लैमिवुडिन SAMP8 चूहों में संज्ञानात्मक गिरावट में सुधार करता है: विवो फार्माकोलॉजिकल मूल्यांकन और नेटवर्क फार्माकोलॉजी में एकीकरण

टैक्सोल वैकल्पिक चीनी जड़ी-बूटियाँ सिस्टैंच

कीवर्ड:एस्परगिलस फेवस · जोजोबा · एंडोफाइटिक कवक · सोने के नैनोकण · टैक्सोल · -विकिरण · पोषण अनुकूलन

परिचय

टैक्सोल सबसे अधिक व्यावसायीकरण वाले व्यापक स्पेक्ट्रम में से एक हैकैंसररोधी औषधियाँ[1]. टैक्सोल की गतिविधि सेलुलर ट्यूबुलिन-सबयूनिट्स हेटेरोडिमर के साथ जुड़ने की अपनी अनूठी विशिष्टता से विस्तृत होती है, जो ट्यूबुलिन पोलीमराइजेशन को बढ़ावा देती है, इस प्रकार ट्यूमर कोशिकाओं के माइटोटिक विभाजन को बाधित करती है [2]। टैक्सोल ने स्तन, फेफड़े, सिर और गर्दन, गर्भाशय के कैंसर और कपोसी के सारकोमा के उन्नत रूपों के खिलाफ एक मजबूत गतिविधि प्रदर्शित की [3]। टैक्सोल का उत्पादन सबसे पहले कुछ पेड़ों की छाल से किया गया था टैक्सस ब्रेविफोलिया "फैमिली टैक्सैसी" [4, 5]; हालाँकि, टैक्सोल की कम उपज है<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as दमा,सूजन, औरकैंसर[32]. इस प्रकार, इस काम का मुख्य उद्देश्य टैक्सोल उत्पादन के लिए अद्वितीय चयापचय स्थिरता के साथ जोजोबा पौधे से अलग किए गए एक नए फंगल का पता लगाना था, ताकि उनके टैक्सोल उपज को अधिकतम करने के लिए विभिन्न तरीकों का मूल्यांकन किया जा सके, साथ ही, निकाले गए टैक्सोल यौगिकों की एंटीप्रोलिफेरेटिव गतिविधि को बढ़ाया जा सके। गामा विकिरण द्वारा मध्यस्थता, सोने के नैनोकणों के साथ संयुग्मन के माध्यम से।

सामग्री और विधियां

एंडोफाइटिक कवक का अलगाव और संवर्धन

पत्तियों, छालों, टहनियों और कलियों के रूप में जोजोबा (सिमंडसिया चिनेंसिस) के विभिन्न हिस्सों को काहिरा विश्वविद्यालय के कृषि संकाय से एकत्र किया गया था, और एंडोफाइटिक कवक के स्रोत के रूप में उपयोग किया गया था। पौधे के हिस्सों को एकत्र किया गया और बहते नल के पानी के नीचे धोया गया, सतह को 1 मिनट के लिए 70 प्रतिशत इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित किया गया और फिर रोगाणुहीन पानी से धोया गया [28]। सतह के निष्फल पौधों के हिस्सों को बाँझ स्थितियों के तहत छोटे टुकड़ों में काटा गया और आलू डेक्सट्रोज एगर (पीडीए) माध्यम, सीजापेक-डॉक्स और माल्ट एक्सट्रेक्ट एगर मीडियम [33-36] की प्लेटों पर रखा गया, और प्लेटों को 30 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। दस दिन। पौधे के हिस्सों की सतह के नसबंदी की प्रभावशीलता का आकलन धोने वाले पानी को सेंट्रीफ्यूज करके किया गया था, फिर 500 उल बाँझ पानी को अवक्षेप में जोड़ा गया और पीडीए माध्यम में चढ़ाया गया [37]। शुद्ध किए गए एंडोफाइटिक फंगल आइसोलेट्स को 7 दिनों के लिए पीडीए स्लैंट्स पर टीका लगाया गया और 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

एंडोफाइटिक कवक से टैक्सोल की स्क्रीनिंग, निष्कर्षण और मात्रा का ठहराव

जोजोबा में रहने वाले बरामद एंडोफाइटिक कवक को आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडीबी) पर उगाकर टैक्सोल उत्पादन के लिए जांचा गया था [38]। 7 दिन पुराने फन गैल आइसोलेट्स में से प्रत्येक के एक प्लग को पीडीबी के 1/250 मिलीलीटर एर्लेनमेयर कार्यों में 15 दिनों के लिए 15 दिनों के लिए 30±1 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया, झटकों की स्थिति में (120) आरपीएम)। ऊष्मायन के बाद, संस्कृतियों को फ़िल्टर किया गया था, और फैटी एसिड को अवक्षेपित करने के लिए छानने को 0.2 प्रतिशत सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ संशोधित किया गया था। टैक्सोल को डाइक्लोरोमेथेन के साथ निकाला गया है, और कार्बनिक चरण को एकत्र किया गया और सूखने तक वाष्पित किया गया, और अवशेषों को मेथनॉल में फिर से भंग कर दिया गया [17, 39]। टैक्सोल को टीएलसी द्वारा मर्क 1 मिमी (20×20 सेमी) पूर्व-लेपित सिलिका जेल प्लेट्स (टीएलसी सिलिका जेल 60 एफ254, डार्मस्टेड, जर्मनी) का उपयोग करके अलग किया गया और पहचाना गया, 254 एनएम [39] पर यूवी रोशनी द्वारा पता लगाया गया। टैक्सोल के कथित धब्बों को टीएलसी सिलिका जेल प्लेटों से निकाला गया और मेथनॉल में घोल दिया गया, 10 मिनट के लिए जोर से घुमाया गया और 5 मिनट के लिए 1000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। अवक्षेपित सिलिका कणों को हटा दिया गया था, और सतह पर तैरनेवाला को C18 रिवर्स चरण कॉलम (एक्लिप्स प्लस C18 4) के HPLC (यंग इन, क्रोमास, 9110 प्लस क्वाटर नैरी पंप, कोरिया) द्वारा टैक्सोल मात्रा निर्धारण और शुद्धता जांच के लिए ले जाया गया था।6 ×150 मिमी, 3.5 माइक्रोमीटर, कैट. #959,963-902)। उपयोग किया गया मोबाइल चरण मेथनॉल/एसीटोनिट्राइल/पानी (25:35:40, वी/वी/वी) था जो 20 मिनट [40] के लिए 1.0 मिली/मिनट की दर से था, और टैक्सोल अंशों को 227 एनएम पर मापा गया था, और उनके प्रामाणिक नमूने की तुलना में अवधारण समय और अवशोषण शिखर क्षेत्र से रासायनिक पहचान और सांद्रता की पुष्टि की गई।

पुनर्प्राप्त एंडोफाइटिक कवक की रूपात्मक और आणविक पहचान

संदर्भ की कुंजी [33-36] के अनुसार पीडीए, सीज़ापेक-डॉक्स और माल्ट एक्सट्रेक्ट मीडिया पर विकसित होकर एंडोफाइटिक फंगल आइसोलेट्स को उनकी मैक्रो और माइक्रो-मॉर्फोलॉजिकल विशेषताओं के आधार पर उनकी प्रजातियों के स्तर पर पहचाना गया था। सबसे शक्तिशाली टैक्सोल-उत्पादक फंगल आइसोलेट्स की पहचान को आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर (आईटीएस) [41, 42] के अनुक्रम के आधार पर आणविक रूप से पुष्टि की गई थी। फंगल जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) को तरल नाइट्रोजन में मायसेलिया (~0.2 ग्राम) को चूर्णित करके निकाला गया, फिर 1 मिलीलीटर सीटीएबी निष्कर्षण बफर (2 प्रतिशत सीटीएबी, 2 प्रतिशत पीवीपी40, {) में वितरित किया गया। {21}}.2 प्रतिशत 2-मर्कैप्टोएथेनॉल, 20 एमएम ईडीटीए, 1.4 एम NaCl इन 100 एमएम ट्रिस−एचसीएल, पीएच 8.0)। पीसीआर प्राइमर सेट ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ और ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ थे। पीसीआर प्रतिक्रिया में 2×पीसीआर मास्टर मिश्रण (i-Taq™, कैट नंबर 25027) के 10 ul, gDNA के 2 ul, प्रत्येक प्राइमर के 1 ul (10 pmol/ul) शामिल हैं, और बाँझ आसुत के साथ 20 ul तक पूरा किया गया है। पानी। पीसीआर को 2 मिनट के लिए 94 डिग्री पर प्रारंभिक विकृतीकरण, 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री पर विकृतीकरण, 10 सेकंड के लिए 55 डिग्री पर एनीलिंग, 35 चक्रों के लिए 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री पर विस्तार और 2 के लिए 72 डिग्री पर अंतिम विस्तार के लिए प्रोग्राम किया गया था। मि. पीसीआर एम्पलीकॉन्स का विश्लेषण 1×टीबीई बफर (एम्बियन कैट# एएम9864) में 1.5 प्रतिशत एग्रोस जेल द्वारा किया गया, 1 केबी डीएनए सीढ़ी (कैट. # पीजी010-55डीआई) का उपयोग करके और जेल दस्तावेज़ीकरण प्रणाली द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया। एम्पलीकॉन्स को समान प्राइमर सेट के साथ एप्लाइड बायोसिस्टम्स सीक्वेंसर, HiSQV बेस, संस्करण 6.0 द्वारा शुद्ध और अनुक्रमित किया गया था। प्राप्त अनुक्रमों को एनसीबीआई डेटाबेस पर गैर-अनावश्यक रूप से खोजा गया, एमईजीए 6.0 सॉफ्टवेयर में आयात किया गया, और क्लस्टल डब्ल्यू मांसपेशी एल्गोरिदम [43] के साथ संरेखित किया गया और फाइलोजेनेटिक पेड़ का निर्माण एमईजीए 6.0 की पड़ोसी-जुड़ने की विधि के साथ किया गया था [44]।

निकाले गए टैक्सोल की रासायनिक संरचना

टैक्सोल के कथित धब्बों को टीएलसी सिलिका जेल प्लेटों से निकाला गया और शुद्ध किया गया, और शुद्धता और एकाग्रता को प्रामाणिक टैक्सोल की तुलना में λ 227 एनएम (आरआईजीओएल, अल्ट्रा -3000 श्रृंखला) पर यूवी-विज़ विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। [39]. समान परिस्थितियों में रिक्त मीडिया का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नकारात्मक आधार रेखा के रूप में किया गया था। शुद्ध टैक्सोल नमूनों के एफटी-आईआर स्पेक्ट्रम का विश्लेषण जेएएससीओ एफटी-आईआर 3600 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा किया गया था। टैक्सोल नमूने को केबीआर छर्रों के साथ पीसा गया था, वैक्यूम के तहत डिस्क में दबाया गया था, और प्रामाणिक नमूने की तुलना में अवशोषण को 400 से 4000 सेमी−1 [3] क्षेत्र में मापा गया था। निकाले गए टैक्सोल की रासायनिक संरचना की पुष्टि प्रामाणिक टैक्सोल की तुलना में एचएनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (जेईओएल, ईसीए -500 II, 500 मेगाहर्ट्ज एनएमआर) से की गई थी। नमूने CDCl3 में हल किए गए थे, रासायनिक बदलाव पीपीएम (δ-स्केल) में दिए गए हैं, और युग्मन स्थिरांक हर्ट्ज़ (हर्ट्ज) में व्यक्त किए गए हैं।

टैक्सोल उत्पादन पर विभिन्न प्रकार के मीडिया का प्रभाव

प्रत्येक फंगल आइसोलेट के 7 दिन पुराने कल्चर से दो एगर प्लग (9 मिमी) को आलू डेक्सट्रोज (पीडीबी), सीजापेकस-डॉक्स (सीजेडडी), एम1डी, और माल्ट एक्सट्रैक्ट (एमई) के 100 मिलीलीटर मध्यम/250 मिलीलीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में तीन प्रतियों में टीका लगाया गया था। ) शोरबा मीडिया। प्रत्येक मीडिया से कवक बीजाणुओं से मुक्त असंक्रमित नियंत्रणों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया, समान परिस्थितियों में 15 दिनों के लिए 30 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, कवक संस्कृतियों को फ़िल्टर किया गया, और टैक्सोल को निकाला गया और ऊपर बताए अनुसार निर्धारित किया गया।

टैक्सोल उपज को अधिकतम करने के लिए पोषण संबंधी स्थितियों का बायोप्रोसेस अनुकूलन

शक्तिशाली फन गैल आइसोलेट द्वारा टैक्सोल उपज को अधिकतम करने के लिए मध्यम संरचना का अनुकूलन प्लैकेट-बर्मन डिजाइन का उपयोग करके प्रतिक्रिया सतह पद्धति द्वारा किया गया था, जिसके बाद केंद्रीय समग्र डिजाइन [17-2 0, 45] का उपयोग किया गया था। आरएसएम डिज़ाइन से, शक्तिशाली फंगल आइसोलेट द्वारा टैक्सोल उत्पादन को प्रभावित करने वाले सकारात्मक और महत्वपूर्ण चर का मूल्यांकन डिज़ाइन-एक्सपर्ट 7.0 (स्टेट ईज़ इंक, मिनियापोलिस, यूएसए) द्वारा सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक प्रयोग तीन जैविक प्रतिकृतियों में चलाया गया और माध्य मानों पर विचार किया गया। वांछित स्थितियों में ऊष्मायन के बाद, कवक बायोमास को फ़िल्टर किया गया था, और टैक्सोल को ऊपर वर्णित अनुसार टीएलसी और एचपीएलसी द्वारा निकाला और मात्राबद्ध किया गया था।

प्लैकेट-बर्मन डिज़ाइन

प्लैकेट-बर्मन डिज़ाइन का उपयोग अक्सर फंगल विकास और बायोएक्टिव सेकेंडरी मेटाबोलाइट्स के उत्पादन के लिए मीडिया घटक के अनुकूलन के लिए किया गया है, जो टैक्सोल उत्पादन को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण चर का मूल्यांकन करता है [18, 2{6}}, 46]। कारक का चुनाव गुणात्मक और मात्रात्मक स्क्रीनिंग में प्रयुक्त मीडिया पर आधारित था। ग्यारह कारकों को शामिल किया गया है; माल्ट अर्क, पेप्टोन, सुक्रोज, सोयाटोन, ग्लूटामाइन, बीफ़ अर्क, और तापमान, पीएच, ऊष्मायन समय, और झटकों की गति के मान और कारक दो स्तरों पर भिन्न थे, और न्यूनतम और अधिकतम स्तर श्रेणियों का चयन किया गया था। 12 प्रयोगों का एक सेट तैयार करने के लिए सांख्यिकीय डिज़ाइन-विशेषज्ञ 7.0 का उपयोग किया गया था। प्रत्येक प्रयोग के लिए, टैक्सोल उत्पादन तीन जैविक प्रतिकृतियों में निर्धारित किया गया था, और टैक्सोल उपज के औसत पर विचार किया गया था।

सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का प्रतिगमन विश्लेषण किया गया था। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक चर के प्रभाव की गणना की गई (बायोमेट्रिक, 2020):

जहां, ई एक परीक्षण चर का प्रभाव है, एम प्लस, और एम- परीक्षणों का टैक्सोल एकाग्रता है, उस पर पैरामीटर क्रमशः उच्च और निम्न स्तर पर था, और एन प्रयोगों की संख्या है जो किए गए थे। उत्पादन पर प्रत्येक चर का प्रभाव उनके संबंधित ई-मूल्यों की गणना करके निर्धारित किया गया था।

जहां टोट हाई उच्च स्तर पर कुल प्रतिक्रियाएं हैं, टोट लो निम्न स्तर पर कुल प्रतिक्रियाएं हैं, और नो परीक्षणों की संख्या है।

टैक्सोल उत्पादन को प्रभावित करने वाले कारकों के बीच केंद्रीय समग्र डिजाइन और बातचीत

चयनित फंगल आइसो लेट द्वारा टैक्सोल उत्पादन को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण सकारात्मक कारकों को एक प्रतिक्रिया सतह प्रकार सीसीडी मॉडल प्रयोगात्मक डिजाइन [47] का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। सीसीडी का उपयोग करके, मध्यम घटकों की सांद्रता को अनुकूलित किया गया था, और उनके अध्ययन किए गए इंटरैक्शन का उपयोग तीन चर के लिए कुल 20 प्रयोग उत्पन्न करने के लिए किया गया था। शक्तिशाली फंगल आइसोलेट से टैक्सोल उत्पादन के लिए चर के इष्टतम स्तर को निर्धारित करने के लिए, विभिन्न कारकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने और टैक्सोल उत्पादन को प्रभावित करने वाले प्रत्येक कारक की परिवर्तनीय स्थिति निर्धारित करने के लिए त्रि-आयामी (3 डी) प्रतिक्रिया सतह वक्र तैयार किए गए थे। 3डी ग्राफ़ तीन कारकों के स्थिरांक को एक आदर्श स्तर पर रखकर और अन्य दो कारकों के विभिन्न स्तरों के लिए टैक्सोल उपज की प्राप्त प्रतिक्रिया को प्लॉट करके बनाए गए थे।

टैक्सोल उपज पर गामा विकिरण का प्रभाव

टैक्सोल का उत्पादन करने वाले शक्तिशाली एंडोफाइटिक आइसोलेट्स को अलग-अलग गामा विकिरण खुराक (0.25–3.0 kGy) की तुलना में 6 0 कोबाल्ट स्रोत (गामा सेल 4000- ए-इंडिया) के साथ -विकिरण के संपर्क में लाया गया था। गैर-विकिरणित संस्कृति के नियंत्रण के लिए; प्रयोग के समय खुराक दर 1.2 kGy/h। नियंत्रण के रूप में गैर-विकिरणित बीजाणु के इनोकुलम की तुलना में, अनुकूलित मीडिया को मानक सांस्कृतिक परिस्थितियों के तहत विकिरणित संस्कृति द्वारा टीका लगाया गया था। संस्कृतियों को एक रोटरी शेकर (120 आरपीएम) पर 15 दिनों के लिए 30±2 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, संस्कृतियों को फ़िल्टर किया गया और टैक्सोल को ऊपर वर्णित अनुसार टीएलसी और एचपीएलसी द्वारा निकाला, शुद्ध और मात्राबद्ध किया गया।

सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) का संश्लेषण और लक्षण वर्णन; टैक्सोल के साथ संयुग्मन

टैक्सोल की कैंसर रोधी गतिविधि

शुद्ध टैक्सोल और टैक्सोल-पीवीपी-एयूएनपी की गतिविधि लिवर कार्सिनोमा (एचपीजी2), और स्तन कार्सिनोमा (एमसीएफ7) के खिलाफ संयुग्मित होती है, जो 3- (4,{6}}डाइमिथाइलथियाज़ोल- 2-वाईएल) द्वारा निर्धारित की गई थी। -2,5-डिफेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख [48]। 96- वेल प्लेट को प्रति वेल 103 कोशिकाओं के साथ बोया गया, और रात भर 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया, फिर दवा की विभिन्न सांद्रताएं जोड़ी गईं, और प्लेटों को 48 घंटे के लिए फिर से इनक्यूबेट किया गया। एमटीटी अभिकर्मक (25 उल) जोड़ा गया था, और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था, और विकसित फॉर्मेज़ान कॉम्प्लेक्स का बैंगनी रंग λ570 एनएम पर मापा गया था। IC50 मान को सकारात्मक नियंत्रण के लिए सामान्य करने वाली ट्यूमर कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या के 50 प्रतिशत की वृद्धि को कम करने वाली दवा की मात्रा द्वारा व्यक्त किया गया था।

टैक्सोल और टैक्सोल-एयूएनपी संयुग्मों की रोगाणुरोधी गतिविधि

टैक्सोल और टैक्सोल-एयूएनपी संयुग्मों की रोगाणुरोधी गतिविधि का मूल्यांकन विभिन्न जीवाणु आइसोलेट्स के खिलाफ किया गया था; कैंडिडा अल्बिकन्स के अलावा बैसिलस सबटिलिस एटीसीसी 6633 और स्टैफिलोकोकस एपिडर्मिडिस, स्यूडोमोनस एरुगिनोसा, एस्चेरिचिया कोली और एंटरोबैक्टर एग्लोमेरन्स। परीक्षण किए गए जीवाणु कोशिकाओं को बाँझ पेप्टोन पानी में निलंबित कर दिया गया ताकि मानक इनोकुलम प्राप्त किया जा सके ~0.5 मैकफ़ारलैंड (1-1.5)× 1{{10}}8 सीएफयू/एमएल λ6 पर {{18 }}0 एनएम. माइक्रोबियल रोगजनकों के विकास में वृद्धि अवरोध (मिमी) का आकलन अगर डिस्क प्रसार विधि द्वारा किया गया था। 6.0 मिमी व्यास वाले बाँझ मानक एंटीबायोटिक डिस्क का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में स्टेराइल एंटीबायोटिक डिस्क (6.0 मिमी) को 20 उल मेथनॉल और एमोक्सिसिलिन-क्लैवुलैनिक एसिड (एएमसी) से लोड किया गया था। डिस्क को टैक्सोल, टैक्सोल-पीवीपी-एयूएनपी और एयूएनपी (1.0 यूजी/एमएल) की समान सांद्रता के साथ लोड किया गया था। तीन जैविक प्रतिकृतियां तैयार की गईं। प्लेटों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया और अवरोध के क्षेत्रों को मापा गया। टैक्सोल की रोगाणुरोधी गतिविधि को सामान्य करने के लिए एमोक्सिसिलिन क्लैवुलैनिक एसिड (एएमसी) और निस्टैटिन का उपयोग किया गया था। विकास का अवरोध क्षेत्र एक वर्नियर कैलिपर (मिमी) द्वारा निर्धारित किया गया था।

सांख्यिकीय आंकड़े

शक्तिशाली टैक्सोल उत्पादकों की रूपात्मक और आणविक पहचान

शक्तिशाली फंगल आइसोलेट उत्पादक टैक्सोल की रूपात्मक विशेषताओं की जांच मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्म वर्णनात्मक कुंजियों के अनुसार की गई, जैसा कि सामग्री और विधियों में वर्णित है, और ए फेवस (छवि 2) के साथ इसकी रूपात्मक निकटता का पता चला। यूनिवर्सल के अनुसार, फंगल आइसोलेट को पीडीए पर 30 डिग्री पर 10 दिनों के लिए उगाया गया था और मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्मदर्शी विशेषताओं से इसकी पहचान का पता चला जैसे कि शंकुधारी सिर, शाखाओं में बंटने का तरीका, कलंक की पहचान, और शंकुधारी ऑन्टोलॉजी और फलने वाले शरीर का गठन। रूपात्मक कुंजियाँ [33], और एस्परगिलस फेवस के समान पाई गईं। शक्तिशाली टैक्सोल-उत्पादक आइसोलेट ए. फेवस को एक टेम्पलेट के रूप में जीडीएनए का उपयोग करके, उनके आईटीएस अनुक्रमों के आधार पर आगे पहचाना गया था। ए. फेवस के पीसीआर एम्प्लिकॉन्स (~550 बीपी) को हल किया गया, शुद्ध किया गया और अनुक्रमित किया गया (चित्र 2)। ए. फेवस का आईटीएस अनुक्रम एनसीबीआई डेटाबेस पर खोजा गया गैर-अनावश्यक विस्फोट था, जिसमें ए. फेवस के साथ 99 प्रतिशत समानता, शून्य ई. मान और 95 प्रतिशत क्वेरी कवरेज प्रदर्शित हुआ। इस प्रकार, सूक्ष्मदर्शी और आणविक विश्लेषणों से, लक्ष्य आइसोलेट की पुष्टि ए. फेवस के रूप में की गई और जेनबैंक पर परिग्रहण संख्या MW485934.1 के साथ जमा किया गया, साथ ही, आइसोलेट को मिस्र के असिउत यूनिवर्सिटी माइकोलॉजिकल सेंटर (एयूएमसी) में जमा किया गया है। बयान संख्या AUMC13892. वर्तमान आइसोलेट में ए के साथ 99 प्रतिशत समानता थी। फेवस आइसोलेट्स MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

चित्र 1 जोजोबा पौधे का रूपात्मक दृश्य। शक्तिशाली टैक्सोल-उत्पादक एंडोफाइटिक कवक की बी प्लेट संस्कृतियाँ; ए. फेवस बीडी1 (13), ए. नाइजर एलवी1 (21), पेनिसिलियम पोलोनियम (23), और ए. ओराइजी बीडी (25) 30 डिग्री पर 8 दिनों के ऊष्मायन के बाद पीडीए पर। फंगल आइसोलेट्स को पीडीबी पर उगाया गया, और मानक स्थितियों में इनक्यूबेट किया गया, और टैक्सोल को निकाला गया और टीएलसी (सी) द्वारा जांचा गया। शक्तिशाली फंगल आइसोलेट्स से टैक्सोल का डी एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम। एचपीएलसी से मात्रा के अनुसार टैक्सोल की ई उपज। फंगल आइसोलेट्स से निकाले गए टैक्सोल का एफ, यूवी-विज़ वर्णक्रमीय विश्लेषण। प्रामाणिक टैक्सोल की तुलना में निकाले गए टैक्सोल का जी एफटी-आईआर विश्लेषण

चित्र 2 पीडीए पर 3, 5 और 8 दिनों की वृद्धि के बाद जोजोबा के एक एंडोफाइट ए फेवस की मैक्रोमोर्फोलॉजिकल विशेषताएं। सूक्ष्म-रूपात्मक विशेषताएं, 400X आवर्धन द्वारा ए. फेवस का शंक्वाकार शीर्ष। ए. फेवस का सी पीसीआर एम्प्लिकॉन 500 बीपी का आईटीएस क्षेत्र, 1 केबी सीढ़ी तक सामान्यीकरण (कैट.#. एसएम0312)। डी अधिकतम संभावना विधि द्वारा आईटीएस ए फेवस का फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण [44]