गुर्दा प्रत्यारोपण

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परिचय

गुर्दाट्रांसप्लांटेशनक्रोनिक किडनी रोग के अंतिम चरण के उपचार के लिए सबसे अच्छा विकल्प है। वर्तमान में, एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति (एएमआर), जो कि मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) को निर्देशित एक दाता-विशिष्ट एंटीबॉडी (डीएसए) की उपस्थिति की विशेषता है, गुर्दे के भ्रष्टाचार को पुरानी क्षति के प्रमुख कारण के रूप में उभरा है, जो बड़े पैमाने पर भ्रष्टाचार के दीर्घकालिक अस्तित्व को सीमित करता है। (1, 2)। हालांकि, मौजूदा योजनाएं नैदानिक ​​​​में आशाजनक परिणाम प्राप्त करने में विफल रही हैंएएमआर (1, 3, 4) का उपचार। इस प्रकार, गुर्दा प्रत्यारोपण के बाद एएमआर के लिए संभावित बायोमार्कर और जोखिम कारकों की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता है, जो उपचार और रोगी के परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है।

संचित साक्ष्य से पता चलता है कि भड़काऊ परिस्थितियों में, बी कोशिकाएं एंटीबॉडी-स्रावित प्लास्मबलास्ट और नियामक बी कोशिकाओं (ब्रेग्स) में अंतर कर सकती हैं, जो एक विशेष बी सेल उपसमुच्चय हैं जो इम्यूनोसप्रेसिव साइटोकिन्स, विशेष रूप से इंटरल्यूकिन (आईएल) -10 को स्रावित करते हैं। (1, 5-7)। इस प्रकार, प्लास्मबलास्ट एलोएंटीबॉडी का उत्पादन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एएमआर होता है, जबकि ब्रेग्स इम्यूनोरेगुलेटरी कार्यों का प्रदर्शन करते हैं और प्रतिरक्षा होमियोस्टेसिस को प्रेरित करने में मदद करते हैं। इस प्रकार, ब्रेग्स को गुर्दा प्रत्यारोपण (1, 8, 9) के बाद एएमआर के प्रतिरोध के साथ निकटता से जुड़ा हुआ बताया गया है।

हालाँकि, Breg उपसमुच्चय के विशिष्ट सतह मार्करों की अभी तक मनुष्यों में पहचान नहीं की गई है (1), पिछले अध्ययनों ने Bregs की चार सामान्य उप-जनसंख्या की सूचना दी है: मेमोरी Bregs (mBregs) जिसे CD19 प्लस CD24 प्लस CD27 प्लस (10), संक्रमणकालीन Bregs ( सीडी19 प्लस सीडी24 प्लस सीडी38 प्लस (10, 11), आईएल-10-मेमोरी ब्रेग्स (आईएल-10 प्लस एमब्रेग्स) के साथ परिभाषित सीडी19 प्लस सीडी24 प्लस सीडी27 प्लस आईएल-10 प्लस (12), और आईएल-10-उत्पादनसंक्रमणकालीन Bregs (IL-10 plus tBregs) को CD19 प्लस CD24 प्लस CD38 प्लस IL-10 प्लस (13) से परिभाषित किया गया है। लगुना-गोया एट अल। ने बताया कि tBregs और IL -10 प्लस tBregs में कमी सकारात्मक रूप से किडनी प्रत्यारोपण (14) के बाद तीव्र अस्वीकृति से जुड़ी है। हालांकि, झोउ एट अल। ने बताया कि tBregs के बजाय mBregs, लिवर प्रत्यारोपण के बाद तीव्र अस्वीकृति वाले पांच रोगियों में उल्लेखनीय रूप से कम हो गया (10)। इसके अलावा, शबीर एट अल। ने बताया कि तीन एएमआर रोगियों (15) में tBregs किडनी अलोग्राफ़्ट अस्वीकृति से जुड़े नहीं थे। इन असंगत परिणामों के आलोक में, यह स्पष्ट करने की आवश्यकता है कि किडनी प्रत्यारोपण के बाद एएमआर रोगियों में कौन सी ब्रेग उप-जनसंख्या महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

वर्तमान अध्ययन में, स्वस्थ, स्थिर (ST), और AMR समूहों के बीच परिसंचारी Bregs के चार उप-जनसंख्या के अनुपात की तुलना की गई। फिर, स्वस्थ, एसटी और एएमआर रोगियों के किडनी ग्राफ्ट में बी सेल, आईएल-10, और केमोकाइन का जैव वितरण निर्धारित किया गया। इसके अलावा, सर्जरी के बाद 90 दिनों के लिए एसटी रोगियों में ब्रेग्स को प्रसारित करने की चार उप-जनसंख्या की गतिशीलता की जांच की गई। ये वर्तमान परिणाम, जो पिछले अध्ययनों (1) द्वारा रिपोर्ट किए गए हैं, सुझाव देते हैं कि परिसंचारी IL -10 प्लस mBregs और IL -10 प्लस tBregs प्रमुख Breg उप-योग हैं जो AMR के प्रतिरोध में योगदान करते हैं।

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कीवर्ड:ब्रेग फेनोटाइपिंग, गुर्दा प्रत्यारोपण, एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति, होमोस्टैसिस, गतिशील

सामग्री और तरीके

रोगी और समूह

सभी रोगियों ने अध्ययन से पहले एक हस्ताक्षरित सूचित सहमति प्रदान की। वर्तमान अध्ययन को झेंग्झौ विश्वविद्यालय (2018-KY-72) के पहले संबद्ध अस्पताल की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। नैदानिक ​​परीक्षण पंजीकरण संख्या ChiCTR1900022501 है।

इन रोगियों को तीन समूहों में विभाजित किया गया था: (1) स्वस्थ नियंत्रण समूह (स्वस्थ, n=9): 18-55 वर्ष की आयु के भीतर स्वस्थ गुर्दा दाता (बीमारी से मुक्त), प्राप्तकर्ताओं के भाई-बहन और पति-पत्नी शामिल हैं; (2) स्थिर ग्राफ्ट फंक्शन ग्रुप (ST, n=25) के प्राप्तकर्ता: 18-55 वर्ष के भीतर के रोगी, जिनकी किडनी का कार्य स्थिर था (गुर्दा प्रत्यारोपण से पहले और बाद में संक्रमण या अस्वीकृति से मुक्त) अनुवर्ती के दौरान अवधि (6 महीने से अधिक या उसके बराबर); (3) एएमआर समूह (एएमआर, एन=18) के प्राप्तकर्ता: 18-55 वर्ष के भीतर के रोगी, जिन्हें एएमआर का निदान किया गया था। एसटी और एएमआर वाले प्राप्तकर्ताओं के गुर्दा ग्राफ्ट से प्राप्त किए गए थेस्वस्थ गुर्दा दाताएस। Banff 2017 सर्वसम्मति (3, 16) के अनुसार, ST और AMR समूहों के बीच विभेदक निदान की पुष्टि दो किडनी रोग विशेषज्ञों द्वारा की गई थी।

परिधीय रक्त, गुर्दे के ऊतक और कोशिका के नमूने

स्वस्थ समूह से परिधीय रक्त के नमूने ऑपरेशन से पहले और ऑपरेशन के 1, 7, और 14 दिनों के बाद एकत्र किए गए थे। एसटी समूह से प्राप्त नमूने ऑपरेशन से पहले और ऑपरेशन के 1, 7, 14, 30 और 90 दिनों के बाद एकत्र किए गए थे। एएमआर समूह से प्राप्त नमूने तब एकत्र किए गए थे जब अस्वीकृति हुई थी (एएमआर के लिए एंटी-रिजेक्शन थेरेपी से पहले)। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (PBMCs) को से अलग किया गया था

Ficoll-Paque ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 5 मिली रक्त और तरल नाइट्रोजन में 10 प्रतिशत डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (सोलरबायो इंक, बीजिंग, चीन) के साथ संरक्षित।

स्वस्थ समूह से प्राप्त कोर सुई रीनल बायोप्सी नमूनों को समय-शून्य दाता किडनी बायोप्सी के लिए सर्जरी से पहले एकत्र किया गया था। एसटी समूह से प्राप्त कोर सुई रीनल बायोप्सी नमूनों को ऑपरेशन के 90 दिनों के बाद प्रोटोकॉल बायोप्सी के कारण उनके गुर्दे के कार्य को स्थिर करने के बाद एकत्र किया गया था। गुर्दा समारोह की दूसरी पंचर हानि के प्रकाश में, सभी एएमआर रोगियों ने एएमआर के लिए एंटी-रिजेक्शन थेरेपी के बाद कोर सुई गुर्दे की बायोप्सी से इनकार कर दिया। इस प्रकार, एएमआर समूह से कोर सुई रीनल बायोप्सी नमूने केवल तभी एकत्र किए गए जब अस्वीकृति हुई (एएमआर के लिए एंटी-रिजेक्शन थेरेपी से पहले)। कुल तीन स्वस्थ दाताओं, नौ एसटी रोगियों और नौ एएमआर रोगियों ने कोर सुई गुर्दे की बायोप्सी से पहले एक हस्ताक्षरित सूचित सहमति प्रदान की। शेष छह स्वस्थ दाताओं, 16 एसटी रोगियों और नौ एएमआर रोगियों ने बायोप्सी के साथ प्रमुख रक्तस्राव के डर से कोर सुई गुर्दे की बायोप्सी से इनकार कर दिया। एकल कोशिकाओं को तीन स्वस्थ दाताओं, तीन एसटी रोगियों और तीन एएमआर रोगियों के कोर सुई रीनल बायोप्सी नमूनों से अलग किया गया था, जो बाह्य मैट्रिक्स के एंजाइमैटिक गिरावट के साथ यांत्रिक पृथक्करण के संयोजन से होता है, जो ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है (मल्टी टिश्यू डिसोसिएशन किट) 1; मिल्टनी बायोटेक, बर्गिस्स ग्लैडबैक, जर्मनी)। गुर्दे की कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में 10 प्रतिशत डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (सोलरबियो इंक, बीजिंग, चीन) के साथ संरक्षित किया गया था, और शेष कोर सुई गुर्दे की बायोप्सी नमूनों को पैराफ़िन में 4 डिग्री पर एम्बेडेड किया गया था।

फ़्लो साइटॉमेट्री

तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 37 डिग्री पर सेट पानी के स्नान में जल्दी से पिघलाया गया। कुल 2-3 × 106 पीबीएमसी को रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट 1640 कमजोर पड़ने वाले सेल उत्तेजना कॉकटेल (500 ×) के साथ जोड़ा गया था, जिसमें पीएमए (फोरबोल 12- मिरिस्टेट 13- एसीटेट) शामिल था। कैल्शियम आयनोफोर (आयनोमाइसिन), और प्रोटीन परिवहन अवरोधक ब्रेफेल्डिन ए और मोनेंसिन, (ईबायोसाइंस, सैन डिएगो, सीए), 5 घंटे के लिए 5 प्रतिशत CO2 के साथ 37 डिग्री पर। मृत कोशिकाओं को 7- अमीनोएक्टिनोमाइसिन डी (थर्मो फिशर साइंटिफिक, पिट्सबर्ग, पीए, यूएसए) के साथ धुंधला करके बाहर रखा गया था, और ब्रेग्स के सतह मार्करों को uorochrome- लेबल एंटीबॉडी (शानदार वायलेट 421 ™ मानव-विरोधी सीडी 1 9, फाइकोएरिथ्रिन के साथ दाग दिया गया था। (PE)/Cy7 मानव-विरोधी CD24, Alexa FluorR647 मानव-विरोधी CD27, Alexa FluorR488

मानव-विरोधी CD38, और ब्रिलियंट वायलेट 510™ मानव-विरोधी CD45; उपयुक्त आइसोटाइप नियंत्रण: ब्रिलियंट वायलेट 421™ माउस

IgG1 k आइसोटाइप कंट्रोल, PE/Cy7 माउस IgG2a k आइसोटाइप कंट्रोल, Alexa FluorR647 माउस IgG1 k आइसोटाइप कंट्रोल, Alexa FluorR488 माउस IgG1 k आइसोटाइप कंट्रोल, और ब्रिलियंट वायलेट

510™ माउस IgG1 k आइसोटाइप नियंत्रण; बायोएजेंड, सैन डिएगो, सीए,

यूएसए) 30 मिनट के लिए 4 डिग्री पर, प्रकाश से सुरक्षा के साथ। इंट्रासेल्युलर धुंधला होने के लिए, कोशिकाओं को एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था जो ब्रेग्स के इंट्रासेल्युलर साइटोकिन्स (पीई एंटी-ह्यूमन आईएल -10; उपयुक्त आइसोटाइप नियंत्रण: पीई रैट आईजीजी 1 के आइसोटाइप कंट्रोल; बायोएजेंड, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के लिए लक्षित थे। कमरे के तापमान पर 30 मिनट, प्रकाश से सुरक्षा के साथ। बीडी बायोसाइंसेज कैंटो II इंस्ट्रूमेंट (बीडी बायोसाइंसेज, यूएसए) का उपयोग करके लेबल की गई कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। लिम्फोसाइट गेट में कुल 100, 000 घटनाएं हासिल की गईं। फ्लोजो सॉफ्टवेयर (ट्री स्टार, सैन कार्लोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके डेटा विश्लेषण किया गया था।

इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 सकारात्मकताएं, स्कोर=चार

सांख्यिकीय विश्लेषण

नेस्टेड केस-कंट्रोल अध्ययन में, रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (आरओसी) वक्र विश्लेषण MedCalc v18.11.3 द्वारा किया गया था। शेष सांख्यिकीय विश्लेषण IBM SPSS 21.0 का उपयोग करके किए गए। विचरण की एकरूपता के साथ आम तौर पर वितरित माप डेटा को माध्य ± मानक विचलन (x ± s) के रूप में व्यक्त किया गया था और स्वतंत्र-नमूना टी-परीक्षण (बीच-समूह तुलना) या विचरण के एकतरफा विश्लेषण (समूह तुलना के बीच) द्वारा विश्लेषण किया गया था। मापन डेटा जिसमें सामान्य वितरण या विचरण की समरूपता नहीं थी, को इंटरक्वेर्टाइल रेंज (IQR) के साथ माध्यिका में व्यक्त किया गया था और मान-व्हिटनी यू परीक्षण (बीच-समूह तुलना) या क्रुस्कल-वालिस परीक्षण (समूह तुलना के बीच) द्वारा विश्लेषण किया गया था। गणना डेटा का विश्लेषण c2 परीक्षण, एक सही c2 परीक्षण, या फिशर के सटीक परीक्षण द्वारा किया गया, जैसा कि आवश्यक था। विचरण का एक तरफ़ा बार-बार उपाय विश्लेषण

विभिन्न समय बिंदुओं पर इस्तेमाल किया गया था। पी-मूल्यों<0.05 were="" considered="" statistically="">

परिणाम

मरीजों की आधारभूत विशेषताएं

वर्तमान अध्ययन में कुल नौ स्वस्थ दाताओं, 25 एसटी रोगियों और 18 एएमआर रोगियों को शामिल किया गया था। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, प्राप्तकर्ताओं का लिंग, आयु, बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई), प्रारंभिक नेफ्रोपैथी, एचएलए बेमेल, सीएनआई, वार्म-इस्किमिया समय और कोल्ड-इस्किमिया समय समूहों के बीच या समूहों के बीच भिन्न नहीं था (पी) > 0.05, सभी के लिए)। हालांकि, एएमआर समूह में एंटी क्लास I और एंटी-क्लास II डीएसए-सकारात्मकता दोनों की घटनाएं काफी अधिक थीं, जब एसटी समूह (पी <0। 001="" एंटी="" के="" लिए="" तुलना="" की="" गई="" थी।="" -क्लास="" i="" डीएसए,="" पी=""><0.001; पी="0.001" एंटी="" क्लास="" ii="" डीएसए="" के="" लिए)।="" इसके="" अलावा,="" एसटी="" रोगियों="" की="" तुलना="" में,="" एएमआर="" रोगियों="" में="" ट्यूबलाइटिस="" (टी),="" इंटरस्टीशियल="" इन्फ्लैमेशन="" (आई),="" और="" पेरिटुबुलर="" कैपिलाराइटिस="" (पीटीसी)="" (पी="0.012" टी="" के="" लिए;="" पी=""><0.001 आई="" और="" पीटीसी="" के="" लिए="" काफी="" अधिक="" स्कोर="" था।="" ),="" banff="" वर्गीकरण="" के="" अनुसार="" (सामान्य,="" स्कोर="0;" हल्का,="" स्कोर="1;" मध्यम,="" स्कोर="2;" गंभीर,="" स्कोर="3)" (3,="" 16)="" (="" पूरक="" टेबल्स="" 1="" और="">

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