लाइसोसोमल लिपिड पेरोक्सीडेशन ट्यूमर प्रतिरक्षा को नियंत्रित करता है

DC661 जैसे पामिटॉयल-प्रोटीन थायोएस्टरेज़ 1 (PPT1) अवरोधकों द्वारा उत्पन्न लाइसोसोमल अवरोध कोशिका मृत्यु उत्पन्न कर सकता है, लेकिन इसके लिए तंत्र पूरी तरह से समझा नहीं गया है। DC661 के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को प्राप्त करने के लिए क्रमादेशित कोशिका मृत्यु पथ (ऑटोफैगी, एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस) की आवश्यकता नहीं थी। कैथेप्सिन, या आयरन या कैल्शियम केलेशन के निषेध से डीसी प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी से बचाव नहीं हुआ। पीपीटी1 निषेध ने लाइसोसोमल लिपिड पेरोक्सीडेशन (एलएलपी) को प्रेरित किया, जिसके कारण लाइसोसोमल झिल्ली पारगम्यता और कोशिका मृत्यु हुई, जिसे एंटीऑक्सीडेंट एन-एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) द्वारा उलटा किया जा सकता था, लेकिन अन्य लिपिड पेरोक्सीडेशन एंटीऑक्सीडेंट द्वारा नहीं। एनएसी के इंट्रालिसोसोमल परिवहन और एलएलपी के बचाव के लिए लाइसोसोमल सिस्टीन ट्रांसपोर्टर एमएफएसडी12 की आवश्यकता थी। पीपीटी1 निषेध ने कैलेरिटिकुलिन की सतही अभिव्यक्ति के साथ कोशिका-आंतरिक इम्युनोजेनेसिटी उत्पन्न की जिसे केवल एनएसी के साथ उलटा किया जा सकता था। डीसी661-उपचारित कोशिकाओं ने निष्क्रिय टी कोशिकाओं को प्राइम किया और टी सेल-मध्यस्थता विषाक्तता को बढ़ाया। डीसी उपचारित कोशिकाओं से टीका लगाए गए चूहों ने "इम्यून हॉट" ट्यूमर में अनुकूली प्रतिरक्षा और ट्यूमर अस्वीकृति उत्पन्न की, लेकिन "इम्यून कोल्ड" ट्यूमर में नहीं। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि एलएलपी लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है, जो कोशिका मृत्यु का एक अनूठा इम्यूनोजेनिक रूप है, जो इम्यूनोथेरेपी और लाइसोसोमल निषेध के तर्कसंगत संयोजनों का रास्ता दिखाता है जिसे नैदानिक ​​​​परीक्षणों में परीक्षण किया जा सकता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-एंटीट्यूमर के लाभ

परिचय

लाइसोसोमल इनहिबिटर हाइड्रोक्सीक्लोरोक्वीन (एचसीक्यू) (1) को शामिल करने वाले क्लिनिकल परीक्षणों में गतिविधि को प्रोत्साहित करने के साथ, क्लोरोक्वीन डेरिवेटिव (2) के आणविक लक्ष्य के रूप में पामिटॉयल-प्रोटीन थायोएस्टरेज़ 1 (पीपीटी1) की पहचान, और क्लिनिकल में नए पीपीटी1 इनहिबिटर का लॉन्च परीक्षणों (3, 4) में, उस तंत्र को समझने की आवश्यकता है जिसके द्वारा लाइसोसोमल अवरोधक कोशिका मृत्यु को प्रेरित करते हैं और ट्यूमर प्रतिरक्षा पर लाइसोसोमल निषेध का प्रभाव पड़ता है। एचसीक्यू के लिए वर्णित लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु के विहित तंत्र में लाइसोसोमल झिल्ली पारगम्यीकरण (एलएमपी), कैथेप्सिन का रिसाव और कैस्पेज़-मध्यस्थता एपोप्टोसिस (5, 6) का सक्रियण शामिल है। हमने पहले दिखाया है कि लाइसोसोमल अवरोधक DC661 अम्लीय ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण में कोशिकाओं में प्रवेश करता है और HCQ (2, 7) की तुलना में अधिक कुशलता से लाइसोसोम में स्थानीयकृत होता है। DC661 कई कैंसर कोशिका रेखाओं में शक्तिशाली कोशिका मृत्यु उत्पन्न करता है (2)। DC661 PPT1 को बांधता है और रोकता है, लाइसोसोम को निष्क्रिय करता है, और ऑटोफैगी को रोकता है। DC661 भी LMP को प्रेरित करता है और क्लीव्ड कैस्पेज़ 3 (2, 7) के स्तर को बढ़ाता है। हाल के वर्षों में, कोशिका मृत्यु के नए तंत्र जिनके इम्यूनोजेनिक परिणाम होते हैं, को परिभाषित किया गया है और इसमें नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस (8) शामिल हैं। लाइसोसोम-आश्रित ऑटोफैगी को एमएचसी वर्ग I (9), साथ ही इम्युनोप्रोटेसोम (10) के घटकों को नीचा दिखाने के लिए दिखाया गया है, यह सुझाव देता है कि ऑटोफैगी निषेध एंटीजन प्रसंस्करण को बढ़ा सकता है। हालाँकि, लाइसोसोमल अवरोध और परिणामी कोशिका मृत्यु के प्रतिरक्षात्मक प्रभावों को पूरी तरह से चित्रित नहीं किया गया है। इस ज्ञान अंतर को संबोधित करने के लिए, हमने यह निर्धारित करने के लिए विहित कोशिका मृत्यु तंत्र पर DC661 के प्रभावों की जांच की कि क्या लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु कोशिका मृत्यु का एक रूप है या बस अन्य स्थापित तंत्रों में से एक का अग्रदूत है। हमने पाया कि HCQ और DC661 ने मेलेनोमा प्रोटीओम में केवल थोड़ी संख्या में प्रोटीन में उल्लेखनीय वृद्धि की है और इनमें से अधिकांश ऑटोफैगी- और एपोप्टोसिस-संबंधी प्रोटीन थे। क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस) के अवरोधकों ने DC661 द्वारा लाइसोसोमल हानि के बाद साइटोटॉक्सिक प्रभाव को कम नहीं किया। लाइसोसोमल लिपिड पेरोक्सीडेशन (एलएलपी) कोशिका की सतह पर कैलेरिटिकुलिन (सीएएलआर) अभिव्यक्ति से जुड़े एलएमपी-प्रेरित कोशिका मृत्यु का एक प्रमुख चालक है। कोशिका मृत्यु के इस रूप को केवल एंटीऑक्सीडेंट एन-एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) का उपयोग करके उलटा किया जा सकता है। लाइसोसोमल सिस्टीन आयातक एमएफएसडी12 के निषेध के कारण एनएसी गतिविधि ख़राब हो गई थी। एलएलपी ने टी कोशिका-मध्यस्थता हत्या को बढ़ावा देने वाले इम्युनोजेनिक फेनोटाइप प्राप्त किए। ये निष्कर्ष दर्शाते हैं कि लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु इम्युनोजेनिक कोशिका मृत्यु का एक संभावित अनोखा रूप है।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

परिणाम

लाइसोसोमल अवरोध ऑटोफैगी और एपोप्टोसिस से जुड़े प्रोटिओम में महत्वपूर्ण परिवर्तन उत्पन्न करता है। लाइसोसोमल इनहिबिटर्स के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को स्थापित करने के लिए, हमने वेक्यूलर एच+-एटीपीस इनहिबिटर बाफिलोमाइसिन-ए1 (1) से इलाज किए गए ए375पी मेलेनोमा, आरकेओ कोलन कार्सिनोमा और एमआईए पाका{1}} अग्नाशय कैंसर सेल लाइनों की व्यवहार्यता का आकलन किया। {{52}0 एनएम); PPT1 अवरोधक DC661 (3 μM) या HCQ (10 μM या 30 μM); पामिटेट मिमेटिक हेक्साडेसिल सल्फोनील फ्लोराइड (एचडीएसएफ; 60 μM); कैथेप्सिन अवरोधक पेप्सटिन ए (पेपा; 10 यूजी/एमएल), ई64 (पेपा; 10 यूजी/एमएल), या पेपा+ई64; और 48 घंटों के लिए लाइसोसोमल झिल्ली विघटनकर्ता ल्यू-लेउ मिथाइल एस्टर हाइड्रोब्रोमाइड (20 μM)। केवल बाफिलोमाइसिन-ए1 और डीसी661 ने कैंसर कोशिका रेखाओं में कोशिका व्यवहार्यता में उल्लेखनीय कमी का कारण बना (चित्र 1ए और पूरक चित्र 1ए; पूरक सामग्री इस लेख के साथ ऑनलाइन उपलब्ध है; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), DC661 उत्पादन के साथ बाफिलोमाइसिन-ए1 की तुलना में कोशिका व्यवहार्यता में अधिक गहन कमी। इन आंकड़ों और क्लोरोक्वीन डेरिवेटिव के औषधीय दवा जैसे गुणों के आधार पर, हमने लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु को समझने के लिए उपकरण के रूप में क्लोरोक्वीन डेरिवेटिव पर अपना अध्ययन केंद्रित किया। DC661 (3 μM) या कम शक्तिशाली HCQ (10 μM या 30 μM) से उपचारित A375P मेलेनोमा कोशिकाओं पर 24 घंटे के लिए एक निष्पक्ष वैश्विक प्रोटिओम विश्लेषण लागू किया गया था। 4,264 उच्च-विश्वास मात्रा वाले प्रोटीनों में से केवल 87 और 55 प्रोटीन क्रमशः DC661 (3 μM) और HCQ (30 μM) के साथ उल्लेखनीय रूप से बढ़े हुए थे; इसके अतिरिक्त, DC661 (3 μM) और HCQ (30 μM) के साथ क्रमशः 14 और 15 प्रोटीनों में उल्लेखनीय रूप से कमी आई (2 से अधिक का पूर्ण गुना परिवर्तन; q ​​<0.05) क्रमशः DC661 (3 μM) या HCQ (30 μM) के साथ , जब वाहन नियंत्रण के साथ तुलना की जाती है। एचसीक्यू (10 μM) की निचली खुराक में वाहन नियंत्रण की तुलना में कोई महत्वपूर्ण प्रोटीन परिवर्तन नहीं दिखा। शीर्ष 50 प्रोटीन जो डीसी661 उपचार के बाद उल्लेखनीय रूप से बढ़े थे, मुख्य रूप से ऑटोफैगी और एपोप्टोसिस से जुड़े थे, और एचसीक्यू की उच्च खुराक के लिए समान परिवर्तन देखे गए थे (चित्र 1बी)। इन कारणों से, हमने अधिक शक्तिशाली DC661 पर आगे के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करना चुना। ऑटोफैगी और एपोप्टोसिस से जुड़े कुछ सबसे बड़े प्रोटीन परिवर्तनों के उदाहरण थे टैक्स बाइंडिंग प्रोटीन 1 (TAX1BP1; बढ़ा हुआ {{66%) गुना); बीसीएल2-इंटरैक्टिंग प्रोटीन 3 (बीएनआईपी3; बढ़ा हुआ 6-गुना); बीआरसीए1 जीन 1 प्रोटीन का पड़ोसी (एनबीआर1; 12-गुना बढ़ा हुआ); सीक्वेस्टोसोम-1 (एसक्यूएसटीएम1/पी62; बढ़ा हुआ 5-गुना); न्यूक्लियर रिसेप्टर कोएक्टीवेटर 4 (एनसीओए4; 3-गुना बढ़ गया); और LC3B (MAP1LC3B; 3-गुना बढ़ गया)। एपोलिपोप्रोटीन बी-100 (एपीओबी; बढ़ा हुआ 66-गुना) भ्रूण के बछड़े के सीरम से प्राप्त किया गया था और इसका आगे अध्ययन नहीं किया गया था। इम्यूनोब्लॉटिंग ने पुष्टि की कि DC661 या HCQ की उच्च सांद्रता के साथ उपचार से खुराक और समय-निर्भर तरीके से ऑटोफैगी कार्गो रिसेप्टर्स NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 और NCOA4 की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है (पूरक चित्र 1, बी और सी)। A375P कोशिकाओं में PPT1 के CRISPR/Cas9 KO ने अपने WT समकक्षों (पूरक चित्र 1D) के साथ तुलना करने पर इन प्रोटीनों पर DC661 के प्रभावों को फ़िनोकॉपी किया। हालाँकि, ऑटोफैगी कार्गो रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति और DC661 उपचार से प्रेरित सापेक्ष वृद्धि कोलन कैंसर, अग्नाशय कैंसर और अन्य मेलेनोमा सेल लाइनों में परिवर्तनशील थी, जिसमें DC661 साइटोटॉक्सिसिटी (पूरक चित्र 1E) प्रदर्शित करता है। इसने सुझाव दिया कि ऑटोफैगी कार्गो रिसेप्टर्स, हालांकि प्रोटीन स्तर पर बढ़े हुए हैं, DC661 उपचार के बाद कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार होने की संभावना नहीं है। इसकी पुष्टि करने के लिए, हमने ऑटोफैगी कार्गो रिसेप्टर्स TAX1BP1 और BNIP3 पर ध्यान केंद्रित किया क्योंकि उन्हें कैंसर कोशिकाओं में प्रॉपोपोटिक प्रभाव ज्ञात है (चित्र 1C)। TAX1BP1 एक ऑटोफैगी कार्गो एडाप्टर (11) है और कैंसर कोशिकाओं (12) में प्रोटीन संश्लेषण अवरोधकों या डीएनए-हानिकारक एजेंटों द्वारा प्रेरित एपोप्टोसिस को भी नियंत्रित करता है। siRNA (चित्र 1D) द्वारा TAX1BP1 के नॉकडाउन ने अल्पावधि (चित्र 1E) और दीर्घकालिक व्यवहार्यता परख (चित्र 1F) में DC प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को प्रभावित नहीं किया। इन परिणामों से पता चला कि TAX1BP1 DC661-मध्यस्थता साइटोटोक्सिसिटी में कोई आवश्यक भूमिका नहीं निभाता है। बीएनआईपी3 एक प्रॉपोप्टोटिक प्रोटीन है जो माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स को ख़राब करता है और माइटोफैगी को नियंत्रित करता है (13)। बीएनआईपी3 (चित्रा 1जी) के प्रभावी नॉकडाउन ने डीसी प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी (आंकड़े 1, एच, और आई) को प्रभावित नहीं किया। इन परिणामों से पता चला कि DC661 के साइटोटॉक्सिक प्रभाव BNIP3 अभिव्यक्ति से स्वतंत्र हैं। इसके बाद, हमने DC661 प्रभावकारिता पर ऑटोफैगोसोम उत्पादन के लिए आवश्यक कैनोनिकल ऑटोफैगी जीन की घटती कोशिकाओं के प्रभावों का अध्ययन किया, जैसे कि ऑटोफैगी सक्रिय करने वाले काइनेज 1 (ULK1) और ऑटोफैगी-संबंधित जीन 7 (ATG7)। यूएलके1 या एटीजी7 (पूरक चित्र 2, ए और बी) के प्रभावी नॉकडाउन ने ऑटोफैजिक फ्लक्स (पूरक चित्र 2सी) को बाधित किया लेकिन डीसी प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी (चित्रा 1, जे-एम) को प्रभावित नहीं किया। इन परिणामों से पता चला कि आवश्यक कोर ऑटोफैगी मशीनरी की अनुपस्थिति DC661 के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को निरस्त नहीं करती है। DC661 द्वारा लाइसोसोमल निषेध कई क्रमादेशित कोशिका मृत्यु मार्गों को प्रेरित करता है। विहित दृष्टिकोण यह है कि लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु एपोप्टोसिस (5) के कारण होती है। इम्यूनोब्लॉटिंग से पता चला कि DC661 उपचार के परिणामस्वरूप कैस्पेज़ -3, -7, और -9 सक्रिय हो गया और PARP -1 का दरार हो गया, जिससे पुष्टि हुई कि DC661 सक्रिय एपोप्टोसिस (चित्रा 2 ए)। पैन-कैस्पेज़ अवरोधक Z-VAD-FMK ने DC661 द्वारा कैस्पेज़ सक्रियण को रोका लेकिन LC3B और p62 के संचय को नहीं रोका, यह दर्शाता है कि एपोप्टोसिस सक्रियण और ऑटोफैगी नाकाबंदी लाइसोसोमल निषेध (चित्र 2B) के बाद अलग-अलग हैं। ZVAD-FMK के साथ एपोप्टोसिस को अवरुद्ध करने से DC661 साइटोटॉक्सिसिटी में वृद्धि या सीमा नहीं हुई, यह सुझाव देते हुए कि एपोप्टोसिस लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु के लिए अपरिहार्य है (चित्रा 2, सी और डी)। DC661 के साइटोटॉक्सिक प्रभाव एपोप्टोसिस और WT कोशिकाओं (चित्र 2E) से गुजरने में असमर्थ बैक्स/बाक डबल-केओ प्राथमिक अस्थि मज्जा कोशिकाओं में समान थे। एपोप्टोसिस की नाकाबंदी ने कोलन कैंसर और अग्नाशय कैंसर कोशिकाओं में डीसी प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी को भी प्रभावित नहीं किया (पूरक चित्र 2, डी-एफ)। क्योंकि हमने पाया कि एपोप्टोसिस डीसी प्रेरित कोशिका मृत्यु के लिए अपरिहार्य है, हमने जांच की कि क्या डीसी661 नेक्रोप्टोसिस प्रेरित करता है, जो रिसेप्टर-इंटरेक्टिंग प्रोटीन काइनेज (आरआईपीके) और मिश्रित वंश किनेज डोमेन-जैसे प्रोटीन द्वारा नियंत्रित क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का दूसरा रूप है। एमएलकेएल)। DC661 उपचार के बाद RIPK और MLKL के फॉस्फोराइलेटेड और सक्रिय रूपों का स्तर 0.1-1 μM (चित्रा 2F) से बढ़ गया था। 3 μM DC661 पर फॉस्फोराइलेटेड RIPK1 की अनुपस्थिति थी लेकिन लगातार फॉस्फोराइलेटेड MLKL का अभाव था, जिससे पता चलता है कि, इस उच्च सांद्रता पर, कोशिका मृत्यु के अतिरिक्त रूप शामिल हो सकते हैं। RIPK1 अवरोधकों नेक्रोस्टैटिन या नेक्रोस्टैटिन -1 या MLKL अवरोधक नेक्रोसल्फोनामाइड के साथ पूर्व-उपचार ने मेलेनोमा कोशिकाओं में DC661 (1 μM) उपचार के बाद RIPK1 के फॉस्फोराइलेशन को रोक दिया (चित्र 2G) लेकिन DC को बचाने में विफल रहा। मेलेनोमा कोशिकाओं में प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी (चित्र 2H) या कोलन कैंसर या अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं (पूरक चित्र 2G)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि नेक्रोप्टोसिस सक्रिय है लेकिन डीसी की मध्यस्थता वाली कोशिका मृत्यु के लिए अपरिहार्य है।

चित्र 1. लाइसोसोमल ऑटोफैगी निषेध एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी प्रोटीन में महत्वपूर्ण परिवर्तन उत्पन्न करता है। (ए)

लाइसोसोम आयरन के मुख्य भंडारण स्थलों में से एक है। अव्यवस्थित अंतःकोशिकीय लौह चयापचय के साथ-साथ घटी हुई रिडक्टिव क्षमता गैर-नैपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को ट्रिगर कर सकती है जिसे फेरोप्टोसिस कहा जाता है। फेरोप्टोसिस की एक पहचान प्रोस्टाग्लैंडीन-एंडोपरॉक्साइड सिंथेज़ 2 (पीटीजीएस2), कटियन ट्रांसपोर्ट रेगुलेटर होमोलोग 1 (सीएचएसी1), और सिस्टीनिल-टीआरएनए सिंथेटेज़ (सीएआरएस) (14) का अपग्रेडेशन है। इन सभी 3 फेरोप्टोसिस मार्करों को DC661 उपचार (चित्रा 3 ए) द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल रूप से अपग्रेड किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि लाइसोसोमल निषेध फेरोप्टोसिस को प्रेरित करता है। DC661 ने C11-BODIPY-उपचारित A375P कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति बदलाव को प्रेरित किया, जो लिपिड पेरोक्सीडेशन, फेरोप्टोसिस की विशेषता का संकेत देता है। यह डीसी प्रेरित बदलाव फेरोप्टोसिस इनहिबिटर फेरोस्टैटिन या लिप रॉक्सस्टैटिन की उपस्थिति में काफी हद तक उलट गया था, जिसे एक प्रभावी एकाग्रता (चित्रा 3 बी और पूरक चित्रा 3 ए) पर प्रशासित किया गया था, जो आगे संकेत देता है कि डीसी 661 प्रेरित फेरोप्टोसिस। हालाँकि, फेरोप्टोसिस निषेध ने DC661 (चित्र 3, C और D) से जुड़ी साइटोटॉक्सिसिटी से बचाव नहीं किया। आयरन चेलेटर डिफेरोक्सामाइन (डीएफओ) और डीसी661 के साथ कैंसर कोशिकाओं के सह-उपचार ने डीसी661 की साइटोटॉक्सिसिटी से बचाव नहीं किया (चित्र 3ई)। फेरोस्टैटिन -1, लिप रॉक्सस्टैटिन -1, या डीएफओ के साथ उपचार ने डीसी661 को मेलेनोमा, कोलन और अग्नाशय कैंसर कोशिकाओं में अल्पकालिक व्यवहार्यता या दीर्घकालिक क्लोनोजेनिक विकास के निषेध से नहीं बचाया (पूरक चित्र 3, बी) -ई, और पूरक चित्र 4, ए-डी)। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि फेरोप्टोसिस सक्रिय है लेकिन डीसी की मध्यस्थता वाली कोशिका मृत्यु के लिए अपरिहार्य है। पायरोप्टोसिस एक सूजन प्रतिक्रिया से जुड़ी क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का एक रूप है जिसमें गैस्ट्रिन (जीएसडीएम) को संसाधित करने वाले कैसपेज़ की सक्रियता शामिल होती है, जिससे प्लाज्मा झिल्ली पर छिद्रों का निर्माण होता है और बाद में उच्च गतिशीलता जैसे क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न जारी होते हैं। समूह बॉक्स 1 (एचएमजीबी1)। मल्टीपल मेलेनोमा सेल लाइन्स (A375P, A375, WM35, और WM793) में DC661 उपचार के परिणामस्वरूप पायरोप्टोसिस के लिए विशिष्ट इनिशिएटर कैस्पेज़ -8 और -9 और एक्ज़ीक्यूटिव कैस्पेज़ -7 सक्रिय हो गए और उत्पादन हुआ पूर्ण लंबाई वाले जीएसडीएमई का दरार, ज्ञात पायरोप्टोसिस इंड्यूसर पीएलएक्स4720 और पीडी0325901 (पूरक चित्र 5ए) के समान। DC661 ने 1% FBS (15) में ज्ञात पाइरोप्टोसिस इंड्यूसर, BRAF और MEK निषेध की तुलना में HMGB1 की एक मजबूत बाह्यकोशिकीय रिलीज़ का उत्पादन किया, जो सक्रिय पायरोप्टोसिस के कार्यात्मक परिणाम को दर्शाता है। इसके बाद, हमने परीक्षण किया कि क्या जीएसडीएमई केओ द्वारा पायरोप्टोसिस का निषेध DC661 के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को सुधारेगा। DC661 उपचार ने LC3II और SQSTM1/ p62 संचय और कैस्पेज़ सक्रियण को प्रेरित किया, लेकिन GSDME-KO WM35 मानव कोशिकाओं में HMGB1 रिलीज लगभग पूरी तरह से निरस्त कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि पायरोप्टोसिस को रोकने का कार्यात्मक परिणाम प्राप्त किया गया था (चित्र 3F)। हालाँकि, DC661 उपचार ने YUMM1.7 WT, खाली वेक्टर (EV), और Gsdme KO1 और KO2 कोशिकाओं में 10% और 1% FBS दोनों स्थितियों (चित्र 3G और पूरक चित्र 5B) में समान साइटोटॉक्सिसिटी उत्पन्न की। कोशिका मृत्यु के कई रूपों का एक सामान्य परिणाम एलडीएच का स्राव है। DC661 ने LDH रिलीज में उल्लेखनीय वृद्धि की, और इसे एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, या फेरोप्टोसिस निषेध (पूरक चित्र 5C) द्वारा उलटा नहीं किया जा सका। इन परिणामों से पता चला कि DC661 कोशिका मृत्यु के कई तरीकों को प्रेरित करता है, जिसमें एपोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस के साथ-साथ नेक्रोप्टोसिस और फेरोप्टोसिस शामिल हैं, लेकिन डीसी प्रेरित कोशिका मृत्यु के लिए कोशिका मृत्यु के इन तरीकों में से किसी की भी आवश्यकता नहीं है। कैथेप्सिन निषेध या कैल्शियम केलेशन लाइसोसोमल झिल्ली पारगम्यता से कोशिका मृत्यु को नहीं रोकता है। यह प्रदर्शित करने के बाद कि कैसपेज़ सक्रियण (जो एपोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस के लिए आवश्यक है) डीसी प्रेरित कोशिका मृत्यु के लिए अपरिहार्य है, हमने अनुमान लगाया कि लाइसोसोम से कैथेप्सिन रिलीज कैसपेज़-निर्भर कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है। रासायनिक (DC661) या आनुवांशिक (PPT1 siRNA [siPPT1]) PPT1 के निषेध से लाइसोसोमल झिल्ली पारगम्यता (LMP) उत्पन्न होती है, जबकि HDSF, PPT1 का एक कम शक्तिशाली अपरिवर्तनीय अवरोधक जो कोशिका संवर्धन में तेजी से समाप्त हो जाता है, LMP को प्रेरित नहीं कर सका, जैसा कि मापा गया है गैलेक्टिन द्वारा-3-पॉजिटिव पंक्टा (चित्र 4ए)। एलएमपी के परिणामस्वरूप साइटोप्लाज्म में कैथेप्सिन और अन्य लाइसोसोमल सामग्री जारी होती है और इसे लाइसोसोम-आधारित कोशिका मृत्यु की एक प्रमुख समीपस्थ विशेषता माना जाता है। DC661 द्वारा प्रेरित LMP साइटोप्लाज्मिक कैथेप्सिन-एल गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि से जुड़ा था, जिसे सिस्टीन प्रोटीज़ अवरोधक E64 (चित्र 4B) के साथ महत्वपूर्ण रूप से अवरुद्ध किया गया था। पिछली रिपोर्टों ने सुझाव दिया है कि खंडित लाइसोसोम से कैथेप्सिन रिलीज कैस्पेज़ सक्रियण को बढ़ावा देता है, जिससे एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु हो जाती है (16-18)। पूर्ण कैथेप्सिन निषेध ने कैस्पेज़ दरार को नहीं रोका (चित्र 4सी) और मेलेनोमा (चित्र 4, डी और ई), कोलन कैंसर और अग्नाशय में अल्पकालिक और दीर्घकालिक व्यवहार्यता परख में डीसी प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी को नहीं बचाया (चित्र 4, डी और ई) कैंसर कोशिकाएं (पूरक चित्र 6, ए-सी)। ये परिणाम कैथेप्सिन-मध्यस्थता कोशिका मृत्यु से प्रेरित लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु के विहित दृष्टिकोण का खंडन करते हैं। लीकी लाइसोसोम से कैथेप्सिन रिलीज के अलावा, पीपीटी 1 खराब होने पर लाइसोसोम से कैल्शियम रिलीज को सेलुलर डिसफंक्शन में फंसाया गया है (19)। DC661 उपचार के परिणामस्वरूप व्यापक रूप से कैल्शियम रिलीज़ हुआ, जिसे सेल स्थायी कैल्शियम (Ca2+) चेलेटर, BAPTA-AM के पूर्व-उपचार द्वारा निरस्त कर दिया गया था। (चित्र 4एफ)। उल्लेखनीय रूप से, BAPTA-AM ने DC प्रेरित LMP (चित्र 4G) या कैस्पेज़ दरार (पूरक चित्र 6, D, और E) को नहीं रोका और, सबसे महत्वपूर्ण बात, DC प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी को नहीं बचाया ( चित्र 4H). ये निष्कर्ष RKO और MIA PaCa-2 सेल लाइनों दोनों में भी देखे गए, जिसमें BAPTA-AM और DC661 (पूरक चित्र 6F) के साथ IC50 मूल्यों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया, जिससे पता चला कि LMP से जुड़ी कोशिका मृत्यु है कैल्शियम या कैथेप्सिन पर निर्भर नहीं।

चित्र 2. डीसी661-प्रेरित एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस। (ए)

चित्र 3. डीसी661-प्रेरित फेरोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस। (ए)

एलएलपी एलएमपी चलाता है। यह स्थापित करने के बाद कि प्रमुख कोशिका मृत्यु मार्गों (एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस, और पायरोप्टोसिस), कैथेप्सिन (पेपा और ई64), और आयन चेलेटर्स (बीएपीटीए-एएम [सीए 2+] और डीएफओ [एफई {3}) के अवरोधक }]) ने DC661 द्वारा कोशिका मृत्यु को नहीं रोका और C-11-BODIPY द्वारा लिपिड पेरोक्सीडेशन का प्रमाण पाकर, हमने DC661 उपचार के 2 और 4 घंटे बाद एक वैश्विक लिपिडोम विश्लेषण किया। DC661 ने लिसोफॉस्फोलिपिड के प्रत्येक वर्ग में प्रारंभिक और निरंतर 3- से 10- गुना वृद्धि को प्रेरित किया (चित्र 5A)। इसके विपरीत, फॉस्फेटिडिलकोलाइन, फॉस्फेटिडाइलथेनॉलमाइन, फॉस्फेटिडिलसेरिन, फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल, फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल और फॉस्फेटिडिक एसिड (पूरक चित्र 7ए) सहित फॉस्फोलिपिड वर्गों में न्यूनतम या कोई परिवर्तन नहीं देखा गया। लाइसोफॉस्फोलिपिड प्रजातियां आरओएस द्वारा उत्पन्न की जा सकती हैं, जो संतृप्त फैटी एसिड श्रृंखला को ऑक्सीकरण करती है जिसे फिर फॉस्फोलिपेज़ (20) द्वारा साफ़ किया जाता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एंटीऑक्सिडेंट आरओएस-मध्यस्थ लिपिड क्षति को रोक सकते हैं, हमने पैन-आरओएस स्वेवेंजर एन-एसिटाइलसिस्टीन (एनएसी) (21, 22) और पुटीय लिपिड पेरोक्सीडेशन अवरोधक ट्रॉलॉक्स (23) की उपस्थिति में डीसी प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी की जांच की। ) और विटामिन सी (एस्कॉर्बिक एसिड) (24, 25)। अब तक परीक्षण किए गए किसी भी अन्य एजेंट के विपरीत, एनएसी के साथ सह-उपचार ने कई सेल लाइनों में डीसी से जुड़े साइटोटॉक्सिसिटी को बचाया (चित्रा 5बी और पूरक चित्रा 7बी)। दीर्घकालिक सीएफयू परीक्षणों से पता चला कि यहां परीक्षण किए गए सभी कोशिका मृत्यु अवरोधकों, आयन चेलेटर्स और कैथेप्सिन अवरोधकों के विपरीत, एनएसी ने A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10, और MC38 कोशिकाओं में DC661 के साइटोटॉक्सिक प्रभाव को रोका। चित्र 5सी और पूरक चित्र 7सी)। दिलचस्प बात यह है कि ट्रॉलॉक्स और विटामिन सी ने मानव मेलेनोमा, कोलोरेक्टल कैंसर, अग्नाशय कैंसर कोशिकाओं और म्यूरिन मेलेनोमा और कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं (चित्र 5D और पूरक चित्र 7, D-H) में DC661 साइटोटॉक्सिसिटी से बचाव नहीं किया। इस असमानता ने हमें यह परीक्षण करने के लिए प्रेरित किया कि क्या एनएसी, ट्रॉलोक्स और विटामिन सी ने एलएमपी को प्रभावित किया है। हमारे परिणामों से पता चला कि एनएसी एकमात्र एंटीऑक्सीडेंट था जिसने डीसी प्रेरित एलएमपी को काफी कम कर दिया (चित्र 5ई)। हमने अनुमान लगाया कि एलएलपी डीसी661 द्वारा एलएमपी उत्पादन को संचालित करता है, जिसे एनएसी द्वारा वापस किया जा सकता है लेकिन ट्रॉलॉक्स और विटामिन सी द्वारा नहीं। एलएलपी की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए हमने फ्लोरोसेंट जांच फोम-एलपीओ (26) का उपयोग किया, जो विशेष रूप से लाइसोसोम का स्थानीयकरण करता है और उत्पादन करता है लिपिड पेरोक्साइड के संपर्क में आने पर वर्णक्रमीय बदलाव 586 से 512 एनएम (लाल से हरा) हो जाता है। हमने पाया कि DC661 ने नियंत्रण की तुलना में LLP को प्रेरित किया (चित्र 5F)। एनएसी ने डीसी उपचारित मेलेनोमा कोशिकाओं के लाइसोसोम में लिपिड पेरोक्सीडेशन को कम कर दिया, जबकि ट्रॉलॉक्स और विटामिन सी एलएलपी को कम करने में विफल रहे (चित्रा 5एफ)। एनएसी, ट्रोलॉक्स और विटामिन सी का लिपिड पेरोक्सीडेशन पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। पीपीटी1 (पूरक चित्र 8ए) का नॉकडाउन, या एचसीक्यू (पूरक चित्र 8बी) की उच्च सांद्रता के साथ उपचार ने भी एलएमपी को प्रेरित किया जिसे एनएसी द्वारा उलटा किया जा सकता है, जबकि यूएलके1 के रासायनिक निषेध ने एलएमपी (पूरक चित्र 8सी) को प्रेरित नहीं किया। महत्वपूर्ण रूप से एसआईपीपीटी1 के नॉकडाउन में एलएलपी भी शामिल है जिसे एनएसी (पूरक चित्र 8डी) के साथ उलटा किया जा सकता है। इन परिणामों से पता चला है कि पीपीटी1 निषेध एलएलपी को प्रेरित करता है जिसे एनएसी द्वारा बचाया जा सकता है और संभवतः पीपीटी 1- निषेध-प्रेरित एलएमपी का कारण है। इसके अलावा, इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि एलएलपी लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु के लिए महत्वपूर्ण है।

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MFSD12 द्वारा लाइसोसोम में सिस्टीन का आयात लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु को कम करता है। 3 लिपिड पेरोक्सीडेशन अवरोधकों में से केवल एनएसी ने एलएलपी को रोका। एक हालिया रिपोर्ट से पता चला है कि 12 (एमएफएसडी12) युक्त प्रमुख फैसिलिटेटर सुपरफैमिली डोमेन लाइसोसोम और मेलानोसोम (27) के लिए सिस्टीन आयातक का एक आवश्यक घटक है। हमने तर्क दिया कि एनएसी, या इसके मेटाबोलाइट सिस्टीन को एमएफएसडी12 के माध्यम से लाइसोसोम में ले जाया जाता है, जहां सिस्टीन अपने डाइसल्फ़ाइड, सिस्टीन में ऑक्सीकृत हो जाता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने siNT और siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP कोशिकाओं में DC661 साइटोटॉक्सिसिटी को बचाने के लिए NAC की क्षमता की तुलना की। हमारे परिणामों से पता चला कि NAC ने siNT कोशिकाओं में DC प्रेरित LMP को बचाया लेकिन siMFSD12 कोशिकाओं में LMP को नहीं बचाया (चित्र 6A)। एनएसी ने डीसी उपचारित एसआईएनटी-ए375पी कोशिकाओं की एलएलपी कम कर दी, लेकिन एसआईएमएफएसडी12 कोशिकाओं की नहीं। DMSO या NAC से उपचारित siMFSD12 कोशिकाओं में siNT कोशिकाओं की तुलना में बेसल LLP (चित्र 6B) बढ़ गया था। जबकि NAC ने siNT कोशिकाओं में DC661 साइटोटॉक्सिसिटी को बचाया, siMSFD12 कोशिकाओं में DC661 साइटोटॉक्सिसिटी को बचाने की NAC की क्षमता पूरी तरह से निरस्त कर दी गई (चित्र 6C)। इससे पता चला कि MFSD12 नॉकडाउन DC661 के विरुद्ध NAC के साइटोप्रोटेक्टिव प्रभावों को रोकता है। एनएसी को साइटोसोल (28) में एसाइलेज़ द्वारा डीएसिटिलेटेड किया जाता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एनएसी उपचार लाइसोसोम के भीतर सिस्टीन या सिस्टीन का संचय उत्पन्न करता है, हमने डीएमएसओ और एनएसी-उपचारित ए375पी कोशिकाओं (चित्र 6डी और पूरक चित्र 9ए) से लाइसोसोम को शुद्ध करने के लिए लाइसोसोमल इम्युनोप्रेसेपिटेशन (लाइसो-आईपी) तकनीक (29) को नियोजित किया और प्रदर्शन किया। एनएसी और संबंधित मेटाबोलाइट्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए लक्षित मेटाबोलॉमिक्स। जैसा कि अपेक्षित था, एनएसी-उपचारित संपूर्ण-सेल लाइसेट और संबंधित अनबाउंड अंशों में एनएसी का पता लगाया गया था। एनएसी-उपचारित लाइसोसोम के भीतर एल-सिस्टीन का स्तर काफी हद तक बढ़ गया था। एल-सिस्टीन केवल एनएसी-उपचारित लाइसोसोम के भीतर ही पता लगाने योग्य था। आश्चर्यजनक रूप से, हमें एनएसी-उपचारित समूहों में ग्लूटाथियोन (कम) में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं मिली (चित्रा 6ई); यह आश्चर्यजनक था क्योंकि आमतौर पर यह माना जाता है कि एनएसी उपचार ग्लूटाथियोन के उत्पादन में वृद्धि करता है, जिससे रेडॉक्स संतुलन सही हो जाता है। इन परिणामों से पता चलता है कि MFSD12 आयातक के माध्यम से लाइसोसोम में आयातित सिस्टीन एलएलपी, एलएमपी और लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु से बचाव के लिए महत्वपूर्ण है। एलएलपी इम्युनोजेनिक है। DC661 (पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस) से प्रेरित विनियमित कोशिका मृत्यु के कुछ रूपों को इम्युनोजेनिक के रूप में पहचाना गया है। पहले, विशिष्ट विशेषताओं के आधार पर कीमोथेरेपी दवाओं के लिए इम्युनोजेनिक कोशिका मृत्यु का वर्णन किया गया है, जिसमें क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न का प्रदर्शन शामिल है, जिसमें CALR की कोशिका सतह अभिव्यक्ति और HMGB1 प्रोटीन और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) (30) की रिहाई शामिल है। कोशिका तनाव के दौरान कोशिका सतहों के संपर्क में आने पर CALR "ईट-मी" सिग्नल के रूप में कार्य करता है। HMGB1 और ATP का बाह्यकोशिकीय विमोचन फ़ैगोसाइटिक कोशिकाओं द्वारा पहचाने जाने वाले "फाइंड-मी" सिग्नल के रूप में कार्य करता है। हमने दो मॉडलों की तुलना की: B16F10 कोशिकाएं, जो सिनजेनिक ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर-घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइटों से लगभग पूरी तरह से रहित हैं, और MC38 कोशिकाएं, जिनमें सिनजेनिक ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइट्स होते हैं। सबसे पहले, हमने दिखाया कि DC661 या siPpt1 उपचार सतह CALR अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित करता है जिसे MC38 कोशिकाओं में NAC सह-उपचार के साथ पूरी तरह से निरस्त किया जा सकता है (आंकड़े 7, ए और बी)। इसी तरह के निष्कर्ष बी16एफ10 कोशिकाओं (चित्र 7सी) में देखे गए। प्रमुख कोशिका मृत्यु मार्गों (एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस) के अवरोधक सीएएलआर की सतही अभिव्यक्ति को रोकने में विफल रहे (चित्र 7डी)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या DC661 द्वारा प्रेरित इम्युनोजेनिक कोशिका मृत्यु MHC वर्ग I अपग्रेडेशन के कारण है, B16F10 और MC38 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए DC661 (3 μM) या DMSO के साथ इलाज किया गया था। हमने पाया कि DC661 उपचार से MHC वर्ग I और इम्युनोप्रोटेसोम अपग्रेडेशन (चित्र 7E और पूरक चित्र 9, B और C) की अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं हुई।

चित्र 4. कैथेप्सिन निषेध या कैल्शियम केलेशन डीसी प्रेरित कोशिका मृत्यु को नहीं रोकता है। (ए)

टी सेल प्राइमिंग पर ऑटोफैगी निषेध के प्रभावों को समझने के लिए, हमने पहले बताए अनुसार C57BL6/J स्प्लेनोसाइट्स का उपयोग करके इन विट्रो प्राइमिंग और कोकल्चर प्रयोग किया। प्राइमिंग के लिए, हमने स्प्लेनोसाइट्स को DC661- या DMSO-उपचारित B16F10 या MC38 कोशिकाओं में उजागर किया। इसके बाद, इन प्राइमेड स्प्लेनोसाइट्स को जीवित B16F10 या MC38 कोशिकाओं के साथ संवर्धित किया गया, और साइटोटॉक्सिसिटी को मापा गया (चित्र 8A)। डीसी उपचारित बी16एफ10 कोशिकाओं से युक्त स्प्लेनोसाइट्स ने डीएमएसओ-उपचारित बी16एफ10 कोशिकाओं के संपर्क में आए स्प्लेनोसाइट्स की तुलना में आईएफएन में उल्लेखनीय वृद्धि की। डीएमएसओ-प्राइमेड स्प्लेनोसाइट्स (चित्रा 8, बी और सी) के साथ तुलना करने पर प्राइमेड टी सेल-प्राइमेड बी 16 एफ 10 कोशिकाओं की मध्यस्थता हत्या डीसी 661- प्राइमेड स्प्लेनोसाइट्स में काफी बढ़ गई थी। DC661 से उपचारित MC38 कोशिकाओं ने B16F10 कोशिकाओं (चित्र 8, D, और E) की तुलना में और भी अधिक IFN- और प्राइमेड T सेल साइटोटोक्सिसिटी उत्पन्न की। DC661 के साथ NAC सह-उपचार स्प्लेनोसाइट्स से IFN-रिलीज को पूरी तरह से निरस्त करने और प्राइमेड टी सेल साइटोटॉक्सिसिटी (चित्रा 8, एफ और जी) को कुंद करने में सक्षम था। MC38 कोशिकाओं (पूरक चित्र 9D) में siCalr द्वारा कैलेरिटिकुलिन के नॉकडाउन ने DC661 उपचार की प्राइमिंग प्रभावकारिता को निरस्त कर दिया और प्राइमेड टी-सेल साइटोटॉक्सिसिटी (चित्रा 8, एच, और आई) को काफी कम कर दिया। कुल मिलाकर, ये डेटा एंटीट्यूमर सेल टी सेल प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने में एलएलपी से जुड़े सीएएलआर अपग्रेडेशन की यंत्रवत भूमिका का समर्थन करते हैं। इसके बाद, हमने इन विट्रो निष्कर्षों को प्रतिरक्षा सक्षम और प्रतिरक्षाविहीन चूहों के मॉडल में इन विवो एंटीट्यूमर टीकाकरण अध्ययन में विस्तारित किया। इस परख के लिए, इन विट्रो फ्रीज-पिघला हुआ या डीसी 661- उपचारित बी16एफ10 या एमसी38 कोशिकाओं को प्रतिरक्षा सक्षम सी57बीएल/6 या एनओडी/एससीआईडी ​​चूहों को उसी प्रकार की जीवित ट्यूमर कोशिकाओं के साथ पुनः चुनौती के खिलाफ बचाने के लिए बाएं किनारे पर एससी इंजेक्ट किया गया था। 7 दिन बाद दाहिने पार्श्व में (चित्र 9ए)। डीसी 661-उपचारित बी16एफ10 कोशिकाएं इन विट्रो जांच के बावजूद ट्यूमर अस्वीकृति को रोकने में विफल रहीं, जिससे पता चलता है कि डीसी661 ने इम्युनोजेनिक कोशिका मृत्यु को प्रेरित किया (चित्र 9बी और पूरक चित्र 9ई)। इसके विपरीत, डीसी उपचारित एमसी38 कोशिकाओं के साथ एक पार्श्व के टीकाकरण ने विपरीत पार्श्व पर प्रत्यारोपित जीवित एमसी38 कोशिकाओं की पूर्ण अस्वीकृति को बढ़ावा दिया (चित्र 9सी और पूरक चित्र 9एफ)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या MC38 ट्यूमर के साथ DC661 के टीके के प्रभाव के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा महत्वपूर्ण थी, हमने NOD/SCID चूहों में प्रयोग दोहराया। आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि डीसी उपचारित एमसी38 कोशिकाओं ने इम्यूनोडेफिशिएंसी एनओडी/एससीआईडी ​​चूहों (चित्र 9डी और पूरक चित्र 9जी) में ट्यूमर को फिर से चुनौती देने की अस्वीकृति को प्रेरित नहीं किया, जो दर्शाता है कि देखे गए टीके के प्रभाव के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा की आवश्यकता थी। इस खोज की मजबूती का परीक्षण करने के लिए, हमने एक और प्रसिद्ध इम्युनोजेनिक माउस कैंसर सेल लाइन, CT26 का चयन किया और ऊपर बताए अनुसार टीकाकरण प्रयोग किया। जैसा कि अपेक्षित था, माउस के एक पार्श्व में DC उपचारित CT26 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण ने एक वैक्सीन जैसा प्रभाव उत्पन्न किया और दूसरे पार्श्व पर प्रत्यारोपित जीवित CT26 कोशिकाओं के विकास को रोक दिया (चित्र 9E और पूरक चित्र 9H)। हमारे निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि डीसी प्रेरित एलएलपी एलएमपी-मध्यस्थता वाली इम्युनोजेनिक कोशिका मृत्यु के लिए महत्वपूर्ण है, जो लाइसोसोमल ट्रांसपोर्टर एमएफएसडी12 (चित्र 9एफ) द्वारा लाइसोसोम में सिस्टीन के आयात से उलट जाता है।

बहस

प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में लाइसोसोमल निषेध एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण प्रतीत होता है, और एचसीक्यू क्लिनिकल परीक्षणों ने उत्साहजनक लेकिन मिश्रित परिणाम उत्पन्न किए हैं (1, 32)। PPT1 HCQ का आणविक लक्ष्य है, और अधिक शक्तिशाली PPT1 अवरोधक, जैसे DC661 (2) और GNS561 (3), इन विट्रो में LMP-मध्यस्थता कोशिका मृत्यु को प्रेरित करते हैं। लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु का सटीक तंत्र और ट्यूमर इम्यूनोजेनेसिटी में इसकी भूमिका को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। जब ऑटोफैगी अवरोध को इम्यूनोथेरेपी (9, 10, 31) के साथ जोड़ा जाता है तो एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा बढ़ जाती है। ऑटोफैगी निषेध के बाद कोशिका-आंतरिक इम्युनोजेनेसिटी के लिए प्रस्तावित तंत्र में एमएचसी वर्ग I और इम्युनोप्रोटेसोम अपग्रेडेशन शामिल हैं, जो दोनों बेहतर एंटीजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, डेंड्राइटिक कोशिकाओं (33) में एमएचसी वर्ग I की सतह के स्तर में वृद्धि से क्लोरोक्वीन संवर्धित सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रिया द्वारा ऑटोफैगी प्रोटीन की हानि या ऑटोफैगी अवरोध। हमने पहले दिखाया था कि प्रणालीगत पीपीटी1 निषेध मैक्रोफेज को एम2 से एम1 फेनोटाइप में पुन: ध्रुवीकृत कर सकता है। PPT1 अवरोधक STING के स्तर को बढ़ा सकते हैं, जिससे IFN रिलीज़ हो सकता है और मेलेनोमा मॉडल (31) में T सेल-मध्यस्थता हत्या में वृद्धि हो सकती है। यहां, हमने प्रदर्शित किया कि एलएलपी स्वयं एक ट्यूमर कोशिका-कोशिका मृत्यु का आंतरिक इम्यूनोजेनिक रूप उत्पन्न करता है। हमने पाया कि लाइसोसोमल अवरोध ने कैंसर कोशिकाओं में बहुत कम प्रोटीन परिवर्तन को प्रेरित किया, और सबसे महत्वपूर्ण रूप से ऊंचे प्रोटीन में ऑटोफैगी कार्गो रिसेप्टर्स और एपोप्टोसिस नियामक शामिल थे। कार्यों में इनमें से कुछ जीनों को लक्षित करने वाले हमारे दृष्टिकोण ने प्रदर्शित किया कि दवा-प्रेरित प्रोटीन संभवतः कोशिका मृत्यु के मुख्य नियामक नहीं थे। ULK1 या ATG7 के आनुवंशिक निषेध ने भी DC661 साइटोटॉक्सिसिटी से बचाव नहीं किया। हमने प्रदर्शित किया कि लाइसोसोमल निषेध क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के कई रूपों को सक्रिय करता है, जिसमें एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस, फेरोप्टोसिस और पायरोप्टोसिस शामिल हैं, लेकिन इनमें से प्रत्येक दवा-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी के लिए डिस्पेंसेबल था। ध्यान दें, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु तंत्र ओवरलैप हो सकते हैं और कई कोशिका मृत्यु तंत्रों का सह-लक्ष्यीकरण लाइसोसोमल झिल्ली पारगम्यता के बाद कोशिका मृत्यु के खिलाफ साइटोप्रोटेक्शन प्रदान कर सकता है। हमारे काम ने लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु के लिए कैथेप्सिन- और कैल्शियम-निर्भर तंत्र को खारिज कर दिया है और कोशिका मृत्यु के महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में एलएलपी के महत्व पर प्रकाश डाला है। हमें एलएलपी के सबूत मिले जो एक एंटीऑक्सिडेंट द्वारा प्रतिवर्ती था जिसे लाइसोसोम, एनएसी में ले जाया गया था और लाइसोसोमल झिल्ली पारगम्यता और साइटोटॉक्सिसिटी के लिए महत्वपूर्ण था। एनएसी एकमात्र एजेंट था जो डीसी प्रेरित कोशिका मृत्यु को कम करने या उलटने में सक्षम था, और यह क्षमता लाइसोसोमल सिस्टीन ट्रांसपोर्टर एमएफएसडी12 की उपस्थिति पर निर्भर थी। लाइसोसोमल पैठ की कमी के कारण संभवतः अन्य लिपिड पेरोक्सीडेशन अवरोधक, ट्रॉलोक्स और विटामिन सी, DC661 साइटोटॉक्सिसिटी को रोकने में असमर्थ थे। एनएसी को सिस्टीन में परिवर्तित किया जाता है, जिसे लाइसोसोम में आयात किया जाता है और इसके डाइसल्फ़ाइड रूप, सिस्टीन में ऑक्सीकरण किया जाता है। सिस्टीन को एक अन्य लाइसोसोमल ट्रांसपोर्टर, सिस्टिनोसिस द्वारा साइटोसोल में निर्यात किया जाता है, जहां यह सिस्टीन में कम हो जाता है जो आंतरिक पोषक स्रोतों को पुनः सक्रिय करता है, रैपामाइसिन कॉम्प्लेक्स 1 के लक्ष्य को पुनः सक्रिय करता है, और ऑटोफैगी (34) को बढ़ावा देता है। सिस्टीन से सिस्टीन (लाइसोसोम) और वापस सिस्टीन (साइटोसोल) में ऑक्सीकरण-कमी का चक्र DC661 साइटोटॉक्सिसिटी या अन्य रोग संदर्भों में अधिक सामान्य लाइसोसोमल चोट के खिलाफ एनएसी का एक संभावित बचाव तंत्र हो सकता है जहां एनएसी चिकित्सीय रूप से उपयोगी साबित हुआ है (35) . एनएसी ने न केवल डीसी प्रेरित एलएलपी और एलएमपी को उलट दिया, बल्कि इम्युनोजेनिक कोशिका मृत्यु मार्कर कैलेरीकुलिन की सतही अभिव्यक्ति भी की। सीएएलआर प्रोटीन की कोशिका सतह अभिव्यक्ति डीसी 661- प्राइमेड स्प्लेनोसाइट्स द्वारा प्रेरित बढ़ी हुई टी सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी के लिए आवश्यक थी, यह दर्शाता है कि लाइसोसोमल निषेध कोशिका-आंतरिक इम्यूनोजेनेसिटी का एक विशिष्ट रूप पैदा करता है।

जबकि पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लाइसोसोमल अवरोध स्थापित फ्लैंक ट्यूमर (9, 31) में प्रतिरक्षा चेकपॉइंट निषेध की एंटीट्यूमर गतिविधि को बढ़ा सकता है, हमारा अध्ययन एमसी38 ट्यूमर के लिए वैक्सीन जैसा प्रभाव प्रदर्शित करने वाला पहला अध्ययन है, लेकिन बी16 ट्यूमर के लिए नहीं। प्रत्यारोपण से पहले ट्यूमर कोशिकाओं का DC661 से उपचार किया गया। यह दर्शाता है कि लाइसोसोमल कोशिका मृत्यु कोशिका-आंतरिक इम्यूनोजेनेसिटी को प्रेरित कर सकती है, लेकिन ये परिवर्तन स्वयं "प्रतिरक्षा शीत" ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को "इम्यून हॉट" ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में उलटने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। "इम्यून कोल्ड" ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट मॉडल B16 और BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (31) में हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रणालीगत लाइसोसोमल अवरोध ने ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज और माइलॉयड सेल-व्युत्पन्न दमनकारी कोशिकाओं पर प्रभाव उत्पन्न किया जो बढ़ाने के लिए पर्याप्त थे। इम्यूनोथेरेपी की प्रभावकारिता. ऐसा हो सकता है कि कोशिका-आंतरिक इम्यूनोजेनेसिटी भी इन प्रतिरक्षा शीत ट्यूमर में एक भूमिका निभाती है जो लाइसोसोमल अवरोध के बाद आईसीडी के प्रति अधिक प्रतिक्रियाशील हो जाती है। नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण में देखे गए लाइसोसोमल निषेध का टीका जैसा प्रभाव क्लिनिक में अनुवादित हो भी सकता है और नहीं भी, लेकिन यह बता सकता है कि पहले से इलाज किए गए बीआरएफ उत्परिवर्ती मेलेनोमा में डबराफेनिब, ट्रामेटिनिब और एचसीक्यू के साथ इलाज करने वाले कुछ रोगियों में इतना गहरा और टिकाऊ क्यों था इस आहार का उत्तर दें (32)। यह समझने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है कि पीपीटी1 निषेध कैसे लाइसोसोमल आरओएस और लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पन्न करता है। V-ATPase और लाइसोसोमल अम्लीकरण का पीपीटी 1-निर्भर विनियमन पर्याप्त स्पष्टीकरण नहीं है क्योंकि बाफिलोमाइसिन लाइसोसोमल अम्लीकरण को रोकता है लेकिन एलएमपी का उत्पादन नहीं करता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इन निष्कर्षों के निहितार्थ से पता चलता है कि लाइसोसोमल अवरोधक जो ट्यूमर सेल-आंतरिक इम्यूनोजेनेसिटी को बढ़ाते हैं, उन्हें तर्कसंगत रूप से उन उपचारों के साथ जोड़ा जा सकता है जो टी-सेल सक्रियण को बढ़ाते हैं, या ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में घुसपैठ करते हैं, जो संभावित रूप से सहक्रियात्मक प्रभाव पैदा करते हैं।

चित्र 5. एन-एसिटाइल सिस्टीन डीसी प्रेरित कोशिका मृत्यु को रोकता है। (ए)

तरीकों

कोश पालन। मानव A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD{3}} (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185), और माउस B16F10 (CRL-6475) सेल लाइनें ATCC से खरीदी गई थीं। मानव A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793, और माउस YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, और Gsdme KO1 और KO2) लाइनें इन-हाउस प्राप्त की गईं। माउस MC38 और CT26 सेल पेनसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के एंडी मिन द्वारा प्रदान किए गए थे। FL5.12 और IL-3-आश्रित Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) प्राथमिक अस्थि मज्जा कोशिकाएं कैथरीन ई. वेलेन, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय से प्राप्त की गईं। मानव पैन्क -1 (सीआरएल -1469, एटीसीसी) सेल लाइन बेन ज़ेड. स्टैंगर, पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई थी। माउस YUMMER 1.7 सेल लाइन ज़ियाओवेई (जॉर्ज) जू, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय से प्राप्त की गई थी। पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय की कोर सुविधाओं द्वारा हर साल माइकोप्लाज्मा के लिए सभी सेल लाइनों का परीक्षण किया गया और विस्टार इंस्टीट्यूट जीनोमिक्स कोर द्वारा शॉर्ट-टेंडेम रिपीट फिंगरप्रिंटिंग का उपयोग करके प्रमाणित किया गया। A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12, और Bax/Bak DKO सेल लाइनों को RPMI 1640 (Invitrogen, 11875) में संवर्धित किया गया; A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10, और MC38 सेल लाइनों को DMEM (इन्विट्रोजन, 11995) में संवर्धित किया गया; और YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, और Gsdme KO1 और KO2) कोशिकाओं (15) को DMEM/F12 50/50 (कॉर्निंग, 10-092-CV) में संवर्धित किया गया। कल्चर मीडिया को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (12306C, मिलिपोरसिग्मा) और 1× एंटीबायोटिक एंटीमायोटिक समाधान (गिब्को, 15140-122) के साथ पूरक किया गया था। FL5.12 और Bax/Bak DKO सेल लाइनों को 50 μM -मर्कैप्टोएथेनॉल (लाइफ टेक्नोलॉजीज, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, मिलिपोरसिग्मा), और 0.35 एनजी/एमएल और 3.5 एनजी के साथ पूर्ण आरपीएमआई मीडिया में बनाए रखा गया था। /एमएल आईएल-3, क्रमशः। YUMMER1.7 और YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, और Gsdme KO) सेल लाइनों को 1× MEM NEAA (गिब्को, 11140-050) के साथ पूरक पूर्ण मीडिया में बनाए रखा गया था। WM35 और WM793 कोशिकाओं को MCDB मीडिया 153 (मिलिपोरसिग्मा, M7403) में संवर्धित किया गया, जिसमें 1× लीबोविट्ज़ L{85}} माध्यम (कॉर्निंग, 10-045-CV) में 10% FBS, 7.5% w/v सोडियम बाइकार्बोनेट ( कॉर्निंग, 25-035-सीआई), 1× एंटीबायोटिक एंटीमायोटिक सॉल्यूशन (गिब्को, 15140-122), और 5 यूजी/एमएल इंसुलिन (मिलिपोरसिग्मा, आई0516)। कोशिकाओं को 5% CO2 की उपस्थिति में 37 डिग्री पर विकसित किया गया। रसायन और अभिकर्मक. खरीदे गए रसायनों में एचसीक्यू सल्फेट (स्पेक्ट्रम केमिकल्स, 747-36-4) और डीसी661 (सेलेककेम, एस8808) शामिल हैं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैल्शियम के लिए कोशिकाओं को दागने के लिए फ्लुओ -4, एएम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, एफ14201) का उपयोग किया गया था। पूरक तालिका 1 और पूरक तालिका 2 में एंटीबॉडी और अवरोधकों की एक सूची प्रदान की गई है।

चित्र 6. एनएसी एलएलपी को एमएफएसडी पर निर्भर तरीके से उलट देता है। (एसी)

तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन-प्रोटिओमिक्स के लिए टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। {{0}}.7 × 106 ए375पी मेलेनोमा कोशिकाओं को 60 मिमी कल्चर डिश में संवर्धित किया गया। कोशिकाओं को DMSO (नियंत्रण), DC661 (3 μM), HCQ (1 {{38 }} μM), या HCQ (3 {{7{{99 }} μM) के साथ 24 घंटे तक लगभग 5 {{ पर उपचारित किया गया। 112}}% संगम। जमे हुए सेल छर्रों को 5 0 एमएम ट्रिस पीएच 7.4, 1% एसडीएस, 15 {{152%) एमएम NaCl, 1 एमएम EDTA, 0.15 एमएम पीएमएसएफ, 1 यूजी/एमएल पेपस्टैटिन के साथ लीज किया गया था। और 1 यूजी/एमएल ल्यूपेप्टिन। स्पष्ट लाइसेट्स (प्रत्येक 1 {{185 %) को 0.5 सेमी इलेक्ट्रोफोरस करके एक बिस्-ट्रिस जेल में डाला गया, जिसके बाद कोलाइडल कूमैसी के साथ फिक्सिंग और धुंधलापन किया गया। प्रत्येक 0.5 सेमी जेल लेन को ट्राइस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन के साथ कम किया गया, आयोडोएसिटामाइड के साथ अल्काइलेट किया गया, और ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया जैसा कि पहले बताया गया है (36)। डाइजेस्ट (1 यूजी) का विश्लेषण नैनोएक्विटी यूपीएलसी (वाटर्स) के अनुरूप क्यू-एक्सएक्टिव प्लस मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) द्वारा किया गया था। विश्लेषणात्मक पृथक्करण 1.7 μm × 250 मिमी पेप्टाइड BEH C18 कॉलम (वाटर्स, 186003546) पर पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड (मोबाइल चरण ए) और एसीटोनिट्राइल (मोबाइल चरण बी) के साथ एक 245- मिनट ग्रेडिएंट का उपयोग करके किया गया था। : 225 मिनट में 5%-30% बी, 5 मिनट में 30%-80% बी, 80% बी पर {{46%) मिनट रुकें, और प्रारंभिक स्थितियों पर वापस लौटें। पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा को 70,{49}} रेजोल्यूशन पर, 400-2,{52}} मी/जेड की स्कैन रेंज, 3 × 106 आयनों का एक स्वचालित लाभ नियंत्रण लक्ष्य और अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ प्राप्त किया गया था। 50 मिलीसेकेंड. डेटा-निर्भर MS2 स्पेक्ट्रा को शीर्ष 20 सबसे प्रचुर आयनों के लिए 17,500 रिज़ॉल्यूशन पर प्राप्त किया गया था, जिसमें 1.5 m/z की अलगाव चौड़ाई, 5 × 104 आयनों का स्वचालित लाभ नियंत्रण लक्ष्य और 50 मिलीसेकंड का अधिकतम इंजेक्शन समय था। पेप्टाइड मैच को पसंदीदा पर सेट किया गया था, और अनिर्धारित और एकल चार्ज किए गए आयनों को अस्वीकार कर दिया गया था (37)। रॉ एमएस डेटा का विश्लेषण मैक्सक्वांट 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) का उपयोग करके यूनिप्रोट मानव अनुक्रम डेटाबेस (10 अक्टूबर, 2019 को एक्सेस किया गया) और ट्रिप्सिन, केराटिन, गोजातीय प्रोटीन सहित एक सामान्य संदूषक डेटाबेस के साथ किया गया था। और माइकोप्लाज्मा (38)। अधिकतम 2 मिस्ड क्लीवेज के साथ ट्राइप्टिक पेप्टाइड विशिष्टता, सिस्टीन (कार्बामिडोमिथाइलेशन) पर निश्चित संशोधन, और परिवर्तनीय मेथिओनिन ऑक्सीकरण या एन-टर्मिनल एसिटिलेशन का उपयोग खोज (39) में किया गया था। पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए 1% एफडीआर का कटऑफ इस्तेमाल किया गया था। रनों के बीच मिलान सक्षम किया गया था; लेबल-मुक्त परिमाणीकरण (40) का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई। पर्सियस 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। प्रोटीन को कम से कम 3 अद्वितीय पेप्टाइड्स द्वारा पहचाना जाना आवश्यक था और एक नमूना समूह के भीतर 3 वैध मान (गैर-शून्य मात्रा) थे, और दूषित पदार्थों और रिवर्स प्रोटीन को डेटा सेट से फ़िल्टर किया गया था। गुम मान सामान्य वितरण से आरोपित किए गए थे। स्थितियों के बीच जोड़ीवार तुलनाएं प्रोटीन स्तर पर क्रमपरिवर्तन-आधारित एफडीआर के साथ एस0=0.1 और 250 यादृच्छिकीकरण के साथ एक 2-पूंछ वाले छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके की गई थीं। जैसा कि निर्दिष्ट है, महत्वपूर्ण परिवर्तनों को 5% से कम की एफडीआर और 1.5 या 2.0 से अधिक पूर्ण गुना परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया था। लाइसो-आईपी। A375P कोशिकाओं को pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus से संक्रमित किया गया और 1 mg/mL पौरोमाइसिन (मिलिपोरसिग्मा, P4512) का उपयोग करके चुना गया। लगभग 3 × 106 HA-टैग की गई A375P कोशिकाओं को पहले वर्णित संस्कृति स्थितियों में 24 घंटे के लिए 10 मिमी एनएसी या जल वाहन नियंत्रण के साथ इलाज किया गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस में धोया गया, 0.5 एमएल ठंडे केपीबीएस में काटा गया, और 2 एमएल डौंस होमोजेनाइज़र में 20 स्ट्रोक का उपयोग करके धीरे से समरूप बनाया गया। लगभग 2.5% होमोजेनेट को संपूर्ण-कोशिका लाइसेट विश्लेषण के लिए आरक्षित किया गया था, और शेष को कोशिका झिल्ली के मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री पर 2 मिनट के लिए 3,{120}} ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। फिर होमोजेनेट सतह पर तैरनेवाला को एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित किया गया और 50 μL एंटी-एचए मोतियों (पियर्स, 88836) या एंटी-डीडीके/फ्लैग मोतियों (ओरिजिन, टीए150042) के साथ 4 डिग्री पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर नमूनों को डायनामैग (थर्मो फिशर साइंटिफिक, 12321डी) पर ट्यूब रखकर अवक्षेपित किया गया और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए धीरे से हिलाया गया। सतह पर तैरनेवाला अनबाउंड अंश विश्लेषण के लिए आरक्षित था। आईपी ​​को 8 एमएम CaCl2 युक्त KPBS से 3 बार धोया गया। मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के लिए लाइसो-आईपी को 80% MeOH में निकाला गया था। वैश्विक लिपिडोम के लिए एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके लिपिड निष्कर्षण और विश्लेषण। मेलेनोमा A375P कोशिकाओं को 60 मिमी डिश में 0.7 × 106 सेल प्रति डिश पर रखा गया था। जब कोशिकाएँ लगभग 50% संगम पर थीं, तो उन्हें 24 घंटे के लिए DMSO (नियंत्रण), DC661 (3 μM), या HCQ (30 μM) से उपचारित किया गया। कोशिकाओं को एचबीएसएस के साथ 2 बार धोया गया, बर्फ-ठंडे मेथनॉल में स्क्रैप किया गया, और क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल / 0.88% NaCl (2: 1: 1) के साथ लिपिड निष्कर्षण के लिए ग्लास ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया जिसमें एक इक्विस्प्लैश आंतरिक लिपिड मानक (अवंती पोलर लिपिड) था। नमूनों को घुमाया गया और फिर बर्फ पर 5 मिनट तक पानी से स्नान कराया गया। 40 डिग्री पर 15 मिनट के लिए 500 ग्राम सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, निचले चरण को एक अन्य ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था। ऊपरी चरण को सिंथेटिक निचले चरण का उपयोग करके पुनः निकाला गया। सोनिकेशन और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, निचले चरण को पहले निचले चरण के संग्रह के साथ जोड़ा गया था। नमूनों को नाइट्रोजन के तहत सुखाया गया, 10% क्लोरोफॉर्म/90% मेथनॉल में पुनः निलंबित किया गया, और ग्लास एलटीक्यू शीशियों में स्थानांतरित किया गया। लिपिड नमूनों का विश्लेषण थर्मो फिशर साइंटिफिक QExactive HF-X मास स्पेक्ट्रोमीटर और वैनक्विश होराइजन UHPLC सिस्टम पर किया गया। विश्लेषणात्मक पृथक्करण में 50:50 एसीटोनिट्राइल/पानी और 88:10:2 आइसोप्रोपेनॉल/एसिटोनिट्राइल/पानी के साथ एक्यूकोर सी30 कॉलम (2.1 मिमी × 150 मिमी, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग किया गया, प्रत्येक में 5 मिमी अमोनियम फॉर्मेट और 0.1% फॉर्मिक एसिड होता है। एलसी-एमएस/एमएस डेटा को निम्नलिखित उपकरण मापदंडों के साथ सकारात्मक और नकारात्मक ध्रुवों में अलग-अलग हासिल किया गया था: एमएस1 स्कैन 120, 000 रिज़ॉल्यूशन; 15,000 रिज़ॉल्यूशन पर शीर्ष 20 सबसे प्रचुर आयनों पर डेटा-निर्भर MS2; 0.4 m/z अलगाव चौड़ाई; और 20:30:40 (43) की चरणबद्ध सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा।

चित्र 7. एन-एसिटाइल सिस्टीन डीसी प्रेरित कैलेरीकुलिन सतह अभिव्यक्ति को रोकता है। (ए-डी)

लिपिडसर्च 4.2 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके लिपिड की पहचान और मात्रा निर्धारित की गई। पहचानी गई लिपिड प्रजातियों को वर्ग के आधार पर अपेक्षित योजक और पहचान ग्रेड द्वारा फ़िल्टर किया गया था। समर्थित वर्गों के लिए पीक क्षेत्रों को इक्विस्प्लैश मानकों के अनुसार सामान्यीकृत किया गया और सेल संख्या में भिन्नता को सही करने के लिए प्रत्येक नमूने के कुल क्षेत्र के आधार पर आगे सामान्यीकृत किया गया। पर्सियस 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42) का उपयोग करके लॉग-ट्रांसफ़ॉर्म किए गए डेटा पर सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। मेटाबोलोन के लिए एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके मेटाबोलाइट निष्कर्षण और विश्लेषण। ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स को संपूर्ण कोशिकाओं, लिसो-आईपी अनबाउंड अंशों और लिसो-आईपी बाउंड नमूनों से 8 {{28 }}% मेथनॉल का उपयोग करके निकाला गया था और तरल क्रोमैटोग्राफी से पहले -8 {3 {{39 }} }} डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। -मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विश्लेषण। अर्क का विश्लेषण एलसी-एमएस द्वारा थर्मो साइंटिफिक क्यू-एक्सएक्टिव एचएफ-एक्स मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके थर्मो वैंक्विश होराइजन यूएचपीएलसी प्रणाली के अनुरूप एचईएसआई II जांच के साथ किया गया था। एलसी पृथक्करण एक ZIC-HILIC कॉलम (2.1 मिमी × 150 मिमी, 5 माइक्रोन कण आकार, EMD मिलिपोर) का उपयोग करके ZIC-HILIC गार्ड कॉलम (2.1 मिमी × 20 मिमी, EMD मिलिपोर) का उपयोग करके प्रवाह दर के साथ 45 डिग्री पर किया गया था। 0.2 एमएल/मिनट की. थियोल समूहों की प्रतिक्रियाशीलता को कम करने के लिए अम्लीय परिस्थितियों में क्रोमैटोग्राफी की गई। मोबाइल चरण ए पानी था और बी एसीटोनिट्राइल था, दोनों में 0.1% फॉर्मिक एसिड था। एलसी ग्रेडिएंट 2 मिनट के लिए 85% बी, 15 मिनट में 85% बी से 20% बी, 0.1 मिनट में 20% बी से 85% बी और 8.9 मिनट के लिए 85% बी था। ऑटोसैंपलर को 4 डिग्री पर रखा गया था, और प्रत्येक नमूने का 4 μL प्रति विश्लेषण इंजेक्ट किया गया था। निम्नलिखित एमएस पैरामीटर का उपयोग किया गया: शीथ गैस प्रवाह दर, 40 एयू; सहायक गैस प्रवाह दर, 10 एयू; स्वीप गैस प्रवाह दर, 2 एयू; सहायक गैस हीटर तापमान, 350 डिग्री; स्प्रे वोल्टेज, सकारात्मक मोड के लिए 3.75 केवी और नकारात्मक मोड के लिए 3.5 केवी; केशिका तापमान, 375 डिग्री; और फ़नल आरएफ स्तर, 40%। सभी नमूनों का विश्लेषण पूर्ण एमएस द्वारा ध्रुवीयता स्विचिंग के साथ किया गया। 1×106 आयनों के स्वचालित लाभ नियंत्रण लक्ष्य और 100 मिलीसेकंड के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ 120, {59}} रिज़ॉल्यूशन पर 65 से 975 m/z तक पूर्ण एमएस स्कैन प्राप्त किए गए थे। ट्रेसफाइंडर 4.1 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके कच्चे डेटा का विश्लेषण किया गया। लक्षित मेटाबोलाइट्स की पहचान विश्लेषणात्मक मानकों के आधार पर उनके पसंदीदा ध्रुवता में सटीक द्रव्यमान और अवधारण समय द्वारा की गई थी। पीक डिटेक्शन ने 1 की स्मूथिंग के साथ आईसीआईएस एल्गोरिदम का उपयोग किया। एक एकीकृत पीक क्षेत्र का उपयोग करके सापेक्ष मात्रा का ठहराव किया गया था, और इन मानों को प्रति नमूना कुल राशि (कुल पीक क्षेत्र के रूप में परिभाषित) में सही किया गया था। पीपीटी1-CRISPR/Cas9 संपादन। A375P PPT1-गैर-लक्ष्य और KO सेल पहले वर्णित (44) के अनुसार तैयार किए गए थे। pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) फेंग झांग (Addgene प्लाज्मिड, 48139) का एक उपहार था। ऐडजीन के माध्यम से उपलब्ध झांग लैब प्रोटोकॉल का पालन करते हुए गाइड आरएनए ऑलिगोस (आईडीटी) को एनील्ड किया गया, फॉस्फोराइलेट किया गया और फिर बीबीएसआई डाइजेस्ट और डीफॉस्फोराइलेटेड पीएक्स459 प्लास्मिड में लिगेट किया गया। लिगेटेड प्लास्मिड को Stbl3 कोशिकाओं (इन्विट्रोजन) में बदल दिया गया। प्लास्मिड प्रीप्स के अनुक्रमण ने वांछित गाइड आरएनए अनुक्रमों की उपस्थिति की पुष्टि की। A375P कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन 3 000 (इन्विट्रोजन, L3000015) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, इसके बाद पौरोमाइसिन का चयन किया गया। सर्वेयर के आकलन से CRISPR/Cas9 द्वारा PPT1 जीन के संपादन की पुष्टि हुई, और PPT1 एंटीबॉडी (ओरिजिन) के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा PPT1 नॉकडाउन की पुष्टि की गई। गाइड आरएनए ऑलिगोस के लिए अनुक्रम इस प्रकार हैं: नॉनटार्गेट गाइड आरएनए फॉरवर्ड (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), नॉनटार्गेट गाइड आरएनए रिवर्स (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), मानव PPT1 गाइड RNA 1 फॉरवर्ड (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), मानव PPT1 गाइड RNA 1 रिवर्स (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), मानव PPT1 गाइड RNA 3 फॉरवर्ड (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), और मानव PPT1 गाइड RNA 3 रिवर्स (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC)। इस पेपर में प्रयुक्त एकल कोशिकाओं से विकसित क्लोनों में निम्नलिखित शामिल हैं: क्लोन सी8 मानव गाइड 1 है और क्लोन बी5 मानव गाइड 3 है। इम्यूनोब्लॉटिंग। दस लाख कोशिकाओं को 10 सेमी डिश में चढ़ाया गया, और अगले दिन उपचार दिया गया; कोशिकाओं को स्क्रैप करके एकत्र किया गया। एसडीएस लिसीस बफर का उपयोग करके संपूर्ण-सेल लाइसेट्स तैयार किए गए थे। प्रोटीन सांद्रता को पियर्स बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, 23225) का उपयोग करके मापा गया था। एसडीएस-पेज के लिए 30-50 यूजी प्रोटीन का उपयोग किया गया था और इसे पीवीडीएफ झिल्ली (बायो-रेड, 1620177) पर स्थानांतरित किया गया था। झिल्ली को अनुकूलित परिस्थितियों के अनुसार 5% बीएसए या 5% स्किम्ड दूध का उपयोग करके अवरुद्ध किया गया था, और 4 डिग्री पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। पीवीडीएफ झिल्ली को 1 × टीबीएस-टी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी इंक, सीएस -9997) से धोया गया और प्रजाति-विशिष्ट एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। बाद में पियर्स ईसीएल वेस्टर्न ब्लॉटिंग सब्सट्रेट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, 32106) और ऑटोरैडियोग्राफी फिल्मों (लैब साइंटिफिक इंक, एक्सएआर एएलएफ 1318) का उपयोग करके झिल्ली को धोया और विकसित किया गया। पायरोप्टोसिस अध्ययन के लिए, प्रोटीन लाइसेट्स को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। 5% बीएसए में अवरुद्ध करने के बाद, पीवीडीएफ झिल्ली को रात भर 4 डिग्री पर संकेतित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया, पीबीएस/ट्वीन में धोया गया, और पेरोक्सीडेज-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (कैलबीओटेक), एक केमिलुमिनसेंस सब्सट्रेट (थर्मो फिशर साइंटिफिक), और एक केमिकडॉक एमपी इमेजिंग सिस्टम (बायो-रेड) का उपयोग करके इम्यूनोएक्टिविटी का पता लगाया गया था। सतह पर तैरनेवाला से जुड़े प्रयोगों के लिए, एसडीएस-पेज के विरूपण से बचने के लिए कोशिकाओं को एफबीएस मुक्त माध्यम में संवर्धित किया गया था। सेल मलबे को हटाने के लिए सेल सतह पर तैरनेवाला काटा गया और 500 ग्राम को 4 डिग्री पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। परिणामी सतह पर तैरनेवाला को एमिकॉन अल्ट्रा 10K (मिलिपोरसिग्मा) का उपयोग करके 30 मिनट के लिए 4 डिग्री पर 4,500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 10 × केंद्रित किया गया था। सांद्रणों को नमूना बफर के साथ मिलाया गया और ऊपर बताए अनुसार वेस्टर्न ब्लॉटिंग के माध्यम से विश्लेषण किया गया। पोंसेउ लाल स्टेनिंग का उपयोग करके प्रोटीन जेल स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया। एलएमपी और कैथेप्सिन एल गतिविधि परख। मानव pEGFP-hGal3 प्लास्मिड तमोत्सु योशिमोरी (एडजीन प्लास्मिड, 73080) का एक उपहार था और इसका उपयोग A375P-गैलेक्टिन -3 लाइन बनाने के लिए किया गया था। pEGFP-C1 नियंत्रण प्लास्मिड वेक्टर बैकबोन खरीदा गया था (नोवो प्रोलैब्स, V012024)। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (इनविट्रोजन, 11668019) का उपयोग करके प्लास्मिड को A375P कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट (1 ug/mL) किया गया; ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को G418 (गिब्को, 10131035) का उपयोग करके स्थिर रूप से चुना गया था। एलएमपी के लिए, कई छवि क्षेत्रों में कुल 25 ए375पी-गैलेक्टिन-3 पंक्टा-पॉजिटिव कोशिकाओं की गिनती की गई। प्रत्येक क्षेत्र में पंक्टा पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत की अलग से गणना की गई, और प्रत्येक समूह के लिए औसत प्रतिशत की गणना की गई। मैजिक रेड कैथेप्सिन एल परख किट (एबीकैम, एबी270774) का उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। कोशिकाओं की छवि ज़ीस एक्सियो ऑब्जर्वर 7 उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत ली गई थी। मैजिक रेड कच्ची एकीकृत तीव्रता की गणना फिजी - इमेजजे सॉफ्टवेयर (एनआईएच) का उपयोग करके की गई थी। एमटीटी (3-[4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल]-2, 5 डिफेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड) सेल व्यवहार्यता परख। प्रत्येक वेल प्लेट में 2,000 कोशिकाओं को तीन प्रतियों में चढ़ाया गया था, और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेल व्यवहार्यता किट (रोश, 11465007001) का उपयोग करके 3- दिन एमटीटी परीक्षण किया गया था। 1 घंटे के लिए अवरोधक पूर्व उपचार दिया गया, इसके बाद DC661 के साथ या उसके बिना अवरोधकों के साथ कोशिकाओं का सह उपचार किया गया। IC50 की गणना के लिए नॉनलाइनियर रिग्रेशन (वक्र फिट) विधि का उपयोग किया गया था।

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कॉलोनी गठन परख. प्रति कुँए 2,000 कोशिकाओं को एक {{2%) कुएँ की प्लेट में डाला गया और अगले दिन उपचारित किया गया; कोशिकाओं को कुल 8 दिनों तक उपचार के अंतर्गत रखा गया। प्रत्येक कुएं में बनी कालोनियों को पीबीएस से धोया गया, 20 मिनट के लिए -2 0 डिग्री पर ठंडे मेथनॉल के साथ तय किया गया, और क्रिस्टल वायलेट 0.5% जलीय घोल (V5265; मिलिपोरसिग्मा) के साथ दाग दिया गया।

ट्रिपैन ब्लू डाई अपवर्जन परख। ट्रिपैन ब्लू परख के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण 0.4% ट्रिपैन ब्लू (25- 900-सीआई, कॉर्निंग) के 1 भाग और पतला सेल नमूनों के 1 भाग को मिलाकर तैयार किया गया था। मिश्रण को 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, और कोशिकाओं को सेलोमीटर विजन (नेक्ससेलोम, विजन -310-0208) पर गिना गया था।

चित्र 8. डीसी661-प्रेरित कैलेरेटिकुलिन सतह अभिव्यक्ति ट्यूमर कोशिकाओं के विरुद्ध टी कोशिकाओं को प्राइम करती है। (ए)

चित्र 9. डीसी उपचारित कोशिकाओं का टीकाकरण विशिष्ट संदर्भों में ट्यूमर अस्वीकृति उत्पन्न करता है। (ए)

फोम-एलपीओ। एलएलपी का अध्ययन एक फ्लोरोसेंट जांच, FOAMLPO का उपयोग करके किया गया था। फोम-एलपीओ को पहले वर्णित (26) के अनुसार संश्लेषित किया गया था। कोशिकाओं को 8 वेल μस्लाइड (ibid, 80807) पर संवर्धित किया गया और अवरोधकों के साथ और DC661 के साथ या उसके बिना इलाज किया गया। कोशिकाओं को 5% CO2 और 95% वायु के वातावरण में 37 डिग्री पर 5 मिनट के लिए FOAM-LPO (1 M) युक्त मीडिया के साथ ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को मीडिया से दो बार धोया गया, और फिर एलएलपी के जवाब में 586 से 512 एनएम तक प्रतिदीप्ति स्थानांतरण का पता लगाने के लिए कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप (ज़ीस एक्सियो ऑब्जर्वर 7 उल्टे माइक्रोस्कोप) के तहत देखा गया। क्यूआरटी-पीसीआर और प्राइमर। A375P (3 × 105) कोशिकाओं को 60 मिमी डिश में संवर्धित किया गया और 24 घंटे के लिए DMSO या DC661 (3 μM) के साथ इलाज किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कुल आरएनए को आरएनए आइसोलेशन किट (क्यूआईएजीएन, 74134) से अलग किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल (थर्मो साइंटिफिक, K1642) के अनुसार 500 एनजी शुद्ध आरएनए के साथ एक आईस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित किया गया था। क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया 1 μL सीडीएनए युक्त एसवाईबीआर ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (बायोरैड, 1725121) का उपयोग करके स्थापित की गई थी। सभी माप तीन प्रतियों में किए गए थे, और BACTIN का उपयोग ΔCT गणना के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में किया गया था। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करके किया गया था: PTGS2/COX-2 फॉरवर्ड (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 रिवर्स (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS फॉरवर्ड (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS रिवर्स (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 फॉरवर्ड (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 रिवर्स (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), बैक्टिन फॉरवर्ड (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT), और बैक्टिन रिवर्स (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC)।

siRNA अभिकर्मक। मानव ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 और MFSD12 के लिए आनुवंशिक नॉकडाउन अध्ययन A375P सेल लाइनों में किए गए थे। माउस पीपीटी1 और कैलेरेटिकुलिन के लिए आनुवंशिक निषेध अध्ययन एमसी38 कोशिकाओं में किए गए। नॉनटार्गेट siRNA (sc{{10}}), मानव ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), माउस Ppt1/Cln1 (sc-142398) और कैलेरेटिकुलिन /कैलरेगुलिन (sc-29895) siRNAs सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी से खरीदे गए थे। इन siRNAs में 3-5 लक्ष्य-विशिष्ट siRNAs के पूल शामिल हैं। फ़्लो साइटॉमेट्री। फेरोप्टोसिस इंडक्शन को C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, थर्मो फिशर साइंटिफिक, D3861) का उपयोग करके मापा गया था। A375P कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से प्लेट में डाला गया और DMSO, फेरोस्टैटिन (10 μM), लिप रॉक्सस्टैटिन (2 μM), इलास्टिन (5 μM) से उपचारित किया गया। ), DC661 (3 μM), या 24 घंटे के लिए एक संयोजन। कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके एकत्र किया गया। कोशिकाओं को 500 μL 1X HBSS (कॉर्निंग, 21-023-CV) में 1 μM C{54}}BODIPY युक्त फिर से निलंबित किया गया और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को 500 μL 1X HBSS में पिलाया गया और पुनः निलंबित किया गया, और प्रतिदीप्ति तीव्रता को 530/30 ब्लू (पेंसिल्वेनिया फ्लो कोर सुविधा विश्वविद्यालय) का उपयोग करके BD LSRII साइटोमीटर पर मापा गया। इम्यूनोजेनिक कोशिका मृत्यु के लिए कैलेरेटिकुलिन की कोशिका सतह अभिव्यक्ति की मात्रा प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पहले वर्णित (45) के अनुसार की गई थी। B16F10 या MC38 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए NAC (10 mM) या DC661 (3 μM) के साथ सुसंस्कृत और उपचारित किया गया। MC38 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 mM NAC की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 48 घंटे तक siPpt1 या siNT से उपचारित किया गया। कोशिकाओं को CALR एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, 12238), एलेक्सा फ्लोर 647 बकरी विरोधी खरगोश द्वितीय एंटीबॉडी (इनविट्रोजन), और प्रोपीडियम आयोडाइड (PI) (बायोलेजेंड, 421301) से रंगा गया था। पीआई और सीएएलआर प्रतिदीप्ति को पकड़ने के लिए क्रमशः 710/50 ब्लू और 670/30 रेड का उपयोग करके बीडी एलएसआरआईआई प्रवाह साइटोमीटर पर दाग वाले नमूने प्राप्त किए गए थे (पेंसिल्वेनिया फ्लो कोर सुविधा विश्वविद्यालय), और विश्लेषण सीएएलआर-पॉजिटिव और पीआई-नेगेटिव कोशिकाओं तक ही सीमित था। झूठी-सकारात्मक घटनाओं से बचने के लिए। टी सेल प्राइमिंग और प्रतिशत साइटोटोक्सिसिटी। B16 या MC38 ट्यूमर कोशिकाओं (5 × 104) को क्रमशः 24 घंटे के लिए NAC (10 mM) या DC661 (1 μM या 3 μM) के साथ सुसंस्कृत और उपचारित किया गया। Calr आनुवंशिक अवरोध के लिए, MC38 कोशिकाओं को 48 घंटों के लिए Calr siRNA या नॉनटार्गेट siRNA (siNT) के साथ इलाज किया गया, इसके बाद 24 घंटों के लिए DMSO या 3 μM DC661 के साथ इलाज किया गया। इसके बाद स्प्लेनोसाइट्स को डीसी661 के साथ बी16 या एमसी38 कोशिकाओं के साथ या उसके बिना आईएल {102}} (5 आईयू/एमएल) की उपस्थिति में संवर्धित किया गया और 72 घंटों के लिए सह-संवर्धित किया गया। प्राइमिंग की पुष्टि सतह पर तैरनेवाला के आईएफएन-एलिसा (बायोलेजेंड, 430815) द्वारा की गई थी। प्राइमेड स्प्लेनोसाइट्स को क्रमशः बी 16 और एमसी 38 कोशिकाओं के लिए 1:20 और 1:50 के लक्ष्य-से-प्रभावक (बी 16 या एमसी 38 से स्प्लेनोसाइट्स) अनुपात के साथ ताजा संवर्धित बी 16 या एमसी 38 कोशिकाओं के साथ सहसंवर्धित किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल (मिलिपोरसिग्मा, 4744926001) (31) के अनुसार बी16 या एमसी38 कोशिका मृत्यु-संबंधित एलडीएच रिलीज और फिर प्रतिशत साइटोटॉक्सिसिटी को मापा गया था। स्थापित कैंसर मॉडल के साथ एंटीट्यूमर टीकाकरण परीक्षण और कीमोथेरेपी अध्ययन। छह से आठ सप्ताह की मादा WT C57BL/6 चूहों, NOD/SCID, और BALB/c चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला से प्राप्त किया गया था। एंटीट्यूमर टीकाकरण प्रयोगों के लिए, WT B16F10, MC38, और CT26 कोशिकाओं को 175 सेमी2 फ्लास्क में 36 घंटे के लिए DC661 (3 μM) से उपचारित किया गया। फिर, सतह पर तैरनेवाला और अलग कोशिकाओं को 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में एकत्र किया गया। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज किया गया और बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोया गया। टीकाकरण के लिए, 150 μL सेलुलर सस्पेंशन को प्रतिरक्षा सक्षम C57BL/6 चूहों, प्रतिरक्षाविहीन NOD/SCID चूहों (1.8 × 104 B16F10 कोशिकाओं, 1.5 × 106 MC38 कोशिकाओं प्रति माउस), या सिंजेनिक BALB/c चूहों (3.0) के बाएं पार्श्व में इंजेक्ट किया गया था। × 106 CT26 सेल प्रति माउस)। पीबीएस में पुनः निलंबित फ्रीज-पिघली कोशिकाओं को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इंजेक्ट किया गया था। एक सप्ताह बाद, समान मात्रा में मैट्रीगेल (कॉर्निंग, 354248) के साथ समान प्रकार की जीवित कैंसर कोशिकाएं (3 × 104 बी 16 एफ 10 कोशिकाएं, 2 × 105 एमसी 38 कोशिकाएं, या प्रति माउस 5 × 105 सीटी 26 कोशिकाएं) दाहिने पार्श्व में इंजेक्ट की गईं। टीका लगाए गए चूहों का. ट्यूमर को इलेक्ट्रॉनिक कैलीपर्स का उपयोग करके मापा गया था, और मात्रा की गणना L × W2 × 0.5 के रूप में की गई थी। अगले दिनों तक ट्यूमर के विकास की नियमित रूप से निगरानी की गई, और ट्यूमर की अनुपस्थिति को कुशल एंटीट्यूमर टीकाकरण का संकेत माना गया। DC661-MC38 टीकाकरण अध्ययन NOD/SCID चूहों में दोहराया गया। सांख्यिकी. 2 समूहों की तुलना करते समय छात्र के अयुग्मित, 2-पुच्छीय टी-परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। जब 2 से अधिक समूहों की तुलना की गई तो 1-वे एनोवा परीक्षण का उपयोग किया गया। यदि पी मान 0.05 से कम था तो एक शून्य परिकल्पना को काफी हद तक खारिज कर दिया गया था। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दिखाया गया है। अध्ययन अनुमोदन. सभी पशु प्रयोग पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे।

चीनी जड़ी बूटी सिस्टैंच पौधा-एंटीट्यूमर

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