एमआईआर -214 पीटीईएन / एकेटी / एमटीओआर-विनियमित ऑटोफैगी के माध्यम से सेप्सिस-प्रेरित तीव्र गुर्दे की चोट को ठीक करता है
Feb 28, 2022
सार। पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि ऑक्सीडेटिव तनाव और स्वरभंग का परिणाम तीव्रगुर्दे की चोट (AKI) सेप्सिस और माइक्रोआरएनए (miR)-214 के दौरान की सुरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैगुर्देऑक्सीडेटिव तनाव के अधीन। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य यह परीक्षण करना है कि क्या miR‑214 का रेनोप्रोटेक्शन सेप्सिस में स्वरभंग से संबंधित है। cecal बंधाव और पंचर (CLP) के एक माउस मॉडल में ऑटोफैगी की भूमिका की जांच की गई। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR) का उपयोग miR-214 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। की संरचना और कार्यगुर्देचूहों से काटा मूल्यांकन किया गया।गुर्दाइम्यूनोहिस्टोकेमिकल, इम्यूनोफ्लोरेसेंट और वेस्टर्न ब्लॉटिंग के साथ ऑटोफैगी के स्तर का पता लगाया गया। यह पाया गया कि miR-214 सेप्टिक चूहों में के स्तर को रोककर AKI को कम कर सकता हैगुर्दास्वरभंग। इसके अलावा, miR-214 ने PTEN अभिव्यक्ति को शांत करके स्वरभंग को रोक दियागुर्दासेप्टिक चूहों के ऊतक। इन निष्कर्षों ने संकेत दिया कि miR-214 ने ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और PTEN / AKT / mTOR मार्ग के नियमन के माध्यम से ऑटोफैगी को रोककर CLP- प्रेरित AKI को संशोधित किया।
कीवर्ड:माइक्रोआरएनए -214, पूति, तीव्र गुर्दे की चोट, स्वरभंग, वृक्क
परिचय तीव्रगुर्दे की चोट(एकेआई) सेप्सिस की सबसे आम जटिलताओं में से एक है और 40-50 प्रतिशत सेप्टिक रोगियों में होता है, जिनकी मृत्यु दर 60 प्रतिशत (1) जितनी अधिक होती है। हालाँकि, सेप्सिस-प्रेरित AKI का रोगजनन अस्पष्ट बना हुआ है। ऑटोफैगी को सेप्सिस-प्रेरित एकेआई में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने और सेप्सिस (2,3) के दौरान एकेआई के विकास में ऑटोफैगी परिणामों के निषेध की सूचना दी गई है। पिछले अध्ययनों (4,5) ने पुष्टि की है कि सेप्सिस कई अंगों में स्वरभंग को ट्रिगर करता है, जिसमें शामिल हैंगुर्दा(6) और ऑटोफैजिक प्रक्रियाएं क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया और ऑक्सीडेटिव तनाव (7) को हटाने में शामिल हैं। हालांकि, अत्यधिक स्वरभंग अवांछित और हानिकारक कोशिका मृत्यु (8) का कारण बन सकता है। इसलिए, सेप्सिस-प्रेरित AKI को कम करने के लिए एक मध्यम स्तर की ऑटोफैगी महत्वपूर्ण है। पिछले अध्ययनों ने बताया है कि miR-214 इस्किमिया-रीपरफ्यूजन-प्रेरित AKI को एपोप्टोसिस (9) को रोककर और miR-214 प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) / AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग (10) के माध्यम से डायबिटिक नेफ्रोपैथी में ऑक्सीडेटिव तनाव को दबा देता है। वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि miR-214 ऑटोफैगी (11) को रोककर चूहों में सेप्सिस-प्रेरित मायोकार्डियल डिसफंक्शन को कम कर सकता है। हालाँकि, क्या miR-214 सेप्सिस से प्रेरित AKI को ठीक कर सकता है, यह स्पष्ट किया जाना बाकी है। वर्तमान अध्ययन में, यह अनुमान लगाया गया था कि miR-214 ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और PTEN / AKT / mTOR मार्ग के नियमन के माध्यम से ऑटोफैगी को रोककर CLP- प्रेरित AKI को दर्शाता है।
किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टैन्च
सामग्री और तरीके
जानवरों।वर्तमान अध्ययन में हेबै मेडिकल यूनिवर्सिटी (शीज़ीयाज़ूआंग, चीन) के मेडिकल लेबोरेटरी एनिमल सेंटर द्वारा आपूर्ति की गई कुल 100 कुनमिंग नर चूहों (वजन, 20.40 ± 2.92 ग्राम; आयु, 6-8 सप्ताह) का उपयोग किया गया था। सभी चूहों को 50 प्रतिशत आर्द्रता के साथ 24 डिग्री सेल्सियस पर 12-एच प्रकाश / अंधेरे चक्र के लिए उपार्जित किया गया था और प्रयोगों से पहले 1 सप्ताह से अधिक या उसके बराबर भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच दी गई थी। सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के दिशानिर्देशों (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 1996) और कंग्जो सेंट्रल अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदन (अनुमोदन संख्या 2017‑020‑) के अनुसार सख्ती से किया गया था। 01)। सभी सर्जरी एनेस्थीसिया के तहत की गई और पीड़ा को कम करने के लिए हर संभव प्रयास किया गया।
Cecal बंधाव और पंचर (CLP)।एक murine सेप्सिस मॉडल बनाने के लिए चूहों पर CLP का प्रदर्शन किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित (12) था। आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन (3 प्रतिशत पर प्रेरित और 0.5 प्रतिशत पर बनाए रखा) द्वारा एनेस्थेटिज़िंग के बाद, 1 सेमी मिडलाइन चीरा काट दिया गया था। उजागर सीकुम (अंत से 1 सेमी की दूरी) को 23-गेज सुई का उपयोग करके दो पंचर के साथ जोड़ा गया था। सीकुम ने धीरे से मल की एक छोटी मात्रा को बाहर निकाला और वापस अपनी शारीरिक स्थिति में रखा गया। पेट की दीवार को 3‑0 रेशमी चोटी के साथ परतों में सीवन किया गया था। प्रक्रिया के बाद, 1 मिली 0.9 प्रतिशत खारा को चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया। चूहों को केवल पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान की गई थी। शम मॉडल चूहों को उसी तरह से संचालित किया गया था जैसे सीएलपी मॉडल बिना सीएलपी के।
प्रयोगात्मक परिरूप. चूहे (एन =6 दिखावा सर्जरी और सीएलपी के लिए) बेतरतीब ढंग से सात समूहों को सौंपा गया था: शाम समूह, सीएलपी समूह, एडेनोवायरस (विज्ञापन) -ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) प्लस सीएलपी समूह, Ad‑miR‑214 प्लस सीएलपी समूह , एंटी-miR-214 प्लस CLP ग्रुप, PTEN इनहिबिटर प्लस CLP ग्रुप और Ad-miR-214 प्लस PTEN इनहिबिटर प्लस CLP ग्रुप। शाम समूह के चूहों को एक ही प्रक्रिया से अवगत कराया गया था, लेकिन सीकुम के बंधन और पंचर के बिना। अन्य समूहों में चूहों को cecal बंधाव और वेध प्राप्त हुआ। रक्त, मूत्र और एकत्र करने के लिए सभी चूहों को आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा जल्दी से एनेस्थेटाइज किया गया थागुर्दाअंतिम उपचार के बाद 24 घंटे के नमूने।
एडेनोवायरस-मध्यस्थता वाले Ad-miR-214, एंटी-miR-214 या Ad-GFP-विवो और पीटीईएन अवरोधक इंजेक्शन में जीन स्थानांतरण। Ad‑miR-214, anti-miR-214, या Ad-GFP (शंघाई जीनफार्मा कं, लिमिटेड) को CLP से 4 दिन पहले चूहों के उदर गुहा में पहुंचाया गया था। संक्षेप में, चूहों को आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा संवेदनाहारी किया गया था। एडेनोवायरस के 200 μl युक्त एक कैथेटर (2x1011 pfu, miR-214, एंटी-miR-214 या Ad-GFP व्यक्त करते हुए) इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से सामान्य चूहों को दिया गया था। पीटीईएन अवरोधक (वीओ-ओएचपिक, इंट्रापेरिटोनियल, सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीए) को सीएलपी चूहों को प्रशासित किया गया था, जिन्होंने एडेनोवायरस के प्रशासन से पहले 10 माइक्रोग्राम / किग्रा 30 मिनट की एकल खुराक पर इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से एंटी-एमआईआर -214 प्राप्त किया था। .
गुर्दा समारोह का आकलन। रक्त के नमूनों को चूहों के दिल से काटा गया, इसके बाद सीरम इकट्ठा करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन (कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 3, 000 xg) किया गया। रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) और सीरम क्रिएटिनिन (सीआर) के सीरम स्तर को हिताची 7600 स्वचालित विश्लेषक (हिताची, लिमिटेड) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एलिसा का उपयोग के स्तरों का विश्लेषण करने के लिए किया गया थागुर्दे की चोटमूत्र के नमूनों में अणु-1 (KIM-1; कैट नं। RKM100; R & D सिस्टम्स, इंक।) और न्यूट्रोफिल जिलेटिनस-जुड़े लिपोकेलिन (NGAL; कैट नं। DY3508; R & D सिस्टम्स, इंक।)
सीरम सूजन साइटोकाइन के लिए परख।सीरम TNF‑ (बिल्ली नं। H052) और IL-6 (बिल्ली संख्या H007) की निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक एलिसा किट (नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट) का उपयोग करके जांच की गई।ऑक्सीडेटिव तनाव मार्करों का मापन. संबंधित परख किट (नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट, नानजिंग, चीन) का उपयोग मालोंडियलडिहाइड (एमडीए) के स्तर को मापने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) की गतिविधि का परीक्षण करने के लिए किया गया था।
ऊतक विज्ञान और ट्यूबलर चोट स्कोर। सभी चूहों के अधीन थेगुर्दासीएलपी के बाद 24 घंटे संज्ञाहरण के तहत छिड़काव।गुर्दानमूने 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तय किए गए थे। ऊतक के नमूनों को तब इथेनॉल समाधानों की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला में निर्जलित किया गया था, जो पैराफिन और कटिन्टो 4 माइक्रोन वर्गों में एम्बेडेड था। वर्गों (4 माइक्रोन) को एक माइक्रोटोम का उपयोग करके काटा गया था और ऊतक वर्गों को ऊतकीय परीक्षा के लिए कमरे के तापमान पर हेमटॉक्सिलिन (5 मिनट) और ईओसिन (1 मिनट) के साथ दाग दिया गया था। स्लाइड्स का मूल्यांकन और एक माइक्रोस्कोप (BX51, ओलिंप कॉर्पोरेशन) का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया था।गुर्देtissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 प्रतिशत (13)।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)।ताज़ागुर्देफॉस्फेट बफर खारा में धोया गया, और 1 मिमी क्यूब्स में काट दिया गया और क्रमिक रूप से 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड में 24 घंटे के लिए 4˚C पर तय किया गया। वर्गों को 4˚C पर 2 घंटे के लिए 1 प्रतिशत ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में डुबोया गया, ग्रेडेड इथेनॉल में निर्जलित किया गया और एपॉक्सीरेसिन में एम्बेडेड किया गया। अंत में, अल्ट्रैथिन वर्गों (60 एनएम) को 60 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट के साथ दोगुना कर दिया गया। प्रेक्षण एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (Tecnai; Hitachi, Ltd.) पर 80 kV पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फिल्म 4489 (ESTAR मोटा आधार; कोडक) का उपयोग करके किया गया था।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC)।ताज़ागुर्दाऊतकों को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए) में ठीक किया गया और पैराफिन में एम्बेडेड किया गया। नमूनों को 4 माइक्रोन-मोटी वर्गों में काट दिया गया और ज़ाइलिन में चित्रित किया गया। पीबीएस के साथ ऊतक वर्गों को धोए जाने के बाद, उन्हें एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए 4 मिनट के लिए 1 0 मिमी साइट्रेट बफर (पीएच 6. 0) में उबाला गया और फिर कमरे के तापमान पर पीबीएस में 10 प्रतिशत बकरी सीरम के साथ अवरुद्ध कर दिया गया। 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-एलसी3बी; 1:400; कैट नं। 4412; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, इंक.) को निर्देशों के अनुसार जोड़ा गया और 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। द्वितीयक एंटीबॉडी (बकरी एंटीरैबिट एचआरपी; 1:2, 000; बिल्ली नं। बीएस 13278; बायोवर्ल्ड टेक्नोलॉजी, इंक।) को जोड़ा गया और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया। डीएबी (100 μl) जोड़ा गया था और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (मॉडल CX31‑P; ओलिंप कॉर्पोरेशन) के तहत देखे गए धुंधला के साथ 5 मिनट के लिए काउंटरस्टैंड किया गया था। सकारात्मक धुंधलापन की तीव्रता, जो भूरी दिखाई देती है, छवि-प्रो प्लस 6.0 छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (मीडिया साइबरनेटिक्स, इंक.) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। इंटीग्रल ऑप्टिकल डेंसिटी (IOD) की गणना तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए की गई थी। प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि के साथ आईओडी मूल्यों में वृद्धि हुई।
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (मात्रात्मक)(RT‑q) पीसीआर। कुल आरएनए से निकाला गया थागुर्दा ऊतकTRIzol अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.) का उपयोग कर मॉडल के शामिल होने के बाद। टाकमैन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (कैट नं। N8080234; इंविट्रोजन; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के निर्देशों के अनुसार, आरएनए को सीडीएनए में उलट दिया गया था। निम्नलिखित थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों का उपयोग किया गया था (miR‑214): 5 मिनट के लिए 95˚C पर प्रारंभिक विकृतीकरण; इसके बाद 30 सेकंड के लिए 95˚C पर विकृतीकरण के 40 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60˚C पर और 30 सेकंड के लिए 72˚C पर बढ़ाव की घोषणा की जाती है। RT-qPCR को ABI प्रिज्म 7500 सीक्वेंस डिटेक्शन सिस्टम (PerkinElmer, Inc.) और एक मानक SYBR ग्रीन PCR किट (टॉयबो लाइफ साइंस) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। U6 का उपयोग miR‑214 के आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था। प्राइमर सीक्वेंस इस प्रकार थे: miR-214, फॉरवर्ड, 5''AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' और रिवर्स, 5''AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, आगे, 5', ATTGGAACGATACAGAGAGAATT-3' और रिवर्स, 5', GGAACGCTTCACGAATTTG-3'। इन प्रयोगों को छह बार दोहराया गया था। 2‑ΔΔCq विधि (14) का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण किया गया। LC3, p62, PTEN, AKT और mTOR के mRNA अभिव्यक्ति स्तरों का मूल्यांकन RT-qPCR के माध्यम से किया गया। इन जीनों के आंतरिक संदर्भ के रूप में actin के साथ, लक्ष्य जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति को मापने के लिए 2‑ΔΔCq का उपयोग किया गया था। तालिका I में दिखाए गए प्राइमर सीक्वेंस को Sangon Biotech Co., Ltd. द्वारा संश्लेषित किया गया था।
पश्चिमी सोख्ता। गुर्दाऊतक को समरूप बनाने के लिए RIPA lysate (बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) के साथ मिलाया गया था और जब कोई दृश्य ऊतक नहीं देखा गया था तो लसीका को रोक दिया गया था। नमूने 13,000 xg पर 10 मिनट के लिए 4˚C पर सेंट्रीफ्यूज किए गए थे और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला बरामद किया गया था। संक्षेप में, माइक्रो बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की गई थी। प्रोटीन के नमूने (80 माइक्रोग्राम प्रति नमूना) को 12 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइडगेल वैद्युतकणसंचलन को कम करके अलग किया गया और फिर रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया गया। अलग किए गए प्रोटीन को PVDF झिल्लियों में स्थानांतरित किया गया। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 5 प्रतिशत स्किम्ड दूध में अवरुद्ध होने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली रातोंरात (4˚C पर) सेते थे। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी (सभी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, इंक.) का उपयोग किया गया था: लाइट चेन 3बी (1:1,000; कैट नं। 4412), पी62 (1:1,000; कैट नंबर 4412), एंटी-पीटीएन (1:1,000; कैट नंबर 9188), एंटी-फॉस्फोराइलेटेड (पी)-एकेटी (सेर473) (1:1,000; बिल्ली नंबर 4060), एंटी-एकेटी (1:1,000; कैट नं। 9272), एंटी-पी-एमटीओआर (सेर 2448) (1:1,000; कैट नं। 5536), एंटी-एमटीओआर (1:1,000; कैट। नंबर 2972) और ‑एक्टिन (1:2,000; कैट। नंबर 4970)। धोने के बाद, झिल्ली को एचआरपी-संयुग्मित एंटी-खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 3, 000; बिल्ली नं। A0208; बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) के साथ (2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर) ऊष्मायन किया गया था। Immobilon Western (MilliporeSigma) के साथ प्रोटीन बैंड का पता लगाया गया और Total-Lab TL120 सॉफ़्टवेयर (Nonlinear Dynamics, 2.01) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। प्रोटीन की अभिव्यक्ति को actin के लिए सामान्यीकृत किया गया था।
सांख्यिकीय विश्लेषण। ग्राफपैड प्रिज्म 9.0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक.) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। सभी डेटा को उनके वितरण के आधार पर निरंतर चर के लिए ± मानक विचलन या माध्यिका (इंटरक्वेर्टाइल रेंज) के रूप में प्रस्तुत किया गया था। आधारभूत विशेषताओं और परिणामों की तुलना एकतरफा एनोवा का उपयोग करके की गई, उसके बाद तुकी के पोस्टहॉक परीक्षण, या क्रुस्कल-वालिस परीक्षण के बाद डन के परीक्षण के रूप में उपयुक्त थे। पी<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
परिणाम
सीएलपी के बाद समय बिंदु 24 घंटे। पिछले अध्ययनों ने बताया है (6,15,16) कि जैव रासायनिक (यानी, एलसी3 और पी62) विश्लेषण से पता चलता है कि सीएलपी के 6‑8 घंटे के बाद सेप्सिस की प्रगति के साथ ऑटोफैगी फ्लक्स को दबा दिया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, में ऑटोलिसोसोम की संख्यागुर्दासर्जरी के बाद 24 घंटे के भीतर सीएलपी-उपचारित चूहों की संख्या में वृद्धि हुई। इसके अलावा, के मार्करों का विश्लेषणगुर्दे की चोटदर्शाता है किगुर्दे समारोहसीएलपी के 24 घंटे बाद सबसे गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो गया था। इसलिए, निम्नलिखित प्रयोगों के लिए सीएलपी को चुनने के बाद 24 घंटे का समय बिंदु।
गुर्दे के ऊतकों में miR-214 पर नियामक प्रभाव। सीएलपी-उपचारित चूहों में miR-214 अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए RT-qPCR विश्लेषण का उपयोग किया गया था। यह पाया गया कि miR‑214 अभिव्यक्ति को में थोड़ा अपग्रेड किया गया थागुर्दासीएलपी सर्जरी के बाद ऊतक 24 घंटे, शम समूह (1.47-गुना, पी) की तुलना में<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">गुर्दाऊतक, शम समूह की तुलना में (दोनों P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की खराबी में सुधार होगा
सेप्टिक चूहों में गुर्दे की शिथिलता पर miR-214 का प्रभाव.रक्त, मूत्र और एकत्र करने के लिए सभी चूहों की बलि दी गईगुर्दासीएलपी सर्जरी के बाद 24 घंटे के नमूने। बुन और सीआर की गंभीरता के महत्वपूर्ण संकेतक हैंगुर्देहानि (17)। इसके अलावा, NGAL और KIM-1 को विशिष्ट बायोमार्कर के रूप में पहचाना गया हैगुर्दे की चोटऔर उनकी बढ़ी हुई अभिव्यक्ति जल्दी से जुड़ी हुई हैगुर्देAKI (17) में ट्यूबलर चोट। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 2A‑D, दिखावा समूह की तुलना में BUN, Cr, KIM-1 और NGAL के स्तर CLP सर्जरी के बाद काफी बढ़ गए थे। हालांकि, Ad‑miR‑214 ने CLP समूह (सभी P) की तुलना में BUN, Cr, KIM-1 और NGAL स्तरों को काफी कम कर दिया।<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">गुर्दा कार्यपैरामीटर। हालाँकि, PTEN अवरोधक के साथ दिखावा करने के बाद, Ad‑miR-214 के सुरक्षा प्रभाव को बढ़ाया गया। परिणाम बताते हैं कि miR-214 सेप्टिक चूहों में गुर्दे की शिथिलता को दर्शाता है।
गुर्दे की सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव पर miR-214 का प्रभाव।जैसा कि चित्र 3ए और बी में दिखाया गया है, सीएलपी ने टीएनएफ‑ और आईएल‑6 के स्तर को काफी बढ़ा दिया है, जबकि Ad‑miR‑214 ने इन मार्करों के स्तर को काफी कम कर दिया है। के साथ तुलना
सेप्टिक चूहों में वृक्क स्वरभंग पर miR-214 का प्रभाव।वर्तमान अध्ययन ने LC3 में परिवर्तनों की जांच कीगुर्दाIHC धुंधला के माध्यम से ऊतक। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 6, शेम समूह (पी) की तुलना में सीएलपी समूह में सकारात्मक धुंधलापन की एलसी 3 तीव्रता में काफी वृद्धि हुई है।<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 बाधित करने के लिए AKT/mTOR मार्ग को सक्रिय करता हैगुर्दे के ऊतकों में पीटीईएन को शांत करके स्वरभंग.ऑटोफैगी पर सीएलपी का प्रभावगुर्दाLC3-II/I और p62 के स्तरों का आकलन करके ऊतकों की जांच की गई। PTEN / AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग ऑटोफैगी (18) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। PTEN-AKT/mTOR मार्ग पर miR-214 के प्रभाव की जांच करने के लिए, LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p‑mTOR और PTEN के प्रोटीन स्तर का विश्लेषण पश्चिमी सोख्ता और RT‑ के माध्यम से किया गया। क्यूपीसीआर विश्लेषण। जैसा कि चित्र 7A‑C में दिखाया गया है, इन प्रोटीनों में संशोधन तेजी से होता है, LC3‑II / LC3‑I की दर में वृद्धि और p62 (दोनों P दोनों) के स्तर में कमी के साथ।<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">गुर्दा tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). इन परिणामों से पता चला कि ऑटोफैगी सीएलपी से प्रेरित थी, और miR‑214 का ओवरएक्प्रेशन इसे आंशिक रूप से बाधित कर सकता है।
जैसा कि चित्र 7A और D‑F में दिखाया गया है, PTEN का अभिव्यक्ति स्तर (P .)<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">गुर्दा tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सीएलपी प्रेरित करता हैगुर्दाAKT / mTOR मार्ग को बाधित करके ऊतक स्वरभंग। Ad‑miR-214 ने PTEN को शांत करके AKT/mTOR मार्ग को सक्रिय कियागुर्दाऊतक। हालांकि, सीएलपी समूह के साथ तुलना में, एंटी-एमआईआर-214 ने एमटीओआर की अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से बाधित नहीं किया। इसलिए, RT‑qPCR का उपयोग आगे PTEN / AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग से संबंधित जीनों के mRNA की अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया गया था। RT‑qPCR (चित्र 8) के परिणामों के अनुसार, शाम समूह की तुलना में, p62, LC3 और PTEN के mRNA अभिव्यक्ति स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई, जबकि AKT और mTOR की mRNA अभिव्यक्ति CLP समूह में कम हो गई। सीएलपी समूह की तुलना में, Ad‑miR‑214, PTEN
अवरोधक और Ad‑miR‑214 प्लस PTEN अवरोधक समूहों ने LC3 और PTEN की mRNA अभिव्यक्ति को कम किया, लेकिन p62, AKT और mTOR (सभी P) की mRNA अभिव्यक्ति में वृद्धि की<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). इस प्रकार, ऑटोफैगी पर p62 का प्रभाव पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर के बजाय ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर हो सकता है। वर्तमान परिणामों ने प्रदर्शित किया कि miR-214 ने PTEN की अभिव्यक्ति को डाउनग्रेड किया और AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय किया।
बहस
वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि अत्यधिक स्वरभंग के लिए हानिकारक थागुर्दे समारोहसेप्टिक चूहों में। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि miR-214 बढ़े हुए प्रसार, मेटास्टेसिस, आक्रमण और कोशिकाओं और ऊतकों के लिए एक ऑन्कोजीन के रूप में कार्य करता है (19-22)। अध्ययनों की रिपोर्ट है कि miR-214 एपोप्टोसिस, ऑक्सीडेटिव तनाव और भड़काऊ कारकों (21,23) को कम करके AKI के खिलाफ एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है। वर्तमान अध्ययन ने आगे ऑटोफैगी के मॉड्यूलेशन में miR-214 की संभावित भागीदारी पर ध्यान केंद्रित करके सेप्सिस-प्रेरित AKI पर miR-214 के सुरक्षात्मक प्रभाव को अंतर्निहित तंत्र की जांच की। परिणामों से पता चला कि ऑक्सीडेटिव तनाव में होता हैगुर्दासीएलपी सर्जरी के प्रशासन के बाद। इस बीच, ऑटोफैगी की सक्रियता होती हैगुर्दा।एलिवेटेड LC3 II/I और p62 की कमीगुर्दासीएलपी सर्जरी के साथ उपचार के बाद देखा गया। जैसा कि अपेक्षित था, miR‑214 का ओवरएक्प्रेशन काफी हद तक क्षीण हो गयागुर्दापैथोलॉजिकल चोटें औरगुर्दासेप्सिस के कारण होने वाली शिथिलता। हालाँकि, miR‑214 के निषेध ने रीनोप्रोटेक्शन के विपरीत प्रवृत्ति प्रदर्शित की। इसके अलावा, Ad‑miR-214 के सुरक्षा प्रभाव को PTEN अवरोधक द्वारा बढ़ाया गया था।
एक सेप्टिक . मेंगुर्दाअत्यधिक सूजन के साथ आरओएस के उत्पादन में भारी वृद्धि होती है और बड़ी संख्या में आरओएस माइटोकॉन्ड्रियल संरचना में परिवर्तन को ट्रिगर करता है और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बाधित करता है, जिससे शरीर एक दुष्चक्र में प्रवेश करता है जो बढ़ जाता हैगुर्दाक्षति (24,25)। इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव सेप्सिस-प्रेरित AKI के मुख्य रोग तंत्रों में से एक हो सकता है। वर्तमान अध्ययन ने अत्यधिक ऑक्सीडेटिव तनाव का प्रदर्शन करते हुए और सबूत प्रदान किए, जो कि एमडीए उत्पादन में वृद्धि और एसओडी गतिविधि को कम करके इंगित किया गया थागुर्दासीएलपी सर्जरी के बाद ऊतक। इसके अलावा, यह पाया गया कि miR‑214 का ओवरएक्प्रेशन उनकी रक्षा कर सकता हैगुर्दासीएलपी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव चोट के खिलाफ, जो ऑटोफैजिक निषेध में शामिल है। यह पिछले अध्ययनों के अनुरूप है कि miR‑214 विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों को ऑक्सीडेटिव तनाव (26,27) से बचाता है।
सेप्सिस के विकास में ऑटोफैगी एक 'दोधारी तलवार' के रूप में कार्य करता है: बेसल ऑटोफैगी विषाक्त ऑक्सीडेटिव प्रोटीन को हटाकर सुरक्षात्मक प्रभाव डाल सकती है, लेकिन अत्यधिक ऑटोफैगी से आरओएस विस्फोट (28,29) जैसे गंभीर तनाव के तहत ऑटोफैजिक सेलुलर मौत हो सकती है। . यह दिखाया गया है कि ऑटोफैगी शुरू में सेप्सिस में सक्रिय होता है, इसके बाद ऑटोफैजिक सेल डेथ (30) के कारण शिथिलता का एक बाद का चरण होता है, जो सेप्सिस-प्रेरित ऑक्सीडेटिव चोट को बढ़ाता है। वर्तमान अध्ययन में, पीटीईएन अवरोधक या miR-214 के ओवरएक्प्रेशन ने सीएलपी-उपचारित चूहों में एंटीऑक्सिडेंट रीनोप्रोटेक्शन प्रदर्शित किया। हालाँकि, miR‑214 के निषेध ने एंटीऑक्सिडेंट रीनोप्रोटेक्शन के विपरीत प्रवृत्ति प्रदर्शित की। तो अत्यधिक या अपर्याप्त स्वरभंग पैदा कर सकता हैगुर्दे खराब; दोनों दुर्भावनापूर्ण हैं और अंततः कोशिका मृत्यु को भड़काते हैं। इसलिए, सेप्टिक स्थिति में ऑक्सीडेटिव चोट को कम करने के लिए ऑटोफैगी के मध्यम स्तर को बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
सिस्टांचे से किडनी/गुर्दे के दर्द में सुधार होगा
संचित साक्ष्य ने संकेत दिया है कि miR-214 विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों (31-33) में स्वरभंग को रोकता है। वर्तमान अध्ययन में, सीएलपी-प्रेरित ऑटोफैगी को रोकने के लिए miR-214 का ओवरएक्प्रेशन पाया गयागुर्दे के ऊतक,जैसा कि LC3‑II/I और p62 जैसे प्रोटीन मार्करों में परिवर्तन से संकेत मिलता है। इसके अलावा, परिणामों ने प्रदर्शित किया कि miR-214 के ओवरएक्प्रेशन ने अत्यधिक स्वरभंग को रोककर CLP- प्रेरित ऑक्सीडेटिव चोट को देखा। वर्तमान अध्ययन ने आणविक तंत्र की भी जांच की जिसके द्वारा miR-214 नियंत्रित करता हैगुर्दासेप्सिस-प्रेरित AKI में स्वरभंग। PTEN/AKT/mTOR एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग मार्ग है जो नियंत्रित करता हैगुर्दाऑटोफैगी (34,35) और जो सेप्सिस-प्रेरित एकेआई में मुख्य भूमिका निभाता है, और पीटीईएन पीआई3के/एकेटी/एमटीओआर सिग्नलिंग मार्ग का एक नकारात्मक अवरोधक है। पिछले अध्ययनों ने बताया कि miR-214 विभिन्न मॉडलों (36-38) में PI3K / AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से स्वरभंग को नियंत्रित कर सकता है। मा एट अल (39) ने पाया कि miR-214 मधुमेह के गुर्दे में स्वरभंग को नियंत्रित कर सकता है। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया था कि CLP- प्रेरित AKI पर miR-214 का प्रभाव PTEN / AKT / mTOR मार्ग के नियमन में शामिल हो सकता है। विशेष रूप से, वर्तमान अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि सीएलपी सर्जरी ने पीटीईएन के स्तर को काफी ऊंचा कर दिया है, लेकिन पी‑एकेटी और पी‑एमटीओआर के स्तर को कम कर दिया है, यह दर्शाता है कि सीएलपी सर्जरी ने एकेटी / एमटीओआर मार्ग को निष्क्रिय कर दिया है। इसके अलावा, miR-214 के ओवरएक्प्रेशन ने CLP- प्रेरित ऑटोफैगी में PTEN को शांत करके AKT / mTOR मार्ग को सक्रिय कर दियागुर्दाऊतक। हालाँकि, एंटी-miR-214 ने पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में mTOR की अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से बाधित नहीं किया। इस प्रकार, RT‑qPCR का उपयोग आगे PTEN / AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग से संबंधित जीनों के mRNA की अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया गया था। वर्तमान अध्ययन ने पहचाना कि miR-214 ने PTEN की अभिव्यक्ति को कम कर दिया और ऑटोफैगी को रोकने के लिए AKT / mTOR सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय कर दिया। हालांकि, के तंत्र से संबंधित अतिरिक्त विवरण प्राप्त करने के लिए आगे विस्तृत अध्ययन किया जाना चाहिएगुर्दासेप्टिक स्थिति में ऑटोफैगी।
निष्कर्ष निकालने के लिए, वर्तमान अध्ययन के परिणामों ने सुझाव दिया कि miR-214 ने सेप्सिस-प्रेरित-के खिलाफ एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाईगुर्दे की चोटऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और पीटीईएन / एकेटी / एमटीओआर मार्ग के नियमन के माध्यम से स्वरभंग को रोककर। वर्तमान निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि miR-214 सेप्सिस-प्रेरित AKI के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है। हालांकि, वर्तमान अध्ययन में 6-8 सप्ताह पुराने चूहों का इस्तेमाल किया गया है, इसलिए वयस्क चूहों में miR‑214 के तंत्र पर और शोध की आवश्यकता है।