्ट किया जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन में, हमने बी कोशिकाओं और प्लास्मेसीटॉइड डीसी की भूमिका का आकलन किया। TLR9 को DC, B कोशिकाओं और मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त किया जाता है, लेकिन T कोशिकाओं द्वारा नहीं। 35-37 T सेल-स्वतंत्र एंटीबॉडी प्रतिक्रिया में BAFF / APRIL के योगदान को जाना जाता है। 38,39 यहां हमने परीक्षण किया कि क्या TLR9 सक्रियण संश्लेषण को बढ़ा सकता है या नहीं। अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और T सेल-स्वतंत्र तरीके से APRIL के माध्यम से IgG-IgA IC का निर्माण। हमने क्लोन मानव IgA 1- स्रावित सेल लाइनों का भी उपयोग किया और दिखाया कि TLR9 सक्रियण ने APRIL और IL -6 के माध्यम से Gd-IgA1 के उत्पादन को बढ़ाया, यह सुझाव देते हुए कि प्रक्रिया T सेल-स्वतंत्र है। इसके अलावा, हमने बी कोशिकाओं और डीसी की भूमिकाओं का मूल्यांकन किया। हमने दिखाया कि बी कोशिकाओं और डीसी के लिए विशिष्ट सीपीजी-ओडीएन ने पूरे स्प्लेनोसाइट्स में अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के उत्पादन में वृद्धि की। इसके अलावा, हमने जांच की कि क्या इन विट्रो में CpG-ODN उत्तेजना IgA उत्पादन को बढ़ा सकती है। पृथक बी कोशिकाओं के सीपीजी-ओडीएन उत्तेजना ने आईजीए के अतिउत्पादन को प्रेरित किया। इसके अलावा, CpG-ODN ने IgA उत्पादन में काफी वृद्धि की जब B कोशिकाओं को DC (सप्लीमेंट्री फिगर S1) के साथ सहसंस्कृत किया गया। ये परिणाम बताते हैं कि CpG-ODN सक्रियण का परिणाम अधिक होता हैIgA उत्पादन और असामान्य ग्लाइकोसिलेशनTLR9 द्वारा T सेल-स्वतंत्र तरीके से मध्यस्थता की जाती है।

आईएल-6 इम्युनोग्लोबुलिन-उत्पादक कोशिकाओं के प्रसार और प्लाज्मा कोशिकाओं के टर्मिनल भेदभाव को बढ़ाने के लिए जाना जाता है। इसके अलावा, आईएल -6 टी कूपिक सहायक सेल भेदभाव के लिए प्राथमिक-उम्मीदवार साइटोकाइन भी हो सकता है .43,44 टी कूपिक सहायक कोशिकाएं बी-सेल आत्मीयता परिपक्वता, वर्ग स्विच पुनर्संयोजन, और स्मृति बी-सेल और प्लाज़्मा सेल पीढ़ी के लिए जर्मिनल सेंटर के भीतर आवश्यक हैं। 43,44 ल्यूपस माउस मॉडल में, आईएल -6 कमी ने टी फॉलिक्युलर हेल्पर सेल भेदभाव और जर्मिनल-सेंटर बी-सेल विस्तार को रोक दिया, जिसके परिणामस्वरूप ऑटोएंटीबॉडी उत्पादन कम हो गया। 45 वर्तमान अध्ययन ने स्पष्ट किया कि सीपीजी-ओडीएन द्वारा टीएलआर 9 सक्रियण ने म्यूरिन आईजीएएन के स्प्लेनोसाइट्स में आईएल -6 उत्पादन बढ़ाया। IgAN के एक murine मॉडल में अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA और IgG-IgA IC के IL-6 प्रेरित अतिउत्पादन। मानव IgA1-स्रावित कोशिकाओं में, हमने पुष्टि की कि IL-6 ने Gd-IgA1.24 का उत्पादन बढ़ाया है। हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि IL-6 नेफ्रिटोजेनिक IgA के अतिउत्पादन को प्रेरित करने वाले प्रमुख अणुओं में से एक हो सकता है। TLR9 सक्रियण द्वारा मध्यस्थता।

एपीआरआईएल आईजीए-श्रेणी के स्विचिंग और प्लास्मेसीटॉइड विभेदन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। 46,47 आईएल -6 बी कोशिकाओं के आईजीए-स्रावित प्लाज्मा कोशिकाओं के टर्मिनल भेदभाव को बढ़ावा देता है। 41,42 वर्तमान अध्ययन ने प्रदर्शित किया कि आईएल {{7} } उत्तेजना ने अप्रैल के उत्पादन को प्रेरित किया। तब हमने अनुमान लगाया कि एपीआरआईएल और आईएल -6 के बीच एक संबंध था जो टीएलआर 9 सक्रियण द्वारा मध्यस्थता से ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के उत्पादन को प्रेरित करता था। हमने पाया कि IL-6-निष्क्रिय एंटीबॉडी ने Gd-IgA1 के CpG-ODN- प्रेरित अतिउत्पादन को पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं किया और APRIL के siRNA नॉकडाउन ने IL द्वारा प्रेरित Gd-IgA1 के अतिउत्पादन को कम कर दिया -6। इन आंकड़ों ने सुझाव दिया कि एपीआरआईएल और आईएल -6 ने सहक्रियात्मक रूप से टीएलआर 9 सक्रियण द्वारा मध्यस्थता वाले जीडी-आईजीए 1 के उत्पादन को बढ़ावा दिया। इसके अलावा, दोनों आईएल -6 - एपीआरआईएल के एंटीबॉडी और सीआरएनए नॉकडाउन ने आईजीए और जीडी-आईजीए 1 के उत्पादन को आईएल -6 से अधिक कम कर दिया - अकेले एंटीबॉडी को निष्क्रिय कर दिया। इस प्रकार TLR9 सक्रियण मार्ग में एंटीबॉडी उत्पादन और ग्लाइकोसिलेशन (चित्र 5) पर IL-6 और APRIL सहक्रियात्मक प्रभाव शामिल हैं। हाल के अध्ययनों ने यह भी संकेत दिया है कि आईएल -6, एपीआरआईएल के संयोजन में, प्रेरित पीढ़ी और प्लाज्मा कोशिकाओं की उत्तरजीविता। 48,49 हालांकि, एपीआरआईएल और आईएल -6 के बीच अंतरकोशिकीय सिग्नलिंग मार्ग को स्पष्ट करने के लिए भविष्य के अध्ययन की आवश्यकता है। नेफ्रिटोजेनिक IgA का उत्पादन।

सिस्टैंचेके लियेगुर्दासंक्रमण

निष्कर्ष के तौर पर,TLR9 सक्रियणअचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के उत्पादन और IgG-IgA IC के गठन को बढ़ाकर IgAN के एक murine मॉडल में गुर्दे की चोट को बढ़ा दिया। इस प्रक्रिया में, TLR9 सक्रियण द्वारा प्रेरित APRIL और IL-6 के अतिउत्पादन ने नेफ्रिटोजेनिक IgA के उत्पादन को बढ़ाया। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन ने स्पष्ट किया कि एपीआरआईएल और आईएल -6 अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए का उत्पादन करने के लिए सहक्रियात्मक रूप से और साथ ही स्वतंत्र रूप से कार्य करते हैं। ये निष्कर्ष IgAN के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण के भविष्य के विकास को सूचित कर सकते हैं।

चित्र 5|IgA नेफ्रोपैथी (IgAN) में IgA-उत्पादक कोशिकाओं में टोल-जैसे रिसेप्टर 9 (TLR9), एक प्रसार-उत्प्रेरण लिगैंड (APRIL), और इंटरल्यूकिन (IL) -6 के बीच सहक्रियात्मक भूमिका। TLR9 सक्रियण ने APRIL और IL-6 के उत्पादन को प्रेरित किया, जिसके परिणामस्वरूप

अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA का अतिउत्पादन। APRIL और IL-6 अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए सहक्रियात्मक रूप से कार्य करते हैं। एपीआरआईएल के अलावा आईएल-6 के उत्पादन को प्रेरित करने के अलावा, जैसा कि पहले बताया गया था, आईएल-6 एपीआरआईएल के संश्लेषण को भी बढ़ा सकता है। इसके अलावा, एपीआरआईएल और आईएल -6 स्वतंत्र रूप से अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए के उत्पादन को बढ़ावा देते हैं। एनएफ-केबी, परमाणु कारक-केबी।

विधि

पशु और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल

IgAN-प्रवण ddY माउस सहज IgAN का एक ज्ञात मॉडल है जिसमें परिवर्तनशील घटना और मानव IgAN की नकल करने वाले ग्लोमेरुलर चोट की सीमा होती है। 10 ddY चूहों को अभिव्यक्ति के आधार पर 3 समूहों में विभाजित किया जाता हैगुर्दे खराब: जल्दी या देर से शुरू होने वाले और मौन चूहों वाले चूहे। डीडीवाई चूहों में प्रारंभिक शुरुआत की बीमारी 20 सप्ताह की उम्र के बाद प्रोटीनुरिया और ग्लोमेरुलर आईजीए जमा के साथ प्रस्तुत करती है। इसलिए, हमने 18 सप्ताह के भीतर डीडीवाई चूहों का उपयोग यह मूल्यांकन करने के लिए किया कि क्या इस मॉडल में टीएलआर 9 सक्रियण ने आईजीएएन को बढ़ा दिया है। जुंटेंडो विश्वविद्यालय, टोक्यो, जापान की पशु सुविधा में कुल 30 मादा डीडीवाई चूहों (एसएलसी जापान, शिज़ुओका, जापान) को बनाए रखा गया था। चूहे को नियमित चाउ (ओरिएंटल यीस्ट कं, टोक्यो, जापान) और वाटर एड लिबिटम खिलाया गया और उन्हें एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त कमरे में रखा गया। प्रायोगिक प्रोटोकॉल को चिकित्सा के Juntendo विश्वविद्यालय संकाय के पशु प्रयोग के लिए आचार समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। 6 सप्ताह की आयु में, चूहों को बेतरतीब ढंग से 2 समूहों में विभाजित किया गया था। एक समूह ने 12 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह 3 बार सीपीजी-ओडीएन इंजेक्शन आईपी प्राप्त किया; दूसरे समूह (नियंत्रण) को गैर-सीपीजी-ओडीएन के साथ इंजेक्ट किया गया था। CpG-ODN और गैर-CpG-ODN को रासायनिक रूप से संश्लेषित किया गया था (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Kanagawa, Japan)। ODN के अनुक्रम क्रमशः CpG या गैर-CpG ODN के लिए TCGTCGTT TTCGGCGCGCGCCG या TGCTGCTTTTGGGGGCCCCCC (50/30) हैं।

मरीन सीरम में आईजीए, आईजीजी, आईजीजी-आईजीए आईसी, और अचानक ग्लाइकोसिलेटेड आईजीए का निर्धारण

मुख नस से रक्त के नमूने लिए गए। सीरम IgA, IgG, और IgG-IgA IC को सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा; बेथिल लेबोरेटरीज, मोंटगोमेरी, TX) द्वारा हमारी पिछली रिपोर्ट के आधार पर संशोधित विधि का उपयोग करके मापा गया था। 5 0 लेक्टिन-बाइंडिंग एसेज़ थे IgA के ग्लाइकोफॉर्म तक पहुँचने के लिए उपयोग किया जाता है। बायोटिनाइलेटेड आरसीए-I (वेक्टर लेबोरेटरीज, बर्लिंगम, सीए) और सांबुकस नाइग्रा बार्क लेक्टिन (वेक्टर लेबोरेटरीज) जो क्रमशः गैलेक्टोज (मुख्य रूप से ए 2,6 लिंकेज में) से जुड़े गैलेक्टोज और सियालिक एसिड को मान्यता देते हैं, इस परख में इस्तेमाल किए गए थे। 51 पतला सीरा प्रति कुएं में 100 एनजी आईजीए जोड़ा गया। सीरम IgA की मात्रा का ठहराव के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल बकरी विरोधी माउस IgA (100 मिली / कुएं) के साथ लेपित माइक्रोटिटर प्लेटों को इन नमूनों के साथ जोड़ा गया था, और बायोटिनाइलेटेड सांबुकस नाइग्रा एग्लूटीनिन या आरसीए- I को तब जोड़ा गया था। एविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज संयुग्म (एक्स्ट्राविडिन; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) लागू किया गया था। अचानक ग्लाइकोसिलेटेड बाध्य आईजीए के सीरम स्तर इकाइयों में व्यक्त किए गए थे (1 इकाई ऑप्टिकल घनत्व 1.0 के रूप में 490 एनएम पर मापा गया)। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, APRIL और BAFF के सीरम स्तर को एक माउस APRIL ELISA किट (MyBioSource, San Diego, CA) और एक माउस BAFF ELISA किट (R&D Systems, Minneapolis, MN) का उपयोग करके मापा गया।

मानव IgA द्वारा उत्पादित Gd-IgA1 के लिए परख1-स्रावित कोशिकाओं

Gd-IgA1 के लिए एक सैंडविच एलिसा का निर्माण Gd-IgA1- विशिष्ट एंटीबॉडी (IBL, जापान) का उपयोग करके किया गया था। 52 Gd-IgA1- विशिष्ट एंटीबॉडी (7.5 मिलीग्राम / एमएल) फॉस्फेट-बफर खारा समाधान में पतला 18 के लिए एक एलिसा प्लेट पर लेपित किया गया था। कमरे के तापमान पर घंटे। नमूने लागू किए गए और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। प्लेट्स को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए धोया और ऊष्मायन किया गया था: 1000- पतला हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माउस मानव विरोधी IgA1 1-श्रृंखला-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (दक्षिणी बायोटेक, बर्मिंघम, एएल)। धोने के बाद, प्लेटों को SIG-MAFAST o-फेनिलेनेडियम सॉल्यूशन (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ विकसित किया गया था, और 1 M सल्फ्यूरिक एसिड (वाको, ओसाका, जापान) को मिलाकर प्रतिक्रिया को रोक दिया गया था। Gd-IgA1 के स्तर को 490 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व के एक मानक वक्र (4-पैरामीटर लॉजिस्टिक कर्व फिटिंग) के संदर्भ में एक्सट्रपलेशन किया गया और इकाइयों में व्यक्त किया गया। मानव प्लाज्मा IgA152 से एंजाइमेटिक रूप से उत्पन्न Gd-IgA1 को एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए क्रमिक रूप से पतला (1.37–1000 ng/ml) किया गया था। इस अध्ययन में, 1 इकाई को मानक Gd-IgA1.52 . के 1 एनजी/एमएल के रूप में परिभाषित किया गया था

डीडीवाई चूहों में गुर्दे की चोट का मूल्यांकन

गुर्देwere removed after perfusion with normal saline solution. Renal tissue specimens for microscopic examination were fixed in 20% formaldehyde, embedded in paraffin, cut into 3-mm-thick sections, and then stained with periodic acid–Schiff. Specimens were quantitatively analyzed to determine the percentage of glomeruli with segmental and global sclerosis and/or mesangial cell proliferation and/or increase in the mesangial matrix. Each section was scored semiquantitatively for percentages of glomeruli with aforementioned lesions (0, 0%; 1, 1% to 24%; 2, 25% to 49%; and 3, >20 ग्लोमेरुली का 50 प्रतिशत। 13,53,54 प्रत्येक खंड के लिए कुल अधिकतम स्कोर 9 था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए गुर्दे के नमूनों को इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक (सकुरा फिनटेक जापान कं, टोक्यो, जापान) में डुबोया गया और -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। नमूनों को 3- मिमी-मोटी वर्गों में काट दिया गया, 5 मिनट के लिए एसीटोन के साथ -20 डिग्री पर तय किया गया, फॉस्फेट-बफर खारा समाधान से धोया गया, एक अवरुद्ध एजेंट (डीएस फार्मा बायोमेडिकल कंपनी, ओसाका, जापान) के साथ अवरुद्ध किया गया। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, और फिर निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन: बकरी विरोधी murine IgA, एलेक्सा संयुग्मित बकरी विरोधी murine IgG, और चूहा विरोधी C3 (बेथिल लेबोरेटरीज)। फॉस्फेट-बफर खारा समाधान के साथ 3 और धोने के बाद, स्लाइड्स को बढ़ते माध्यम (डको, टोक्यो, जापान) के साथ रखा गया था। नमूनों का विश्लेषण किया गया और कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी (ओलंपस कॉर्पोरेशन, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके उनकी नकल की गई।

वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

प्लीहा कोशिकाओं से आरएनए को टोरिज़ोल समाधान (इनविट्रोजन, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके निकाला गया था और आरनेसी मिनी किट (74106; क्यूजेन, वालेंसिया, सीए) के साथ शुद्ध किया गया था। SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, टोक्यो, जापान) और विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके एप्लाइड बायोसिस्टम्स 7500 रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन सिस्टम का उपयोग करके वास्तविक समय की मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन किया गया था: माउस TLR9 फॉरवर्ड प्राइमर TCTCCCAACATGGTTCTCCGTCG, रिवर्स प्राइमर TGCAGTCCAGGCCATGA; माउस MyD88 फॉरवर्ड प्राइमर GCACCTGTGTCTGGTCCATT, रिवर्स प्राइमर CTGTTGGA CACCTGGAGACA; और हाउसकीपिंग जीन ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज फॉरवर्ड प्राइमर CATTGTGGAAG GGCTCATGA, रिवर्स प्राइमर TCTTCTGGGTGGCAGTGATG। प्रवर्धन की स्थिति इस प्रकार थी: 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर प्रीहीटिंग और फिर 3 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण के 40 चक्र, और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री पर एनीलिंग और विस्तार। APRIL, Hs 00601664_ g1, Mm 03809849- s1, और BAFF, Mm 01168134- m1 के प्राइमर के लिए होमो सेपियन्स-विशिष्ट TaqMan जीन अभिव्यक्ति assays (Life Technologies, Carlsbad, CA) खरीदे गए थे। . टाकमैन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन साइकलिंग की स्थिति इस प्रकार थी: 20 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर प्रीहीटिंग और फिर 3 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण के 40 चक्र, और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री पर एनीलिंग और विस्तार

डीडीवाई चूहों के स्प्लेनोसाइट्स के साथ इन विट्रो अध्ययन में

20 प्रतिशत भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट -1640 माध्यम में स्प्लेनोसाइट्स सुसंस्कृत थे। लाल रक्त कोशिकाओं को 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रेड ब्लड सेल लाइसिंग बफर (R7757; सिग्मा-एल्ड्रिच) में lysed किया गया था, इसके बाद रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट -1640 मध्यम में धुलाई की गई। 50 सेल संस्कृतियों को 37 डिग्री पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखा गया था। 5 प्रतिशत CO2। क्लास सी CpG-ODN (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG) को TLR9 लिगैंड के रूप में इस्तेमाल किया गया था। रिकॉम्बिनेंट आईएल -6, एंटी-आईएल -6 एंटीबॉडी, और चूहे आईजीजी 1 आइसोटाइप नियंत्रण आर एंड डी सिस्टम से प्राप्त किए गए थे। कोशिकाओं को CpG-ODN, 10 एनजी/एमएल पुनः संयोजक आईएल -6, और 100 एनजी/एमएल एंटी-आईएल6 एंटीबॉडी के मध्यम या अनुशंसित सांद्रता के साथ सुसंस्कृत किया गया था। IgA, अचानक ग्लाइकोसिलेटेड IgA, IgG-IgA IC, और APRIL को स्प्लेनोसाइट्स द्वारा उत्पादित 72- इन विट्रो में ऊष्मायन के बाद एलिसा द्वारा मापा गया था।

मानव IgA के साथ इन विट्रो अध्ययन1-सेल लाइनों को स्रावित करना

एक स्वस्थ व्यक्ति के रक्त से बी कोशिकाओं को एपस्टीन-बार वायरस के साथ अमर कर दिया गया, आईजीए उत्पन्न करने के लिए उप-क्लोन किया गया 1- सेल लाइनों को स्रावित किया गया, और वर्णित के रूप में सुसंस्कृत किया गया। 9 इसके अलावा, हमने एपीआरआईएल/बीएएफएफ और आईएल के लिए रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति की पुष्टि की। -6. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट -1640 माध्यम में कोशिकाओं को 20 प्रतिशत भ्रूण बछड़ा सीरम, स्ट्रेप्टोमाइसिन और पेनिसिलिन के साथ 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत सीओ 2 के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में पूरक किया गया था। क्लास बी CpG-ODN (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT) को TLR9 लिगैंड के रूप में इस्तेमाल किया गया था। पुनः संयोजक IL-6, पुनः संयोजक APRIL, एंटी-IL-6 एंटीबॉडी, और बकरी IgG नियंत्रण एंटीबॉडी R&D सिस्टम से प्राप्त किए गए थे। कोशिकाओं को या तो मध्यम या अनुशंसित सांद्रता के साथ CpG-ODN, 50 एनजी / एमएल पुनः संयोजक आईएल -6, 40 एनजी / एमएल पुनः संयोजक एपीआरआईएल, और 100 एनजी / एमएल एंटी-आईएल -6 72 घंटे के लिए एंटीबॉडी के साथ सुसंस्कृत किया गया था।

पश्चिमी सोख्ता

IgA1-स्रावित कोशिकाओं से सुपरनैटेंट्स को 5 प्रतिशत से 15 प्रतिशत ग्रेडिएंट स्लैब जैल का उपयोग करके परिस्थितियों को कम करने के तहत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया गया था। जैल को पॉलीविनाइलिडीन डिफ़्लुओराइड झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया और एपीआरआईएल (एबकैम इंक, कैम्ब्रिज, एमए) और ग्लिसराल्डिहाइड -3- फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (एबीकैम इंक) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। संवर्धित रसायनयुक्त रसायन (जीई हेल्थकेयर, टोक्यो, जापान) और ल्यूमिनेसिसेंस डिटेक्टर (कोनिका मिनोल्टा हेल्थकेयर, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके केमिलुमिनेसिसेंस द्वारा ब्लास्ट की कल्पना की गई थी। परिणामों का मूल्यांकन घनत्वमितीय रूप से किया गया।

अप्रैल सीआरएनए नॉकडाउन

मानव IgA1-स्रावित कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक प्रोटोकॉल का उपयोग करके APRIL- विशिष्ट siRNA (GS8741, Qiagen) या siRNA गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (GS10673, Qiagen) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। . 24 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएल पुनः संयोजक आईएल -6 (आर एंड डी सिस्टम) के साथ ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, IgA और Gd-IgA1 की माप के लिए कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला काटा गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

विचरण के विश्लेषण का उपयोग करके विभिन्न मापदंडों के बीच सहसंबंध का विश्लेषण किया गया था। डेटा को माध्य ± एसडी या माध्य मान के रूप में व्यक्त किया गया था। P मान <{0}}.05 को="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="" गया।="" विंडोज="" (ग्राफपैड="" सॉफ्टवेयर,="" सैन="" डिएगो,="" सीए)="" के="" लिए="" ग्राफपैड="" प्रिज्म="" संस्करण="" 6.0="" का="" उपयोग="" करके="" सभी="" सांख्यिकीय="" विश्लेषण="" किए="" गए="">

सिस्टैंचेके लियेगुर्दारोग के लक्षण

खुलासा

सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया।

आभार

इस अध्ययन को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर 18K08252 और जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट, AMED से गुर्दे की बीमारियों के लिए व्यावहारिक अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। JN और BAJ को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान DK078244 और DK082753 द्वारा समर्थित किया गया था। हम सुश्री टेरुमी शिबाता को उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम सुश्री ताकाको इकेगामी और सुश्री टोमोमी इकेदा (आणविक और जैव रासायनिक अनुसंधान विभाग, जुंटेंडो यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन) और सुश्री तमामी सकानिशी (डिवीजन ऑफ सेल बायोलॉजी, जुंटेंडो यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन) को भी उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। .

पूरक सामग्री

अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ)

चित्रा S1। CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) -सक्रिय B कोशिकाएँ और वृक्ष के समान कोशिकाएँ (DCs) IgA उत्पादन को और बढ़ाती हैं। बी कोशिकाओं और डीसी को डीडीवाई चूहों के तिल्ली से अलग किया गया था। सीपीजी-ओडीएन उत्तेजना ने पृथक बी कोशिकाओं में आईजीए उत्पादन में वृद्धि की। डीसी के साथ बी कोशिकाओं को सह-संवर्धन करके इस वृद्धि को और बढ़ाया गया। *पी < 0.05.="" अनुपूरक="" विधियों="" में="" विस्तृत="" विधियाँ="" प्रदान="" की="" गई="" हैं।="" अनुपूरक="">

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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