विकासशील किडनी में परिपक्वता चरणों का आणविक पता लगाना
Feb 20, 2022
सारस्टेम सेल बायोलॉजी में हालिया प्रगति ने की पीढ़ी को सक्षम किया है गुर्दाइन विट्रो में organoids, और इन organoids के आगे परिपक्वता प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण के बाद मनाया जाता है। हालांकि, वर्तमान ऑर्गेनोइड्स अपरिपक्व रहते हैं और उनके सटीक परिपक्वता चरणों को निर्धारित करना मुश्किल होता है क्योंकि विकासात्मक चरण-निर्भर जीन अभिव्यक्तियों के बारे में सीमित जानकारी होती है।गुर्दाविवो में। प्रासंगिक आणविक निर्देशांक स्थापित करने के लिए, हमने विकास पर एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) का प्रदर्शन कियागुर्देमाउस में विभिन्न चरणों में। भ्रूण के दिन 15.5 के साथ-साथ सेललाइन-विशिष्ट अभिव्यक्ति की तुलना में जन्म के समय उत्थान का प्रदर्शन करने वाले जीन का चयन करके, हमने व्यक्तिगत सेल वंश में विकासात्मक चरणों के साथ सहसंबद्ध जीन सूची तैयार की। प्रतिरोपित भ्रूण पर इन सूचियों का अनुप्रयोगगुर्दे पता चला कि संग्रह नलिकाओं के अलावा अधिकांश सेल प्रकारों ने समान परिपक्वता प्रदर्शित कीगुर्देविवो में नवजात अवस्था में, सेल वंशों में गैर-समकालिक परिपक्वता का खुलासा करता है। इस प्रकार, हमारा scRNA-seq डेटा विकासशील की परिपक्वता का आकलन करने के लिए उपयोगी आणविक निर्देशांक के रूप में काम कर सकता हैगुर्देऔर अंत मेंगुर्दाऑर्गेनोइड्स।
कीवर्ड:गुर्दा विकास, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण, परिपक्वता, स्वस्थानी संकरण में, वृक्क
परिचयगुर्दाकम से कम दो प्रकार के पूर्ववर्तियों से प्राप्त होता है: नेफ्रॉन पूर्वज और मूत्रवाहिनी कली (कोस्टेंटिनी और कोपन, 2010)। नेफ्रॉन पूर्वज ग्लोमेरुलरपोडोसाइट्स, समीपस्थ नलिकाएं, हेनले के लूप (LOH) और डिस्टल नलिकाओं सहित स्टोनफ्रॉन देते हैं, जबकि मूत्रवाहिनी कली शाखाएं बड़े पैमाने पर एकत्रित नलिकाएं और मूत्रवाहिनी (कोबायाशीतल।, 2008) (मैरोसेटल।, 2008) बनाती हैं। बहे। नेफ्रॉन के पूर्वज और मूत्रवाहिनी कली चूहों में भ्रूण के दिन (ई) 11.5 के आसपास अपनी बातचीत शुरू करते हैं। ई 15.5 पर, समग्र नेफ्रॉन खंड निर्दिष्ट किए जाते हैं, लेकिन नेफ्रॉन के पूर्वजों से नए नेफ्रॉन उत्पन्न होते रहते हैं। ग्लोमेरुलर वास्कुलराइजेशन के बाद, मूत्र E16.5-E17.5 (रसौली और लू, 2013) पर बहने लगता है। इस बीच, के आंतरिक (मज्जा) क्षेत्रगुर्दालम्बा करता है, LOH के विस्तार को दर्शाता है और नलिकाओं को इकट्ठा करता है। यह मज्जा क्षेत्र का विकास जन्म के दिन के बाद भी जारी रहता है (P0), जबकि नेफ्रॉन जनक स्व-नवीकरण बंद कर देते हैं और जन्म के कुछ दिनों के भीतर गायब हो जाते हैं (हार्टमैनेट अल।, 2007) (रंबेल एट अल।, 2011) ( वोलोवेल्स्की एट अल।, 2018)।
स्टेम सेल बायोलॉजी में हालिया प्रगति ने की पीढ़ी को सक्षम किया हैगुर्दाइन विट्रो में ऑर्गेनोइड्स (मोरिज़ेन एट अल।, 2015; तागुची एट अल।, 2014; ताकासातो एट अल।, 2015)। हमने पहले बनाया थागुर्दाप्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से ऑर्गेनोइड्स: माउस भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) (टैगुचिएटल।, 2014)। हालांकि, यह स्पष्ट हो रहा है कि इन विट्रो में ऑर्गेनोइड अपरिपक्व अवस्था में रहते हैं, इसके बराबरगुर्देचूहों में लगभग E14.5-E15.5 और मनुष्यों में गर्भधारण के 10-14 सप्ताह (टैगुचिया और निशिनाकमुरा, 2017; ताकासातोएट अल।, 2015; वू एट अल।, 2018)। हमने और अन्य ने प्रयोगात्मक रूप से प्रत्यारोपण के तरीके भी विकसित किए हैंगुर्दाइम्युनोडेफिशिएंसी चूहों में ऑर्गेनोइड्स, ऑर्गेनॉइड वास्कुलराइजेशन और होस्ट सर्कुलेशन से कनेक्शन की अनुमति देता है (बंटौनस एट अल।, 2018; शर्मिन एट अल।, 2016; सुब्रमण्यम एट अल।, 201 9; तनिगावा एट अल।, 2018; वैन डेन बर्ग एट अल।) 2018)। प्रत्यारोपण पर, ऑर्गेनोइड्स के भीतर ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स निस्पंदन फ़ंक्शन से संबंधित अधिक परिपक्व रूपात्मक विशेषताएं प्राप्त करते हैं, जो संभवतः ऑक्सीजन की आपूर्ति और / या संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ बातचीत के कारण होता है। हालांकि सटीक तंत्र अनसुलझे रहते हैं, प्रत्यारोपण का उपयोग अक्सर ऑर्गेनोइड की परिपक्वता को प्रेरित करने के लिए किया जाता है। स्टेम सेल बायोलॉजी के अनुसंधान क्षेत्र।
इन प्रगतियों के बावजूद, आणविक निर्देशांक की कमी के कारण परिपक्वता चरणों का सटीक निर्धारण मुश्किल है, यानी विकास पर निर्भर जीन अभिव्यक्ति पर व्यापक जानकारी।गुर्दा।वर्तमान में, ये निर्देशांक माउस भ्रूण के लिए भी उपलब्ध नहीं हैंगुर्देविवो में। यह स्थिति काफी हद तक सेल प्रकारों की बढ़ती संख्या के कारण उत्पन्न होती हैगुर्दाविकास, प्रत्येक कोशिका प्रकार में छोटी मात्रा में कोशिकाएँ होती हैं। पारंपरिक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, जिसमें बड़ी संख्या में सजातीय कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, विषम परिपक्वता के लिए उपयुक्त नहीं हैंगुर्दे।GUDMAP डेटाबेस (www.gudmap.org) ने विकासशील देशों में बड़ी संख्या में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण जमा किए हैंगुर्दा, कुल मिलाकर कुछ सहितगुर्देऔर कुछ सॉर्ट या माइक्रोडिसेक्टेड कोशिकाओं में (मैकमोहन एट अल।, 2008)। हालाँकि, यहाँ तक कि
बाद के विश्लेषण में अक्सर कई चरणों से कोशिकाएं होती हैं, और इस प्रकार डेटा परिपक्वता विश्लेषण के लिए सीधे उपयोग योग्य नहीं होते हैं। एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) विश्लेषण ने जटिल और विषम अंगों में जीन अभिव्यक्तियों की जांच को सक्षम किया है, जिसमें निम्न शामिल हैं:गुर्दा, और इनमें से कुछ डेटा GUDMAP डेटाबेस (एडम एट अल।, 2017a; कॉम्ब्स एट अल।, 2019a, 2019b; लिंडस्ट्रॉम एट अल।, 2018; मैगेला एट अल।, 2017; रैंसिक एट अल।) में जमा किए गए हैं। , 2019; वांगेट अल।, 2018; वू एट अल।, 2018)। हालांकि, इनमें से अधिकांश पिछले अध्ययनों में भ्रूण या वयस्क का विश्लेषण किया गया थागुर्देएटा सिंगल टाइम पॉइंट, या तुलना
विवोगुर्देइन विट्रो के साथगुर्दाऑर्गेनोइड्स। इस प्रकार, कुछ अध्ययनों ने संबोधित किया हैगुर्दासीमित सेल प्रकार के लिए मध्य-गर्भ से जन्म तक परिपक्वता (चेन एट अल।, 2015)। के लिए आणविक निर्देशांक स्थापित करने के लिएगुर्दावर्तमान अध्ययन में परिपक्वता, हमने माउस विकसित करने पर scRNA-seq का प्रदर्शन कियागुर्देविभिन्न चरणों में, और चयनित परिपक्वता-आश्रित जीन। हमने आगे RNA-seq डेटा और परिपक्वता-निर्भर जीनों के भावों की तुलना करके प्रत्यारोपित भ्रूण के गुर्दे की परिपक्वता स्थिति का आकलन किया। हमारे RNA-seq डेटा और चयनित जीन सूचियाँ विकास की परिपक्वता के लिए संदर्भ उपकरण के रूप में काम करेंगीगुर्देऔर अंत मेंगुर्दाऑर्गेनोइड्स।
परिणाम
विकासशील गुर्दे का scRNA-seq विश्लेषणहमने माउस विकसित करने पर scRNA-seq का प्रदर्शन कियागुर्देतीन अलग-अलग चरणों में: E15.5, E17.5, और P0। उच्च गुणवत्ता वाले डेटा क्रमशः 4,493, 2,36 0, और 2467 जीन प्रति सेल के मध्यम रीड के साथ प्राप्त किए गए थे। Seurat v3.1.1 (बटलर एट अल।, 2018; स्टुअर्ट एट अल।, 2019a) का उपयोग करके डेटा के विश्लेषण के बाद, कोशिकाओं को 45 समूहों में वर्गीकृत किया गया था, जिसमें P0 की तुलना में बड़ी संख्या में ठोस क्लस्टर थे। E15.5 पर (चित्र 1A)। हमने सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों का उपयोग करते हुए अधिकांश समूहों के लिए सेल प्रकारों की पहचान की: नेफ्रॉन पूर्वज (छह2þ, क्लस्टर 0, 1, और 10), ग्लोमेरुलर पॉडोसाइट्स (Nphs1þ, क्लस्टर 8 और 11), ग्लोमेरुलर पार्श्विका उपकला कोशिकाएं (क्लॉडिन 1 (Cldn1) )þ, क्लस्टर 20), समीपस्थ नलिकाएं (S1 खंड: विलेय वाहक परिवार (Slc) 5a2þ, क्लस्टर 15 और 31; S2 खंड: Slc5a2?/Slc34a1þ, क्लस्टर 13 और 6; S3 खंड: Aquaporin 1 (Aqp1)þ/Slc7a13þ (ली एट अल।, 2015; रैंसिक एट अल।, 2019), क्लस्टर 37), एलओएच (पतला अवरोही अंग: Aqp1þ/Slc39a8þ (ली एट अल।, 2015; रैंसिक एट अल।, 2019), क्लस्टर 27; मोटा आरोही अंग: यूरोमोडुलिन (उमोद)þ/Slc12a1þ, क्लस्टर 28 और 17), डिस्टल नलिकाएं (Slc12a3þ, क्लस्टर 5), यूरेटेरिक बड टिप्स (Retþ, क्लस्टर 22 और 35), और डक्ट डंठल इकट्ठा करना (Aqp2þ, क्लस्टर 16, 21, और 41) (चित्र। 1बी, अंजीर। S1A)। इंटरकलेटेड कोशिकाओं ने एक क्लस्टर बनाया जो एकत्रित वाहिनी समूहों (Atp6v1g3þ, क्लस्टर 39) (चित्र। 1B) से अलग हो गया। अंतरालीय कोशिकाओं को कई समूहों (7, 9, 12, 14, 23, 29, 30, 33, और 34) में वर्गीकृत किया गया था, जिनमें से समूह 9/33, 12, और 34 स्ट्रोमल पूर्वजों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं (Foxd1þ (कोबायाशी एट अल।) , 2014)), मेसेंजियल कोशिकाएं (Nt5eþ), और रेनिन-उत्पादक कोशिकाएं (Ren1þ), क्रमशः (चित्र। S1B)। एंडोथेलियल सेल क्लस्टर (Pecam1þ, क्लस्टर 3, 19, 24, 25, और 32) में Ehd3þ कोशिकाएं (क्लस्टर 32, अंजीर। S1C) शामिल हैं, जो संभवतः ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (पटराका एट अल।, 2007) का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस प्रकार, Seurat v3.1.1, जो निकटतम पड़ोसियों को क्लस्टर करने के लिए एकीकरण एंकर का उपयोग करता है (Stuartet al।, 2019b), सफलतापूर्वक कई प्रकार के सेल को वर्गीकृत किया गया है।गुर्देविकास के विभिन्न चरणों में।
के दौरान प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्तियों और विकासात्मक संकेतन गतिविधियों में अस्थायी परिवर्तनगुर्दापरिपक्वता
नेफ्रॉन पूर्वजों को तीन समूहों (चित्र। S1D) में वर्गीकृत किया गया था: क्लस्टर 0 जिसमें सिक्स2þ/Cited1þ भोली कोशिकाएँ होती हैं, क्लस्टर 10 जिसमें सिक्स2þ/Cited1þ/Top2a भोली कोशिकाओं का प्रसार होता है, और क्लस्टर 1 जिसमें सिक्स2þ/उद्धृत होता है{{10} }/Wnt4þ प्राइमेड सेल (बॉयल एट अल।, 2008; कोबायाशीत अल।, 2008; सेल्फ एट अल।, 2006)। नेफ्रॉन खंड विनिर्देश के दौरान, नेफ्रॉन पूर्वज आबादी ने सबसे पहले एक माफ़ब पोडोसाइट शाखा का गठन किया,
जो अंततः Nphs1þ पोडोसाइट्स (अंजीर। 1B और 2A) में विभेदित हो गया। समीपस्थ नलिकाओं के लिए शाखाएं और पोडोसाइट शाखा से अलग से गठित LOH/डिस्टल नलिकाएं। समीपस्थ नलिकाओं के लिए अग्रदूत कोशिकाएं
प्रतिलेखन कारक जीन Osr2 और फिर Hnf4a (छवि 2B) को व्यक्त किया, जिनमें से उत्तरार्द्ध समीपस्थ नलिकाओं में परिपक्वता-निर्भर जीन को नियंत्रित करता है (Deacon et al।, 2019; Marable et al, 2018, 2020; Martovetsky
एट अल।, 2013)। LOH / डिस्टल नलिकाओं के लिए सामान्य अग्रदूत कोशिकाओं ने Pou3f3 (नाकाई एट अल।, 2003) और Sim1 दोनों को व्यक्त किया, क्रमशः LOH और डिस्टल नलिकाओं के विनिर्देशन के बाद Sim2 और Gata3 की बाद की अभिव्यक्ति के साथ (चित्र। 2C)। Tfap2b, जिसे हाल ही में डिस्टल नेफ्रॉन विकास (मार्नरोस, 2020) के लिए महत्वपूर्ण बताया गया है, LOH और डिस्टल नलिकाओं (चित्र। S1E) में भी पाया गया था। इस प्रकार, प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्तियों में अस्थायी बदलाव अलग-अलग नेफ्रॉन खंडों में होते हैंगुर्दापरिपक्वता, और शाखाओं के परिधीय सिरों पर क्लस्टर (क्लस्टर 5,6, 8, 17, 31, और 37) प्रत्येक वंश में सबसे परिपक्व अवस्था का प्रतिनिधित्व करते हैं।
विकासात्मक संकेतों के दृष्टिकोण से, WNT सिग्नलिंग पाथवे गतिविधि के लिए एक संकेतक, Axin2, मुख्य रूप से डिस्टल नलिकाओं के विकास में पाया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था (Jho et al।, 2002)। Fgf8 और Etv4, और
FGF सिग्नलिंग गतिविधि (Maoetal।, 2009) के लिए संकेतक, डिस्टल नलिकाओं के विकास में भी व्यक्त किए गए थे, लेकिन एक अपरिपक्व अवस्था तक ही सीमित थे। इसके विपरीत, Bmp7 (ऑक्सबर्ग एट अल।, 2005) को अपरिपक्व और परिपक्व दोनों चरणों के साथ-साथ पॉडोसाइट्स में डिस्टल नलिकाओं में व्यक्त किया गया था, जबकि Bmp4 (मियाज़ाकी एट अल।, 2000) मुख्य रूप से समीपस्थ नलिकाओं में पाया गया था। हमने यह भी नोट किया कि प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों की गतिविधियां नीचे थीं-
अधिकांश नेफ्रॉन खंडों में परिपक्व कोशिकाओं में विनियमित। उदाहरण के लिए, Axin2 (WNT सिग्नलिंग इंडिकेटर) और Etv4 (FGF सिग्नलिंग इंडिकेटर) परिपक्व पोडोसाइट्स और समीपस्थ और डिस्टल नलिकाओं (चित्र 2D) में अनुपस्थित थे। Hey1 (नॉच सिग्नलिंग इंडिकेटर) के लिए भी यही प्रवृत्ति देखी गई, जबकि Hes1 को केवल पॉडोसाइट्स और समीपस्थ नलिकाओं (चित्र 2E) में डाउनग्रेड किया गया था। एक BMP संकेतन संकेतक, Id1 (Korchynskyi and Ten Dijke, 2002; L? opez-Rovira et al।, 2002), परिपक्व पोडोसाइट्स और डिस्टल नलिकाओं (चित्र 2F) में कम हो गया था। इस प्रकार, नेफ्रॉन खंड-विशिष्ट विकासात्मक संकेतन सक्रियण, इसके बाद डाउनरेगुलेशन, के दौरान मनाया जाता हैगुर्दापरिपक्वता
व्यक्तिगत सेल वंश के लिए विकासात्मक चरण-निर्भर जीन सूचियाँ
हमारे scRNA-seq विश्लेषण से पता चला है कि कुछ स्थापित वंश-प्रतिबंधित विभेदकों को व्यक्त करने वाले UMAP क्लस्टर पहले से ही E15.5 (चित्र। 1B) में मौजूद थे। अलग-अलग नेफ्रोनसेगमेंट के लिए चरण-निर्भर जीन की पहचान करने के लिए, हमने पहले प्रत्येक वंश के सबसे परिपक्व समूहों में E15.5 और P 0 के बीच की जीन अभिव्यक्तियों की तुलना की, और E15 की तुलना में P 0 पर महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड या डाउनग्रेड किए गए जीन को उठाया। 5. हालांकि, हमने पाया कि इन सूचियों में सेलुलर तनाव से जुड़े जीन शामिल हैं, जैसे कि हीट शॉक प्रोटीन जीन, जून / फॉस परिवार के जीन, और गद्दा 45 जीन (एडम एट अल।, 2 0 17 ए), जिन्हें इसके द्वारा विकसित किया जा सकता है। P0 . के लिए उपयोग की जाने वाली कठोर कोशिका पृथक्करण प्रक्रियाएँगुर्दे. Because these genes were ubiquitously expressed, it was difficult to discriminate them from maturation-dependent genes that were ubiquitously expressed. Thus, we decided to select cell-type specific genes and picked up the upregulated or downregulated genes in the corresponding clusters between the two stages. Most of the upregulated genes at P0 showed consistent results in UMAP plots, while the downregulated genes showed less prominent differences between the two stages. In addition, the downregulated genes were detected in more immature cell clusters at P0, reflecting the repetitive differentiation processes from nephron progenitors. Therefore, we decided to focus on the upregulated genes (fold change, >2.5), और यूएमएपी भूखंडों के आधार पर प्रत्येक उम्मीदवार जीन को उसकी स्पोटियोटेम्पोरल अभिव्यक्ति के लिए क्यूरेट किया। अंत में चयनित जीनों के वायलिन भूखंडों ने व्यक्तिगत सेल लाइन-एज (छवि 3 ए, अंजीर। एस 2, एस 3, एस 4 ए, टेबल एस 1) में अपने चरण-निर्भर भाव दिखाए। डॉट प्लॉट्स ने अपने सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्तियों (छवि 3 बी) की पुष्टि की, हालांकि समीपस्थ नलिकाओं के एस 2 खंड के लिए चुने गए कई जीन भी एस 1 और एस 3 खंडों में व्यक्त किए गए थे। इन चयनित जीन सूचियों में पोडोसाइट्स के लिए कोलेजन टाइप 4 अल्फा3 चेन (Col4a3) और सेमाफोरिन (सेमा) 3g, समीपस्थ नलिकाओं के लिए Slc5a12 (लैक्टेट ट्रांसपोर्टर) और साइटोक्रोम P450 परिवार (CYP) 27b1 (विटामिन डी के अल्फा हाइड्रॉक्सिलेज), उमोद और प्रोस्टाग्लैंडीन ई शामिल हैं। LOH के लिए रिसेप्टर 3 (Ptger3), नलिकाओं को इकट्ठा करने के लिए Aqp2 और Aqp3, और मूत्रवाहिनी कली युक्तियों के लिए लिपोकेलिन 2 (Lcn2)। अधिकांश जीन पहले से ही E17.5 . पर अपग्रेड किए गए थे
और P0 पर उन लोगों के लिए तुलनीय अभिव्यक्ति स्तर दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि E15.5 और E17.5 के बीच पर्याप्त परिपक्वता हो सकती है। हमने डिस्टल नलिकाओं (टेबल S1) के लिए केवल कुछ जीनों का पता लगाया, क्योंकि इस सेल वंश में अधिकांश अपग्रेड किए गए जीन भी नलिकाओं को इकट्ठा करने में व्यक्त किए गए थे। एक साथ लिया, विकासशील का scRNA-seq विश्लेषणगुर्देकई परिपक्वता चरणों में अधिकांश नेफ्रॉन खंडों में चरण-निर्भर और वंश-विशिष्ट जीन की पहचान को सक्षम किया।
प्रतिनिधि जीन के चरण-निर्भर जीन अभिव्यक्तियों का ऊतकीय सत्यापन
हिस्टोलॉजिकल परीक्षा द्वारा जीन सूचियों की वैधता की पुष्टि करने के लिए, हमने E15.5 और P0 में चयनित जीनों की अभिव्यक्तियों का निर्धारण किया।गुर्देसीटू संकरण या अत्यधिक संवेदनशील आरएनएस्कोप प्रौद्योगिकी (वांग एट अल।, 2 0 12) में पारंपरिक डिगॉक्सिजेनिन-आधारित द्वारा। क्योंकि स्वस्थानी संकरण और विशेष रूप से आरएनएस्कोप प्रौद्योगिकी में व्यापक संकेत प्रवर्धन शामिल है, जीन अभिव्यक्ति स्तरों में सूक्ष्म अंतर का पता लगाने की संभावना नहीं है। इस प्रकार, हमने ऐसे जीनों का चयन किया जो E15.5 पर न्यूनतम अभिव्यक्ति दिखाते थे और UMAP भूखंडों में P 0 पर एक ही वंश तक सीमित थे। हिस्टोलॉजिकल सेक्शन का उपयोग करके परिपक्वता चरणों के लागत प्रभावी मूल्यांकन के लिए भी ऐसे जीन उपयोगी होंगे। पोडोसाइट्स में, सभी चार जीनों की जांच की गई (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) P 0 पर आसानी से पाए गए, और E15.5 पर उनकी अभिव्यक्ति का स्तर P 0 (छवि 4A) की तुलना में कम था। ) इसके विपरीत, Nphs1 ने दो चरणों में तुलनीय अभिव्यक्ति दिखाई (चित्र 4A)। समीपस्थ नलिकाओं में, तीन जीन (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) ने E15.5 पर कमजोर या न्यूनतम संकेत और P0 (छवि 4B) पर मजबूत अभिव्यक्ति दिखाई, जबकि Slc34a1 ने दोनों चरणों (छवि 4B) में तुलनीय अभिव्यक्ति दिखाई। Slc12a1 (चित्र 5A) की अपेक्षाकृत स्थिर अभिव्यक्ति के विपरीत, LOH (उमोद, Ptger3, Car15) में तीन जीनों के चरण-निर्भर अभिव्यक्तियों को मान्य किया गया था। हमने नलिकाओं को इकट्ठा करने में तीन जीनों (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) के लिए स्वस्थानी संकरण में भी प्रदर्शन किया, और उनके चरण-निर्भर अभिव्यक्तियों (चित्र 5B) की पुष्टि की। इनमें से, Aqp2 और Cdkn2b को डक्ट डंठल इकट्ठा करने में व्यक्त किया गया था, जबकि Lcn2 को uretericbudtips में पाया गया था। इसके विपरीत, रिटैंड Wnt7b ने अपेक्षाकृत स्थिर अभिव्यक्ति स्तर (छवि 5 बी) दिखाया। स्वस्थानी संकरण डेटा हमारे scRNA-seq डेटा की विश्वसनीयता का समर्थन करते हुए, UMAP भूखंडों के अनुरूप थे।
प्रतिनिधि जीन के चरण-निर्भर जीन अभिव्यक्तियों का ऊतकीय सत्यापन
हिस्टोलॉजिकल परीक्षा द्वारा जीन सूचियों की वैधता की पुष्टि करने के लिए, हमने E15.5 और P0 में चयनित जीनों की अभिव्यक्तियों का निर्धारण किया।गुर्देसीटू संकरण या अत्यधिक संवेदनशील आरएनएस्कोप प्रौद्योगिकी (वांग एट अल।, 2 0 12) में पारंपरिक डिगॉक्सिजेनिन-आधारित द्वारा। क्योंकि स्वस्थानी संकरण और विशेष रूप से आरएनएस्कोप प्रौद्योगिकी में व्यापक संकेत प्रवर्धन शामिल है, जीन अभिव्यक्ति स्तरों में सूक्ष्म अंतर का पता लगाने की संभावना नहीं है। इस प्रकार, हमने ऐसे जीनों का चयन किया जो E15.5 पर न्यूनतम अभिव्यक्ति दिखाते थे और UMAP भूखंडों में P 0 पर एक ही वंश तक सीमित थे। इस तरह के जीन हिस्टोलॉजिकल सेक्शन का उपयोग करके परिपक्वता चरणों के लागत प्रभावी मूल्यांकन के लिए भी उपयोगी होंगे। पोडोसाइट्स में, सभी चार जीनों की जांच की गई (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) P 0 पर आसानी से पाए गए, और E15.5 पर उनकी अभिव्यक्ति का स्तर P 0 (छवि 4A) की तुलना में कम था। ) इसके विपरीत, Nphs1 ने दो चरणों में तुलनीय अभिव्यक्ति दिखाई (चित्र 4A)। समीपस्थ नलिकाओं में, तीन जीन (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) ने E15.5 पर कमजोर या न्यूनतम संकेत और P0 (छवि 4B) पर मजबूत अभिव्यक्ति दिखाई, जबकि Slc34a1 ने दोनों चरणों (छवि 4B) में तुलनीय अभिव्यक्ति दिखाई। Slc12a1 (चित्र 5A) की अपेक्षाकृत स्थिर अभिव्यक्ति के विपरीत, LOH (उमोद, Ptger3, Car15) में तीन जीनों के चरण-निर्भर अभिव्यक्तियों को मान्य किया गया था। हमने नलिकाओं को इकट्ठा करने में तीन जीनों (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) के लिए स्वस्थानी संकरण में भी प्रदर्शन किया, और उनके चरण-निर्भर अभिव्यक्तियों (चित्र 5B) की पुष्टि की। इनमें से, Aqp2 और Cdkn2b को डक्ट डंठल इकट्ठा करने में व्यक्त किया गया था, जबकि Lcn2 को uretericbudtips में पाया गया था। इसके विपरीत, रिटैंड Wnt7b ने अपेक्षाकृत स्थिर अभिव्यक्ति स्तर (छवि 5 बी) दिखाया। स्वस्थानी संकरण डेटा हमारे scRNA-seq डेटा की विश्वसनीयता का समर्थन करते हुए, UMAP भूखंडों के अनुरूप थे।
प्रत्यारोपित भ्रूण के गुर्दे नवजात अवस्था के करीब परिपक्वता दिखाते हैं
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रत्यारोपित किया गया हैगुर्देशारीरिक परिपक्वता प्रक्रिया का पालन करते हुए, हमने भ्रूण के माउस का उपयोग करके प्रत्यारोपण प्रयोग किएगुर्देदाता ऊतकों के रूप में। क्योंकि का प्रत्यारोपण
पृथक भ्रूणगुर्देमूत्र पथ के गलत संबंध (छवि S5A) के परिणामस्वरूप हाइड्रोनफ्रोसिस होने की संभावना है, हमने पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग किया है जो संभावित रूप से बरकरार मूत्र प्रवाह (योकोटे एट अल।, 2015) को संरक्षित करता है। इसके लिए हमने E12.5 . का प्रत्यारोपण कियागुर्देमेजबान वयस्क चूहों (छवि 6 ए) के एपिडीडिमिस वसा में, मूत्राशय के अग्रदूत क्लोअका से जुड़ा हुआ है। जब रोपाई के 12 दिन बाद कटाई की जाती है,गुर्देआकार में वृद्धि हुई थी (3.29? 0.35 मिमी 2 बनाम 0.23? 0।02 मिमी 2, n¼ 3, p <0.05), और मूत्राशय में मूत्र का पता चला था (चित्र 6ए), यह सुझाव देता है कि मूत्र का प्रवाह के माध्यम से होता हैगुर्दा-मूत्राशय कनेक्शन बनाए रखा गया था। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि वृक्क मज्जा का गठन कॉर्टिकोमेडुलरी पैटर्निंग (चित्र। 6 ए) के साथ हुआ था। सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों के धुंधला होने से संकेत मिलता है कि LTL समीपस्थ नलिकाओं, SLC12A1þ LOH, और KRT8þ मूत्रवाहिनी कलियों के समग्र वितरण को संरक्षित किया गया था (चित्र 6B), और NPHS1þ पोडोसाइट्स के साथ ग्लोमेरुली को PECAM1þ एंडोथेलियल कोशिकाओं (छवि S5B) के साथ संवहनी किया गया था। , जो भ्रूण के गुर्दे के इन विट्रो कल्चर के दौरान शायद ही कभी देखा जाता है (हाल्ट एट अल।, 2016)। इसके बाद, हमने प्रत्यारोपित भ्रूण का scRNA-seq विश्लेषण कियागुर्देऔर विवो में भ्रूण के गुर्दे से प्राप्त आंकड़ों के साथ तुलना की। प्रत्यारोपित गुर्दे के यूएमएपी भूखंडों ने विवो (छवि 6सी) में नवजात गुर्दे के समान क्लस्टर पैटर्न दिखाया, लेकिन नेफ्रॉन पूर्वजों और मूत्रवाहिनी कली युक्तियों का प्रतिनिधित्व करने वाले क्लस्टर प्रत्यारोपित गुर्दे में गायब थे (छवि 6 सी, अंजीर। एस 5 सी और डी)। यद्यपि नेफ्रोजेनिक आला के इस अप्रत्याशित कमी का कारण अज्ञात है, यह विवो में गुर्दे की तुलना में प्रत्यारोपित गुर्दे के छोटे आकार की व्याख्या कर सकता है, जैसा कि हम बाद के खंड में चर्चा करते हैं। बहरहाल, अन्य सेल आबादी को नवजात अवस्था (छवि 6C) में गुर्दे के समान पैटर्न में क्लस्टर किया गया था। पोडोसाइट्स और प्रत्यारोपित गुर्दे में समीपस्थ नलिकाओं में अधिकांश परिपक्वता-आश्रित जीन की अभिव्यक्ति का स्तर P 0 गुर्दे (चित्र। 6D, अंजीर। S6, तालिका S2) में तुलनीय था। हालाँकि, संग्रह नलिकाओं में कई जीन P{{10}} गुर्दे की तुलना में निचले स्तर पर व्यक्त किए गए थे, जिनमें Cdkn2b (चित्र। 6D, चित्र। S6, तालिका S2) शामिल हैं। इसके विपरीत, Aqp2 और Aqp3 अभिव्यक्तियों को P 0 किडनी (चित्र 6D) के तुलनीय स्तरों पर अपेक्षाकृत बनाए रखा गया था। इसके अलावा, Wnt9b और Hoxd3, जिन्हें विवो में P 0 पर डाउनग्रेड किया गया था, प्रतिरोपित किडनी (चित्र। S4A) में उच्च बने रहे, इस प्रकार, प्रत्यारोपित किडनी में एकत्रित नलिकाएं गुर्दे की तुलना में अधिक अपरिपक्व होने की संभावना थी। पी0. एक समान प्रवृत्ति, कुछ हद तक, LOH (चित्र 6D, चित्र S6) में देखी गई थी। ये परिणाम बताते हैं कि परिपक्वता सभी सेल वंशों में समकालिक रूप से नहीं होती है।
बहसविकास-मानसिक जीव विज्ञान में अंग परिपक्वता सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक है। स्टेम सेलबायोलॉजी में, प्रत्यारोपण का उपयोग अक्सर प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की परिपक्वता को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, जिसमें शामिल हैंगुर्दाऑर्गेनोइड्स। हालांकि, परिपक्वता के लिए आणविक निर्देशांक की कमी के कारण परिपक्वता चरणों का सटीक निर्धारण मुश्किल है। इस प्रकार, हमने माउस भ्रूण का scRNA-seq विश्लेषण कियागुर्देविकास के विभिन्न चरणों में, जिसने भ्रूण के परिपक्व होने में चरण-निर्भर अभिव्यक्ति दिखाने वाले जीन की पहचान को सक्षम कियागुर्दे. इस जानकारी को प्रत्यारोपित भ्रूण के गुर्दे में scRNA-seq डेटा पर लागू करके, हमने आगे पाया कि प्रत्यारोपण के बाद परिपक्वता प्रक्रिया नवजात अवस्था के करीब आगे बढ़ी, लेकिन सेल वंश में गैर-समकालिक रूप से। थोक अनुक्रमण के विपरीत, scRNA-seq प्रत्येक कोशिका वंश के सबसे परिपक्व अंशों में जीन अभिव्यक्तियों का आकलन करने में सक्षम था, इस प्रकार विकासशील गुर्दे के साथ-साथ प्रत्यारोपण में संबंधित उप-जनसंख्या के साथ सटीक तुलना करने में सक्षम था।गुर्दाएस। चरण-निर्भर अभिव्यक्तियों के लिए चयनित जीन सूचियों को अलग-अलग वंशों के परिपक्वता चरणों के आकलन के लिए आणविक निर्देशांक के रूप में कार्य करने के लिए सिद्ध किया गया था। विभिन्न चरणों में प्रसवोत्तर गुर्दे में scRNA seq डेटा को जोड़ने और वयस्क गुर्दे परिपक्वता मूल्यांकन के लिए और उपयोगी संसाधन तैयार करेंगे।
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या समान परिणाम पहले से मौजूद डेटासेट का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं, हमने E14.5 और P1 में प्रकाशित scRNA-seq डेटा का पुन: विश्लेषण किया।गुर्दे(एडम एट अल।, 2017ए; मैगेला एट अल।, 2017)। हालाँकि, UMAP भूखंडों ने दिखाया कि P1 पर अधिकांश सेल प्रकारों की परिपक्व आबादी का प्रतिनिधित्व करने वाले क्लस्टर E14.5 डेटा (अंजीर। S7A और B) में अनुपस्थित थे, जिससे हमें जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने में बाधा उत्पन्न हुई।
दो चरणों के बीच संबंधित क्लस्टर। एकमात्र अपवाद मूत्रवाहिनी कली युक्तियाँ थीं। दोनों चरणों में रिट क्लस्टर का पता लगाया गया था, और Lcn2 को हमारे परिणामों के अनुरूप P1 (छवि। S7C) में अपग्रेड किया गया था। इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन में scRNA-seq डेटा और जीन सूचियों के महत्व पर बल देते हुए, पहले से मौजूद डेटा सीमित उपयोग के थे। हमने दिखाया कि प्रत्यारोपित में पोडोसाइट्स और समीपस्थ नलिकाएंगुर्देनवजात अवस्था के करीब परिपक्व हो गया, जबकि नलिकाओं का संग्रह अपेक्षाकृत अपरिपक्व रहा। एकत्रित नलिकाओं की परिपक्वता हानि के अंतर्निहित कारणों को स्पष्ट किया जाना बाकी है। मूत्र प्रवाह से उत्पन्न शारीरिक शक्ति में कमी एक संभावित कारण हो सकता है, क्योंकि एकत्रित नलिकाएं मूत्र पथ में सबसे नीचे की ओर स्थित होती हैं। हमने भ्रूण प्रत्यारोपण कियागुर्देक्लोअका के साथ, पृथक गुर्दे के पारंपरिक प्रत्यारोपण की तुलना में बेहतर मूत्र प्रवाह संरक्षण के उद्देश्य से (चित्र। S5)। हालांकि, यह संभव है कि नेफ्रॉन खंडों के निचले हिस्से की परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए मूत्र प्रवाह अपर्याप्त था। वैकल्पिक रूप से, एकत्रित नलिकाएं पहले से ही मूत्राशय से बैकफ्लो के कारण यांत्रिक क्षति का सामना कर चुकी हैं, हालांकि विश्लेषण के समय स्पष्ट हाइड्रोयूरेटर या हाइड्रोफ्रोसिस नहीं देखा गया था। मेजबान मूत्रवाहिनी के साथ दाता-व्युत्पन्न मूत्राशय का बाद में संबंध था
अंजीर। 6. प्रत्यारोपित की परिपक्वतागुर्देनवजात अवस्था के करीब। (ए) एक E12.5 . का संपूर्ण-माउंट दृश्यगुर्दाप्रत्यारोपण से पहले क्लोअका के साथ (दिन 0)। प्रत्यारोपण के बाद 12 दिन में काटे गए मूत्राशय के साथ प्रत्यारोपित गुर्दे के हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला के साथ संपूर्ण-माउंट दृश्य और ऊतकीय विश्लेषण। लाल तीर: मूत्राशय में मूत्र की उपस्थिति। स्केल बार: 500 μ मीटर। (बी) का प्रतिरक्षणगुर्दासमीपस्थ नलिकाओं (LTL: हरा), हेनले के लूप (SLC12A1: लाल), और एकत्रित नलिकाओं (KRT8: ग्रे) के लिए मार्करों के साथ प्रत्यारोपण के बाद दिन 12 में। स्केल बार: 200 माइक्रोन। (सी) विवो में भ्रूण के गुर्दे के यूएमएपी भूखंड (ई15.5 और पी0) और प्रत्यारोपित भ्रूण गुर्दे (प्रत्यारोपण के बाद 12 दिन)। तीर: नेफ्रॉन पूर्वज (एनपी); एरोहेड: यूरेरिक बड टिप (यूबी)। पीओडी: पोडोसाइट; पीईसी: ग्लोमेरुलर पार्श्विका उपकला कोशिका; डीएन: नेफ्रॉन को अलग करना; पीटी: समीपस्थ नलिका; LOH: हेनले का लूप; डीटी: डिस्टल ट्यूब्यूल; सीडी: डक्ट इकट्ठा करना; सीडी-आईसी: एकत्रित वाहिनी की इंटरकलेटेड सेल; I C; बीचवाला सेल; ईसी: एंडोथेलियल सेल; यूटी: मूत्रवाहिनी; ईसा पूर्व: रक्त कोशिका। (डी) प्रतिरोपित में चरण-निर्भर जीन के वायलिन भूखंडगुर्देविवो (E15.5 और P0) में भ्रूण के गुर्दे की तुलना में।
हाइड्रोनफ्रोसिस को रोकने और आगे के विकास में सहायता करने की सूचना दी (योकोटे एट अल।, 2015), इस प्रकार इस तरह के प्रत्यारोपण में हमारे परिपक्वता मार्कर जीन की अभिव्यक्तियों का विश्लेषण करना जानकारीपूर्ण होगा। जबकि आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, हमारी जीन सूची विकासशील में व्यक्तिगत वंश की परिपक्वता स्थिति के आकलन के लिए उपयोगी साबित हुईगुर्देसाथ ही प्रत्यारोपण मेंगुर्दे. हमारा RNA-seq डेटा की परिपक्वता स्थिति का आकलन करने के लिए उपयोगी निर्देशांक के रूप में भी काम करेगागुर्दाप्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स। वर्तमान किडनी ऑर्गेनॉइड भ्रूण के चरणों में प्रतिनिधित्व करते हैं (टैगुची और निशिनाकामुरा, 2017; ताकासातो एट अल।, 2015; वू एट अल।, 2018), और आगे की परिपक्वता रोग मॉडलिंग के लिए और अंततः प्रत्यारोपण योग्य गुर्दे की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। वर्तमान में, रूपात्मक विश्लेषणों को छोड़कर, ऑर्गेनोइड के परिपक्वता चरणों को मापने के लिए कुछ विधियां उपलब्ध हैं। इस प्रकार, हमारे परिणाम ऑर्गेनॉइड परिपक्वता के आणविक पता लगाने की दिशा में एक आधार के रूप में काम करेंगे। जबकि पारंपरिकगुर्दाऑर्गेनोइड्स में मुख्य रूप से नेफ्रॉन (ग्लोमेरुली और .) होते हैंगुर्देनलिकाओं), हमने हाल ही में उच्च-क्रम की किडनी संरचनाओं के निर्माण की सूचना दी, जिसमें नेफ्रोन के साथ ब्रांचिंगयूरेटिक कलियों को शामिल किया गया है, जो यूरेटेरिक कली युक्तियों (टैगुची और निशिनाकामुरा, 2017) के आसपास वितरित की गई हैं। हमने माउस ईएससी-व्युत्पन्न नेफ्रॉन पूर्वजों और मूत्रवाहिनी कलियों को भ्रूण के स्ट्रोमल पूर्वजों के साथ जोड़कर हासिल किया है, और निकट भविष्य में ऑर्गेनोटाइपिक उत्पन्न करना सैद्धांतिक रूप से संभव होना चाहिए।गुर्दाकेवल माउस ESCs से और अंततः मानव IPSC से संरचनाएं। इस प्रकार, अगला कदम आगे की परिपक्वता के लिए ऑर्गेनोइड्स का प्रत्यारोपण होगा। हमारा scRNA-seq डेटा ट्रांसप्लांट किए गए ऑर्गेनोइड्स की परिपक्वता अवस्थाओं का आकलन करने के लिए उपयोगी संदर्भ उपकरण के रूप में काम करेगा।
प्रत्यारोपित में नेफ्रोजेनिक आला की कमीगुर्देअप्रत्याशित था। यद्यपि परिपक्वता पर ध्यान केंद्रित करने वाले वर्तमान अध्ययन का मुख्य दायरा नहीं है, यह कमी विवो में गुर्दे की तुलना में प्रत्यारोपित गुर्दे के छोटे आकार की व्याख्या कर सकती है। चूहों में नेफ्रॉन जनक जन्म के कई दिनों बाद तक नवजात नेफ्रॉन को जन्म देना जारी रखते हैं (हार्टमैन एट अल।, 2007; रूंबेल एट अल।, 2011; वोलोवेल्स्की
एट अल।, 2018) और नेफ्रॉन पूर्वजों के समय से पहले घटने से छोटे आकार के गुर्दे होते हैं (कांडा एट अल।, 2014; सेल्फ एट अल।, 2006)। यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि प्रतिरोपित में किन रखरखाव कारकों की कमी हैगुर्देऔर क्या नेफ्रॉन जनक या मूत्रवाहिनी कली युक्तियों का नुकसान इस घटना का प्राथमिक कारण है। इन पहेली को सुलझाने से अंततः प्रतिरोपित की वृद्धि होगीगुर्दाएक के लिए organoids
तुलनीय आकारगुर्देविवो में। एक साथ लिया गया, हमने दिखाया है कि हमारे scRNA-seq डेटा और जीन सूचियां भ्रूण और प्रत्यारोपित गुर्दे की परिपक्वता चरणों का आकलन करने के लिए आणविक आधार के रूप में काम कर सकती हैं, और IPSC से प्राप्त किडनी ऑर्गेनोइड पर लागू होंगी। यद्यपि हमने वर्तमान अध्ययन में नेफ्रॉन के विकास और परिपक्वता पर ध्यान केंद्रित किया है, अन्य वंशों का विस्तृत विश्लेषण, जैसे कि स्ट्रोमल और एंडोथेलियल कोशिकाएं, हमारे scRNA-seq डेटा का उपयोग करके अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे।गुर्दापरिपक्वता
सामग्री और तरीके
scRNA-seq विश्लेषण करता हैगुर्दे को पहले वर्णित विधि (तानिगावा एट अल।, 2 0 16) से संशोधित एक प्रोटोकॉल द्वारा अलग कर दिया गया था और scRNA-seq विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। C57BL/6N चूहों (CLEA Japan Inc.) को E15.5 और E17.5 विश्लेषण और Foxd1GFPCreER के लिए नियोजित किया गया था; tdTomato और Tbx18MerCreMer: tdTomato चूहों को C57BL/6N और ICR की मिश्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर P0 विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था (ग्रिसंती एट अल।, 2013; कोबायाशी एट अल।, 2014)। छहगुर्देE15.5 पर 10 मिनट के लिए 0.25 प्रतिशत trypsin/EDTA में पच गया। E17.5 और P0 महिलागुर्दे were minced roughly with forceps, digested with dissociation buffer comprising 2 mg/ml collagenase (Sigma; Cat# 9407), 2.4 U/ml dispase (Gibco; Cat# 17105-041), 2 mM CaCl 2 (Wako; Cat# 031–00435), 50 μ g/ml DNase I (Sigma; Cat# 11284932001), and 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma; Cat# 172012) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma; Cat# D5796) for 15 min at 37? C, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin/EDTA for 10 min. Trypsin was inactivated by addition of DMEM/10%FCS containing50 μ g/mlDNaseI,andthecells werewashed with HEPES-buffered saline solution (Thermo; Cat# 14185-052) containing 2% FCS, 50 μ g/ml DNase I, 1 mM CaCl 2 , and 0.035% NaHCO 3 (Wako; Cat# 191–01305). Cells were resuspended in 0.04% BSA/PBS, filtered through a 40- μ m-pore strainer (Falcon; Cat# 352340), and evaluated for their cell number and viability (>90 प्रतिशत) काउंटेस ऑटोमेटेड सेल काउंटर (थर्मो; कैट# C10227) का उपयोग करके। E15.5 और E17.5 में से प्रत्येक से कुल 5000 अलग-अलग सेल और P0 से दो नमूने (5000 सेल प्रति सैंपल) क्रोमियम कंट्रोलर (10x जीनोमिक्स) पर लागू किए गए थे। . एक क्रोमियम सिंगल सेल 3 0 लाइब्रेरी और जेल बीड्स किट v2 (10x जीनोमिक्स) का उपयोग ओलिगो-डीटी-प्राइमेड सीडीएनए लाइब्रेरी बनाने के लिए किया गया था, जिसे तब एक इलुमिना हाईसेक 3000 (E15.5 के लिए 14,000 रीड्स; 7000 रीड्स) द्वारा अनुक्रमित किया गया था। E17.5 के लिए; 14,000 P0 के लिए पढ़ता है)। नमूनों का Q30 बेस RNA पढ़ता है (क्यू-स्कोर अनुक्रमण गुणवत्ता दर्शाता है) 86 थे। E15.5 के लिए 2 प्रतिशत, E17.5 के लिए 63.8 प्रतिशत, और P0 के लिए 93.6 प्रतिशत।
प्रत्येक जीन के लिए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMI) की गणना तालिकाएँ उत्पन्न करने के लिए सेल रेंजर (संस्करण 3.0.2; 10x जीनोमिक्स) के सेल रेंजर काउंट कमांड का उपयोग करके कच्चे अनुक्रम डेटा को संसाधित किया गया था। प्रति सेल। सबसे पहले, हमने एकल संयुक्त P0 नमूना उत्पन्न करने के लिए सेल रेंजर के सेल रेंजर aggr कमांड का उपयोग करके दो P0 नमूनों को एकीकृत किया। इस बिंदु पर, हमने E15.5, E17.5, और P0 नमूनों के लिए क्रमशः 4,158, 5,551, और 10,810 सेल प्राप्त किए, जिनमें प्रति सेल क्रमशः 4,493, 2,360, और 2467 जीन थे। इन तीन व्यक्तिगत रूप से उत्पन्न डेटासेट को सेल रेंजर aggr कमांड का उपयोग करके एकीकृत किया गया था। बाद के सभी विश्लेषण आर सांख्यिकीय प्रोग्रामिंग भाषा (आर कोर टीम, 2018) में प्रति-गठन किए गए थे। सेरात पैकेज (संस्करण 3.1.1) का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण, डेटा सामान्यीकरण, डेटा स्केलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन (बटलर एट अल।, 2018) (स्टुअर्ट एट अल।, 2019ए) सहित विश्लेषण के लिए किया गया था। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, व्यक्त करने वाली कोशिकाएं<200 genes,="">8000 genes (possibly representing doublets), or >20 प्रतिशत माइटोकॉन्ड्रियल जीन को फ़िल्टर किया गया। अंतिम डेटासेट में क्रमशः E15.5, E17.5, और P0 नमूनों में 20,672जीन और 3,441,4,592, और 8161 सेल शामिल थे (कुल: 16,194 सेल)। जैकस्ट्रॉप्लॉट फ़ंक्शन (चुंग एंड स्टोरी, 2015) द्वारा निर्धारित 74 के आयाम मान के साथ आयाम में कमी के लिए एक प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग किया गया था। शीर्ष 2000 अत्यधिक परिवर्तनशील जीनों को FindVariableFeatures फ़ंक्शन द्वारा चुना गया था और क्लस्टरिंग के लिए आयामी जानकारी के साथ उपयोग किया गया था। 2.4 के रिज़ॉल्यूशन मान का उपयोग करके क्लस्टर विभाजन किया गया था। FindClusters कमांड ने कुल 45 क्लस्टर उत्पन्न किए जिन्हें आसानी से क्लस्टर-विशिष्ट मार्कर जीन के साथ अलग किया गया था, जो कि Seuratpackage के FindMarkers फ़ंक्शन के साथ प्राप्त किया गया था। Cluster26 में संभवतः मरने वाली कोशिकाएं शामिल थीं जो फ़िल्टरिंग मापदंडों से बच गईं, क्योंकि इसमें कोई विशिष्ट मार्कर जीन, कम माइटोकॉन्ड्रियल जीन नहीं दिखाया गया था, और सुविधाओं की अपेक्षाकृत कम संख्या। यूनिफ़ॉर्म मैनिफोल्ड एप्रोक्सिमेशन एंड प्रोजेक्शन फ़ॉर डायमेंशन रिडक्शन (यूएमएपी) प्लॉट्स को यूवोट पैकेज (बेच्ट एट अल।, 2019) का उपयोग करके तैयार किया गया था। UMAP निर्देशांक, सेरात क्लस्टर निर्देशांक, और प्राप्त क्लस्टर-विशिष्ट मार्करों को Loupe सेल ब्राउज़र सॉफ़्टवेयर (10x जीनोमिक्स) का उपयोग करके पुष्टि विश्लेषण के लिए csv फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया गया था। ScRNA-seq डेटा को नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन जीन एक्सप्रेशन ओम्निबस (GSE149134) में जमा किया गया था।
विकासात्मक चरण पर निर्भर जीन उम्मीदवारों का चयन
प्रत्येक क्लस्टर में विकासात्मक चरण-निर्भर जीन उम्मीदवारों का चयन करने के लिए, हमने E15.5 (उदाहरण के लिए क्लस्टर के बीच तुलना) की तुलना में P 0 पर अपग्रेड किए गए जीन को लेने के लिए FindMarkers फ़ंक्शन का उपयोग किया।
8 at P0 and cluster 8 at E15.5 for podocytes). Subsequently, we utilized the AverageExpression function to add the average gene expression data for each cluster at each stage for stage-dependent comparisons (log-fold change >1 और पी-मान<0.05). to="" determine="" segment-specific="" genes,="" we="" compared="" the="" target="" cluster="" with="" all="" other="" clusters="" at="" p0="" and="" selected="" the="" genes="" with="" low="" p-values="" (p="" <="" 0.05)="" and="" low="" expression="" rates="" in="" other="" clusters="" (pct2=""><0.11). after="" selecting="" the="" overlapping="" genes,="" we="" verified="" them="" in="" umap="" plots="" to="" finalize="" the="" lineage-specific="" stage-dependent="">
इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषणपैराफिन वर्गों को साइट्रेट बफर में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के अधीन किया गया था, पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 1 प्रतिशत बीएसए के साथ ऊष्मायन द्वारा अवरुद्ध किया गया था। वर्गों तो 4 पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया? सी, कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए एलेक्सा फ्लोर रंगों के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा किया। नाभिक को 4, 6-डायमिडीनो-2-फिनाइल-इंडोल (Roche; Cat# 10236276001) के साथ दाग दिया गया था। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था: बायोटिनाइलेटेड एलटीएल (वेक्टर लेबोरेटरीज; बी -1325), खरगोश विरोधी एसएलसी 12 ए 1 (स्ट्रेसमार्क बायोसाइंस; एसपीसी -401 डी), चूहा विरोधी केआरटी 8 (विकास-मानसिक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा विश्वविद्यालय; ट्रोमा-आई), गिनी पिग एंटी-एनपीएचएस1 (प्रोजेन; जीपी-एन2); और खरगोश विरोधी CD31 (Abcam; ab28364)। प्रतिदीप्ति छवियों को एक LSM780 कन्फोकल माइक्रोस्कोप (कार्ल जीस) या FV3000 कन्फोकल माइक्रोस्कोप (ओलिंप) द्वारा कैप्चर किया गया था।
सिटू हाइब्रिडाईजेशन मेंआरएनएस्कोप मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट रिएजेंट किट v2 (एडीसी; कैट # 323100) का उपयोग करके 10 प्रतिशत फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन वर्गों का आरएनएस्कोप विश्लेषण किया गया था। टीएसए प्लस फ्लोरोफोरस (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ सिग्नल प्रवर्धन किया गया था। RNAscope जांच का विवरण तालिका S3 में दिया गया है। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, एक स्वचालित डिस्कवरी सिस्टम (Roche) का उपयोग करके वर्णित (काकू एट अल।, 2013) के रूप में कप के डिगॉक्सिजेनिन-आधारित सीटू संकरण में प्रदर्शन किया गया था। पीसीआर द्वारा कप जांच को विशिष्ट प्राइमरों (टेबल एस 3) का उपयोग करके क्लोन किया गया था, और आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके डिगॉक्सिजेनिन के साथ लेबल किया गया था। प्रत्येक जांच के लिए प्रत्येक भ्रूण अवस्था में दो से तीन नमूनों की जांच की गई, और लगातार परिणाम दिखाई दिए।
माउस भ्रूणीय गुर्दे का प्रत्यारोपणC57BL/6N गर्भवती मादा चूहों (E12.5) और वयस्क नर चूहों (8-12 सप्ताह) को CLEA Japan Inc. से खरीदा गया था और एक विशिष्ट रोग-मुक्त पशु सुविधा में रखा गया था। मेजबान वयस्क चूहों को 0.75 मिलीग्राम/किलोग्राम मेडेटोमिडाइन, 4.{{10}} मिलीग्राम/किलो मिडाज़ोलम, और 5.0 मिलीग्राम युक्त सामान्य खारा के पेरिटोनियल प्रशासन द्वारा संवेदनाहारी किया गया था। / किग्रा ब्यूटोरफानॉल। E12.5 पर क्लोअका के साथ माउस भ्रूण के गुर्दे को मेजबान चूहों (योकोटे एट अल।, 2015) के एपिडीडिमिस वसा में प्रत्यारोपित किया गया। सर्जरी के बाद, एटिपामेज़ोल को एक संवेदनाहारी विरोधी के रूप में प्रशासित किया गया था। प्रत्यारोपित भ्रूण के गुर्दे प्रत्यारोपण के 12 दिनों के बाद काटे गए। ScRNA-seq विश्लेषण के लिए, गुर्दे को P0 किडनी के समान ही अलग कर दिया गया था। सभी पशु प्रयोग हमारे संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए और कुमामोटो विश्वविद्यालय की आचार समिति (#A2019-113) द्वारा अनुमोदित किए गए।
सार्वजनिक रूप से उपलब्ध scRNA-seq डेटा का पुन: विश्लेषणE14.5 माउस भ्रूण के लिए scRNA-seq डेटागुर्दाऔर पी1गुर्दा(एडम एट अल।, 2017बी; मैगेला एट अल।, 2017) जीन एक्सप्रेशन ऑम्निबस (एक्सेस नंबर, जीएसई94333 और जीएसई104396, क्रमशः) से डाउनलोड किए गए थे। इन आंकड़ों के बाद के सभी विश्लेषण आर सांख्यिकीय प्रोग्रामिंग भाषा (आर कोर टीम, 2018) में किए गए थे, और सेरात पैकेज (संस्करण 3.2.2) का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण, डेटा सामान्यीकरण, डेटा स्केलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन सहित विश्लेषण के लिए किया गया था। धारा 4.1 में।