Norwogonin PC12 कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस को कम करता है

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सार

पृष्ठभूमि: नॉरवोगोनिन कंकाल संरचना में तीन फेनोलिक हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ एक प्राकृतिक फ्लेवोन है और इसमें उत्कृष्ट हैएंटीऑक्सिडेंटगतिविधि। हालांकि, नॉरवोगोनिन का न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव स्पष्ट नहीं है। यहां, हमने PC12 कोशिकाओं में हाइपोक्सिया द्वारा प्राप्त ऑक्सीडेटिव क्षति के खिलाफ नॉरवोगोनिन की सुरक्षात्मक क्षमता की जांच की। तरीके: सेल व्यवहार्यता और एपोप्टोसिस की जांच क्रमशः एमटीटी परख और एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई धुंधला द्वारा की गई। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) सामग्री को डीसीएफएच-डीए परख का उपयोग करके मापा गया था। लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH), malondialdehyde (MDA), औरएंटीऑक्सिडेंटवाणिज्यिक किटों का उपयोग करके एंजाइम का स्तर निर्धारित किया गया था। संबंधित जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति को क्रमशः वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता द्वारा मापा गया था। परिणाम: हमने पाया कि नॉरवोगोनिन ने सेल व्यवहार्यता को बढ़ाकर, एलडीएच रिलीज को कम करके, और सेल आकारिकी में परिवर्तन को संशोधित करके पीसी12 कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट को कम किया। नॉरवोगोनिन ने भी एक के रूप में काम कियाएंटीऑक्सिडेंटआरओएस को साफ करके, एमडीए उत्पादन को कम करके, सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), केटेलेस (सीएटी), और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीपीएक्स) की गतिविधियों को बनाए रखने और एचआईएफ -1 और वीईजीएफ़ के अभिव्यक्ति स्तर को कम करके। इसके अलावा, वोगोनिन ने कैस्पेज़ -3, साइटोक्रोम सी, और बैक्स के अभिव्यक्ति स्तरों को बाधित करके सेल एपोप्टोसिस को रोका, जबकि बीसीएल के अभिव्यक्ति स्तर -2 और बीसीएल -2 / बैक्स के अनुपात में वृद्धि की। निष्कर्ष: नॉरवोगोनिन पीसी12 कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट को कम करता है, आरओएस को बुझाता है, की गतिविधियों को बनाए रखता हैएंटीऑक्सिडेंटएंजाइम, और माइटोकॉन्ड्रियल एपोप्टोसिस मार्ग को बाधित करना।

कीवर्ड: नॉरवोगोनिन,प्रतिउपचारक गतिविधि, हाइपोक्सिया, ऑक्सीडेटिव तनाव, एपोप्टोसिस

पार्श्वभूमि

एरोबिक जीवों को ऊर्जा उत्पादन के लिए ऑक्सीजन (O2) की आवश्यकता होती है। हाइपोक्सिया को ऊतक में सेलुलर फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए अपर्याप्त O2 आपूर्ति के रूप में परिभाषित किया गया है और अक्सर कुछ शारीरिक स्थितियों जैसे कि उच्च ऊंचाई [1], और कई रोग स्थितियों जैसे स्ट्रोक [2] में होता है। मस्तिष्क विशेष रूप से हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट के प्रति संवेदनशील है क्योंकि इसकी उच्च ऑक्सीजन खपत, असंतृप्त फैटी एसिड में समृद्ध है, और कम हैएंटीऑक्सिडेंटक्षमता [3]। बढ़ते प्रमाणों ने संकेत दिया है कि हाइपोक्सिया मस्तिष्क पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है [4-6]।

लिनलिन जिंग, रोंगमिन गाओ, जी झांग, डोंगमेई झांग, जिन शाओ, झेंगपिंग जिया और हुइपिंग मा

फार्मेसी विभाग, पीएलए, लान्झोउ 730050, गांसु, चीन के संयुक्त रसद समर्थन बल का 940 वां अस्पताल

हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट [7, 8] में ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस को दो योगदान कारक माना जाता है। हाइपोक्सिया एक्सपोजर को इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन में वृद्धि करने के लिए सूचित किया गया है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव को सुविधाजनक बनाता है। अत्यधिक आरओएस, जैसे सुपरऑक्साइड आयन (O2−˙), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2), और हाइड्रॉक्सिल रेडिकल (HO•), लिपिड, झिल्ली, प्रोटीन और डीएनए पर हमला करके संरचनात्मक और कार्यात्मक सेलुलर परिवर्तन की ओर जाता है, और बाद में कोशिका क्षति का कारण बनता है [ 9]।

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इसके साथ ही, अधिक उत्पादित आरओएस भी माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र (एमपीटीपी) [10] के उद्घाटन की सुविधा प्रदान करता है और प्रो-एपोप्टोसिस प्रोटीन को बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में स्थानांतरित करता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के विध्रुवण और साइटोक्रोम सी [11] के रिलीज को प्रेरित करता है। ये परिवर्तन अंततः माइटोकॉन्ड्रियल-निर्भर एपोप्टोसिस [12] का कारण बनते हैं। तो, यह माना जाता है किएंटीऑक्सीडेंटअत्यधिक आरओएस को रोकने या समाप्त करने की क्षमता के साथ हाइपोक्सिया से प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस को क्षीण करके उनके सुरक्षात्मक प्रभाव को बढ़ा सकते हैं। बहुत सारे अध्ययनों ने साबित किया है किएंटीऑक्सिडेंटविटामिन सी [13], आइसोफ्लेवोन [8], और नाइट्रोक्साइड रेडिकल्स [14] जैसे पूरक इन विट्रो और विवो में हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट को सीमित कर सकते हैं। Flavonoids सर्वव्यापी पौधे माध्यमिक चयापचयों का एक बड़ा और विविध वर्ग है। उन्हें हमेशा एक उत्कृष्ट प्राकृतिक माना जाता हैएंटीऑक्सिडेंटमुक्त कणों को परिमार्जन करने और लिपिड पेरोक्सीडेशन को रोकने की क्षमता के साथ।

वर्तमान में, मानव स्वास्थ्य पर उनके लाभकारी प्रभावों के कारण यौगिकों के इस वर्ग पर अधिक से अधिक ध्यान दिया गया है। फ्लेवोनोइड्स को औषधीय क्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के मालिक होने के लिए दिखाया गया है, जैसे कि विरोधी भड़काऊ, एंटीनोसाइसेप्टिव, और न्यूरोप्रोटेक्टिव गतिविधि, आदि, जिनमें से सभी को उनकी एंटीऑक्सिडेंट गतिविधियों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है [15]। कई अध्ययनों ने संकेत दिया है कि फ्लेवोनोइड हाइपोक्सिया-प्रेरित विफलता पर उत्कृष्ट सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, हाइपोक्सिया [16] से प्रेरित रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिका मृत्यु के खिलाफ रुटिन का एक मजबूत न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है। हाल के एक अध्ययन से यह भी पता चलता है कि रुटिन H9c2 कोशिकाओं [17] में ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस को रोककर कोबाल्ट क्लोराइड-प्रेरित हाइपोक्सिया क्षति को कम कर सकता है। इसके अलावा, लियू एट अल सुझाव देते हैं कि नोबिलेटिन (3′,4′,5,6, 7,8-हेक्सामेथोक्सी फ्लेवोन) एच9सी2 सेल में एक्ट/जीएसके-3 मार्ग को सक्रिय करके मायोकार्डियल I/R चोट को कम करता है। [18]। इसके अलावा, बबूल चूहे कार्डियोमायोसाइट्स और H9C2 कार्डियोमायोब्लास्ट को हाइपोक्सिया / पुनर्संयोजन-प्रेरित चोट के खिलाफ Nrf2 सिग्नलिंग मार्ग [19] के AMPK-मध्यस्थता सक्रियण के माध्यम से बचा सकता है।

नॉरवोगोनिन (5,7,8-ट्राइहाइड्रॉक्सी फ्लेवोन, अंजीर। 1) एक औषधीय रूप से सक्रिय फ्लेवोन है जो स्कुटेलरिया बैकलेंसिस जॉर्जी (चीनी में "हुआंग किन") की जड़ से अलग होता है, जो एक पारंपरिक चीनी जड़ी बूटी है जिसका उपयोग इन्फ्लूएंजा और कैंसर के इलाज के लिए किया जाता है। [20, 21]। हालांकि, प्राकृतिक पौधों में इसके निम्न स्तर के कारण नॉरवोगोनिन की जैविक गतिविधियों पर सीमित अध्ययन किए गए हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, नॉरवोगोनिन के कई संश्लेषण विधियों की सूचना दी गई है [22, 23]।

हमारे पिछले अध्ययन ने चार चरणों [24] में क्रिसिन से नॉरवोगोनिन प्राप्त करने की एक सरल विधि भी स्थापित की। इन शोधों ने नॉरवोगोनिन की जैविक गतिविधियों के आगे के मूल्यांकन को सकारात्मक रूप से प्रभावित किया है। अध्ययनों से पता चला है कि नॉरवोगोनिन एंटीऑक्सिडेंट [25], कैंसर विरोधी [26, 27], एंटीवायरल [28] और रोगाणुरोधी गतिविधियों [29] के मालिक हैं और साथ ही आरओएस [30] के साइनाइड प्रेरित उत्पादन को रोकता है। हालांकि, क्या नॉरवोगोनिन में हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट के खिलाफ सुरक्षात्मक क्षमताएं अज्ञात हैं। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य पीसी12 कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस के खिलाफ नॉरवोगोनिन के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करना था।

तरीकों

सामग्री और अभिकर्मक

नॉरवोगोनिन (शुद्धता 98 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर) को हमारे पहले बताए गए तरीके [24] के अनुसार संश्लेषित किया गया था। रुटिन (शुद्धता 96 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर) को सीआई युआन बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (ज़िआन, शांक्सी, चीन) से खरीदा गया था। नॉरवोगोनिन और रुटिन को बाँझ डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग कर दिया गया था, जिसे −20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था, और उपयोग से तुरंत पहले सेल संस्कृति माध्यम में पतला किया गया था। Dulbecco का संशोधित ईगल मीडियम (DMEM), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), स्ट्रेप्टोमाइसिन और पेनिसिलिन Solarbio co., Ltd. (बीजिंग, चीन) से खरीदे गए थे।

malondialdehyde (MDA), लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (SOD), कैटेलेज (CAT), और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (GPx) की किट नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट (जियांग्सु, चीन) से प्राप्त की गई थी। 2′,7′-डाइक्लोराइड-हाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (DCFH-DA) और (3-(4,5-डाइमिथाइलथियाजोल-2-yl)-2,5- डिपेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड) टेट्राजोलियम (एमटीटी) सिग्मा-एल्ड्रिच कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर -1 (HIF -1), वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ), बी सेल लिंफोमा -2 (बीसीएल -2), बीसीएल {{17 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी }} संबद्ध X प्रोटीन (Bax), Caspase-3, Cytochrome C, और -actin सभी Abcam (कैम्ब्रिज, यूके) से खरीदे गए थे। द्वितीयक एंटीबॉडी ZsBio कंपनी (बीजिंग, चीन) से प्राप्त किए गए थे।

बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (जियांग्सु, चीन) से एक एपोप्टोसिस विश्लेषण किट प्राप्त की गई थी। सभी रसायन और सॉल्वैंट्स विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे और चीन में एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से प्राप्त किए गए थे। सेल संस्कृति PC12 कोशिकाओं को चीनी विज्ञान अकादमी (TCR 9, शंघाई, चीन) के सेल बैंक से खरीदा गया था और DMEM में 10 प्रतिशत (v / v) FBS, 100 U / mL पेनिसिलिन और 100 U / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ बनाए रखा गया था। 5 प्रतिशत CO2 युक्त आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर। नॉरवोगोनिन की साइटोटोक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए, PC12 कोशिकाओं (मार्ग 4 ~ 6) को अलग-अलग सांद्रता (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol/L) के साथ और न ही वोगोनिन के साथ पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। 1 घंटे और फिर 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत। हाइपोक्सिया एक्सपोजर सेल हाइपोक्सिया चोट मॉडल को प्रेरित करने के लिए, पीसी 12 कोशिकाओं को एक आर्द्र कक्ष में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री पर हाइपोक्सिया वातावरण (1 प्रतिशत ओ 2, 5 प्रतिशत सीओ 2 और 94 प्रतिशत एन 2) के अधीन किया गया था। नॉर्मोक्सिक नियंत्रण कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर सुसंस्कृत किया गया था।

हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट के खिलाफ नॉरवोगोनिन के सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, PC12 कोशिकाओं को विभिन्न सांद्रता (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ के साथ पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। एल) हाइपोक्सिया उपचार से पहले 1 घंटे के लिए नॉरवोगोनिन। सेल व्यवहार्यता कोशिकाओं की व्यवहार्यता को पहले वर्णित [31] के रूप में एमटीटी परख द्वारा मापा गया था। संक्षेप में, PC12 कोशिकाओं (1 × 105 कोशिकाओं / एमएल) को 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में रखा गया था। फिर कुओं में नॉरवोगोनिन के विभिन्न सांद्रता जोड़े गए। कुओं को नियंत्रित करने के लिए डीएमएसओ की समान मात्रा जोड़ी गई। सेल संस्कृति माध्यम में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.1 प्रतिशत है । नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिया स्थितियों में ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक कुएं में 10 μL MTT (5.0 mg / mL) जोड़ा गया, इसके बाद 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। फिर, एमटीटी के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया और फॉर्मेज़न उत्पाद को 100 μL डीएमएसओ में भंग कर दिया गया। अवशोषण को 570 एनएम पर स्पेक्ट्रामैक्स i3 माइक्रोप्लेट रीडर (आणविक उपकरण, सनीवेल, सीए, यूएसए) पर मापा गया था। परिणाम नियंत्रण समूह के सापेक्ष प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए थे। हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एचई) धुंधला पीसी 12 कोशिकाओं को कांच के कवरलिप्स पर बीजित किया गया था, 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था, इससे पहले कि वे उसी तरह से नॉरवोगोनिन के साथ इलाज किए गए थे जैसा कि ऊपर वर्णित है।

माध्यम को हटा दिया गया था और कांच के कवरलिप्स को ठंडे पीबीएस से धोया गया था, इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मेथनॉल के साथ निर्धारण किया गया था, और फिर 5 मिनट के लिए तीन बार ठंडे पीबीएस से धोया गया था। अंत में, कोशिकाओं को एचई धुंधला प्रोटोकॉल [32] के अनुसार दाग दिया गया। सेल रूपात्मक परिवर्तनों को सत्यापित करने के लिए सेल का विश्लेषण एक OLYMPUS IX73 माइक्रोस्कोप (100 ×) का उपयोग करके किया गया था। माइक्रोस्कोप से जुड़े DXM 1200 C डिजिटल कैमरा (Nikon) का उपयोग करके डिजिटल चित्र प्राप्त किए गए थे। PC12 कोशिकाओं में ROS सामग्री इंट्रासेल्युलर ROS स्तर DCFH-DA परख [33] का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, PC12 कोशिकाओं (1 × 105 कोशिकाओं/एमएल) को 6-अच्छी तरह से प्लेटों में रखा गया था। हाइपोक्सिया उपचार के बाद, PC12 कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और फिर 37 डिग्री पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए 10 μM DCFH-DA युक्त संस्कृति माध्यम में ऊष्मायन किया गया। कोशिकाओं को ओलिंप उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (टोक्यो, जापान) के साथ देखा गया था और एक बेक टन डिकिंसन FACScan प्रवाह साइटोमीटर (बीडी बायोसाइंसेस, सीए, यूएसए) द्वारा विश्लेषण किया गया था, जिसमें 488 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 525 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य थे। आरओएस स्तर को नियंत्रण के सापेक्ष प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। एलडीएच रिसाव, एमडीए सामग्री, और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधि PC12 कोशिकाओं (1 × 105 कोशिकाओं / एमएल) को 90 मिमी डिश में रखा गया था। ऊपर वर्णित हाइपोक्सिया उपचार के बाद, प्रत्येक डिश से 50 μL संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था, और वाणिज्यिक परख किट (जियानचेंग इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी, नानजिंग, चीन) का उपयोग करके माध्यम में एलडीएच गतिविधि का पता लगाया गया था और इसे यू / एमएल के रूप में व्यक्त किया गया था। PC12 कोशिकाओं को दो बार ठंडे पीबीएस से धोने के बाद काटा और समरूप बनाया गया। कुल प्रोटीन की सांद्रता BCA प्रोटीन परख किट द्वारा मापी गई। एमडीए सामग्री और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधि वाणिज्यिक परख किट (जियानचेंग इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी, नानजिंग, चीन) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।

एमडीए की सामग्री को एनएमओएल / एमजी प्रोटीन के रूप में प्रस्तुत किया गया था। SOD, CAT और GPx की गतिविधियों को U/mg प्रोटीन के रूप में प्रस्तुत किया गया। सेल एपोप्टोसिस (एनेक्सिन-वी / पीआई धुंधला) हाइपोक्सिया उपचार के बाद, पीसी 12 कोशिकाओं को काटा गया, दो बार ठंडे पीबीएस से धोया गया, और फिर बाध्यकारी बफर के साथ निलंबित कर दिया गया। निर्माता (बायोटाइम, शंघाई, चीन) के प्रोटोकॉल के बाद कोशिकाओं को एनेक्सिन वी-एफआईटीसी और पीआई समाधान के साथ इलाज किया गया था। बेक्टन डिकिंसन FACScan फ्लो साइटोमीटर (BD Biosciences, CA, USA) का उपयोग करके डेटा संग्रह किया गया। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण पीसी 12 कोशिकाओं के कुल आरएनए को ट्राईजोल अभिकर्मक (तकरा, डालियान, चीन) का उपयोग करके निकाला गया था और प्राइमस्क्रिप्ट टीएम आरटी अभिकर्मक किट (AK4301, AK4301) का उपयोग करके सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था।

तकारा, डालियान, चीन)। सीडीएनए एन्कोडिंग HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, caspase-3, साइटोक्रोम C, और ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) जीन को मात्रात्मक वास्तविक- टाइम पीसीआर एक 7300 रीयल-टाइम डिटेक्शन सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, सीए, यूएसए) का उपयोग कर रहा है। उपयोग किए गए प्राइमरों को तालिका 1 में दिखाया गया था। पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति 30 एस के लिए 95 डिग्री थी, इसके बाद 5 एस के लिए 95 डिग्री के 40 चक्र और 31 एस के लिए 60 डिग्री थे। mRNA स्तर की गणना 2-ΔΔCt पद्धति का उपयोग करके की गई और GAPDH के लिए सामान्यीकृत किया गया, जो कि संदर्भ जीन है। पश्चिमी धब्बा PC12 कोशिकाओं को RIPA एजेंटों में काटा और समरूप बनाया गया। बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी। 30 कुरूप नमूनों को 12 प्रतिशत एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन पर हल किया गया और फिर पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (मिलिपोर, बिलरिका, एमए, यूएसए) में स्थानांतरित कर दिया गया।

कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएसटी बफर में 5 प्रतिशत गैर-वसा वाले सूखे दूध के साथ झिल्ली को अवरुद्ध कर दिया गया था और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था: एंटी-एचआईएफ -1 (1: 3 0 0, एबी 179483, एबकैम, यूके), एंटी-वीईजीएफ (1:1000, एबी46154, एबकैम, यूके), एंटी-बीसीएल-2 (1:1000, ab59348, एबकैम, यूके), एंटी-बैक्स (1:500, ab32503, Abcam, यूके), एंटी कस्पासे-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), एंटी साइटोक्रोम C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) और एंटी- -एक्टिन (1:2000, ab8227) , Abcam, UK) रात भर 4 डिग्री पर। फिर, झिल्ली को धोया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (1:2000, ZsBio, बीजिंग, चीन;) के साथ ऊष्मायन किया गया। इम्यूनोरिएक्टिव बैंड्स को एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) अभिकर्मकों का उपयोग करके देखा गया था। बैंड की सापेक्ष तीव्रता को -एक्टिन आंतरिक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया गया और इमेज-प्रो प्लस 6.0 (मीडिया साइबरनेटिक्स, इंक।, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

परिणाम औसत ± एसडी के रूप में व्यक्त किए गए थे जो कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त हुए थे। छात्र-न्यूमैन-केल्स पोस्ट हॉक टेस्ट के बाद विचरण (एनोवा) के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग करके समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण किया गया था। <0.05 का="" p-मान="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="">

परिणाम

हाइपोक्सिया-प्रेरित चोट के खिलाफ नॉरवोगोनिन सुरक्षात्मक पीसी 12 कोशिकाएं

सबसे पहले, नॉरवोगोनिन की प्रोलिफ़ेरेटिव गतिविधि को रोकने के लिए, सामान्य PC12 कोशिकाओं पर इसकी साइटोटोक्सिसिटी को MTT परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। जैसा कि अंजीर में देखा गया है। 2a, 1 × 1 0 - 8 -1 × 1 0 - 5 mol / L (P> 0.05) की सांद्रता में नॉरवोगोनिन के साथ उपचार के बाद सेलुलर प्रसार में काफी बदलाव नहीं आया। ) हालाँकि, सेल व्यवहार्यता में काफी कमी आई जब नॉरवोगोनिन की सांद्रता को बढ़ाकर 1 × 10− 4 mol/L (P <0.05) कर="" दिया="" गया।="" परिणामों="" ने="" संकेत="" दिया="" कि="" नॉरवोगोनिन="" ने="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−5="" mol/l="" की="" सांद्रता="" पर="" pc12="" कोशिकाओं="" पर="" विषाक्तता="" या="" प्रसार="" गतिविधि="" प्रदर्शित="" नहीं="">

फिर हमने हाइपोक्सिया-प्रेरित PC12 कोशिकाओं की चोट के खिलाफ नॉरवोगोनिन के सुरक्षात्मक प्रभाव की जांच की। जैसा कि चित्र 2बी में दिखाया गया है, नियंत्रण समूह की तुलना में, हाइपोक्सिया समूह में सेल व्यवहार्यता 58.71 प्रतिशत (पी <0.01) तक="" कम="" हो="" गई="" थी।="" हाइपोक्सिया="" उपचार="" की="" तुलना="" में,="" 1="" ×="" 10−="" 8,="" 1="" ×="" 10−="" 7,="" और="" 1="" ×="" 10−="" 6="" मोल/एल="" नॉरवोगोनिन="" खुराक-निर्भरता="" से="" संरक्षित="" पीसी12="" हाइपोक्सिया-प्रेरित="" चोट="" के="" खिलाफ="" कोशिकाओं,="" क्रमशः="" 58.71="" से="" 62.79="" प्रतिशत="" (पी=""><0.05), 66.68="" प्रतिशत="" (पी=""><0.01) और="" 69.88="" प्रतिशत="" (पी=""><0.01) से="" सेल="" व्यवहार्यता="" की="" वसूली।="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" रुटिन="" के="" साथ="" प्रीट्रीटमेंट="" ने="" भी="" एक="" सुरक्षात्मक="" प्रभाव="" प्रदर्शित="" किया,="" जो="" हाइपोक्सिया="" उपचार="" की="" तुलना="" में="" सेल="" व्यवहार्यता="" को="" 63.78="" प्रतिशत="" तक="" बढ़ा="" देता="" है।="" 1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" नॉरवोगोनिन="" के="" साथ="" व्यवहार="" की="" गई="" व्यवहार्यता="" को="" घटाकर="" 63.43="" प्रतिशत="" कर="" दिया="" गया,="" जो="" अभी="" भी="" हाइपोक्सिया="" समूह="" (p=""><0.05) की="" तुलना="" में="" काफी="" अधिक="" है।="" इन="" परिणामों="" ने="" प्रदर्शित="" किया="" कि="" नॉरवोगोनिन="" ने="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−5="" mol/l="" की="" सांद्रता="" में="" महत्वपूर्ण="" साइटोप्रोटेक्शन="" दिखाया="" और="" सबसे="" प्रभावी="" एकाग्रता="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" है।="" तब="" इस="" खुराक="" को="" निम्नलिखित="" प्रयोगों="" में="" इष्टतम="" खुराक="" के="" रूप="" में="" इस्तेमाल="" किया="" गया="">

नॉरवोगोनिन की सुरक्षात्मक क्षमता को रूपात्मक परिवर्तनों द्वारा भी सत्यापित किया गया था। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 2c, हाइपोक्सिया उपचार के बिना PC12 कोशिकाएं नियमित आकार (फ्यूसीफॉर्म), समान आकार के साथ अच्छी तरह से विकसित हुईं। हाइपोक्सिया एक्सपोजर के बाद, पीसी 12 कोशिकाओं ने संकोचन, गोलाकार आकार, desquamation, और कम सेल घनत्व प्रदर्शित किया। हाइपोक्सिया एक्सपोजर बेहतर होने से पहले कोशिकाओं को नॉरवोगोनिन या रूटिन के साथ दिखाया गया था, विलुप्त होने वाली कोशिकाओं की संख्या में कमी आई थी, और सेल आकार सामान्य रूप से ठीक हो गया था। इसके अलावा, एलडीएच रिसाव द्वारा नॉरवोगोनिन की सुरक्षात्मक क्षमता की पुष्टि की गई थी, जो सेल झिल्ली अखंडता के नुकसान से जुड़ा हुआ है। जैसा कि चित्र 2d में दिखाया गया है, हाइपोक्सिया एक्सपोज़र (P <0.01) के="" बाद="" संस्कृति="" माध्यम="" में="" ldh="" गतिविधि="" में="" उल्लेखनीय="" रूप="" से="" वृद्धि="" हुई="">

नॉरवोगोनिन या रुटिन के साथ प्रीट्रीटमेंट ने नाटकीय रूप से एलडीएच रिसाव को कम कर दिया, यह सुझाव दिया कि नॉरवोगोनिन और रुटिन ने कोशिका झिल्ली की अखंडता को बहाल किया। Norwogonin PC12 कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित ऑक्सीडेंट तनाव को रोकता है ROS और MDA हाइपोक्सिया से प्रेरित सेलुलर ऑक्सीडेंट तनाव के दो महत्वपूर्ण संकेतक हैं। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 3 ए और बी, हाइपोक्सिया एक्सपोजर के बाद पीसी 12 कोशिकाओं में आरओएस और एमडीए की काफी बढ़ी हुई सामग्री देखी गई। नॉरवोगोनिन या रुटिन प्रीट्रीटमेंट ने आरओएस और एमडीए के उत्पादन को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया।

एसओडी, कैट और जीपीएक्स जैसे एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ मुख्य रक्षा प्रणाली के रूप में माने जाते हैं। जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 3c-e, हाइपोक्सिया एक्सपोज़र ने PC12 कोशिकाओं में SOD, CAT और GPx की गतिविधियों को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया। नॉरवोगोनिन या रुटिन के साथ उपचार ने इन परिवर्तनों को उलट दिया और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की गतिविधियों को बहाल कर दिया। इन सभी परिणामों ने संकेत दिया कि नॉरवोगोनिन ने हाइपोक्सिया द्वारा प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ पीसी 12 कोशिकाओं की रक्षा की।