Nrf2/ARE पाथवे के माध्यम से PC12 कोशिकाओं पर प्रेरित एपोप्टोसिस के H2O पर चार फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव 2-

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

माईक्वान ली 1, ताओ जू 1, फी झोउ 1, मेंगमेंग वांग 1, हुआक्सिन सॉन्ग 1, जिंग जिओ और बैयी लू 1,*

1 परिचय

ऑक्सीडेटिव तनाव, जो एंटीऑक्सिडेंट होमियोस्टेसिस का असंतुलन है, लिपिड पेरोक्सीडेशन, प्रोटीन और डीएनए की चोट, कोशिका उम्र बढ़ने और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। यह प्रक्रिया कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान करती है, जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), पार्किंसंस रोग (पीडी), और इस्किमिया / रीपरफ्यूजन [1]। हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2), जो मुख्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) में से एक है, लिपिड पेरोक्सीडेशन और डीएनए क्षति का कारण बनता है [2]। इसके अलावा, H2O2 हाइड्रॉक्सिल मुक्त कणों का एक अंतर्जात स्रोत है जो सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव [3,4] की पृष्ठभूमि के स्तर में योगदान देता है। इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस को रोकने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के उपचार की क्षमता हो सकती है।

परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2 (Nrf2), एक प्रतिलेखन कारक है जो दृढ़ता से ऑक्सीडेटिव तनाव से जुड़ा होता है। Nrf2 का सक्रियण हेम ऑक्सीजनेज़ -1 (HO -1), NAD (P) H क्विनोन ऑक्सीडोरक्टेज़ 1, विरोधी भड़काऊ [13], और इम्युनोमोडायलेटरी सहित कई एंटीऑक्सिडेंट और डिटॉक्सिफिकेशन जीन के प्रतिलेखन को प्रेरित करता है। ] बायोएक्टिविटीज। Osmanthusfragrans कई एशियाई खाद्य पदार्थों में एक सामान्य घटक है और लंबे समय से इसका सेवन किया जाता है। हमने पहले दिखाया था कि O.fragrans फूल के अर्क ने स्थानिक सीखने और स्मृति को बढ़ाया, ऑक्सीडेटिव क्षति को रोक दिया, और ICR माउस मॉडल [15] में d-galactose- प्रेरित उम्र बढ़ने में न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधियों का प्रदर्शन किया। O.fragrans फूलों के अर्क [16] की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों के लिए Salidroside, Acteoside, और isoacteoside प्रमुख PhGs प्रतिक्रिया हैं।

PhGs के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव पर अध्ययन ने वांछनीय परिणाम प्राप्त किए हैं। सालिड्रोसाइड ने पीसी 12 कोशिकाओं के सेल एपोप्टोसिस को काफी कम कर दिया जो एमपीपी प्लस [17,18] में उजागर हुए थे। Acteoside ने PC12 कोशिकाओं [19] और A p 25-35- प्रेरित SH-SY5Y सेल की चोट [20] में MPP प्लस-प्रेरित एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव को भी कम किया। एचीनाकोसाइड की जांच ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए (टीएनएफए) से एसएच-एसवाई5वाई कोशिकाओं में प्रेरित एपोप्टोसिस पर की गई थी [21], चूहों में एमपीटीपी-प्रेरित डोपामिनर्जिक विषाक्तता [22], चूहे के कोर्टिकल कोशिकाओं की ग्लूटामेट-घायल प्राथमिक संस्कृतियों [23], और { {19}}PC12 कोशिकाओं में ओएचडीए-प्रेरित क्षति [24]। परिणामों ने संकेत दिया कि PhG ने एक साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रदर्शित किया और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के इलाज के लिए संभावित एजेंट हैं। अध्ययनों से पता चला है कि PhGs के एंटीऑक्सीडेंट गुण इन यौगिकों के लिए कई अन्य बायोएक्टीविटी हैं [25]। हालांकि, कुछ अध्ययनों ने ऑक्सीडेटिव विषाक्तता के खिलाफ PhGs के आणविक तंत्र की जांच की है।

हमारे अध्ययन में, हमने निम्नानुसार चार विशिष्ट PhG का चयन किया: सैलिड्रोसाइड (फेनिलेथेनॉइड मोनोसेकेराइड्स), एक्टोसाइड (फेनिलेथेनॉइड डिसैकराइड्स), आइसोएक्टोसाइड (फेनिलेथेनॉइड डिसैकराइड्स), और इचिनाकोसाइड (फेनिलेथेनॉइड ट्राइसेकेराइड)। हमने H2O 2- प्रेरित PC12 सेल मॉडल पर PhG के सुरक्षात्मक प्रभाव और आणविक तंत्र की जांच के लिए विभेदित PC12 कोशिकाओं [26] का उपयोग करते हुए न्यूरोनल डेथ के एक मॉडल को नियोजित किया। हमने प्रदर्शित किया कि PhGs ने Kelch- जैसे ECH से जुड़े प्रोटीन 1 (Keap1) से जुड़कर Nrf2 / ARE पाथवे को सक्रिय कर दिया। इस प्रक्रिया ने एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों को अपग्रेड किया और पीसी 12 कोशिकाओं के प्रतिरोध को ऑक्सीडेटिव तनाव में बढ़ा दिया।

न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों का उपचार:सिस्टैंच से पीएचडी

2. परिणाम

2.1. PhGs ने H2O को दबा दिया2-PC12 कोशिकाओं में प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी

PC12 कोशिकाओं पर H2O2 और PhGs (0.1,1,5, और 10 g/mL) के साइटोटोक्सिक प्रभावों का परीक्षण किया गया। परिणामों से पता चला कि H2O2 ने एकाग्रता-निर्भर और समय-निर्भर शिष्टाचार (चित्रा 1 ए) में पीसी 12 सेल व्यवहार्यता के नुकसान को प्रेरित किया। 2 घंटे के लिए PC12 कोशिकाओं के 200 H2O2 के संपर्क में आने से सेल की व्यवहार्यता 57.4 प्रतिशत हो गई। 0.1,1, 5, और 10 /एमएल पर पीएचजी के साथ कोशिकाओं के प्रीट्रीटमेंट का सेल व्यवहार्यता (चित्रा 1बी) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और एच2ओ से स्पष्ट रूप से संरक्षित पीसी12 कोशिकाओं को सुधार कर क्षति को प्रेरित किया। सेल व्यवहार्यता 9.549-22.141 प्रतिशत, 12.092-25.289 प्रतिशत, 1.470-9.289 प्रतिशत, और 3.411-11.441 प्रतिशत, क्रमशः ( चित्रा 1सी)। हालांकि, सैलिड्रोसाइड (0.1 ^g/mL), आइसोएक्टोसाइड (0.1, 1, 5, और 10 ^g/mL), इचिनाकोसाइड (0.1,1, और 5 ^g/mL) प्रीट्रीटमेंट ने HzOz- प्रेरित सेल पर कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। चोट। PhGs के साथ कोशिकाओं के प्रीट्रीटमेंट ने H2O2 (चित्र 1D) द्वारा प्रेरित रूपात्मक विशेषता को भी संशोधित किया।

आकृति 1।PhGs ने PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को दबा दिया। एमटीटी परख द्वारा सेल व्यवहार्यता का पता लगाया गया था। PC12 कोशिकाओं पर विभिन्न सांद्रता पर H2O2 (A) और PhGs (B) का साइटोटोक्सिक प्रभाव। (सी) PhGs ने सेल व्यवहार्यता में H2O 2- प्रेरित कमी को देखा। PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1, और 10 mg/mL) के साथ इनक्यूबेट किया गया, और फिर 200 pM H2O2 के साथ दूसरे 2 के लिए इनक्यूबेट किया गया। h के बाद PhG को हटा दिया गया। (डी) रूपात्मक अवलोकन। उपचार के बाद कोशिकाओं को एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप (x100), CK: सामान्य समूह, H2O2: H2O2 उपचारित समूह, HL: सालिड्रोसाइड कम खुराक उपचारित समूह, HH: सालिड्रोसाइड उच्च खुराक उपचारित समूह, ML: एक्टोसाइड कम खुराक उपचारित समूह द्वारा देखा गया। एमएच: एक्टियोसाइड हाई डोज ट्रीटेड ग्रुप, आईएल: आइसोएक्टोसाइड लो डोज ट्रीटेड ग्रुप, आईएच: आइसोएक्टेओसाइड हाई डोज ट्रीटेड ग्रुप, एसएल: इचिनाकोसाइड लो डोज ट्रीटेड ग्रुप, एसएच: इचिनाकोसाइड हाई डोज ट्रीटेड ग्रुप। ** पी <0.01 बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" #="" पी=""><0.05, बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह;="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="">

2.2. PhGs ने H2O को दबा दिया2-PC12 कोशिकाओं में ROS, लिपिड पेरोक्सीडेशन (MDA), और बढ़ी हुई सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (SOD) गतिविधियों के प्रेरित इंट्रासेल्युलर संचय

2 घंटे के लिए PC12 कोशिकाओं का 200 pM H2O2 तक एक्सपोजर ROS स्तर, MDA सामग्री में वृद्धि, और SOD गतिविधि में कमी (चित्र 2)। PhGs प्रीट्रीटमेंट ने ROS स्तर, सालिड्रोसाइड और एक्टोसाइड को क्षीण कर दिया, और आइसोएक्टोसाइड और इचिनाकोसाइड प्रीट्रीटमेंट की उच्च खुराक ने ROS स्तर (p <0.01) को="" महत्वपूर्ण="" रूप="" से="" क्षीण="" कर="" दिया।="" सालिड्रोसाइड="" प्रीट्रीटमेंट="" ने="" एमडीए="" सामग्री="" पर="" कोई="" प्रभाव="" नहीं="" दिखाया,="" लेकिन="" एक्टोसाइड="" प्रीट्रीटमेंट="" ने="" एमडीए="" सामग्री="" को="" काफी="" हद="" तक="" कम="" कर="" दिया="" (पी=""><0.05)। आइसोएक्टोसाइड="" और="" इचिनाकोसाइड="" प्रीट्रीटमेंट="" ने="" एमडीए="" सामग्री="" को="" काफी="" हद="" तक="" कम="" कर="">

चित्र 2।PhGs ने ROS और MDA संचय को अवरुद्ध कर दिया और PC12 कोशिकाओं में SOD की गतिविधियों को बढ़ा दिया। PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1, और 10 4g/mL) के साथ इनक्यूबेट किया गया, और फिर 200 |^M H2O2 के साथ दूसरे के लिए इनक्यूबेट किया गया। 2 घंटे बाद PhG को हटा दिया गया। (ए) पीएचजी ने आरओएस और एमडीए संचय को अवरुद्ध कर दिया। (बी) पीएचजी ने एमडीए संचय को अवरुद्ध कर दिया। (सी) पीएचजी ने एसओडी की गतिविधियों में वृद्धि की। CK: सामान्य समूह, मॉडल: H2O2 उपचारित समूह, सालिड्रोसाइड: सालिड्रोसाइड उपचारित समूह, एक्टोसाइड: एक्टोसाइड उपचारित समूह, आइसोएक्टोसाइड: आइसोएक्टोसाइड उपचारित समूह, इचिनाकोसाइड: इचिनाकोसाइड उपचारित समूह। ** पी < 0.01="" बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" #="" p=""><0.05, बनाम="" h2o2="" उपचारित="" समूह,="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="">

2.3.PhGs उलट H2O2-PC12 कोशिकाओं में प्रेरित अपोप्टोसिस

2 घंटे के लिए H2O2 उपचार (200 |1M) PC12 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को काफी बढ़ा देता है, जिसकी कुल एपोप्टोटिक दर 16.02 प्रतिशत (चित्र 3) तक है। हालांकि, 24 घंटे के लिए पीएचजी (0.1 और 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ दिखावा करने से एकाग्रता-निर्भर तरीके से एपोप्टोसिस दर में कमी आई (पी <0.01)। सालिड्रोसाइड,="" एक्टियोसाइड,="" आइसोएक्टोसाइड,="" और="" इचिनाकोसाइड="" ने="" सेल="" एपोप्टोसिस="" के="" प्रतिशत="" में="" 4.750-6.627="" प्रतिशत,="" 4.413-5.800="" प्रतिशत,="" 6.593-10.047="" प्रतिशत,="" और="" 1.530-7.510="" प्रतिशत,="">

चित्र तीन. PhGs ने PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित एपोप्टोसिस को उलट दिया। PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1, और 10 /g/mL) के साथ इनक्यूबेट किया गया, और फिर 2 0 0 pM H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। पीएचडी हटा दी गई। फिर, एपोप्टोसिस को पीआई / एफआईटीसी फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया। CK: सामान्य समूह, मॉडल: H2O2 उपचारित समूह, सालिड्रोसाइड: सालिड्रोसाइड उपचारित समूह, एक्टोसाइड: एक्टोसाइड उपचारित समूह, आइसोएक्टोसाइड: आइसोएक्टोसाइड उपचारित समूह, इचिनाकोसाइड: इचिनाकोसाइड उपचारित समूह। ** पी <0.01 बनाम="" अनुपचारित="" समूह;="" ##="" p=""><0.01, बनाम="" h2o2="" उपचारित="">

2.4. PhGs उलट H2O2-HO के प्रोटीन एक्सप्रेशन का प्रेरित डाउनरेगुलेशन-1, NQO1, GCLC, और GCLM

HO {0}}, NQO1, और ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगेज (GCL) महत्वपूर्ण सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम हैं, और HO -1, NQO1, और GCL (GCLC या GCLM) के उत्प्रेरक या संशोधित सबयूनिट हैं। Nrf2-नियंत्रक डाउनस्ट्रीम जीन [27]। उपचार के बाद HO -1, NQO1, GCLC, और GCLM की प्रोटीन अभिव्यक्ति देखी गई। H2O2 के साथ या बिना H2O2 (चित्र 6A-C) (p <0.01) के="" ho-1="" और="" nqo1="" की="" प्रोटीन="" अभिव्यक्ति="" के="" बीच="" एक="" स्पष्ट="" अंतर="" पाया="" गया।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" p^g/ml)="" ने="" h2o="" को="" उलट="" दिया2-ho-1="" के="" प्रोटीन="" एक्सप्रेशन="" के="" डाउनरेगुलेशन="" को="" प्रेरित="" किया="" ({{32}="" पर="" सैलिड्रोसाइड="" को="" छोड़कर)="" }.1="" पीजी/एमएल),="" एनक्यूओ1="" (एक्टोसाइड="" को="" छोड़कर="" 0.1="" पीजी/एमएल)="" (पी="">< {{40}}.01)।="" h2o2="" ने="" gclc="" और="" gclm="" प्रोटीन="" अभिव्यक्ति="" (p=""><0.05) (चित्र="" 6a,d,e)="" को="" भी="" डाउनग्रेड="" किया।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" pg/ml)="" उलट="" h2o2-="" gclc="" के="" प्रोटीन="" एक्सप्रेशन="" के="" डाउनरेगुलेशन="" को="" प्रेरित="" करते="" हैं="" (0.1="" pg/ml="" पर="" इचिनाकोसाइड="" को="" छोड़कर)="" (p=""><0.01) और="" gclm="" (0.1="" स्नातकोत्तर/एमएल="" पर="" सैलिड्रोसाइड="" को="" छोड़कर)="" (पी=""><0.01) ।="" फिर,="" एच="" ओ="" -1="" के="" लिए="" रासायनिक="" अवरोधकों="" का="" उपयोग="" एच="" 2="" ओ="" 2-="" प्रेरित="" साइटोटोक्सिसिटी="" के="" खिलाफ="" पीएचजी="" के="" संरक्षण="" को="" विनियमित="" करने="" में="" एंटीऑक्सिडेंट="" एंजाइमों="" की="" भूमिकाओं="" का="" मूल्यांकन="" करने="" के="" लिए="" किया="" गया="" था।="" phgs="" (0.1="" और="" 10="" pg/ml)="" ने="" h2o="" 2-="" प्रेरित="" साइटोटोक्सिसिटी="" को="" रोका,="" लेकिन="" इस="" तरह="" के="" सुरक्षात्मक="" प्रभाव="" को="" ho="" -1="" अवरोधक="" znpp="" (p=""><0.01) द्वारा="" 20="" pm="" (चित्र="" 6f,="" p=""><0.01) पर="" उलट="" दिया="" गया।="">

2.5. Keap1 अभिव्यक्ति और आणविक डॉकिंग विश्लेषण

शारीरिक स्थितियों के तहत, Keap1 Nrf2 के Neh2 डोमेन से जुड़कर Nrf2 के एक दमनकारी प्रोटीन के रूप में कार्य करता है और Nrf2 को एक Cul 3- पर आधारित E3 ubiquitin ligase को ubiquitination और 26S प्रोटीसम [28] द्वारा बाद में गिरावट के लिए लक्षित करता है। PhGs के Keap1 के लिए बाध्यकारी क्षमता का मूल्यांकन आणविक डॉकिंग विश्लेषण द्वारा उनके एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव के तहत तंत्र की जांच के लिए किया गया था।

एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव: सिस्टांचेपीएचजी

3. चर्चा

हमने PC12 कोशिकाओं में H2O2 प्रेरित-साइटोटॉक्सिसिटी पर PhGs के न्यूरोप्रोटेक्शन की जांच की। परिणाम बताते हैं कि PhGs ढोंग ने HzOz- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को काफी हद तक दबा दिया, इंट्रासेल्युलर ROS स्तर को देखा, इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों के स्तर में सुधार किया, और अंततः PC12 कोशिकाओं में H2O 2- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को उलट दिया। इसके अलावा, PhGs ने Nrf2 के ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण को बढ़ा दिया, HO -1, NQO1, GCLC, और GCLM की प्रोटीन अभिव्यक्ति के HzOz- प्रेरित डाउनरेगुलेशन को उलट दिया। इसके अलावा, PhGs ने Keap1 प्रोटीन में Nrf2 बाइंडिंग साइट के साथ संभावित इंटरैक्शन दिखाया।

H2O2- प्रेरित PC12 सेल की चोट में, लिपिड पेरोक्सीडेशन, जो लिपिड के ऑक्सीडेटिव क्षरण को संदर्भित करता है, झिल्ली की पारगम्यता में वृद्धि करता है, जिससे कोशिका क्षति होती है [29]। एमडीए गठन व्यापक रूप से लिपिड पेरोक्सीडेशन [30] के सूचकांक के रूप में उपयोग किया जाता है। H2O2 ने ROS उत्पादन को बढ़ाया और SOD, केटेलेस और GPx जैसे एंटीऑक्सीडेंट रक्षा एंजाइमों को समाप्त कर दिया। यह प्रक्रिया ऑक्सीडेटिव तनाव [31] की ओर ले जाती है, जो अधिकांश न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के कारण और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पिछले अध्ययनों अनुरूप, हमने H2O2 उपचार के बाद ROS के बढ़े हुए स्तर, इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों को कम किया और PC12 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को बढ़ाया। PhGs प्रीट्रीटमेंट ने इंट्रासेल्युलर ROS में HzOz- प्रेरित वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से देखा, इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों में सुधार किया, और अंततः PC12 कोशिकाओं में HzOz- प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी को उलट दिया।

कुआंग एट अल। [32] ने बताया कि इचिनाकोसाइड ने माइटोकॉन्ड्रियल एपोप्टोटिक मार्ग के माध्यम से पीसी12 कोशिकाओं में एच2ओ2-प्रेरित साइटोटोक्सिसिटी पर एक महत्वपूर्ण न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया। इस अध्ययन में, हमने पाया कि इचिनाकोसाइड, सालिड्रोसाइड, एक्टोसाइड, और आइसोएक्टोसाइड ने PC12 कोशिकाओं की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को बढ़ाकर न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया क्योंकि उन्होंने Nrf2 की ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियता को बढ़ाया और HO-1, NQO1 की डाउनस्ट्रीम प्रोटीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड किया। जीसीएलसी, और जीसीएलएम। कई अध्ययनों ने स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया है कि एनआरएफ 2 लक्ष्य जीन की सक्रियता, विशेष रूप से एचओ -1, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में सूजन, ऑक्सीडेटिव क्षति और कोशिका मृत्यु से दृढ़ता से रक्षा करती है। एचओ -1 प्रणाली को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में बहुत सक्रिय बताया गया है, और इसका मॉड्यूलेशन स्पष्ट रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [33]। हाल के अध्ययनों ने AD [34] में Nrf2 के पुनर्सक्रियन के लिए एक कुशल लक्ष्य के रूप में PD [9] और Keap1 की प्रगति और जोखिम में Nrf2 की भूमिका को भी स्पष्ट किया है। परिणाम न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में Nrf2 के लिए नए साक्ष्य का समर्थन करते हैं।

आणविक डॉकिंग विश्लेषण से पता चला है कि PhGs निम्नलिखित बाध्यकारी क्षमताओं के साथ Keap1 से जुड़ सकते हैं: इचिनाकोसाइड> आइसोएक्टोसाइड> एक्टियोसाइड> सालिड्रोसाइड। इन परिणामों के अनुरूप, PhGs दिखावा ने Nrf2 परमाणु अनुवाद का नेतृत्व किया, नाभिक में निम्नलिखित Nrf2 अभिव्यक्ति के साथ: इचिनाकोसाइड> आइसोएक्टोसाइड * एक्टोसाइड> सालिड्रोसाइड। हमने माना कि ग्लाइकोसाइड्स की संख्या ने PhGs और Keap1 के संभावित बाइंडिंग मोड को प्रभावित किया है, और बाइंडिंग मोड ने आगे Keap1 से Nrf2 की रिहाई का कारण बना। इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप Nrf2 और डाउनस्ट्रीम जीन की सक्रियता हुई और अंततः PC12 कोशिकाओं को H2 O 2 - प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है।

सिस्टैंच के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावपीएचजी

4. सामग्री और तरीके

4.1. रासायनिक यौगिक और अभिकर्मक

सालिड्रोसाइड (सीएएस नंबर {{0}}), एक्टियोसाइड (सीएएस नंबर 61276-17-3), आइसोएक्टोसाइड (सीएएस नंबर 61303-13-7), और इचिनाकोसाइड (सीएएस नंबर {{3} }) YYuanye बायोटेक्नोलॉजी कंपनी (शंघाई, चीन) से खरीदे गए थे। पीएचजी को पीबीएस में भंग कर 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार किया गया था, जिसे -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। H2O2 को अलादीन® (शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। RPMI -1640 मध्यम और भ्रूण गोजातीय सीरम Hyclone (लोगान, UT, USA) से खरीदे गए थे, और 0.5 प्रतिशत ट्रिप्सिन EDTA, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन Keyi (हांग्जो, चीन) से खरीदे गए थे। एमडीए, एसओडी डायग्नोस्टिक किट, एमटीटी, और डीसीएफएच-डीए बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (नानजिंग, जिआंगसु, चीन) से खरीदे गए थे। एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई डबल स्टेनिंग किट सोलरबायो लाइफ साइंसेज (बीजिंग, चीन) से खरीदी गई थी। Nrf2, Histone H3, Keap1, HO -1, NQO1, GCLC, GCLM, और p-actin, एंटी-माउस-हॉर्सरैडिश पेरोक्साइड (HRP) IgG, और एंटी-खरगोश-HRP-IgG के एंटीबॉडी Abcam से खरीदे गए थे। (लंदन, यूके)। एच ओ -1 और जेडएनपीपी के अवरोधक सिग्मा केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदे गए थे। RNAiso Plus, GDNA इरेज़र के साथ प्राइमस्क्रिप्ट ™ RT अभिकर्मक किट, और SYBR® Premix Ex Taq ™ II तकरा (शिगा, जापान) से खरीदे गए थे। Lipofectamine® RNAiMAX अभिकर्मक अभिकर्मक थर्मो फिशर साइंटिफिक (वॉलथम, यूके) से खरीदा गया था। Nrf2 siRNA अनुक्रम इस प्रकार थे: आगे, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; और उल्टा, UUAAGACACUGUAAUUCGG। इस बीच, नियंत्रण siRNA अनुक्रम इस प्रकार थे: आगे, UUCUCCGAACGUGUCACGU; और उल्टा, ACGUGACACGUUCGGAGAA।

4.2. कोश पालन

माउस अधिवृक्क फियोक्रोमोसाइटोमा लाइन (PC12 कोशिकाएं) जैव रसायन और कोशिका जीव विज्ञान संस्थान, SIBS, (CAS, शंघाई, चीन) से प्राप्त की गई थी। कोशिकाओं को RPMI -1640 (Hyclone) में बनाए रखा गया था जिसमें 1 0 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (Hyclone), 100 U/mL पेनिसिलिन, और 0.1 mg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 के साथ था। माध्यम हर दूसरे दिन बदला गया था।

4.3. सेल व्यवहार्यता परख

PC12 कोशिकाओं को 2 x 104 कोशिकाओं/वेल पर 96-वेल प्लेट्स में वरीयता दी गई थी। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए अवरोधक के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया, 24 घंटे के लिए PhGs के साथ या बिना इनक्यूबेट किया गया, और फिर PhG को हटा दिए जाने के बाद H2O2 के साथ एक और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 5 मिलीग्राम / एमएल एमटीटी के साथ 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इलाज किया गया था, और मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दिया गया था। जीवित कोशिकाओं द्वारा बनाए गए फॉर्मेज़ान क्रिस्टल को नीला रंग [35] उत्पन्न करने के लिए डीएमएसओ के 150 आरएल में भंग कर दिया गया था, और एक प्लेट रीडर पर अवशोषण को 570 एनएम पर मापा गया था। नियंत्रणों ने अकेले डीएमएसओ के साथ माध्यम की समान सांद्रता का उपयोग किया। सेल व्यवहार्यता को नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में सामान्यीकृत किया गया था।

PhGs की सांद्रता (0.1,1,5, और 10 Rg/mL) को PhGs के साइटोटोक्सिसिटी विश्लेषण और इचिनाकोसाइड [32] के रिपोर्ट किए गए साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव के आधार पर चुना गया था। रिपोर्ट के अनुसार, 10 Rg/mL से नीचे कोई साइटोटोक्सिसिटी प्रभाव नहीं दिखाया गया था, और इचिनाकोसाइड को HzOz-घायल सेल मॉडल में साइटोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाने के लिए सूचित किया गया था।

4.4. एपोप्टोसिस परख

एपोप्टोसिस का पता एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई डबल स्टेनिंग किट (सोलरबायो) से लगाया गया था। PC12 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट्स में 2 x 105 सेल्स/वेल में सीड किया गया। लगाव के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए PhGs (0.1 और 10 Rg / mL) के साथ इलाज किया गया और PhG को हटा दिए जाने के बाद एक और 2 घंटे के लिए H2O2 के साथ ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस में धोया गया, 10 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर दो बार सेंट्रीफ्यूज किया गया, और बाध्यकारी बफर के 500 आरएल में फिर से जोड़ा गया। एफआईटीसी-लेबल एनेक्सिन वी (5 आरएल) और प्रोपीडियम आयोडाइड।

लघुरूप

जीसीएलसी ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगेज-कैटेलिटिक सबयूनिट

जीसीएलएम ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगेज-कैटेलिटिक संशोधक सबयूनिट

H2O2 हाइड्रोजन पेरोक्साइड

HO-1 हीम ऑक्सीजनेज़ 1

Keap1 केल्च ईसीएच एसोसिएशन प्रोटीन

NQO1 NAD(P)H क्विनोन ऑक्सीडोरक्टेज 1

Nrf2 परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक 2

PhGs सालिड्रोसाइड, एक्टोसाइड, आइसोएक्टोसाइड, और इचिनाकोसाइड

आरओएस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां

ZnPP जिंक प्रोटोपोर्फिरिन

सिस्टैंच डेजर्टिकोला अर्क: सिस्टैंच का पीएचजी

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© 2018 लेखकों द्वारा। लाइसेंसधारी एमडीपीआई, बेसल, स्विट्ज़रलैंड। यह लेख क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (CC BY) लाइसेंस (http:ZZcreativecommons.org/licenses/byZ4.0Z) के नियमों और शर्तों के तहत वितरित एक ओपन-एक्सेस लेख है।