Nlrc3 नॉकआउट चूहों ने HTNV संक्रमण के बाद गुर्दे के रोग संबंधी परिवर्तन दिखाए

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हंतान वायरस (HTNV) मनुष्यों को संक्रमित करता है और रक्तस्रावी बुखार का कारण बनता हैगुर्देसिंड्रोम(एचएफआरएस)। एचएफआरएस के अच्छी तरह से चित्रित पशु मॉडल का विकास वैक्सीन उम्मीदवारों और चिकित्सीय एजेंटों के परीक्षण में तेजी ला सकता है और एचएफआरएस के रोगजनन के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है। क्योंकि NLRC3 में कई इम्युनोरेगुलेटरी भूमिकाएँ हैं, हमने HFRS का एक नया मॉडल स्थापित करने के लिए Nlrc3 - / - चूहों की HTNV संक्रमण की संवेदनशीलता की जांच की। Nlrc3 - / - चूहों ने वजन घटाने का विकास किया,गुर्दे का रक्तस्राव,और एचटीएनवी संक्रमण के बाद ट्यूबल फैलाव, मानव एचएफआरएस के कई नैदानिक ​​लक्षणों का पुनर्पूंजीकरण। इसके अलावा, संक्रमित Nlrc3 - / - चूहों ने जंगली प्रकार के C57BL / 6 (WT) चूहों की तुलना में सीरम, प्लीहा और गुर्दे में अधिक वायरल लोड दिखाया, और उनमें से कुछ ने WT चूहों की तुलना में कई अंगों के भीतर अधिक हेमटोलॉजिकल विकार और महत्वपूर्ण रोग परिवर्तन प्रकट किए। हमारे परिणामों से पता चलता है कि HTNV संक्रमित Nlrc3 - / - चूहे नैदानिक ​​​​लक्षण और रोग परिवर्तन विकसित कर सकते हैं, जो HFRS के रोगियों से मिलते-जुलते हैं, जो उम्मीदवार के टीकों और चिकित्सीय के रोगजनन और परीक्षण के अध्ययन के लिए एक नए मॉडल का सुझाव देते हैं।

कीवर्ड:HFRS, HTNV, NLRC3, वृक्क रक्तस्राव, वृक्क नलिका फैलाव

परिचय

रक्तस्रावी बुखार के साथगुर्देसिंड्रोम (एचएफआरएस) कृन्तकों से मनुष्यों में हंतावायरस के जूनोटिक संचरण के बाद तीव्र अंतरालीय नेफ्रोपैथी प्रस्तुत करता है। यह रोग मुख्य रूप से एशिया और यूरोप (1, 2) में होता है। एचएफआरएस पैदा करने वाले सबसे प्रचलित रोगजनक डोबरावा वायरस (डीओबीवी), पुमाला वायरस (पीयूयूवी), सियोल वायरस (एसईओवी), और हंता वायरस (एचटीएनवी) हैं, जिनमें से प्रत्येक एचएफआरएस की अलग गंभीरता का कारण बनता है। रोग की विशेषताएं उत्तर और दक्षिण अमेरिका में भिन्न हैं, जहां हंटावायरस संक्रमण मुख्य रूप से एंडीज वायरस (ANDV) और सिन नोम्ब्रे वायरस (एसएनवी) (3) द्वारा हेंतावायरस पल्मोनरी सिंड्रोम (HPS) का कारण बनता है।

एचएफआरएस तेज बुखार, हाइपोटेंशन की विशेषताओं के साथ होता है,गुर्दे की विफलता, और रक्तस्राव(4). इसे पांच नैदानिक ​​चरणों में विभाजित किया जा सकता है: ज्वर, हाइपोटेंसिव शॉक, ओलिगुरिक, मूत्रवर्धक, और दीक्षांत। एचटीएनवी संक्रमण का एक तीव्र प्रकरण एचएफआरएस की ओर जाता है, अक्सर थ्रोम्बोसाइटोपेनिया, ल्यूकोसाइटोसिस, एनीमिया, ऊंचा सीरम क्रिएटिनिन और यकृत एंजाइम (5) के साथ होता है। इन नैदानिक ​​लक्षणों और संकेतों को आंशिक रूप से इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि एचटीएनवी मुख्य रूप से गुर्दे पर हमला करता है और तीव्र ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल नेफ्रैटिस द्वारा विशेषता गुर्दे की चोट को प्रेरित करता है जिसमें सूजन कोशिकाओं (6) की घुसपैठ शामिल होती है, जिसके परिणामस्वरूप कई अन्य अंग पीड़ित होते हैं (7)

कृंतक हंटावायरस के लिए प्राकृतिक जलाशय हैं जो बिना बीमारी के जानवरों को लगातार संक्रमित करते हैं (8)। उनका मलमूत्र, जैसे लार, मूत्र और मल, संभावित संदूषक बन जाते हैं जो मनुष्यों को संक्रमित कर सकते हैं जो दूषित मल के छोटे कण एरोसोल को अंदर लेते हैं। Hantaviruses आमतौर पर वयस्क BALB/c और C57BL/6 चूहों (9) में स्पर्शोन्मुख संक्रमण का कारण बनते हैं, लेकिन घातक स्नायविक रोग या चूसने वाले और नवजात चूहों (10, 11) में लगातार संक्रमण। यद्यपि नेफ्रोपैथिक असामान्यताएं प्रयोगात्मक रूप से PUUV संक्रमित सिनोमोलगस मैकाक (Macaca fascicularis) में प्रदर्शित की गई थीं, इन जानवरों ने HFRS (12) के एक हल्के मामले के समान, केवल हल्के प्रोटीनमेह, प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ और ट्यूबलर क्षति गुर्दे को दिखाया। इसके अलावा, नाक मार्ग के माध्यम से HTNV से संक्रमित हैम्स्टर्स ने लगातार स्पर्शोन्मुख संक्रमण का नेतृत्व किया, जो छिटपुट विरेमिया द्वारा विशेषता है, लेकिन फेफड़ों, मस्तिष्क और गुर्दे में वायरल जीनोम प्रतियों के उच्च स्तर हैं। मांसपेशी इंजेक्शन के माध्यम से उच्च खुराक एचटीएनवी से संक्रमित फेरेट्स ने शरीर के वजन में क्रमिक कमी (5-12 समय के साथ प्रतिशत) दिखाया, लेकिन बरकरारगुर्दे के कार्य,विरेमिया की अनुपस्थिति, और अंगों में वायरस के संचरण की कमी। मार्मोसेट्स में, एचटीएनवी के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन ने उच्च स्तर के सेरोकोनवर्जन और तटस्थ एंटीबॉडी के उत्पादन का नेतृत्व किया; लगातार, इन जानवरों के अंगों में कोई गुर्दा क्षति, विरेमिया या वायरस संचरण नहीं था (13)।

उनकी अपूर्णता के बावजूद, चूहों और चूहों का उपयोग करने वाले पशु मॉडल को हंटवायरस रोगजनन (14) का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया था। योशिमात्सु एट अल। ने दिखाया कि एचटीएनवी के साथ एससीआईडी ​​​​चूहों के संक्रमण ने फुफ्फुसीय एडिमा (15, 16) के साथ घातक बर्बादी की बीमारी का कारण बना, और न्यूट्रोफिल की कमी ने फुफ्फुसीय एडिमा के विकास को रोक दिया, लेकिन एचएफआरएस के कोई विशेष रक्तस्रावी घाव नहीं पाए गए (15)। शिमिज़ु एट अल। पाया गया कि HFRS रोगियों से पृथक HTNV 6-सप्ताह की मादा BALB/c चूहों को अंतःशिरा से संक्रमित कर सकता है, जिससे 6-9 दिनों के लिए विरेमिया हो सकता है, जिसमें अस्थायी वजन घटाने, बालों की झुर्रियाँ, गुर्दे का बाहर निकलना (17) सहित रोग के लक्षण दिखाई दे सकते हैं। ) उसी माउस मॉडल में, के बीच की सीमा में मैक्रोस्कोपिक रक्तस्राव थावृक्क छालऔर मज्जा, लेकिन क्या देखे गए हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन कम गुर्दा समारोह से जुड़े थे, इसकी जांच नहीं की गई थी। मानवकृत चूहों में, HTNV संक्रमण वजन घटाने, गतिविधि में कमी, झालरदार फर और फेफड़ों की चोट की ओर जाता है, जो लगता है कि वायरल संक्रमण (18) के लिए फेफड़े मुख्य लक्ष्य अंग हैं। इसलिए, एचटीएनवी संक्रमण का एक उपयुक्त पशु मॉडल जो एचएफआरएस की अधिकांश रोग विशेषताओं को पकड़ता है, अभी भी आवश्यक है।

सिस्टैंच समीक्षाके लियेवृक्क नलिका का फैलाव

एनएलआर इंट्रासेल्युलर जन्मजात प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स के सबसे प्रमुख परिवार हैं और जन्मजात प्रतिरक्षा को विनियमित करने में भिन्न कार्य करते हैं। यद्यपि सबसे प्रसिद्ध एनएलआर (जैसे, एनएलआरपी 3) सूजन और प्रतिरक्षा सक्रियण में सकारात्मक नियामक कार्य प्रदर्शित करते हैं, एनएलआर का एक असामान्य उप-समूह, जिसे निरोधात्मक एनएलआर के रूप में परिभाषित किया गया है, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में निरोधात्मक कार्य प्रदर्शित करता है। एनएलआर-मध्यस्थता वाले जन्मजात प्रतिरक्षा दमन के तंत्र को समझने के लिए, एनएलआरसी3 और एनएलआरएक्स1 जैसे निरोधात्मक एनएलआर के लिगेंड्स की जांच की गई है (19)। NLRC3 एक नकारात्मक नियामक है जो इंटरफेरॉन जीन (STING) सक्रियण (19) के उत्तेजक और क्षीणन द्वारा टाइप I इंटरफेरॉन (IFN-I) प्रतिक्रिया को क्षीण करता है। NLRX1, माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान और प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया के बीच एक केंद्रीय होमोस्टैटिक द्वारपाल के रूप में, रोग की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया गया है, दोनों रोगज़नक़-चालित और अन्यथा (20)। क्योंकि HTNV रोग सूजन और प्रतिरक्षा सक्रियण की बहुत अधिक विकृति को प्रकट करता है, हमने रोग के आणविक तंत्र की जांच के लिए Nlrc3-/- चूहों को चुना।

इस अध्ययन से पता चला है कि Nlrc3 - / - चूहों का मॉडल एचएफआरएस के रोगियों में देखी गई व्यवस्थित चोट जैसा दिखता है, जिसमें थ्रोम्बोसाइटोपेनिया की विशेषता होती है,गुर्दे की नलिका का फैलाव, और रक्तस्राव।वायरल बोझ विश्लेषण से पता चला कि Nlrc3 - / - चूहों ने सीरम, प्लीहा और गुर्दे सहित कई ऊतकों में उच्च वायरल भार प्रस्तुत किया। हमारे अध्ययन उम्मीदवार टीकों और चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए उपयोगी एचटीएनवी संक्रमण के लिए एक माउस मॉडल स्थापित करते हैं।

विधि

वीवायरस स्टॉक

HTNV स्ट्रेन {0}} को चांगशॉ हैंग (चाइनीज सेंटर फॉर डिजीज कंट्रोल एंड प्रिवेंशन) द्वारा दान किया गया और फिर हमारी प्रयोगशाला में संरक्षित और विस्तारित किया गया। वेरो E6 कोशिकाओं का उपयोग वायरस के प्रसार के लिए किया गया था, और संक्रामक टाइटर्स को इम्यूनोफ्लोरेसेंस एसेज़ (IFAs) द्वारा 50 प्रतिशत टिशू कल्चर संक्रामक खुराक (TCID50) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। TCID50 और पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (PSU) के बीच रूपांतरण निम्नलिखित गणना पर आधारित था: 1 PFUs 0.7×TCID50 (21)।

Nlrc3 नॉकआउट माउस मॉडल की पीढ़ी

जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों और Nlrc3 नॉकआउट (Nlrc3 - / -) माउस मॉडल को शंघाई मॉडल ऑर्गेनिज्म सेंटर, इंक (शंघाई, चीन) द्वारा डिजाइन और विकसित किया गया था। Nlrc3 - / - माउस प्राप्त करने के लिए, Cas9 mRNA, और sgRNAs इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा तैयार किए गए थे। Nlrc3 जीन के एक्सॉन 2-3 को हटाने के लिए लक्षित दो sgRNAs: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'। C57BL/6J चूहों के जाइगोट्स प्राप्त किए गए और इन विट्रो ट्रांसक्राइब्ड Cas9 mRNA और sgRNAs के साथ इंजेक्ट किया गया और स्यूडोप्रेग्नेंट प्राप्तकर्ताओं को स्थानांतरित किया गया। प्राप्त F0 चूहों के जीनोटाइप की पहचान और पुष्टि पीसीआर द्वारा की गई और प्राइमर जोड़े का उपयोग करके अनुक्रमण किया गया: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; आर-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'। C57BL/6J चूहों के साथ पार करके, सकारात्मक F0 चूहों को F1 विषमयुग्मजी Nlrc3 नॉकआउट चूहों को प्राप्त करने के लिए चुना गया था। पीसीआर और अनुक्रमण विश्लेषण ने प्राप्त एफ 1 चूहों को मान्य किया। विषमयुग्मजी Nlrc3 - / - चूहों को प्राप्त करने के लिए, मादा और नर F1 विषमयुग्मजी चूहों को बेतरतीब ढंग से परस्पर जोड़ा गया। सभी अध्ययनों के लिए चूहे 6-8 सप्ताह की आयु के थे।

पशु संक्रमण और नमूने तैयार करना

मीडिया के 50 उल में HTNV के कुल 5×105 पीएफयू को इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से टीका लगाया गया था। नियंत्रण समूहों में चूहों को समान मात्रा में पीबीएस प्राप्त हुआ। पच्चीस से पच्चीस Nlrc3 - / - या WT चूहों का उपयोग किया गया था। प्रत्येक प्रकार के चूहों को संक्रमण के बाद 0, 3, 6, 9 और 12 दिनों के नमूने के लिए पांच समूहों में विभाजित किया गया था। शरीर के वजन और गुदा का तापमान प्रतिदिन दर्ज किया गया। प्रत्येक समय बिंदु पर, दोनों समूहों के चार से पांच जानवरों को परीक्षण के लिए इच्छामृत्यु दी गई। वायरोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, हृदय, यकृत, प्लीहा, फेफड़े, गुर्दे और मस्तिष्क से ताजा ऊतक के नमूने एकत्र किए गए और फिर -80 डिग्री पर तुरंत जमे। चूहे को ठंडे पीबीएस के साथ सुगंधित किया गया था, और अंगों को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में 4 घंटे के लिए हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए तय किया गया था। वायरल लोड परीक्षण और रक्त नियमित जांच के लिए रक्त का नमूना एकत्र किया गया था, और जैव रसायन विश्लेषण के लिए सीरम को अलग किया गया था।

साइटोकाइन परख

निर्माता के निर्देशों के अनुसार LEGENDplex™ माउस एंटी-वायरस रिस्पांस पैनल (13-plex) (BioLegend) के साथ 13 अलग-अलग साइटोकिन्स के लिए प्रत्येक माउस से कुल 25 एमएल सीरम की परख की गई। एफएसीएस कैलीबुर साइटोमीटर (बेक्टन डिकिंसन बायोसाइंसेज, सीए) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डेटा का विश्लेषण LEGENDplex v8.0 द्वारा किया गया था। सॉफ़्टवेयर।

रीयल-टाइम आरटी-पीसीआर परख

प्रत्येक माउस से ऊतक के नमूनों को तौला गया और पीबीएस में डुबोया गया और फ़्रीक्वेंसी 3 0 / s और टाइम 5 मिनट का उपयोग करके एक स्वचालित होमोजेनाइज़र-टिशूलाइज़र II (QIAGEN, जर्मनी) द्वारा समरूप बनाया गया। कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए, 2 0 0 एमएल ऊतक समरूपों को 5 0 0 एमएल टीआरआईज़ोल अभिकर्मक में स्थानांतरित किया गया, इसके बाद क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और आइसोप्रोपेनॉल वर्षा हुई। QIAamp वायरल आरएनए मिनी किट (क्यूजेन, यूके) का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के लिए 140 एमएल सीरम नमूनों को 560 एमएल एवीएल बफर में वाहक आरएनए (क्यूजेन, यूके) में स्थानांतरित किया गया था। अंत में, आरएनए को RNase मुक्त पानी में फिर से भंग कर दिया गया। प्रत्येक नमूने से वायरल आरएनए का पता लगाने के लिए एक एचटीएनवी विशिष्ट रीयल-टाइम आरटी-पीसीआर परख की गई। HTNV के सेगमेंट के लिए विशिष्ट रूप से लक्षित प्राइमर अनुक्रम निम्नानुसार अपनाया गया था: F-5'- GATCAGTACAGTCTAGTCA- 3' और R-5'- TGATTCTTCCACCATTTGT-3'। क्यूआरटी-पीसीआर परख के लिए वन-स्टेप टीबी ग्रीन प्राइमस्क्रिप्ट ™ आरटी-पीसीआर किट II (परफेक्ट रियल टाइम) (तकरा, जापान) का उपयोग किया गया था। फाइनल मास्टर मिक्स (20mL) में 2 mL RNA, 5.6 mL RNase फ्री dH2O, 0.8mL फ़ॉरवर्डिंग और रिवर्स प्राइमर (10 mM), 0.8 mL प्राइमस्क्रिप्ट 1 स्टेप एंजाइम मिक्स 2, और 10 mL ऑफ़ 2 × वन स्टेप शामिल थे। टीबी ग्रीन आरटी-पीसीआर बफर 4. इस्तेमाल की जाने वाली साइकिलिंग की स्थिति 5 मिनट के लिए 42 डिग्री, 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री, फिर 0 सेकंड के लिए 95 डिग्री के 40 चक्र, 15 सेकंड के लिए 65 डिग्री और 0 सेकंड के लिए 95 डिग्री थी। लाइटकाइकलर प्लेटफॉर्म (रोश डायग्नोस्टिक्स, यूएसए) पर प्रतिक्रियाओं को चलाया और विश्लेषण किया गया।

वायरल लोड का पूर्ण परिमाणीकरण

वायरल आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स आरएनए मानक के रूप में MAXIscript किट (थर्मो साइंटिफिक, यूके) का उपयोग करके डीएनए से इन-विट्रो-ट्रांसक्रिप्शन द्वारा प्राप्त किया गया था, जिसमें परख (22) द्वारा लक्षित एचटीएनवी आरएनए के 562 बेस शामिल थे, और फिर एक अल्ट्रामाइक्रो माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा इसकी मात्रा निर्धारित की गई थी। बायोटेक एपोच, यूएसए), मानक आरएनए स्टॉक की सांद्रता 8 0 0 एनजी/एमएल थी। प्रत्येक नमूने में वायरल लोड का आकलन करने के लिए, मानक आरएनए को 10- गुना सीरियल कमजोर पड़ने के साथ तैयार किया गया था, जिसमें प्रति प्रतिक्रिया 1010 प्रतियों से लेकर 103 प्रतियों तक थी। हमारे मानक आरएनए में प्रति प्रतिक्रिया 1010 प्रतियों की 101 प्रतियों की पहचान सीमा है, और इस प्रकार हम प्रति प्रतिक्रिया 100 जीनोम प्रतियों पर इस परख के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित करते हैं। इन-रन विश्लेषण, मानक वक्रों को -3.6624 के ढलान, 41.68 चक्रों के Y-अवरोधन और 0.9996 के R2 मान के साथ स्थापित किया गया था।

पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण

माउस ऊतक के नमूनों से ऊतक lysates तैयार किए गए थे। प्रोटीन सांद्रता का पता लगाने के लिए बाइसीनोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट (थर्मो साइंटिफिक, यूके) का उपयोग किया गया था। प्रोटीन विश्लेषण के लिए, प्रत्येक नमूने से कुल प्रोटीन का 30 मिलीग्राम SDS-polyacrylamide gel पर अपलोड किया गया और NC झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। फिर, कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए अवरुद्ध करने के लिए 5 प्रतिशत स्किम्ड दूध के घोल का उपयोग किया गया। इसके बाद, 1:1000 ने HTNV-NP (हमारी प्रयोगशाला द्वारा तैयार और शुद्ध) के खिलाफ 1A8 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को पतला किया (23, 24) जोड़ा गया और रातोंरात 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। अंत में, झिल्ली को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी, एचआरपी-संयुग्मित खरगोश विरोधी माउस आईजीजी, या एचआरपी-संयुग्मित माउस विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ ऊष्मायन किया गया था। प्रोटीन का पता लगाने के लिए एचआरपी के रसायनयुक्त सब्सट्रेट को तब जोड़ा गया था। इमेज जे सॉफ्टवेयर (एनआईएच, यूएसए) का उपयोग करके प्रोटीन बैंड की तीव्रता का डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। बी-एक्टिन का उपयोग सामान्यीकरण के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परख

ऊतक के नमूने पैराफिन में एम्बेडेड थे और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला के लिए 4 मिमी में कटा हुआ था। अनुभाग अंतर्जात पेरोक्साइड के deparaffinization और पुनर्जलीकरण और निष्क्रियता से गुजरते हैं। अनुभागों को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री पर साइट्रेट बफर (पीएच =6) में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के अधीन किया गया था। फिर, कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए अवरुद्ध करने के लिए 5 प्रतिशत सामान्य बकरी सीरम का उपयोग किया गया था। mAb 1A8 का उपयोग HTNV NP प्रतिजन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में किया गया था और रातोंरात 4 डिग्री पर ऊतक वर्गों के साथ ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर FITC एंटी-माउस IgG (Invitrogen) के साथ धुंधला हो जाना, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए DAPI। 3DHISTECH (हंगरी) का उपयोग छवि अधिग्रहण के लिए और CaseViewer2.4 डेटा विश्लेषण के लिए किया गया था।

ऊतक विज्ञान परीक्षा

कोशिका और ऊतक आकारिकी को संरक्षित करने के लिए, हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए ऊतक के नमूनों को ठीक करने के लिए 4 प्रतिशत तटस्थ बफर फॉर्मेलिन का उपयोग किया गया था। इन ऊतकों को 5 मिमी वर्गों में संसाधित किया गया और फिर हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दिया गया। अंत में, प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्गों की जांच की गई, और छवियों को 3DHISTECH (हंगरी) द्वारा कैप्चर किया गया, जिसका विश्लेषण CaseViewer2.4 द्वारा किया गया। घावों की डिग्री को एक पूर्व-निर्धारित 4- ग्रेड प्रणाली का उपयोग करके नेत्रहीन रूप से स्कोर किया गया था: सामान्य सीमा के भीतर 0 के रूप में, न्यूनतम 1 के रूप में, 2 के रूप में हल्का, 3 के रूप में मध्यम, 4 के रूप में गंभीर।

पशु विषय अध्ययनसभी पशु प्रयोगों को चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय पशु केंद्र की प्रयोगशाला प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। (सं.20210403)।

आंकड़ेग्राफपैड प्रिज्म 9 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, सभी डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया गया। टी-टेस्ट या वन-वे एनोवा का उपयोग आंकड़ा किंवदंतियों में निर्दिष्ट के रूप में किया गया था। 0.05 से कम का P-मान महत्वपूर्ण माना गया।

परिणाम

एनएलआरसी3 के विभिन्न अंगों में वायरल लोड का पता लगाना - / - एचटीएनवी के साथ इंट्रापेरिटोनियल संक्रमण के बाद चूहे

HTNV संक्रमण के लिए Nlrc3 - / - चूहों की संवेदनशीलता को चिह्नित करने के लिए, Nlrc3 - / - चूहों के एक समूह को नियंत्रण के रूप में WT चूहों का उपयोग करते हुए, प्रति माउस HTNV के 5 × 1 0 5 PFU से इंट्रापेरिटोनियल रूप से संक्रमित किया गया था। नैदानिक ​​​​लक्षणों, तापमान और शरीर के वजन में परिवर्तन के लिए सभी जानवरों की प्रतिदिन निगरानी की गई। विभिन्न प्रयोगशाला मापदंडों, वायरल लोड और पैथोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए संक्रमण के बाद (डीपीआई) 3, 6, 9 और 12 दिनों में चूहे की बलि दी गई। Nlrc3 -/− चूहों ने 4 डीपीआई पर अपना वजन कम करना शुरू कर दिया, और 6 डीपीआई तक, वजन घटाने> उनके शुरुआती शरीर के वजन का 5 प्रतिशत दर्ज किया गया। इसकी तुलना में, WT चूहों ने कोई वजन घटाने का प्रदर्शन नहीं किया (चित्र 1क)। दोनों समूहों में कोई बुखार दर्ज नहीं किया गया (चित्र 1बी)। वायरल चुनौती वाले चूहों में HTNV के प्रसार और प्रतिकृति का आकलन करने के लिए, वायरल आरएनए कॉपी नंबरों की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए सीरम और प्रमुख अंगों (हृदय, यकृत, प्लीहा, फेफड़े, गुर्दे और मस्तिष्क सहित) एकत्र किए गए थे। परिणामों से पता चला है कि विरेमिया दोनों समूहों में 3 डीपीआई पर हुआ (एनएलआरसी3 -/- चूहों: 943 ± 140 प्रतियां प्रति एमएल समकक्ष; डब्ल्यूटी चूहों: 803 ± 277 प्रतियां प्रति एमएल)। विशेष रूप से, WT चूहों का सीरम वायरल लोड 3 डीपीआई पर पहुंच गया और उसके बाद तेजी से कम हो गया, जबकि एनएलआरसी 3 - / - चूहों में, वायरल लोड ने 6 डीपीआई तक एक मध्यवर्ती स्तर बनाए रखा और फिर उत्तरोत्तर 9 डीपीआई (चित्रा) के निम्न स्तर तक कम हो गया। 1सी)। इसके अलावा, हमने रक्त में वायरल प्रतिकृति को निर्धारित करने के लिए संक्रमण के बाद 0, 3, 6, और 9 दिनों में HTNV संक्रमित चूहों का पूरा रक्त एकत्र किया। परिणामों से पता चला कि वायरल लोड 3 डीपीआई पर बढ़ा और फिर रक्त कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति का सुझाव देते हुए कम हो गया। जैसा कि पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है, वायरल प्रतियों की संख्या Nlrc 3-/- चूहों में WT चूहों (Nlrc 3-/- चूहों: 5752 ± 502 प्रति मिलीलीटर; WT चूहों: 3589) की तुलना में अधिक थी। ± 869 प्रतियां प्रति एमएल) 3 डीपीआई पर। इसके अलावा, 2- Nlrc3 - / - चूहों (3033 ± 175 प्रतियाँ प्रति मिलीग्राम) की तिल्ली में 6 डीपीआई पर WT चूहों (1520 ± 425 प्रतियाँ प्रति मिलीग्राम) की तुलना में गुना अधिक वायरल लोड का पता चला था; 9 डीपीआई (एनएलआरसी3 -/- चूहों: 500 ± 87 प्रतियां प्रति मिलीग्राम; डब्ल्यूटी चूहों: 270 ± 40 प्रतियां प्रति मिलीग्राम) (चित्रा 1सी) पर गुर्दे में एक ही पैटर्न देखा गया था। कुल मिलाकर, WT चूहों की तुलना में Nlrc3 - / - चूहों में मामूली उच्च वायरल लोड का पता चला था।

इसके बाद, हमने HTNV न्यूक्लियोप्रोटीन (NP) स्तरों की जांच की। जैसा कि आंकड़े 2A, C, Nlrc3 में दिखाया गया है - / - चूहों ने तिल्ली और गुर्दे में WT चूहों की तुलना में उच्च वायरल प्रतिजन स्तर प्रस्तुत किया। गुर्दे और प्लीहा में वायरल प्रतिजनों का सांख्यिकीय विश्लेषण क्रमशः चित्र 2बी, डी में दिखाया गया था। Nlrc3 - / - चूहों (पूरक चित्रा 2) के हृदय, यकृत, फेफड़े और मस्तिष्क में वायरल एंटीजन के निम्न स्तर का पता चला था। Nlrc3 के हृदय, फेफड़े और मस्तिष्क में वायरल एनपी प्रोटीन का स्तर - / - चूहों प्रोटीन स्तर (सप्लीमेंट्री फिगर्स 2 बी, एफ, एच) पर डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में कम थे, लेकिन सांख्यिकीय महत्व हृदय और मस्तिष्क दोनों के बीच एमआरएनए पर दिखाया गया था। और प्रोटीन का स्तर (सप्लीमेंट्री फिगर्स 2ए, ई, आई)। इस खोज ने सुझाव दिया कि सक्रिय वायरल

प्रतिकृति HTNV संक्रमण के बाद Nlrc3 - / - चूहों के रक्त, प्लीहा और गुर्दे में हुई। अंत में, हमने तिल्ली और गुर्दे में HTNV NP के अभिव्यक्ति स्तरों का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग किया। HTNV NP FL प्रतिदीप्ति तीव्रता गुर्दे में अधिक थीगुर्दे6 डीपीआई और 9 डीपीआई पर डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में ट्यूबल्स (चित्रा 2ई) और एनएलआरसी3 के प्लीहा लाल लुगदी (चित्रा 2एफ) - / - चूहों। साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि Nlrc3 - / - चूहों में HTNV के इंट्रापेरिटोनियल संक्रमण की आशंका अधिक होती है।

Nlrc3 के नियमित रक्त परीक्षण - / - HTNV के संक्रमण के बाद चूहों

यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि एचएफआरएस पैथोलॉजी काफी हद तक प्रतिरक्षा-मध्यस्थता है, जिसमें प्रतिरक्षा परिसरों, पूरक सक्रियण, टी सेल प्रतिक्रिया (24–26), और एचटीएनवी-प्रेरित साइटोकिन उत्पादन (26, 27) शामिल हैं, जिससे कई अंगों में चोट लगती है। इसके अलावा, वायरल रक्तस्रावी बुखार (वीएचएफ) वायरस से संक्रमित लोगों में थ्रोम्बोसाइटोपेनिया एक सामान्य नैदानिक ​​​​विशेषता है। इस प्रकार, हमने Nlrc3 - / - और WT चूहों से 3, 6, 9, और 12 डीपीआई पर एकत्र किए गए पूरे रक्त का उपयोग करते हुए पहली बार हेमटोलॉजी परीक्षण किया। परिणामों से पता चला कि WT चूहों में PLT की संख्या 3dpi पर कम हो गई और फिर धीरे-धीरे ठीक हो गई, लेकिन वे Nlrc3 - / - चूहों में घटते रहे, जब तक कि 9 dpi पर सबसे कम मूल्य तक नहीं पहुंच गया, जो कि WT में 9 dpi (P) की तुलना में काफी कम था।<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

Nlrc3 - / - चूहों में 6 डीपीआई पर महत्वपूर्ण रूप से वृद्धि हुई है लेकिन डब्ल्यूटी चूहों (चित्रा 3 सी) में नहीं। दोनों प्रकार के चूहों में न्यूट्रोफिल थोड़ा कम हो गया लेकिन 6 डीपीआई (चित्रा 3डी) पर औसत स्तर तक पहुंच गया। लिम्फोसाइटों की संख्या 3 डीपीआई पर काफी कम हो गई, जबकि वे 6 डीपीआई पर डब्ल्यूटी चूहों में बढ़ने लगे, लिम्फोसाइट गिनती एनएलआरसी 3 - / - चूहों (चित्रा 3 ई) में 6 डीपीआई पर निम्न स्तर पर रही। परिधीय रक्त में सीडी3 प्लस सीडी4 प्लस टी कोशिकाओं बनाम सीडी3 प्लस सीडी8 प्लस टी कोशिकाओं का अनुपात साथी साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था और इसे 3 डीपीआई पर बढ़ाया गया और फिर 6 डीपीआई पर तेजी से उलट दिया गया, जो अक्सर एचएफआरएस रोगियों में देखे गए परिवर्तनों के अनुरूप होता है। 3F), जिसमें CD4 plus T कोशिकाओं में नाटकीय रूप से कमी आई है, और CD8 plus T कोशिकाएँ अपरिवर्तित रहती हैं या प्रतिपूरक विस्तारित होती हैं जिसके परिणामस्वरूप CD4/CD8 का अनुपात उल्टा हो जाता है। इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि HTNV के Nlrc3 - / - चूहों में इंट्रापेरिटोनियल इनोक्यूलेशन, कुछ हद तक, HTNV से संक्रमित रोगियों की मुख्य नैदानिक ​​​​विशेषताओं को प्रेरित करता है, जैसे कि थ्रोम्बोसाइटोपेनिया और उलट CD4 / CD8 T सेल अनुपात।

संक्रमित Nlrc3 के गुर्दे में पैथोलॉजिकल परिवर्तन - / - चूहे चिह्नित रेनल इंटरस्टीशियल हेमोरेज और रीनल ट्यूबल डिलेटेशन को दर्शाता हैइसके बाद, एचटीएनवी-संक्रमित चूहों के पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का मूल्यांकन एच एंड ई धुंधला द्वारा किया गया और सभी संक्रमित एनएलआरसी 3 के गुर्दे में मौजूद पाया गया - / - चूहों की एडिमा के रूप में प्रकट हुआगुर्देट्यूबलर उपकला कोशिकाएं। 6 डीपीआई पर, रक्तस्रावी घाव देखे गए थेगुर्देमज्जा (चित्रा 4ए)।वृक्क नलिकाफैलाव 3 डीपीआई के रूप में जल्दी देखा गया था, इसकी गंभीरता 9 डीपीआई पर पहुंच गई और 12 डीपीआई तक बनी रही, और यह डब्ल्यूटी चूहों (आंकड़े 4 बी, सी) की तुलना में एनएलआरसी 3 - / - चूहों में अधिक स्पष्ट है। इन निष्कर्षों ने संकेत दिया

उस तीव्र नेफ्रोपैथी की विशेषता हैगुर्दे की नलीफैलाव औरगुर्दे के बीच का रक्तस्रावHTNV से संक्रमित Nlrc3 - / - चूहों में प्रेरित किया गया था। यकृत, प्लीहा, फेफड़े में अन्य रोग परिवर्तनों के रूप में, चूहों के इन दो समूहों ने समान परिणाम दिखाए। इनमें मुख्य रूप से प्लीहा में अतिरिक्त-मज्जा संबंधी हेमटोपोइजिस, फेफड़े में वायुकोशीय दीवार का मोटा होना और यकृत अध: पतन (सप्लीमेंट्री फिगर्स 3 ए-एफ) शामिल हैं। उपरोक्त के आधार पर, HTNV संक्रमण के तीव्र चरण के दौरान Nlrc3 - / - चूहों के गुर्दे में देखी गई रोग संबंधी विशेषताएं मानव HFRS मामलों में नैदानिक-रोग संबंधी परिवर्तनों के समान थीं।

इसके आधार पर, हमने आगे गुर्दे के कार्यात्मक विकारों के लिए चूहों में रक्त और मूत्र के संबंधित सूचकांकों की जांच की। माउस सेरा को ऐलेनिन एमिनोट्रांस्फरेज़ (एएलटी), क्रिएटिन किनसे एमबी अंश (सीके-एमबी), यूरिया, साथ ही यूरिक एसिड (यूए) के मूल्यांकन के लिए एकत्र किया गया था। जैसा कि चित्र 4D में दिखाया गया है, नियंत्रण WT चूहों की तुलना में, सीरम UA का स्तर Nlrc3 - / - चूहों में 3 dpi पर महत्वपूर्ण रूप से ऊंचा किया गया था, सीरम CK-MB को Nlrc3 - / - चूहों में 9 dpi पर महत्वपूर्ण रूप से ऊंचा किया गया था, लेकिन सीरम का स्तर ALT, UREA और CREA ने कोई ऊंचाई नहीं दिखाई थी (पूरक तालिका 1)।

गुर्देपीयूयूवी से संक्रमित एचएफआरएस में भागीदारी में क्षणिक प्रोटीनमेह, सूक्ष्म लेकिन शायद ही कभी दिखाई देने वाला हेमट्यूरिया, और ऑलिग्यूरिक एकेआई, इसके बाद पॉल्यूरिया और रिकवरी शामिल हैं। इस रोग में प्रोटीनमेह की विशिष्ट विशेषता रोग के तीव्र चरण (6) के बाद इसकी तीव्र कमी थी। विभिन्न एटियलजि के कारण तीव्र ट्यूबलोइंटरस्टीशियल नेफ्रैटिस वाले रोगियों के एक बड़े समूह में, केवल एक-चौथाई रोगियों में प्रोटीनुरिया पाया गया, जबकि सभी रोगियों में से केवल 2 प्रतिशत, नेफ्रोटिक रेंज प्रोटीनुरिया पाया गया (28)। हमने 0, 3, 6 डीपीआई पर मूत्र एकत्र किया और पाया कि मूत्र प्रोटीन का स्तर 3 डीपीआई पर बढ़ गया है, जो संक्रमण का तीव्र चरण है। मूत्र प्रोटीन सांद्रता में काफी वृद्धि हुई थी और संक्रमित Nlrc3 - / - चूहों और WT चूहों (चित्रा 4E) में औसत मूल्य 3 डीपीआई पर 0 .3 ग्राम / एल के करीब था।

घुसपैठ करने वाली सूजन कोशिकाओं की जांच करने के लिएगुर्देHTNV संक्रमण के बाद बीचवाला, हमने CD3, F4/80 और CD11b के साथ धुंधला इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) का प्रदर्शन किया। परिणामों से पता चला कि सीडी 3 के लिए सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक समूह ने घुसपैठ की हैगुर्देएचटीएनवी संक्रमण (चित्रा 5ए) के बाद बीचवाला, और सीडी11बी के लिए सकारात्मक मायलोइड कोशिकाएं कॉर्टिकल ट्यूबलोइंटरस्टिशियल (चित्रा 5 बी) में दिखाई दीं। घुसपैठ करने वाले सीडी3 प्लस टी कोशिकाओं और सीडी11बी प्लस मायलोइड कोशिकाओं का अनुपात डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में संक्रमित एनएलआरसी 3-/- चूहों में काफी अधिक है, लेकिन एफ4/80 के लिए सकारात्मक मैक्रोफेज पूरे वृक्क प्रांतस्था और मज्जा में वितरित किए गए हैं और कोई महत्वपूर्ण नहीं दिखाया गया है। इन दो माउस प्रकारों के बीच अंतर (चित्र 5C)।

HTNV संक्रमण ने Nlrc3 में एक मजबूत साइटोकाइन प्रतिक्रिया को प्रेरित किया - / - चूहे

भड़काऊ साइटोकिन्स का अतिउत्पादन आमतौर पर एचएफआरएस वाले विषयों में बताया जाता है और इसने इस परिकल्पना को जन्म दिया है कि साइटोकिन डिसरेगुलेशन रोग के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। वाहेरी एट अल। (8) ने पाया कि वायरल संक्रमण जैसे प्रो-इन्फ्लैमेटरी संकेतों के जवाब में, मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और लिम्फोसाइट्स जैसे विभिन्न कोशिकाओं द्वारा कई साइटोकिन्स का उत्पादन किया गया था। वांग एट अल। ने बताया कि TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10, और RANTES (लेकिन IL नहीं -4) की सीरम सांद्रता बहुत अधिक थी। नियंत्रण के साथ तुलना में एचएफआरएस रोगियों (29) में; और यह कि उच्चतम सांद्रता आमतौर पर ज्वर, हाइपोटेंशन और ऑलिग्यूरिक चरणों के दौरान पाई गई, विशेष रूप से गंभीर और महत्वपूर्ण प्रकार के एचएफआरएस मामलों में। उच्च प्लाज्मा आईएल -6 स्तर गंभीर से जुड़े थेगुर्देपीयूयूवी-प्रेरित एचएफआरएस में विफलता और थ्रोम्बोसाइटोपेनिया और रोग की गंभीरता के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

हमारे परिणामों से पता चला है कि एचटीएनवी संक्रमण ने सीएक्ससीएल-1, सीसीएल-5, आईएल-6, आईएल-12, टीएनएफ-ए, और आईएफएन-जी सहित साइटोकिन उत्पादन को बढ़ा दिया है। Nlrc3 - / - चूहों, और इन साइटोकिन्स का स्तर 6 या 9 डीपीआई पर पहुंच गया; इसकी तुलना में, WT चूहों में संक्रमण प्रक्रिया (चित्र 6) के दौरान कमजोर साइटोकिन प्रतिक्रियाएं थीं।

निष्कर्ष में, हमने इस अध्ययन में पाया कि HTNV के इंट्रापेरिटोनियल इनोक्यूलेशन के बाद, Nlrc3 - / - चूहों में वजन घटाने का विकास होता है,गुर्दे का रक्तस्राव, और नलिका फैलाव। ये विशेषताएं एचएफआरएस के नैदानिक ​​​​लक्षणों से मिलती-जुलती हैं, जो पहले से प्रकाशित किसी भी अन्य पशु मॉडल की तुलना में अधिक निकटता से हैं। इसके अलावा, Nlrc3 - / - चूहों ने WT चूहों और Nlrc3 की तुलना में सीरम, प्लीहा और गुर्दे में एक उच्च वायरल लोड दिखाया - / - चूहों ने हेमटोलॉजिकल विकार और कई अंगों में महत्वपूर्ण रोग परिवर्तन विकसित किए, इस प्रकार Nlrc3 का HTNV संक्रमण स्थापित किया - / - एचएफआरएस के अध्ययन के लिए एक नए मॉडल के रूप में चूहे।

बहस

यहां वर्णित HFRS माउस मॉडल दर्शाता है कि HTNV संक्रमित Nlrc3 - / - चूहे एक उपयुक्त छोटे पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसका उपयोग HFRS टीकों और चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है। Nlrc3 - / - माउस मॉडल मनुष्यों में देखी गई व्यवस्थित चोट से मिलता-जुलता है, जिसमें थ्रोम्बोसाइटोपेनिया, लिम्फोसाइटोपेनिया, एएसटी (यकृत की शिथिलता), एलडीएच, क्रिएटिन किनसे एमबी अंश और यूए का ऊंचा सीरम स्तर होता है।(गुर्दे की शिथिलता) इसके अलावा, Nlrc3 - / - चूहों ने वजन घटाने और स्पष्ट विकसित कियागुर्दे का रक्तस्राव. लक्ष्य अंगों में वायरल प्रतिकृति और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन फेफड़े, प्लीहा, यकृत और गुर्दे में पाए गए। इसके अलावा, Nlrc3 - / - चूहों के रक्त, प्लीहा और गुर्दे में वायरल आरएनए भार का मामूली उच्च स्तर पाया गया। इसकी तुलना में, WT चूहों ने रक्त, प्लीहा और गुर्दे में वायरल आरएनए का पता लगाने के बावजूद हल्के ऊतकीय परिवर्तन विकसित किए।

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 प्रतिशत) (30)। उदाहरण के लिए, नाक मार्ग के माध्यम से HTNV से संक्रमित हैम्स्टर्स ने लगातार स्पर्शोन्मुख संक्रमण का नेतृत्व किया, जो छिटपुट विरेमिया द्वारा विशेषता है, लेकिन फेफड़ों, मस्तिष्क और गुर्दे में वायरल जीनोम प्रतियों के उच्च स्तर। मांसपेशी इंजेक्शन के माध्यम से उच्च खुराक एचटीएनवी से संक्रमित फेरेट्स ने शरीर के वजन में क्रमिक कमी (5-12 समय के साथ प्रतिशत) दिखाया, लेकिन बरकरारगुर्दे के कार्य, विरेमिया की अनुपस्थिति, और अंगों में वायरस संचरण की कमी। मार्मोसेट्स में, एचटीएनवी के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन ने उच्च स्तर के सेरोकोनवर्जन और तटस्थ एंटीबॉडी के उत्पादन का नेतृत्व किया; लगातार, इन जानवरों के अंगों में कोई गुर्दा क्षति, विरेमिया या वायरस संचरण नहीं था (13)।

अवलोकन के अनुसार कि हेमटोलॉजिकल परिवर्तन केवल एक ही समय बिंदु पर देखे गए हैं और साइटोकिन परिवर्तन महत्वपूर्ण नहीं हैं, हमें लगता है कि उन्हें एचटीएनवी संक्रमण की प्रकृति द्वारा समझाया जा सकता है, जो कई अन्य वायरल संक्रमणों के समान है जो कई अंगों को पीड़ित करते हैं, और इसलिए अक्सर एकल पैरामीटर के निरंतर परिवर्तन खोजना मुश्किल है। कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्ष आम तौर पर क्षेत्र में मौजूदा ज्ञान के अनुरूप हैं। इसके अलावा, Nlrc3 - / - चूहों की खोज में HTNV संक्रमण के लिए अधिक संवेदनशीलता है और HFRS के रोग संबंधी परिवर्तनों के समान कई परिवर्तन दिखाना क्षेत्र में एक नया योगदान है। यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि मानव संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं हैनटवायरस के लिए प्राथमिक लक्ष्य हैं। , जो सामान्यीकृत केशिका फैलाव और एडीमा (31) की परिवर्तनीय डिग्री की ओर जाता है।

वायरल एंटीजन विभिन्न ऊतकों के केशिका एंडोथेलियम के भीतर पाए जा सकते हैं (हंतावायरस कोशिकाओं को संवहनी पारगम्यता कारक वीईजीएफ के प्रति संवेदनशील बनाकर एंडोथेलियल सेल पारगम्यता को निर्देशित करते हैं, जबकि एंजियोपोइटिन 1 और स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट हंतावायरस-निर्देशित पारगम्यता को रोकते हैं)। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला है कि Nlrc3 - / - चूहों के गुर्दे देखे गए थेगुर्दे की नली9 dpi, Nlrc3 - / - चूहों में WT चूहों की तुलना में अधिक गंभीर रोग परिवर्तनों के साथ फैलाव और 12 dpi पर बना रहा। Nlrc3 - / - चूहों में, गुर्दे में वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिका शोफ और उल्लेखनीय वृक्क अंतरालीय रक्तस्राव देखा गया। इसके अलावा, प्लीहा के लाल गूदे में प्रमुख अतिरिक्त-मज्जा संबंधी हेमटोपोइजिस 6, 9, और 12 डीपीआई, और जर्मिनल सेंटर फैलाव और 12 डीपीआई पर बहुसंस्कृति वाली विशाल कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि देखी गई। 3, 6, 9, और 12 डीपीआई दिनों में लीवर ने गंभीर हेपेटोसाइटिक अध: पतन और बिखरे हुए परिगलन को भी दिखाया। फेफड़े की सूजन और वायुकोशीय दीवार का मोटा होना 6 डीपीआई पर देखा गया। इस खोज से पता चलता है कि HTNV से संक्रमित Nlrc3 - / - चूहों में HTNV संक्रमण का लीवर और किडनी पर महत्वपूर्ण और दीर्घकालिक प्रभाव पड़ा। इसके अलावा, Nlrc3-/- चूहों ने प्रमुखता दिखाईवृक्क नलिका का फैलाव, बीचवाला रक्तस्राव, और HTNV संक्रमण के बाद गुर्दे की शिथिलता। सीरम यूए का स्तर 3 डीपीआई पर काफी ऊंचा था, जो गुर्दे की शिथिलता का एक स्पष्ट संकेत था। मूत्र प्रोटीन सांद्रता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी और संक्रमित Nlrc3-/- चूहों में औसत मूल्य 0.3 dpi पर 3 g/L के करीब था। यूए वृद्धि की समान प्रवृत्ति डब्ल्यूटी चूहों में नहीं देखी गई थी। ये परिणाम बताते हैं कि हमारा मॉडल मानव HTNV संक्रमण की अधिक रोग संबंधी विशेषताओं का पुनर्पूंजीकरण करता है।

एन प्रोटीन (एनपी) हेंतावायरस संक्रमित कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में उत्पन्न होता है और संक्रमण के 4 घंटे बाद (32) के रूप में इसका पता लगाया जा सकता है। इन विशेषताओं का मुख्य कारण है कि एलिसा का समापन बिंदु वायरल कणों की संख्या और वायरल संक्रमण की प्रगति का आकलन करने के लिए हैनटवायरस एन प्रोटीन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस एसेज़ का पता लगाना है। विभिन्न विधियाँ प्राप्त परिणामों और निष्कर्ष तक पहुँचने को प्रभावित कर सकती हैं। वायरल प्रोटीन और विरेमिया वायरल संक्रमण के दो अलग-अलग पैरामीटर हैं, और वे हमेशा समकालिक रूप से नहीं बदल सकते हैं। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के परिणामों से पता चला है कि एनपी स्तरों की एक क्षणिक ऊंचाई प्लीहा में 6 डीपीआई पर हुई है, जहां वायरस एक क्षणिक प्रतिकृति से गुजर सकता है, उसके बाद इसकी निकासी हो सकती है। जैसा कि अपेक्षित था, वायरल प्रोटीन संचय पीक विरेमिया के बाद देखा गया, जो 3 डीपीआई पर दिखाई दिया। दरअसल, प्लीहा और गुर्दे में वायरल प्रतिकृति को 9 और 12 डीपीआई पर मध्यम स्तर पर बनाए रखा गया था, साथ में एन प्रोटीन संश्लेषण (9 डीपीआई पर प्लीहा: डब्ल्यूटी चूहों: 192 ± 128 प्रतियां प्रति मिलीग्राम; एनएलआरसी 3 - / - चूहों: 431 ±) प्रति मिलीग्राम 229 प्रतियां; 12 डीपीआई पर प्लीहा: डब्ल्यूटी चूहों: 160 ± 85 प्रति मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम; Nlrc3 - / - चूहों: 226 ± 118 प्रतियां प्रति मिलीग्राम)। हालांकि, प्रोटीन स्तर पर एचटीएनवी एनपी की मात्रा 6 पाई पर अधिकतम पहुंच गई और पूरे 9 और 12 डीपीआई में उच्च बनी रही। वायरल आरएनए प्रतियों और प्रोटीन की मात्रा के कैनेटीक्स में अंतर विभिन्न अंगों में उनके अंतर क्षय को दर्शा सकता है।

रोग मॉडल में साइटोकिन्स की भूमिका आमतौर पर अधिक जटिल होती है। PUUV- प्रेरित HFRS में, गंभीरवृक्कीय विफलताऔर थ्रोम्बोसाइटोपेनिया उच्च प्लाज्मा IL-6 स्तरों (33) से जुड़े हैं। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि एचटीएनवी संक्रमण ने सीएक्ससीएल -1, सीसीएल -5, आईएल -6, आईएल -12, टीएनएफ-ए, और आईएफएन-जी सहित उन्नत साइटोकिन उत्पादन का नेतृत्व किया। Nlrc3 - / - चूहों, लेकिन WT चूहों में उतना नहीं। यह ध्यान देने योग्य है कि 9 dpi पर, Nlrc3 - / - चूहों ने इस समय एक मजबूत साइटोकिन प्रतिक्रिया के साथ, अपनी तिल्ली और गुर्दे में उल्लेखनीय रोग परिवर्तन दिखाया। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि साइटोकिन्स का उच्च स्तर रोग के रोगजनन से संबंधित हो सकता है।

सारांश में, हम जो परिणाम यहां रिपोर्ट करते हैं, वे प्रदर्शित करते हैं कि इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से HTNV के साथ टीका लगाए जाने के बाद, Nlrc3 - / - चूहों में वजन घटाने, थ्रोम्बोसाइटोपेनिया विकसित होता है, rगुर्दे की शिथिलता, और रक्तस्राव।ये पहले से प्रकाशित किसी भी अन्य पशु मॉडल की तुलना में एचएफआरएस के नैदानिक ​​​​लक्षणों से अधिक मिलते-जुलते हैं। इस मॉडल का उपयोग विवो में संभावित टीकों और चिकित्सीय और एचएफआरएस रोगजनन के गहन अध्ययन के मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है।