मोर्टेलिन/ग्लूकोज-विनियमित प्रोटीन 75 गैस्ट्रिक कैंसर के सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध को बढ़ावा देता है

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सार

प्लेटिनम दवा उपचार गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) के रोगियों के लिए सबसे प्रमुख कीमोथेरेपी रणनीतियों में से एक है। हालांकि, चिकित्सीय प्रभाव संतोषजनक से कम है, मुख्य रूप से प्लैटिनम दवाओं के लिए अधिग्रहित प्रतिरोध के कारण। इसलिए, अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ जीसी की चिकित्सीय प्रभावकारिता में काफी सुधार कर सकती है। इस अध्ययन में, हमने जीसी में ग्लूकोज-विनियमित प्रोटीन 75 (GRP75) के कीमो-प्रतिरोध-संबंधित कार्यों / तंत्रों और नैदानिक ​​​​महत्व की जांच करने का लक्ष्य रखा है। यहां, हमारे डेटा से पता चला है कि SGC7901 कोशिकाओं की तुलना में, GRP75 की अभिव्यक्ति सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध (कोशिकाओं (SGC7901 *) में स्पष्ट रूप से अधिक थी। GRP75 की दस्तक ने माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (MP) के रखरखाव को समाप्त कर दिया और परमाणु कारक एरिथ्रोइड को बाधित कर दिया {{ 10}}संबंधित कारक 2 (एनआरएफ2), फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3 किनसे/प्रोटीन किनसे बी (पीएल3के/एकेटी), हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर 1ए (एचआईएफ-1ए), और सी-माइसी, जिसके परिणामस्वरूप इसकी सक्रियता अवरुद्ध हो गई। उनके डाउनस्ट्रीम लक्ष्य। इन प्रक्रियाओं ने एंटी-ऑक्सीडेशन/एपोप्टोसिस क्षमताओं को क्षीण कर दिया और एसजीसी7901 "कोशिकाओं में चयापचय रिप्रोग्रामिंग को बदल दिया, जिससे इन कोशिकाओं को सिस्प्लैटिन में पुन: संवेदनशील बना दिया गया। हालांकि, एसजीसी7901 कोशिकाओं में जीआरपी75 की अधिकता ने विपरीत प्रभाव पैदा किया। एक xenografts मॉडल उपरोक्त परिणामों की पुष्टि की। प्लैटिनम कीमोथेरेपी और मेटा-विश्लेषण प्राप्त करने वाले जीसी रोगियों में, जीआरपी 75 का एक उच्च स्तर सकारात्मक रूप से आक्रामक विशेषताओं और खराब पूर्वानुमान के साथ जुड़ा हुआ था जिसमें गैस्ट्र भी शामिल है लेकिन सीमित नहीं है आंतों के कैंसर, और समग्र अस्तित्व के लिए एक स्वतंत्र भविष्यवक्ता थे। सामूहिक रूप से, हमारे अध्ययन ने संकेत दिया कि जीआरपी75 जीसी के सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध में शामिल था और जीआरपी75 प्लैटिनम-प्रतिरोध कोशिकाओं में दवा की प्रतिक्रिया को बहाल करने के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है और जीसी रोगियों के नैदानिक ​​​​प्रबंधन का मार्गदर्शन करने में एक सहायक योगात्मक रोगनिरोधी उपकरण हो सकता है।

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परिचय

गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) चीन में पाचन तंत्र के कैंसर की पहली प्रमुख घटना और दूसरी प्रमुख मृत्यु दर थी। उन्नत जीसी के लिए वर्तमान उपचार प्रणालीगत कीमोथेरेपी के साथ संयुक्त सर्जरी ऑपरेशन थे, लेकिन उच्च शल्य चिकित्सा पुनरावृत्ति के कारण दीर्घकालिक जीवित रहने की दर संतोषजनक से कम थी। नैदानिक ​​अभ्यास में, प्लैटिनम दवाएं उन्नत के लिए पहली पंक्ति एजेंटों में से एक थीं। जीसी कीमोथेरेपी 3. हालांकि, दवाओं के लिए अधिग्रहित प्रतिरोध हमेशा प्लैटिनम-आधारित उपचार के कई चक्रों के बाद होता है और एक खराब रोग का संकेत देता है।सिस्टैंचइसलिए, संभावित तंत्र को रोशन करना और जीसी रोगियों में प्लैटिनम दवाओं के प्रतिरोध को दूर करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करना तत्काल आवश्यक था।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

ग्लूकोज-विनियमित प्रोटीन 75 (GRP75) तनाव-प्रेरक आणविक चैपरोन था जो हीट शॉक प्रोटीन परिवार से संबंधित था। GRP75 का ओवरएक्प्रेशन, विभिन्न मानव कैंसर में ट्यूमर की प्रगति के साथ निकटता से जुड़ा था 5-7। यहां, एक मेटा-विश्लेषण की खोज के माध्यम से, हमने पाया कि जीआरपी75 के उच्च स्तर ने कई पाचन तंत्र के कैंसर (कोलोरेक्टल कैंसर, कोलेजनोकार्सिनोमा और अग्नाशय के कैंसर) में काफी खराब रोग का संकेत दिया। दवा प्रतिरोध के लिए, GRP75 के निषेध ने हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा और डिम्बग्रंथि के कैंसर में सिस्प्लैटिन और डॉक्सोरूबिसिन प्रतिरोध को उलट दिया "। GRP75 ने साइटोप्लाज्म में p53 को शास्त्रीय रूप से अनुक्रमित किया, जिससे p53 फ़ंक्शन निष्क्रिय हो गया और ऐप-tosis10 को दबा दिया गया। एक पिछले अध्ययन में बताया गया है कि GRP75 सामान्य p53 फ़ंक्शन के साथ GC में GRP75 नकारात्मक ट्यूमर की तुलना में सकारात्मक ट्यूमर का पूर्वानुमान खराब था। हालाँकि, p53 GC में सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीनों में से एक था (50 प्रतिशत से अधिक रोगियों को प्रभावित करता है) l 2-15। इसलिए हमने परिकल्पना की कि p53 गतिविधि के शास्त्रीय दमन के अलावा, GRP75 एपी 53-स्वतंत्र तरीके से नियोजित करके जीसी में प्लैटिनम दवाओं के प्रतिरोध को उत्प्रेरण/बनाए रखने में शामिल हो सकता है।

इस अध्ययन में, GRP75 की उच्च अभिव्यक्ति ने SGC7901 कोशिकाओं में और एक xenografts मॉडल में सिस्प्लैटिन प्रतिरोध में योगदान दिया। यंत्रवत् रूप से, GRP75 ने एंटी-ऑक्सीकरण / एपोप्टोटिक क्षमताओं और चयापचय रिप्रोग्राम-मिंग गुणों को विनियमित करके सिस्प्लैटिन प्रतिरोध को प्रेरित / बनाए रखा।ऑस्ट्रेलियाजीसी रोगियों में, जीआरपी 75 के ओवरएक्प्रेशन ने आक्रामक विशेषताओं और खराब रोग का निदान करने में योगदान दिया। हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि GRP75 ने GC में सिस्प्लैटिन प्रतिरोध को बढ़ावा दिया और प्लैटिनम दवा उपचार की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए एक बायोमार्कर हो सकता है।सिस्टैंच लाभGRP75 को लक्षित करना GC प्रणालीगत कीमोथेरेपी की एक नई समझ प्रदान कर सकता है।

परिणाम

जीसी सेल व्यवहार्यता assays में सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध पर GRP75 के प्रभाव को SGC7901 ~ कोशिकाओं के प्रतिरोध को सत्यापित करने के लिए नियोजित किया गया था, SGC7901 और SGC7901CR कोशिकाओं के लिए सिस्प्लैटिन के इप्सोस (uM) थे: 5.518 बनाम 72.46 (छवि 1 ए)। KM-प्लॉटर डेटाबेस के आधार पर, GRP75 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति ने खराब पूर्वानुमान (चित्र 1B) का संकेत दिया। इसके अलावा, SGC7901CR कोशिकाओं में अपने पैतृक SGC7901 कोशिकाओं (छवि 1C) की तुलना में GRP75 अभिव्यक्तियों में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई है, यह सुझाव देते हुए कि GRP75 सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध में योगदान कर सकता है। इस परिकल्पना को सत्यापित करने के लिए, SGC7901 ~ कोशिकाओं को हाथापाई- या GRP75 siRNA द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और तले के लिए सिस्प्लैटिन के IC50s (uM)- या GRP75 siRNA ट्रांसफ़ेक्ट SGC7901CK कोशिकाएँ थीं: 50.83 बनाम 20। 86, क्रमशः (चित्र। 1डी)। इसके विपरीत,

GRP75 प्लास्मिड को SGC7901 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट करके GRP75 के ओवरएक्प्रेशन से पता चला है कि हाथापाई के लिए सिस्प्लैटिन के IC50s- या GRP75 प्लास्मिड ट्रांसफ़ेक्ट SGC7901 सेल 3.825 बनाम 6.98 (Fig.1E) थे। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चला कि जीआरपी75 ने जीसी में सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध को बनाए रखने/उत्प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई, लेकिन तंत्र आगे की जांच कर रहा था।

GRP75 में अंतर्निहित संभावित तंत्रों ने सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध का कारण बना

हमने GEO से माइक्रोएरे डेटासेट GSE122130 (SGC7901CR बनाम SGC7901) और GSE14209 (ऊतक, सिस्प्लैटिन-प्रतिरोधी बनाम सिस्प्लैटिन-संवेदनशील) डाउनलोड किए, फिर हमने DAVID पर आधारित GO-जैविक प्रक्रिया और KEGG-पाथवे संवर्धन विश्लेषण किया, और शीर्ष 10 परिणाम Fig.2A-D में दिखाए गए थे। SGC7901C* कोशिकाओं और SGC7901 कोशिकाओं के बीच जैविक प्रक्रियाओं के आवश्यक अंतरों में ऑक्सीकरण-कमी, एपोप्टोटिक प्रक्रिया (चित्र। 2A), KEGG-पाथवे संवर्धन विश्लेषण शामिल हैं, जिसमें पाया गया कि DEGs सेट चयापचय पथ के साथ निकटता से संबंधित थे, और फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3 किनसे / प्रोटीन किनसे बी (PI3K/AKT) पाथवे (चित्र 2B)। सिस्प्लैटिन-प्रतिरोधी और सिस्प्लैटिन-संवेदनशील ट्यूमर के ऊतकों के बीच जैविक प्रक्रियाओं के आवश्यक अंतर में दवा की प्रतिक्रिया को शामिल किया गया था और केईजीजी-पाथवे संवर्धन विश्लेषण (छवि 2 सी, डी) में चयापचय मार्ग भी मुख्य कड़ी था। इसके अलावा, स्ट्रिंग डेटाबेस का उपयोग करके जीआरपी75 के साथ महत्वपूर्ण रूप से बातचीत करने वाले 60 प्रोटीनों का एक नेटवर्क बनाया गया था, फिर केईजीजी-पाथवे विश्लेषण ने प्रति-गठन किया कि चयापचय मार्गों ने जीआरपी 75 और इसके इंटरेक्टर्स (छवि 2 ई) के बीच एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। इन परिणामों के आधार पर, हमने अनुमान लगाया कि एंटी-ऑक्सीडेशन / एपोप्टोसिस और मेटाबॉलिक रिप्रोग्रामिंग जीसी के अस्तित्व और विकास को बढ़ावा दे सकते हैं जो सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध की ओर ले जाता है। हालाँकि, विनियमन में GRP75 भागीदारी के तंत्र को और अध्ययन की आवश्यकता थी (चित्र 2F)।

एंटी-ऑक्सीडेशन और एंटी-एपोप्टोसिस पर GRP75 का प्रभाव यहाँ, इंट्रासेल्युलर ROS स्तर SGC7901CR कोशिकाओं में अपने पैतृक समकक्षों (छवि 3A) की तुलना में ऊंचा किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि SGC7901Ck कोशिकाओं को अपेक्षाकृत उच्च ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों से अवगत कराया गया था। पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि जीआरपी75 एमएमपी के स्थिरीकरण में शामिल था, जो आरओएस पीढ़ी का एक महत्वपूर्ण स्रोत है। इधर, GRP75 की दस्तक ने सिस्प्लैटिन से प्रेरित SGC7901CK कोशिकाओं में MMP के रखरखाव को समाप्त कर दिया, और GRP75 के ओवरएक्प्रेशन का SGC7901 कोशिकाओं (छवि 3 बी) में विपरीत प्रभाव पड़ा।सिस्टैंच कोलेस्ट्रॉलफिर, हमने GRP75 और एंटी-ऑक्सीकरण और एंटी-एपोप्टोसिस के बीच संबंधों को मान्य किया। जैसा कि चित्र 3C में दिखाया गया है, GRP75 की दस्तक ने SGC7901 में परमाणु कारक एरिथ्रोइड -2- संबंधित कारक 2 (NRF2) और इसके डाउनस्ट्रीम लक्ष्य जीन (HO-1 और NQO-1) के स्तर को कम कर दिया। ~ कोशिकाओं, और GRP75 के overexpression ने SGC7901 कोशिकाओं में विपरीत प्रभाव दिखाया। इसके अलावा, SGC7901CR कोशिकाओं में GRP75 या NRF2 के नॉकडाउन ने सिस्प्लैटिन से प्रेरित इंट्रासेल्युलर ROS पीढ़ियों, एपोप्टोसिस (छवि 3D), और कस्पासे -3 गतिविधियों (सप्लीमेंट्री अंजीर। S1) को और बढ़ाया। इसके विपरीत, SGC7901 कोशिकाओं में GRP75 की अति-अभिव्यक्ति ने सिस्प्लैटिन-प्रेरित ROS पीढ़ियों, सेल एपोप्टोसिस (छवि 3E), और कस्पासे -3 गतिविधियों (सप्लीमेंट्री अंजीर। S1) को महत्वपूर्ण रूप से देखा। इन परिणामों से पता चला कि जीआरपी75 ने सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध को बनाए रखा / प्रेरित किया, जीसी कोशिकाओं में एंटी-ऑक्सीकरण और एंटी-एपोप्टोसिस उत्प्रेरण के माध्यम से हो सकता है।

मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग पर GRP75 का प्रभाव अगला, हमने आगे जांच की जिससे GRP75 ने मेटाबॉलिक रिप्रोग्रामिंग के परिवर्तन को प्रेरित किया। बढ़ते हुए प्रमाणों से पता चला है कि ट्यूमर कोशिकाओं का चयापचय एक एकल चयापचय मार्ग में असामान्य परिवर्तन नहीं था, बल्कि पूरे सेलुलर चयापचय नेटवर्क का एक पुन: प्रोग्रामिंग था। कई शास्त्रीय ओंकोजीन या सिग्नलिंग मार्ग प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग में शामिल थे, जैसे कि PI3K/AKT, हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल फैक्टर ला (HIF-la), c-myc, और इसी तरह"'819। इसलिए, हमने सत्यापित किया कि क्या GRP75 था जीसी कोशिकाओं के मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग में शामिल। जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है, हमने एसजीसी7901सीआर कोशिकाओं में पी-एकेटी, एचआईएफ-ला और सी-माइसी के स्तर को अपने पैतृक एसजीसी7901 कोशिकाओं की तुलना में देखा। इसके अलावा, एसजीसी7901सीआर कोशिकाओं में, GRP75 ने सिस्प्लैटिन-प्रेरित p-AKT, HIF-la, और c-Myc प्रोटीन स्तर और ग्लाइकोलाइसिस से संबंधित उनके डाउनस्ट्रीम लक्ष्य (HK2: hexokinase 2; PDK1: pyruvate dehydrogenase kinase l; और LDHA: lactate dehydrogenase A chain) को कम कर दिया। इसके विपरीत, SGC7901 कोशिकाओं में GRP75 के ओवरएक्प्रेशन ने विपरीत प्रभाव दिखाया (चित्र 4B, C)। इसके अलावा, SGC7901CR कोशिकाओं में GRP75 या AKT के नॉकडाउन ने सिस्प्लैटिन द्वारा प्रेरित ग्लूकोज तेज और सेल व्यवहार्यता / वृद्धि में उल्लेखनीय कमी दिखाई; हालाँकि, SGC7901 कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से GRP75 की अधिकता सिस्प्लैटिन के कारण ग्लूकोज तेज और सेल व्यवहार्यता / वृद्धि की क्षमता में वृद्धि (चित्र। 4डी-एफ)। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों ने संकेत दिया कि जीआरपी 75 ने जीसी कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध को बनाए रखा / प्रेरित किया, पी-एकेटी, एचआईएफ-ला, और सी-माइसी की मध्यस्थता वाले चयापचय रिप्रोग्रामिंग में भाग लेने के माध्यम से हो सकता है।

एक xenograft मॉडल में इन विट्रो डेटा की पुष्टि तब हमने विवो में GRP75 की संभावित नैदानिक ​​प्रासंगिकता की जांच की। xenograft डेटा ने संकेत दिया कि अकेले सिस्प्लैटिन के साथ उपचार या अकेले GRP75 की खराबी ट्यूमर के विकास को रोक सकती है; हालांकि, जीआरपी75 नॉकडाउन के साथ संयुक्त सिस्प्लैटिन उपचार ने ट्यूमर के विकास (छवि 5 ए) के सिस्प्लैटिन-प्रेरित निषेध की काफी सुविधा प्रदान की। इसके अलावा, IHC और qPCR assays ने दिखाया कि सिस्प्लैटिन प्लस GRP75 siRNA ने अकेले सिस्प्लैटिन उपचार की तुलना में Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT, और डाउनस्ट्रीम लक्ष्यों की अभिव्यक्तियों को काफी कम कर दिया, लेकिन एपोप्टोसिस में वृद्धि हुई (जैसा कि TUNEL धुंधला, अंजीर। 5B द्वारा निर्धारित किया गया है) , सी)। सामूहिक रूप से, इन परिणामों ने संकेत दिया कि, एंटी-ऑक्सीकरण / एंटी-एपोप्टोसिस क्षमताओं और चयापचय रिप्रोग्रामिंग को विनियमित करने के माध्यम से, GRP75 ने विवो उत्तरजीविता और विकास को प्रेरित किया जिसके कारण जीसी के सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध का कारण बना।

एक विशिष्ट कैंसर को बढ़ावा देने वाले कारक के रूप में GRP75 की पहचान और GC . में GRP75 का नैदानिक ​​​​महत्व

हमने तब GC नमूनों के लगातार वर्गों में GRP75 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 6A, आसन्न गैर-ट्यूमर गैस्ट्रिक ऊतकों की तुलना में, GC ऊतकों में GRP75 अभिव्यक्ति की काफी ऊंचाई देखी गई थी। IHC-तीव्रता स्कोर (छवि 6B) द्वारा GC ऊतकों में GRP75 के ओवरएक्प्रेशन का प्रदर्शन किया गया था। घातक ट्यूमर चरण (छवि 6C, D) के TNM वर्गीकरण में वृद्धि के साथ GRP75 के लिए मजबूत धुंधलापन भी देखा गया। फिर, हमने इन 116 GC नमूनों को IHC-तीव्रता, चित्र 6E के अनुसार दो समूहों ("GRP75 कम" बनाम. GRP75 उच्च ") में विभाजित किया। "GRP75 उच्च" समूह में ट्यूमर के अनुप्रस्थ व्यास "GRP75 निम्न" समूह (छवि 6F) की तुलना में काफी बड़े थे। हमने आगे जीसी में जीआरपी75 के नैदानिक ​​​​रोग का निदान मान्य किया। कापलान-मीयर उत्तरजीविता विश्लेषण ने यह भी दिखाया कि "जीआरपी75 उच्च" समूह में जीसी रोगियों का समग्र अस्तित्व "जीआरपी75 निम्न" समूह (छवि 6जी) की तुलना में बदतर था।

बहुभिन्नरूपी विश्लेषण ने पहचाना कि GRP75 समग्र अस्तित्व (तालिका 1) के लिए एक स्वतंत्र भविष्यवक्ता था।सिस्टैंच डेजर्टिकोला साइड इफेक्ट,सारांश में, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि जीआरपी 75 की जीसी प्रगति, सिस्प्लैटिन प्रतिरोध और खराब रोग का निदान करने में एक विशिष्ट भूमिका थी। साहित्य खोज और चयन और मेटा-विश्लेषण के पूर्वानुमान प्रवाह आरेख के साथ GRP75 के उच्च स्तर का मेटा-विश्लेषण अनुपूरक चित्र S2 में दिखाया गया था। यादृच्छिक-प्रभाव मॉडल और निश्चित-प्रभाव मॉडल का उपयोग एचआर मूल्य की गणना और विश्लेषण के लिए किया गया था, दोनों ने दिखाया कि जीआरपी75 के उच्च स्तर खराब रोगी परिणामों के साथ महत्वपूर्ण रूप से जुड़े हुए हैं। विषमता (I'=0.0 प्रतिशत, p =0.559) (चित्र 7A) के साथ जमा हुआ HR 1.91 (95 प्रतिशत CI 1.62 से 2.25) था। फिर हमने एक उपसमूह विश्लेषण किया, जिससे पता चला कि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में जीआरपी75 का अभिव्यक्ति स्तर (पूल एचआर 1.99,95 प्रतिशत सीआई 1.64 से 2.43 था), का खराब उत्तरजीविता रोग के साथ एक महत्वपूर्ण संबंध है। निश्चित रूप से, इसी तरह के परिणाम अन्य ट्यूमर में भी पाए गए (पूल एचआर 1.74,95 प्रतिशत सीआई 1.29 से 2.33) (छवि 7 बी)। दोनों

शामिल अध्ययनों के संभावित प्रकाशन पूर्वाग्रह का आकलन करने के लिए बेग के फ़नल प्लॉट और एगर के परीक्षण का उपयोग किया गया था। GRP75 और OS के बीच संबंध के विश्लेषण में, Begg के परीक्षण और Egger के परीक्षण का p-मान क्रमशः 0.076 और 0.024 था, (चित्र 7C और D)। हालांकि, प्रकाशन पूर्वाग्रह के मूल्यांकन में एगर के परीक्षण में उच्च संवेदनशीलता है। इस प्रकार, हमारे परिणामों को अधिक विश्वसनीय बनाने के लिए ट्रिम और भरण पद्धति का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्र 7E में दिखाया गया है, फिक्स्ड-इफेक्ट मॉडल में समायोजित HR 1.785 (95 प्रतिशत CI 1.530 से 2.081, p) था।<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

बहस

इस अध्ययन में, हमने जीसी, प्लैटिनम दवाओं वाले रोगियों के लिए पहली पंक्ति के कीमोथेराप्यूटिक एजेंटों में से एक का उपयोग किया। शास्त्रीय रूप से, प्लैटिनम दवाएं सहसंयोजक रूप से डीएनए श्रृंखला पर गुआनिन से बंध सकती हैं और इस प्रकार, डीएनए 2 की प्रतिकृति और प्रतिलेखन को अवरुद्ध कर सकती हैं। हालांकि, दवा प्रतिरोध और अवांछनीय दुष्प्रभावों के कारण, जीसी रोगियों में प्रतिरोध को उलटने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करना तत्काल आवश्यक था। इसके अलावा, जीसी रोगियों ने सिस्प्लैटिन के कई पाठ्यक्रम प्राप्त करने के बाद दवा प्रतिरोध विकसित किया, और हमारे परिणामों से पता चला कि SGC7901 ~ कोशिकाओं ने SGC7901 कोशिकाओं की तुलना में सिस्प्लैटिन के लिए महत्वपूर्ण प्रतिरोध प्रदर्शित किया।

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) ने मानव कैंसर की शुरुआत और प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है-7। हाल ही में, यह स्पष्ट हो गया था कि कीमोथेरेपी प्रतिरोध में GRP75 की भी महत्वपूर्ण भूमिका थी "। GRP75 के अलावा, अन्य हीट शॉक प्रोटीन ने PI3K/AKT/NF-KB और अन्य मार्गों के माध्यम से सिस्प्लैटिन प्रतिरोध में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई21-24 हालांकि, जीआरपी75 और सिस्प्लैटिन प्रतिरोध के आणविक तंत्र की शायद ही कभी रिपोर्ट की गई थी। यहां, हमारे अध्ययन से पता चला है कि जीआरपी75 ने एंटी-ऑक्सीडेशन/एपोप्टोसिस क्षमताओं को बढ़ावा दिया और मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग को बदल दिया, जिससे जीसी कोशिकाओं में सिस्प्लैटिन प्रतिरोध हो गया। हमने यह भी पाया कि जीआरपी75 को अपग्रेड किया गया था SGC7901 ~ कोशिकाओं और रोगियों से ऊतक के नमूनों में, और दवा प्रतिरोध, जीवित रहने, विकास और खराब परिणामों के साथ सहसंबद्ध था। इस बीच, बहुभिन्नरूपी विश्लेषण ने पहचान की कि GRP75 समग्र अस्तित्व के लिए एक स्वतंत्र भविष्यवक्ता था। इसके अलावा, मेटा-विश्लेषण ने संकेत दिया कि ए जीआरपी75 के उच्च स्तर ने खराब पूर्वानुमान दिखाया, जिसमें जीसी भी शामिल है, लेकिन यह इन्हीं तक सीमित नहीं है, जो हमारे शोध के साथ अत्यधिक संगत था। उपरोक्त सभी परिणामों ने पुष्टि की कि जीआरपी75 को लक्षित करना संभव है सिस्प्लैटिन प्रतिरोध को उलटने और जीसी रोगियों के पूर्वानुमान में सुधार के लिए एक नया दृष्टिकोण बनने की उम्मीद की जा सकती है।

शारीरिक स्थितियों के तहत, कोशिकाओं को अनिवार्य रूप से बाहरी कारकों और इंट्रासेल्युलर एरोबिक चयापचय से आरओएस से अवगत कराया गया था। एक दोधारी तलवार के रूप में, उपयुक्त आरओएस महत्वपूर्ण सिग्नल अणु थे जो कोशिकाओं के सामान्य कार्य को नियंत्रित करते थे, जबकि अत्यधिक आरओएस ने एपोप्टोसिस को जन्म दिया। इसलिए, रेडॉक्स संतुलन और एपोप्टोटिक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के लिए शरीर में एक सटीक एंटीऑक्सीडेंट विनियमन प्रणाली मौजूद थी। हालांकि, शारीरिक स्थितियों के विपरीत, ट्यूमर के आरओएस स्तर आम तौर पर उसी ऊतक उत्पत्ति के सामान्य नियंत्रण से काफी अधिक थे, जिसने एक विशेष के अस्तित्व को निर्धारित किया। ट्यूमर कोशिकाओं में एंटी-ऑक्सीडेंट प्रणाली, विशेष रूप से दवा प्रतिरोधी ट्यूमर कोशिकाओं के लिए 27-29। हमारे परिणामों ने पुष्टि की कि SGC7901CR कोशिकाओं ने SGC7901 कोशिकाओं की तुलना में ROS के अपेक्षाकृत उच्च स्तर का प्रदर्शन किया और GRP75 ने एंटी-ऑक्सीकरण / एपोप्टोसिस की क्षमता को बढ़ाया। ट्यूमर कोशिकाओं में चयापचय संबंधी असामान्यताओं का एक लंबा इतिहास रहा है। 1930 के दशक की शुरुआत में, ओटो वारबर्ग ने पाया कि ट्यूमर कोशिकाएं ग्लाइकोलाइसिस को पसंद करती हैं। ऑक्सीजन-पर्याप्त परिस्थितियों में भी, ट्यूमर कोशिकाओं ने अभी भी एटीपी पीढ़ी के लिए ग्लाइकोलाइसिस की उच्च दर बनाए रखी है। इस असामान्य चयापचय पैटर्न को "वारबर्ग प्रभाव" 3031 कहा गया। वारबर्ग प्रभाव के नेतृत्व वाले चयापचय परिवर्तनों को हाल ही में चयापचय रिप्रोग्रामिंग के रूप में संदर्भित किया गया था, और इन परिवर्तनों के अध्ययन ने जीसी सेल चयापचय की गहरी समझ प्रदान की। यह प्रदर्शित किया गया था कि जीसी कोशिकाओं और सामान्य कोशिकाओं ने न केवल ग्लूकोज चयापचय में बल्कि लिपिड और अमीनो एसिड के चयापचय में भी चयापचय अंतर प्रदर्शित किया है। इस शोध में, हमने पाया कि ग्लूकोज चयापचय में परिवर्तन मुख्य में से एक थे। कोशिका वृद्धि को बनाए रखने वाले लिंक, अंततः जीसी सिस्प्लैटिन प्रतिरोध की ओर ले जाते हैं।

जैसा कि हमने उल्लेख किया है, शास्त्रीय ऑन्कोजीन और सिग्नलिंग मार्ग जैसे PI3K / AKT, HIF-la, और c-myc प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से चयापचय रिप्रोग्रामिंग में शामिल थे। ट्यूमर कोशिकाओं में PI3K / AKT मार्ग के सक्रियण ने बहुत सारी चयापचय गतिविधियों को बढ़ाया। सबसे पहले, यह कोशिकाओं को ग्लूकोज, अमीनो एसिड और अन्य पोषक तत्वों को ग्रहण करने के लिए प्रेरित करता है। दूसरा, AKT ने जीन अभिव्यक्ति और एंजाइम गतिविधि पर अपने प्रभाव के माध्यम से ग्लाइकोलाइसिस और लैक्टेट उत्पादन में वृद्धि की और कैंसर कोशिकाओं में युद्ध-बर्ग प्रभाव को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था। तीसरा, इस पथ-मार्ग की सक्रियता ने मैक्रोमोलेक्यूल्स के जैवसंश्लेषण को बढ़ाया और लिपोजेनिक जीन और लिपिड संश्लेषण की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। इसके अलावा, जीआरपी 75- सक्रिय एकेटी और बाह्य संकेत-विनियमित प्रोटीन किनेसेस 1 और 2 ने बैक्स गठनात्मक परिवर्तन और एपोप्टोसिस 8 को बाधित किया। ट्यूमर कोशिकाओं को हाइपोक्सिया के लिए अनुकूलित किया गया, जिसमें ग्लूकोज तेज, ग्लाइकोलाइसिस को प्रोत्साहित करने के लिए एचआईएफ-ला लक्ष्य जीन को अपग्रेड करके चयापचय रिप्रोग्रामिंग शामिल है। लैक्टिक एसिड का उत्पादन और स्राव, ग्लाइकोजन भंडारण, ग्लूटामाइन कैट-एबोलिज्म³, और लिपिड बूंदों में ट्राइग्लिसराइड्स के संचय को बढ़ावा देता है। हाल ही में, यह स्पष्ट हो गया था कि जीआरपी 75 विशेष रूप से एचआईएफ-ला से जुड़ सकता है और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को लक्षित कर सकता है, जिससे जुड़ा हुआ है VDAC1 और HK2, जिसने एपोप्टोसिस को रोका'। C-myc कई तरह से मेटाबॉलिक रिप्रोग्रामिंग की मध्यस्थता कर सकता है, और c-myc-मध्यस्थता वाले मेटाबॉलिक रिप्रोग्रामिंग को काफी हद तक माइटोकॉन्ड्रिया को प्रभावित करके हासिल किया गया था। एक ओर, c-myc ने LDHA, HK2, और PDK11938 सहित ग्लाइकोलाइटिक-संबंधित एंजाइमों की अभिव्यक्ति को सीधे विनियमित करके ग्लाइकोलाइसिस को बढ़ावा दिया। दूसरी ओर, प्रतिलेखन के माध्यम से ग्लूटामाइन चयापचय में शामिल c-myc सक्रिय एंजाइमों के उपयोग को बढ़ावा दिया। ट्यूमर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा ग्लूटामाइन। इस प्रभाव को "ग्लूटामिनोलिसिस" कहा जाता है। इसके अलावा, जीआरपी 75-ओवरएक्प्रेशन ने साइक्लिन-बी1 को कम किया और ओवेरियन कैंसर सेल के विकास को बढ़ावा देने के लिए साइक्लिन-डी1 और सी-माइसी को अपग्रेड किया। हमारे वर्तमान परिणामों के आधार पर, हमने ट्यूमर मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग नेटवर्क के नियमन में संभावित महत्वपूर्ण कड़ी के रूप में जीआरपी75 के माध्यम से जीसी सिस्प्लैटिन प्रतिरोध की एक नई समझ प्रदान की।

निष्कर्ष

अंत में, हमने दिखाया कि जीआरपी75 का ओवरएक्प्रेशन एंटी-ऑक्सीकरण / एपोप्टोसिस और मेटाबॉलिक रिप्रोग्रामिंग नेटवर्क को विनियमित करके जीसी कोशिकाओं में उत्तरजीविता / वृद्धि को बढ़ावा दे सकता है, जिससे सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध उत्पन्न होता है।

सामग्री और तरीके

कोशिकाओं, अभिकर्मकों, और संस्कृति की स्थिति

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 प्रतिशत शुद्धता), सिग्मा-एल्ड्रिच (शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। कोशिकाओं को RPMI -1640 माध्यम (गिब्को, ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए) में संवर्धित किया गया, 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम FBS）, 100 U/ml पेनिसिलिन, 100 ug/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को), और इनक्यूबेटेड के साथ पूरक किया गया। 5 प्रतिशत CO2 में 37 डिग्री पर। सिस्प्लैटिन-प्रतिरोध फेनोटाइप के रखरखाव के लिए, SGC7901CR कोशिकाओं को सिस्प्लैटिन 5μM） वाले माध्यम में ऊष्मायन किया गया था।

ज़ेनोग्राफ़्ट और उपचार

इस अध्ययन को नानजिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था, और जानवरों के साथ मानवीय व्यवहार किया गया था और पीड़ा को कम करने के संबंध में। BALB / c नग्न चूहों को SLRC प्रयोगशाला पशु केंद्र (शंघाई, चीन) से प्राप्त किया गया था और पारंपरिक रूप से रखा गया था जैसा कि हमने पहले वर्णित किया था। एक्सनोग्राफ़्ट अध्ययन के लिए, 100ul मैट्रीगेल में 2×10 डिग्री SGC7901CK कोशिकाओं को 5 सप्ताह के लिए चूहों के गुच्छे में सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया था। जीसी के सिस्प्लैटिन प्रतिरोध पर जीआरपी75 के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए, हमने इंट्राटूमोरल और इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन परख किया। संक्षेप में, चूहों को बेतरतीब ढंग से 4 समूहों (प्रति समूह 5 चूहों) में विभाजित किया गया था: (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK-सिस्प्लैटिन, और -4-GRP75 केडी-सिस्प्लैटिन। SiRNA si-Con या si-GRP75, 100nM के 100ul) हर 3 दिनों में इंट्राट्यूमोरल इंजेक्शन थे। सिस्प्लैटिन (5 मिलीग्राम / किग्रा) चिकित्सा के अधीन समूह प्रति सप्ताह 3 बार इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन थे और अन्य समूहों को समान मात्रा में खारा के साथ सुगंधित किया गया था। हर हफ्ते ट्यूमर को मापा गया और उनकी मात्रा की गणना सूत्र का उपयोग करके की गई: वी=वाई (चौड़ाई 2 लंबाई)। 5 सप्ताह के बाद, चूहों की बलि दी गई, और आगे की जांच के लिए ट्यूमर के ऊतकों को हटा दिया गया।

मरीजों और ऊतक के नमूने

इस अध्ययन को दूसरे संबद्ध अस्पताल, नानजिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी की मेडिकल एथिक्स कमेटी और नानजिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी के संबद्ध चांगझौ नंबर 2 अस्पताल द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रत्येक रोगी से प्रतिभागी की लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। क्लिनिक-पैथोलॉजिकल डेटा को पूरक तालिका S1 में सूचीबद्ध किया गया था। ऊतक माइक्रोएरे का निर्माण झुओली बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (शंघाई, चीन) द्वारा किया गया था जैसा कि हमने पहले बताया था*

सेल अभिकर्मक

अभिकर्मक के लिए, स्क्रैम्बल और पीसीडीएनए-3.1-जीआरपी75-ध्वज को जनरल बायोटेक (शंघाई, चीन) द्वारा संश्लेषित किया गया था; जबकि siRNAs को अनुपूरक तालिका S2 में सूचीबद्ध किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन 3000 अभिकर्मक (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, यूएसए) के माध्यम से क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। संक्षेप में, कोशिकाओं को RPMI 1640 माध्यम में 1 × 10 डिग्री कोशिकाओं के घनत्व पर 6- अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाया गया था जिसमें एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10 प्रतिशत एफबीएस था। 24 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 5 एनजी / एमएल तले हुए या जीआरपी 75- ध्वज, या 20 एनएम सी-कॉन या सी-जीआरपी75 के साथ 12 घंटे के लिए क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। अभिकर्मक के बाद, अन्य प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने से पहले कोशिकाओं को एक और 24 घंटे के लिए 10 प्रतिशत एफबीएस के साथ पूरक एक ताजा माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था।

मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) उपयोग किए गए प्राइमरों को पूरक तालिका S3 में सूचीबद्ध किया गया था। कुल आरएनए का अलगाव, आरएनए का सीडीएनए में ट्रांसक्रिप्शन, और एप्लाइड बायोसिस्टम्स 7300एचटी मशीन के साथ क्यूआरटी-पीसीआर का प्रदर्शन सभी हमारे पिछले अध्ययन 2 के अनुसार थे। -एक्टिन को सीडीएनए अखंडता सुनिश्चित करने और अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए प्रवर्धित किया गया था। प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन की गणना एक तुलनात्मक दहलीज चक्र (सीटी) विधि द्वारा सूत्र 2- (4ACt) का उपयोग करके की गई थी।

यह लेख दाई एट अल से निकाला गया है। सेल डेथ डिस्कवरी (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w