पैराक्वाट की कम सांद्रता एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनेज 1/2, प्रोटीन किनेज बी, और सी-जून एन-टर्मिनल किनेज 1/2 पाथवे: पैराक्वाट-प्रेरित सेल डेथ में सी-जून एन-टर्मिनल किनेज की भूमिका

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

मिरिया निसो-सैंटानो, जोसे एम। मोरैन, लूर्डेस गार्सा-रुबियो, एना गोमेज़-मार्टन, रोजा ए। गोंजालेज़-पोलो, जर्मेन सोलर, § और जोस एम। फ्यूएंट्स

सार:

पैराक्वाट एक जड़ी-बूटी है जो अपने प्रदर्शित न्यूरोटॉक्सिसिटी और 1-मिथाइल-4-फेनिलपीरिडिनियम (एमपीपी प्लस) के लिए मजबूत संरचनात्मक समानता के कारण पार्किंसनिज़्म को प्रेरित करने के लिए एक संभावित जोखिम के साथ, एक प्रसिद्ध न्यूरोटॉक्सिन है जो एक समान नैदानिक ​​​​सिंड्रोम का कारण बनता है प्रतिपार्किंसंस रोग(पीडी)। हालाँकि, वर्तमान में किसी भी सेल सिस्टम में पैराक्वाट द्वारा सक्रिय सिग्नलिंग पाथवे के बारे में बहुत कम जानकारी है। इस अध्ययन में, हमने E18 कोशिकाओं में बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेसेस 1 और 2 (ERK1/2), c-Jun N-टर्मिनल किनसे (JNK), और प्रोटीन किनसे B (PKB) सक्रियण पर पैराक्वेट के प्रभाव की जांच की है। ईआरके 1/2, जेएनके 1/2, और पीकेबी फॉस्फोराइलेशन में पैराक्वाट की कम सांद्रता ने बहुत जल्दी वृद्धि को प्रेरित किया। फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3-किनेज (पीआई-3के) अवरोधक वोर्टमैनिन और एलवाई 294002 (2-(4-मॉर्फोलिनिल)-8-फिनाइल-4एच{{ 19}}बेंजोपायरन-4-एक) पीकेबी फास्फारिलीकरण में प्रारंभिक पैराक्वाट-प्रेरित वृद्धि को रोकता है। इसके अलावा, ERK1 / 2 सक्रियण में प्रारंभिक पैराक्वाट-मध्यस्थता वृद्धि माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे किनसे 1 (MEK1) अवरोधक PD 98059 (2 # -एमिनो -3 # -मेथॉक्सीफ्लेवोन) के प्रति संवेदनशील थी, जबकि JNK1 / 2 प्रतिक्रियाएं थीं जेएनके 1/2 अवरोधक एसपी 600125 (एंथ्रा [1-9- सीडी] पायराज़ोल -6 (2 एच) -एक) द्वारा अवरुद्ध। Wortmannin, LY 294002, या PD 98059 के साथ प्रीट्रीटमेंट ने E18 कोशिकाओं में पैराक्वाट कोशिका मृत्यु को प्रभावित नहीं किया। इसके विपरीत, SP 600125 ने E18 कोशिकाओं में पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु को काफी कम कर दिया। निष्कर्ष में, हमने दिखाया है कि पैराक्वेट की कम सांद्रता E18 कोशिकाओं में ERK1 / 2, JNK1 / 2, और PKB ​​फॉस्फोराइलेशन में बहुत जल्दी वृद्धि को उत्तेजित करती है। इसके अलावा, प्रस्तुत डेटा से पता चलता है कि JNK1 / 2 मार्ग का निषेध E18 कोशिकाओं को पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु से बचाता है और इस तथ्य का समर्थन करता है कि JNK1 / 2 के प्रारंभिक सक्रियण को रोकना पीडी उपचार में एक संभावित रणनीति का गठन कर सकता है। मुख्य शब्द: पैराक्वाट; कम सांद्रता; जेएनके; कोशिकीय मृत्यु; पार्किंसन।

एंटी-पार्किंसंस रोग जड़ी बूटी:सिस्टैंचे

परिचय

पार्किंसंस रोग (पीडी)एक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो लेवी बॉडीज (ओलानोव और टैटन, 1999) के रूप में जाने जाने वाले इंट्रासाइटोप्लास्मिक समावेशन के साथ उप-कॉन्स्टेंटिया नाइग्रा में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की मृत्यु की विशेषता है। केवल 5-10 प्रतिशत पीडी रोगियों के पास इस बीमारी का एक पारिवारिक रूप है जिसमें वंशानुक्रम के एक ऑटोसोमल प्रमुख मोड (गैसर, 2001) है। युवा-शुरुआत रोगियों में आनुवंशिक कारक महत्वपूर्ण हैं, लेकिन वे अधिक सामान्य छिटपुट पीडी में एक प्रमुख भूमिका निभाने की संभावना नहीं रखते हैं। इसके विपरीत, महामारी विज्ञान के अध्ययन कई पर्यावरणीय कारकों का संकेत देते हैं जो पीडी के विकास के जोखिम को बढ़ाते हैं।पार्किंसंस रोग) इनमें कीटनाशक, शाकनाशी, औद्योगिक रसायन, खेती और ग्रामीण परिवेश में रहना (Cory-Slechta et al।, 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al।, 2005; Tanner and BenShlomo, 1999) शामिल थे। पीडी में एक पर्यावरणीय कारक के समर्थन में सबसे ठोस तर्क एमपीटीपी (1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6- के जैविक प्रभावों की खोज से संबंधित है। टेट्रार्की-ड्रॉपरिडाइन)। यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विष एक सिंड्रोम पैदा करता है जो नैदानिक ​​​​और शारीरिक रूप से पीडी (कोपिन और मार्के, 1988; लैंगस्टन एट अल।, 1983) के समान है। इस अर्थ में, व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले हर्बिसाइड पैराक्वाट (1,1#-डाइमिथाइल -4,4#-बायपिरिडिनियम) को एमपीटीपी के सक्रिय मेटाबोलाइट एमपीपीþ के लिए इसकी संरचनात्मक समरूपता दोनों के आधार पर एक उपचारात्मक जोखिम कारक के रूप में सुझाया गया है। टैनर और लैंगस्टन, 1990), और पार्किंसनिज़्म की रिपोर्ट पर एजेंट के संपर्क के साथ सहसंबद्ध (हर्ट्ज़मैन एट अल।, 1990; हबल एट अल।, 1993; जिमेनेज़-जिमेनेज़ेट अल।, 1992; लिउ एट अल।, 1997; वांग एट। अल।, 1992)। हालाँकि, जबकि MPPþ कोशिका मृत्यु में शामिल सिग्नलिंग मार्ग अच्छी तरह से ज्ञात हैं (Halvorsen et al।, 2002; Gomez-Santos et al।, 2002; गोंजालेज-पोलो एट अल।, 2003), सक्रिय सिग्नलिंग मार्ग के बारे में बहुत कम जाना जाता है। पैराक्वाट द्वारा (चेंग एट अल।, 2003; चुन एट अल।, 2001; पेंग एट अल।, 2004) वैसे भी, पैराक्वेट की कम सांद्रता के संपर्क में आने के बाद देखी गई शुरुआती घटनाओं के बारे में कोई अध्ययन नहीं है।

MPPþ और पैराक्वाट सहित कई उत्तेजनाएं, इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग कैस्केड की एक सरणी को सक्रिय कर सकती हैं, जो कोशिका मृत्यु और कोशिका अस्तित्व मार्ग दोनों के साथ निकटता से जुड़ी हुई हैं। उदाहरण के लिए, MPPþ (गोमेज़-सैंटोस एट अल।, 2002; हलवोर्सन एट अल।, 2002) माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे (एमएपीके) परिवार और प्रोटीन किनसे बी (पीकेबी) के सदस्यों को सक्रिय करता है। TheMAPK परिवार के सदस्यों को MPPþ या पैराक्वाट द्वारा सक्रिय किया जाता है जिसमें बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेसेस 1 और 2 (ERK1/2), c-Jun N-टर्मिनल किनेसेस (JNK1 और JNK2), और p38 MAPK शामिल हैं। यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि ERK1 / 2 और पीकेबी सक्रियण एपोप्टोटिक सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करके सेल अस्तित्व को बढ़ावा देता है, जबकि जेएनके 1/2 और पी 38 एमएपीके की सक्रियता न्यूरोनल सेल डेथ (हार्पर और लोग्रासो, 2001; शिन एट अल।, 2001; ज़िया एट अल।, 1995) से जुड़ी है। . फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3-किनेज (पीआई-3के)/पीकेबी मार्ग का सक्रियण न्यूरोनल उत्तरजीविता (शिन एट अल।, 2001) में शामिल है। विशेष रूप से, जेएनके 1/2 मार्ग की सक्रियता एमपीपी-और पैराक्वाट विषाक्तता (कैसरिनो एट अल।, 2000; हल्वोर्सन एट अल।, 2002; पेंग एट अल।, 2004) में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है और इसके परिणामस्वरूप सेलुलर प्रक्रियाओं में प्रभावित होती है। पी.डी.(पार्किंसंस रोग).

हर्ब सिस्टैंच: एंटी-पार्किंसंस रोग

सामग्री और तरीके

सेल लाइन और संस्कृति।

इस अध्ययन में अनायास अमर चूहे के मस्तिष्क के न्यूरोब्लास्ट्स, E18 कोशिकाओं का उपयोग किया गया। E18 सेल लाइन 18-दिन पुराने भ्रूण चूहे सेरेब्रल कॉर्टिस की संस्कृतियों से सहज अमरता द्वारा प्राप्त की गई है और कृपया डॉ. ए. मुनोज़ (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, मैड्रिड, स्पेन) द्वारा प्रदान की गई थी। . E18 कोशिकाएं आदिम न्यूरोब्लास्ट का प्रतिनिधित्व करती हैं जो NF 68 और आदिम न्यूरोनल मार्कर नेस्टिन को व्यक्त करते हैं लेकिन एस्ट्रोसाइट मार्कर, ग्लियल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन की कमी होती है। डिब्यूटिरिल-सीएमपी के साथ आंशिक विभेदन प्रेरण के बाद, कोशिकाएं एनएफ 145, एनएफ 220, और न्यूरॉन-विशिष्ट एनोलेज़ (मुनोज़, व्यक्तिगत संचार) जैसे अतिरिक्त न्यूरोनल मार्करों को व्यक्त करती हैं। कोशिकाओं को हैंक्स एफ -12 (Hyclone, Brevieres, France) में विकसित किया गया था और 10 प्रतिशत FCS (Hyclone), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 mg / ml), और पेनिसिलिन (100 U / ml) के साथ पूरक किया गया था। कोशिकाओं को 5 3 10 5 पर एक 75- सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क (टीपीपी, ट्रैसैडिंगन, स्विटजरलैंड) में बीज दिया गया और 5% सीओ 2/95 प्रतिशत वायु वातावरण के तहत 37 सी पर ऊष्मायन किया गया। एक trypsin-EDTA समाधान (Hyclone) का उपयोग करके trypsinization द्वारा सप्ताह में एक बार संस्कृतियों को पारित किया गया था।

सेल उपचार।

75-cm2 टिशू कल्चर फ्लास्क में कंफ्लुएंट सेल्स (~ 80 प्रतिशत) को trypsinized किया गया और 5 3104 सेल्स/cm2 की सांद्रता में टिशू कल्चर डिश में सीड किया गया। चौबीस घंटे बाद, माध्यम की आकांक्षा की गई और इसे अकेले ताजा माध्यम या माध्यम से बदल दिया गया जिसमें पैराक्वाट की संकेतित सांद्रता थी। आगे के प्रयोगों में, किनेज अवरोधकों के विभिन्न सांद्रता (एलवाई 294002, वोर्टमैनिन, एसपी 600125, और पीडी)(पार्किंसंस रोग)98059, सभी टोक्रिस, ब्रिस्टल, यूनाइटेड किंगडम से) को पैराक्वेट एक्सपोजर से 30 मिनट पहले जोड़ा गया था। चूंकि काइनेज इनहिबिटर को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड में भंग कर दिया गया था, इसलिए नियंत्रण उच्चतम सांद्रता (0.2 प्रतिशत वॉल्यूम / वॉल्यूम) के साथ किया गया था। डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड जोड़ नियंत्रण प्लेटों के व्यवहार्यता मूल्यों को प्रभावित नहीं करता है।

सेल व्यवहार्यता परख।

सेल व्यवहार्यता वर्णमिति एमटीटी परख (मोसमैन, 1983) द्वारा निर्धारित की गई थी। व्यवहार्य कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम सक्सेनेट डिहाइड्रोजनेज एमटीटी को एक फॉर्मेज़ान डाई में चयापचय कर सकता है जो 57 0 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित करता है। इन प्रयोगों के लिए, 24-अच्छी तरह से परीक्षण प्लेटों का उपयोग किया गया था। प्रत्येक उपचार के अंत में, पीबीएस में 5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में तैयार किए गए एमटीटी के 1 0 0 एल को प्रत्येक प्लेट में जोड़ा गया था। ऊष्मायन के 3 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दिया गया था, और फॉर्मेज़न अवक्षेप को अम्लीय आइसोप्रोपेनॉल (पूर्ण आइसोप्रोपेनॉल में 0.04–0.1 एन एचसीएल) के साथ घुलनशील किया गया था। परिवर्तित डाई का अवशोषण 570 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर 630-690 एनएम पर पृष्ठभूमि घटाव के साथ मापा गया था। अनुपचारित संस्कृतियों का अवशोषण 100 प्रतिशत निर्धारित किया गया था।

एमटीटी परख द्वारा प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वर्णमिति एलडीएच परख किट (रोच, इंडियानापोलिस, आईएन) का उपयोग करके संस्कृति माध्यम में साइटोसोलिक एंजाइम लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) की रिहाई को मापकर कोशिका मृत्यु का भी आकलन किया गया था। . एलडीएच रिसाव को संस्कृति माध्यम में एलडीएच गतिविधि के अनुपात के रूप में कुल गतिविधि प्रति कुएं (3100) के रूप में परिभाषित किया गया था। दोनों विधियों का उपयोग करके तुलनीय डेटा प्राप्त किया गया था।

सेल के अर्क और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की तैयारी।

प्रायोगिक उपचारों के बाद, कोशिकाओं (60- मिमी व्यंजन में सुसंस्कृत) को दो बार ठंडे पीबीएस के साथ धोया गया और स्क्रैपिंग द्वारा हटा दिया गया और फिर 4 सी पर 5 मिनट के लिए 900 3 जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। कोशिकाओं को एक बफर में lysed किया गया था। 50mM HEPES, pH 7.5, 300mMNaCl, 1 प्रतिशत ट्राइटन X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4, और प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) युक्त। कोशिकाओं को 13, 000 3 g पर 4 सी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरनेवाला 80 सी पर पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण तक संग्रहीत किया गया था। मानक के रूप में बीएसए का उपयोग करके ब्रैडफोर्ड (1976) के अनुसार प्रोटीन सांद्रता को मापा गया।

प्रोटीन की समान मात्रा (10 एलजी प्रति शर्त) को 12 प्रतिशत एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन में हल किया गया और पारंपरिक आंशिक रूप से संशोधित तरीकों (फ्यूएंट्स एट अल।, 2000) के अनुसार पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। संक्षेप में, मिनी ट्रांस-ब्लॉट सेल उपकरण (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) का उपयोग करके प्रोटीन को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया (60 मिनट के लिए 250 एमए)। प्रतिरक्षण की प्रक्रिया में टीटीबीएस (10 एमएम ट्रिस/एचसीएल, पीएच 7.5, 150 एमएम NaCl, और 0.2 प्रतिशत ट्वीन -20) के साथ झिल्ली (कमरे के तापमान पर 60 मिनट) का स्थानांतरण और अवरोधन शामिल है जिसमें 10 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध होते हैं। टीटीबीएस 10 प्रतिशत गैर-वसा वाले सूखे दूध या 5 प्रतिशत बीएसए में खरगोश पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग, बेवर्ली, एमए, पतला 1: 1000 से सभी) के साथ कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए झिल्ली को ऊष्मायन किया गया था। धोने के बाद (टीटीबीएस के साथ दो 5- मिनट की अवधि के लिए), झिल्ली को पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (टीटीबीएस में 10 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध के साथ 1: 5000) के साथ ऊष्मायन (कमरे के तापमान पर 60 मिनट) किया गया था। धोने के बाद (दो 5- मिनट की अवधि और एक 10- मिनट की अवधि के लिए), बाध्य एंटीबॉडी का पता लगाने की कल्पना ईसीएल-प्लस अभिकर्मक (एमर्शम बायोसाइंसेज, ऑर्से, फ्रांस) का उपयोग करके केमिलुमिनेसिसेंस द्वारा की गई थी और मात्रा द्वारा विश्लेषण किया गया था। एक सॉफ्टवेयर (बायो-रेड)। एक्टिन सामग्री का विश्लेषण एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (सिग्मा से) का उपयोग करके नियंत्रण के रूप में किया गया था, टीटीबीएस में 1:2500 पतला 10 प्रतिशत नॉनफैट सूखे दूध के साथ)।

सांख्यिकीय विश्लेषण।

प्रत्येक प्रयोग को व्यक्तिगत प्रयोगों के परिणामों के बीच संतोषजनक सहसंबंध के साथ कम से कम तीन बार दोहराया गया था। दिखाए गए डेटा एक प्रतिनिधि प्रयोग के हैं; प्रत्येक समूह औसतन तीन से चार संस्कृति व्यंजन थे। सभी डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। एनोवा द्वारा परिणामों का विश्लेषण किया गया। 0.05 से कम के p मानों को महत्वपूर्ण माना गया।

एंटी-पार्किंसंस रोग:सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट

परिणाम

E18 कोशिकाओं में Paraquat के साइटोटोक्सिक प्रभाव

जैसा कि पहले बताया गया था (कैपेलेटी एट अल।, 1998; चुन एट अल।, 2001; गोंजालेज-पोलो एट अल।, 2004), कई सेल लाइनें पैराक्वेट के विषाक्त गुणों के प्रति संवेदनशील हैं। पैराक्वाट के संपर्क में आने से सेल व्यवहार्यता में खुराक पर निर्भर कमी आई। (अंजीर। 1.) इस अध्ययन में, 24 घंटे के लिए 25एलएम पैराक्वाट के साथ इलाज किए गए ई18 कोशिकाओं ने सेल व्यवहार्यता का 50 प्रतिशत नुकसान प्रदर्शित किया। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन एमटीटी में परिवर्तन को एक फॉर्मेज़ान डाई में मापकर किया गया था जो 570 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित करता है। इस परख का उपयोग बड़े पैमाने पर कई सेल लाइनों में कोशिका मृत्यु की निगरानी के लिए किया जाता है, जिसमें E18 कोशिकाएं (डोनेयर एट अल।, 2005; गार्सिया-रोमन एट अल।, 2001), और विभिन्न अपमान शामिल हैं, जिसमें पैराक्वाट (चुन एट अल।, 2001; गोंजालेज) शामिल हैं। -पोलो एट अल।, 2004)।

E18 कोशिकाओं में ERK1 / 2 का पैराक्वाट-प्रेरित सक्रियण

पैराक्वाट के साथ इलाज किए गए E18 कोशिकाओं में ERK1 / 2 सक्रियण में वृद्धि की निगरानी पश्चिमी सोख्ता द्वारा फॉस्फोस्पेसिफिक ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) एंटीबॉडी का उपयोग करके की गई थी। 25lM पैराक्वाट के साथ E18neuroblasts कोशिकाओं के प्रदर्शन ने ERK1 / 2 (44/42 kDa) (छवि 2A) की फॉस्फोराइलेशन (Thr202 / Tyr204) स्थिति में उल्लेखनीय वृद्धि की। फॉस्फोराइलेशन में अधिकतम वृद्धि 5 मिनट के बाद हुई, जिसके बाद फॉस्फोराइलेशन का स्तर धीरे-धीरे कम होकर बेसल स्तरों के करीब आ गया। इसके अलावा, पैराक्वाट द्वारा प्रेरित ईआरके 1/2 फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि एकाग्रता-निर्भर नहीं थी (छवि 2 बी)। MEK1 अवरोधक, PD . के साथ पूर्व उपचार(पार्किंसंस रोग)98059 (50lM; डुडले एट अल।, 1995) ERK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन (चित्र 3) में पैराक्वेट-प्रेरित वृद्धि को पूरी तरह से रोक दिया।

E18 कोशिकाओं में PKB का पैराक्वाट-प्रेरित सक्रियण

E18 कोशिकाओं में PKB सक्रियण का पता पश्चिमी सोख्ता द्वारा फॉस्फो-विशिष्ट (Ser473) एंटीबॉडी का उपयोग करके लगाया गया था। 25lM पैराक्वेट के साथ E18 कोशिकाओं के उत्तेजना ने PKB फॉस्फोराइलेशन (चित्र 4A) में उल्लेखनीय वृद्धि की। यह वृद्धि 20 मिनट के बाद होती है, जो ईआरके 1/2 फॉस्फोराइलेशन की तुलना में फॉस्फोराइलेशन के स्तर के बाद धीरे-धीरे बेसल स्तरों (छवि 4 ए) के करीब घट जाती है। इसके अलावा, पीकेबी फॉस्फोराइलेशन में पैराक्वाट-मध्यस्थता वृद्धि अधिकतम 25 एलएम पैराक्वाट (छवि 4 ए) के साथ एकाग्रता-निर्भर थी। चूंकि PKB सक्रियण के लिए PI-3K आवश्यक है, E18 कोशिकाओं में पैराक्वाट-प्रेरित PKB सक्रियण में PI-3K की भूमिका, इसलिए, PI-3K अवरोधक wortmannin और का उपयोग करके पता लगाया गया था। एलवाई 294002।

PKB फॉस्फोराइलेशन में पैराक्वाट-मध्यस्थता वृद्धि पूरी तरह से E18 कोशिकाओं के दिखावा (30 मिनट) के बाद 100nM wortmannin और 30lM LY 294002 (छवि 5) के साथ पूरी तरह से अवरुद्ध हो गई थी। इन अवलोकनों से पता चलता है कि एक पीआई -3 के-आश्रित मार्ग E18 कोशिकाओं में पीकेबी फास्फोरिलीकरण में पैराक्वाट-प्रेरित वृद्धि की मध्यस्थता करता है।

E18 कोशिकाओं में JNK1 / 2 का पैराक्वाट-प्रेरित सक्रियण

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पैराक्वाट जेएनके 1/2in न्यूरॉन्स (चुन एट अल।, 2001; पेंग एट अल।, 2004) और नॉनन्यूरोनल कोशिकाओं (बेनेट एट अल।, 2001; चेंग एट अल।, 2003) को सक्रिय करता है। हालांकि, इस काम में नियोजित लोगों की तुलना में उपयोग की जाने वाली सांद्रता काफी हद तक अधिक है। इसके अतिरिक्त, JNK1/2 सक्रियण की कल्पना करने के लिए चयनित समय भी अधिक लंबा है। E18 कोशिकाओं में JNK1 / 2 सक्रियण का पता पश्चिमी सोख्ता द्वारा फॉस्फोस्पेसिफिक JNK (Thr183 / Tyr185) एंटीबॉडी का उपयोग करके लगाया गया था। 25lM पैराक्वेट के साथ E18 कोशिकाओं के उत्तेजना ने JNK (46/54 kDa) फॉस्फोराइलेशन (चित्र। 6A) में एक उल्लेखनीय और प्रारंभिक वृद्धि का उत्पादन किया। ये वृद्धि 5 मिनट के बाद अधिकतम थी जिसके बाद फॉस्फोराइलेशन का स्तर बेसल स्तरों (छवि 6 ए) की ओर कम हो गया। हालांकि, जेएनके 1/2 फॉस्फोराइलेशन में पैराक्वाटमेडियेटेड वृद्धि एकाग्रता-निर्भर नहीं थी (छवि 6 बी)। JNK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन में पैराक्वाट-मध्यस्थता वृद्धि JNK1 / 2 अवरोधक SP 600125 (10lM; अंजीर। 7; बेनेट एट अल।, 2001) के प्रति संवेदनशील थी। अंत में, पैराक्वाट (25lM) ने समान समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों (डेटा नहीं दिखाया गया) में E18 कोशिकाओं में p38 MAPK फॉस्फोराइलेशन में औसत दर्जे की वृद्धि को उत्तेजित नहीं किया। ये प्रयोग फॉस्फोस्पेसिफिक p38 MAPK (Thr180 / Tyr182) एंटीबॉडी का उपयोग करके किए गए थे।

Paraquat और Kinase अवरोधकों के साथ E18 कोशिकाओं के उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता का मापन

यह दिखाने के बाद कि पैराक्वेट सभी मामलों में E18 कोशिकाओं में एक प्रारंभिक सक्रियण ERK1 / 2, PKB, और JNK1 / 2 उत्पन्न करता है, हमने बाद में औषधीय विशिष्ट का उपयोग करके पैराक्वाट की कम सांद्रता से प्रेरित कोशिका मृत्यु में इन किनेज मार्गों के तेजी से सक्रियण की भूमिका निर्धारित की। अवरोधक। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, E18 कोशिकाओं का 25lM पैराक्वाट के संपर्क में आने से सेल व्यवहार्यता (लगभग 50 प्रतिशत) में उल्लेखनीय कमी आई है। पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में ERK1 / 2, PKB, और JNK1 / 2 की भूमिका की जांच करने के लिए, E18 कोशिकाओं को निम्नलिखित किनेज अवरोधकों के साथ 30 मिनट के लिए पूर्वनिर्मित किया गया था: PD(पार्किंसंस रोग)98059 (50lM; MEK1 / 2 अवरोधक), LY 294002 (30lM; PI -3 K अवरोधक), wortmannin (100nM; PI -3 K अवरोधक), और SP 600125 (10lM; JNK1 / 2 अवरोधक)। जैसा कि चित्र 8 में दिखाया गया है (और इसे तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है), wortmannin, LY 294002, और PD 98059 का 25lM पैराक्वाट द्वारा प्रेरित सेल व्यवहार्यता के नुकसान पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा।

बहस

हाल ही में, विभिन्न अध्ययनों ने इस संभावना में रुचि बढ़ाई है कि कीटनाशकों जैसे पर्यावरणीय न्यूरोटॉक्सिन नॉनजेनेटिक पीडी के विकास से संबंधित हो सकते हैं।(पार्किंसंस रोग)(कोरी स्लेच्टा एट अल।, 2005; लैंड्रिगन एट अल।, 2005; नॉरिस एट अल।, 2004; रिट्ज एंड यू, 2000; शेरर एट अल।, 2001)। PQ संभावित शाकनाशी में से एक है जो PD में शामिल है, क्योंकि MPPþ के साथ एक समान रासायनिक संरचना और रोग की घटनाओं और PQused की मात्रा के बीच मजबूत सहसंबंध (लांसका, 1997; लिउ एट अल।, 1997; रिट्ज और यू, 2000)। फिर भी, पैराक्वेट के निम्न स्तर तक कम जोखिम में होने वाले न्यूरोनल विषाक्तता के तंत्र का निर्धारण नहीं किया गया है। किसी भी मामले में, पिछले कार्यों में प्रारंभिक प्रक्रिया में कोई दिलचस्पी नहीं है, जो कि पैराक्वाट के प्रदर्शन के बाद सामने आई है। वर्तमान अध्ययन की प्रमुख खोज यह है कि हमने दिखाया है कि E18neuroblast कोशिकाओं ने पैराक्वाट्रैपिड की कम सांद्रता के संपर्क में आने से आम तौर पर एंटीपैप्टोटिक सिग्नलिंग मार्ग PI -3 K / PKB और MEK ERK के सक्रिय फॉस्फोराइलेशन को बढ़ा दिया और आम तौर पर प्रॉपोपोटिक JNK1 / 2 एमएपीके। इसके विपरीत, पैराक्वाट ने समय को उत्तेजित नहीं किया- या p38 MAPK फॉस्फोराइलेशन में एकाग्रता-निर्भर औसत दर्जे की वृद्धि। जैसा कि ऊपर बताया गया है, हमने पैराक्वाट की कम सांद्रता का उपयोग किया। इस तथ्य की प्रासंगिकता कि क्या पैराक्वाट मस्तिष्क में प्रवेश कर सकता है या नहीं क्योंकि यह एक आवेशित अणु है, इस पर बहस हो चुकी है। हालांकि, हाल के निष्कर्षों (शिमिज़ु एट अल।, 2001) से पता चला है कि पैराक्वेट मस्तिष्क में जाने के लिए तटस्थ अमीनो एसिड पंप का उपयोग कर सकता है। इस कार्य में प्रस्तुत निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि कोशिका मृत्यु प्रक्रियाओं में फंसे एनके सहित कई सिग्नल मार्गों को तेजी से उत्तेजित करने के लिए सेल में केवल पैराक्वेट की कम सांद्रता की आवश्यकता होती है। पैराक्वाट की कम सांद्रता के कारण ये शुरुआती सक्रियता पहली बार, वर्तमान कार्य में प्रस्तावित हैं।

पैराक्वाट (चेंग एट अल।, 2003; पेंग एट अल।, 2004) से प्रेरित पीकेबी या ईआरके 1/2 के फॉस्फोराइलेशन स्तरों में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए बहुत कम ध्यान दिया गया है। किसी भी स्थिति में, पिछली रिपोर्टें (पेंग एट अल।, 2004) पैराक्वेट (400lM) की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता का उपयोग करती हैं, जो एक्सपोजर के 12-18 घंटे के बाद ईआरके के फॉस्फोराइलेशन डिग्री को मापती हैं। इस समय, उन्होंने पी-ईआरके स्तरों में परिवर्तन नहीं देखा। हमारे काम में, हमने ईआरके 1/2 (छवि 2 ए) के शुरुआती (5-10 मिनट) और महत्वपूर्ण सक्रियण का पता लगाया। यह सक्रियता धीरे-धीरे बेसल स्तरों तक घटती जाती है। हमारी स्थितियों में, फॉस्फोराइलेटेड ERK1 / 2 (12-18h के बाद) का स्तर नियंत्रण के समान है, यह दर्शाता है कि यह मार्ग इन समय सक्रिय नहीं है (डेटा नहीं दिखाया गया है) जैसा कि पेंग एट अल द्वारा वर्णित है। (2004)। यह सक्रियण एकाग्रता-निर्भर नहीं है, यह परिणाम दर्शाता है कि ईआरके की मजबूत उत्तेजना पैराक्वेट की बहुत कम सांद्रता के साथ प्राप्त और बनाए रखी जाती है। पैराक्वाट एक्सपोजर के बाद भी फॉस्फोराइलेटेड पीकेबी स्तरों में परिवर्तन का वर्णन नहीं किया गया है। हम चित्र 4 में दिखाते हैं कि परिणाम समय और एकाग्रता-निर्भर हैं, जो 25एलएम पैराक्वाट के साथ 20- मिनट के एक्सपोजर के बाद अधिकतम प्रभाव दिखाते हैं। यही है, पीकेबी फॉस्फोराइलेशन में प्रारंभिक पैराक्वाट-मध्यस्थता वृद्धि ईआरके 1/2 के लिए देखे गए लोगों के साथ तुलनीय है। ये डेटा पीकेबी और ईआरके उत्तरजीविता मार्ग दोनों के फॉस्फोराइलेशन को सक्रिय करने में एक प्रारंभिक वृद्धि को प्रकट करते हैं। पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में पीकेबी या ईआरके के प्रारंभिक सक्रियण के बारे में कोई डेटा नहीं है। हालाँकि, पिछले अध्ययन (Halvorsen et al।, 2002) MPPþ के संपर्क में आने वाले न्यूरोब्लास्टोमा SH-SY5Y कोशिकाओं में दोनों मार्गों में समान प्रारंभिक वृद्धि का वर्णन करते हैं। इस मामले में, फॉस्फोराइलेशन का स्तर बेसल स्तर की ओर क्षय नहीं होता है। पैराक्वाट और एमपीपीþ के बीच पहले से संबंधित समान संरचना के कारण ये डेटा विशेष रूप से दिलचस्प हैं, जो दोनों अणुओं के प्रभाव में फंसे सेलुलर मशीनरी की एक अलग शुरुआत का संकेत देते हैं।

पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में योगदान करने वाले संकेतों की मध्यस्थता में JNK1 / 2pathway की भूमिका पर अधिक ध्यान दिया गया है। इस अध्ययन में, हमने दिखाया है कि पैराक्वेट की कम सांद्रता (25lM) ने फॉस्फोराइलेटेड JNK1 / 2 (चित्र। 6) में उल्लेखनीय वृद्धि की है। जैसा कि PKBor ERK1/2 में होता है, यह सक्रियता बहुत प्रारंभिक शुरुआत (5 मिनट) और बेसल स्तरों पर धीमी वापसी के साथ समय पर निर्भर है। पिछले काम (चेंग एट अल।, 2003; चुन एट अल।, 2001; पेंग एट अल।, 2004) किसी भी मामले में पैराक्वेट की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (400lM से) द्वारा उत्पादित JNK1 / 2pathway की देर से (12-18 घंटे) सक्रियता दिखाते हैं [पेंग एट अल।, 2004] से 800lM [चुनेट अल।, 2001])। हमारी स्थितियों में, संकेतित समय पर JNK1 / 2 का फॉस्फोराइलेशन डिग्री नियंत्रण के बराबर है। कुल मिलाकर, ये परिणाम पहली बार इंगित करते हैं कि पैराक्वाट की बहुत कम सांद्रता के लिए सेल एक्सपोजर पीकेबी, ईआरके 1/2, और जेएनके 1/2 मार्गों की प्रारंभिक सक्रियता पैदा करता है।

यह स्थापित करने के बाद कि पैराक्वाट E18 कोशिकाओं में प्रारंभिक PKB, ERK1 / 2, और JNK1 / 2 सक्रियण को ट्रिगर करता है, हमने तब कई औषधीय अवरोधकों का उपयोग करके पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में इन प्रोटीन किनसे मार्गों की भूमिका की जांच की। 570 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित करने वाले फॉर्मेज़ान डाई में एमटीटी में परिवर्तन को मापकर सेल व्यवहार्यता की निगरानी की गई थी। MTT परख का उपयोग MPPþ या पैराक्वाट (गोंजालेज पोलो एट अल।, 2003, 2004; श्मक एट अल।, 2002; शेंग एट अल।, 2002; स्टॉर्च एट अल।, 2004) सहित विभिन्न अपमानों के बाद न्यूरोनल चोट को सटीक रूप से मापने के लिए किया गया है। ), और यह कोशिका मृत्यु को निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है। जैसा कि चित्र 8 में दिखाया गया है, चयनात्मक JNK1 / 2 अवरोधक SP 600125 के साथ दिखावा करने से पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में काफी कमी आई है। SP 600125 की इस सांद्रता ने JNK1 / 2 (चित्र 7) के पैराक्वाट-प्रेरित सक्रियण को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया। ये आंकड़े बताते हैं कि जेएनके 1/2 मार्ग के प्रारंभिक सक्रियण का अवरोध कोशिकाओं को पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु से बचाता है। ये डेटा पिछले अध्ययनों (चुन एट अल।, 2001; पेंग एट अल।, 2004) के अनुरूप हैं, जिससे पता चला है कि जेएनके 1/2 पैराक्वाट द्वारा ट्रिगर न्यूरोनल सेल डेथ में शामिल है। हालांकि, ये अध्ययन इस अध्ययन में नियोजित की तुलना में पैराक्वाट की 15 से 30 गुना अधिक सांद्रता का उपयोग करते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि पैराक्वेट की कम सांद्रता न केवल सक्रियण उत्पन्न कर सकती है, बल्कि इस मार्ग का एक प्रारंभिक सक्रियण भी कर सकती है। SP600125 के साथ देखी गई सुरक्षा यह भी इंगित करती है कि JNK1 / 2 मार्ग पैराक्वाट द्वारा प्रेरित कोशिका मृत्यु में शामिल है। इसके अतिरिक्त, जेएनके 1/2 निषेध को पीडी . के इलाज में संभावित रणनीति के रूप में डिजाइन किया गया है(पार्किंसंस रोग)विवो और इन विट्रो (वांग एट अल।, 2004) दोनों में कई मॉडलों में।

सिस्टैंच का न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पीकेबी और ईआरकेपाथवे दोनों न्यूरोनल सर्वाइवल (गाइटन एट अल।, 1996; शिन एट अल।, 2001) में शामिल हैं। इस अध्ययन में, हमने दिखाया है कि पैराक्वाट उत्पादन की कम सांद्रता और पीकेबी और ईआरके दोनों मार्गों को जल्दी उत्तेजित करती है। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि पैराक्वाट-प्रेरित पीकेबी और ईआरके सक्रियण कोशिकाओं को पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु से बचाने में शामिल हो सकते हैं। इस संभावना की जांच करने के लिए, हमने संरचनात्मक रूप से असंबंधित PI-3K अवरोधक wortmannin और LY 294002 और ERK1/2inhibitor PD का उपयोग किया।(पार्किंसंस रोग)98059। दिलचस्प बात यह है कि, पीकेबी और ईआरके निषेध दोनों ने पैराक्वाट की उपस्थिति में सेल व्यवहार्यता में बदलाव नहीं किया, यह सुझाव देते हुए कि, हमारी स्थितियों में, पीकेबी में वृद्धि हुई है और ई 18 कोशिकाओं में पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में जीवित रहने के लिए ईआरके सक्रियण आवश्यक नहीं है।

यह सर्वविदित है कि पैराक्वेट न्यूरोटॉक्सिसिटी का तंत्र, अन्य कारकों के बीच, ऑक्सीडेटिव तनाव (गोंजालेज-पोलो एट अल।, 2004; मोलेस एट अल।, 2003) के माध्यम से मध्यस्थता है। इस अर्थ में, हाल ही में पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु में फंसे प्रारंभिक एपोप्टोटिक घटनाओं में एक बहुत तेज़ साइटोसोलिक ऑक्सीडेटिव तनाव का वर्णन किया गया है (गोंजालेज-पोलो एट अल।, 2004)। चूंकि ऑक्सीडेटिव तनाव एमएपीके परिवार (जैसे ईआरके 1/2 और जेएनके 1/2) और पीकेबी (कामता और हिरता, 1999) के सदस्यों को सक्रिय करता है, ईआरके 1/2, जेएनके 1/2 और पीकेबी के इस प्रारंभिक सक्रियण को तेजी से ऑक्सीडेटिव के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। पैराक्वाट एक्सपोजर के बाद तनाव-प्रेरित।

सारांश में, हमारे परिणाम पहली बार दिखाते हैं कि पैराक्वाट की कम सांद्रता पीकेबी, ईआरके 1/2, और जेएनके 1/2 फॉस्फोराइलेशन इनई 18 कोशिकाओं में बहुत जल्दी और मजबूत वृद्धि को उत्तेजित करती है। इसके अलावा, हमने दिखाया है कि JNK1 / 2 मार्ग के प्रारंभिक सक्रियण का निषेध E18 कोशिकाओं को पैराक्वाट-प्रेरित कोशिका मृत्यु से बचाता है। यह परिणाम कुछ प्रारंभिक घटनाओं (तेजी से जेएनके 1/2 सक्रियण के रूप में) के अस्तित्व की ओर इशारा करता है जो पैराक्वेट की कम सांद्रता से प्रेरित कोशिका मृत्यु में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। यह परिणाम पैराक्वाट विषाक्तता और पीडी के विकास में इसके संभावित प्रभाव के अध्ययन में एक नई और रोमांचक लाइन भी खोलता है।(पार्किंसंस रोग).

टिप्पणी: सिस्टांचेएक पारंपरिक चीनी जड़ी बूटी है जिसका न्यूरॉन्स और मस्तिष्क कोशिकाओं पर प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच को डेजर्ट जिनसेंग के रूप में भी जाना जाता है, यह न्यूरो रोग के लिए एक संभावित उपचार है जैसे किपार्किंसंस रोगआधुनिक औषधीय अध्ययन के आधार पर