ओलिगोसेकेराइड्स विभेदन के समूह को कम करके गुर्दे की तीव्र क्षति को कम करता है 44-गुर्दे की ट्यूबलर कोशिकाओं में मध्यस्थता वाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँ

अमूर्त:तीव्र गुर्दे की चोट (एकेआई)का एक आकस्मिक प्रकरण हैगुर्दे की क्षतिजो आमतौर पर अस्पतालों में भर्ती मरीजों में होता है। आज तक, इसे कम करने के लिए कोई आदर्श उपचार विकसित नहीं किया गया हैएकेआई गंभीरता. ओलिगो-फूकोइडन(एफसी) रीनल इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस को रोकने के लिए विभेदन 44 (सीडी44) के रीनल ट्यूबलर सेल सतह प्रोटीन क्लस्टर में हस्तक्षेप करता है; हालाँकि, AKI पर ऑलिगोसैकेराइड्स का प्रभाव अज्ञात बना हुआ है। इस अध्ययन में, AKI पर ऑलिगोसेकेराइड के प्रभाव की जांच के लिए एफसी, गैलेक्टो-ऑलिगोसेकेराइड (जीओएस), और फ्रुक्टो-ऑलिगोसेकेराइड (एफओएस) का चयन किया गया था। यह साबित हुआ है कि सभी तीन ऑलिगोसेकेराइड आंत द्वारा आंशिक रूप से अवशोषित होते हैं। हमने पाया कि ऑलिगोसेकेराइड्स ने खुराक पर निर्भर रूप से सीडी44 एंटीजेनिसिटी को कम कर दिया और एनआरके में सीडी44, फॉस्फो-जेएनके, एमसीपी, आईएल, और टीएनएफ की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को दबा दिया। वृक्क ट्यूबलर कोशिकाएं। इस बीच, CD44 siRNA अभिकर्मक और JNK अवरोधक SP600125 ने फॉस्फो-जेएनके और साइटोकिन्स की हाइपोक्सिया-प्रेरित अभिव्यक्ति को कम कर दिया। CD44 के लिगैंड, हाइलूरोनन ने CD44 और फॉस्फो-जेएनके पर ऑलिगोसेकेराइड के प्रभाव का प्रतिकार किया। इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट के लिए सर्जरी के 2 दिन बाद, ओलिगोसेकेराइड्स ने AKI चूहों में गुर्दे की सूजन, सीरम क्रिएटिन, एमसीपी {{23 }}, आईएल {{24 }}, और टीएनएफ- को कम कर दिया। सर्जरी के 7 दिन बाद किडनी की रिकवरी को बढ़ावा मिला। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एफसी, जीओएस और एफओएस वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित सीडी44/जेएनके कैस्केड और साइटोकिन्स को रोकते हैं, जिससे एकेआई चूहों में एकेआई और गुर्दे की सूजन में सुधार होता है। इसलिए,ऑलिगोसेकेराइड अनुपूरणAKI वाले रोगियों के लिए एक संभावित स्वास्थ्य देखभाल रणनीति है।

कीवर्ड: तीव्र गुर्दे की चोट; विभेदन का समूह 44; फ्रुक्टो-ओलिगोसेकेराइड; गैलेक्टुलिगोसैकेराइड; ऑलिगो-फूकोइडन; सूजन

1 परिचय

तीव्र गुर्दे की चोट(एकेआई) की विशेषता ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर में अचानक कमी और परिणामस्वरूप सीरम क्रिएटिनिन में वृद्धि है। यह क्षति अस्पतालों और गहन देखभाल इकाइयों में भर्ती मरीजों, विशेषकर बुजुर्गों में आम है। इस्केमिया, सेप्सिस और नेफ्रोटॉक्सिसिटी AKI के मुख्य कारण हैं जो अक्सर सह-अस्तित्व में होते हैं और इस प्रकार, निदान और उपचार को जटिल बनाते हैं [1]। गंभीर एकेआई के कारण डिस्चार्ज किए गए मरीजों को प्रतिकूल घटनाओं, जैसे कि क्रोनिक किडनी रोग, हृदय संबंधी घटनाएं, कैंसर और संक्रमण का खतरा होता है [2]। AKI का विकास तेजी से हो रहा है और इसकी गंभीरता से बचने या कम करने के लिए कोई प्रभावी उपचार उपलब्ध नहीं है। विशिष्ट पोषक तत्वों के सेवन से AKI में गुर्दे की ट्यूबलर चोट को कम किया जा सकता है [3]। इसलिए, AKI पर विशिष्ट पोषण के प्रभाव का अध्ययन करने से AKI को सुधारने और डिस्चार्ज किए गए रोगियों के सामने आने वाले जोखिमों में मदद मिलेगी।

सूजन और ल्यूकोसाइट भर्तीAKI के प्रमुख मध्यस्थ हैं। गुर्दे, विशेष रूप से वृक्क ट्यूबलर कोशिकाएं, उत्पन्न करती हैंसूजन संबंधी साइटोकिन्सAKI के दौरान, जैसे कि IL -1, IL -6, मोनोसाइट कीमोआट्रेक्टेंट प्रोटीन -1 (MCP -1), और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर- (TNF- ) [4,5] . ये साइटोकिन्स प्रणालीगत सूजन और ल्यूकोसाइट भर्ती को और प्रेरित करते हैं। यद्यपि कई ल्यूकोसाइट उपसमूह AKI (जैसे कि टी-नियामक कोशिकाएं) पर सुरक्षात्मक प्रभाव डालते हैं, अधिकांश न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स और डेंड्राइटिक कोशिकाएं AKI रिकवरी के लिए हानिकारक हैं [6]। उच्च साइटोकिन स्तर [7] के कारण प्रणालीगत सूजन भी AKI से उबरने के लिए हानिकारक है। गुर्दे द्वारा स्रावित साइटोकिन्स में, एमसीपी -1 मुख्य रूप से ल्यूकोसाइट भर्ती के लिए जिम्मेदार है, आईएल -1 और टीएनएफ- [8,9] सहित विभिन्न साइटोकिन्स पर प्रतिक्रिया करता है, और रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विभिन्न गुर्दे की चोटों के कारण [10]। मानव समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं एचके -2 में, हाइपोक्सिया-प्रेरित एमसीपी -1 अभिव्यक्ति सी-जून एनएच 2- टर्मिनल काइनेज (जेएनके) मार्ग [11] द्वारा मध्यस्थ होती है। पी38 मार्ग वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं [12] में एल्ब्यूमिन-प्रेरित एमसीपी -1 अभिव्यक्ति में भी शामिल है। इसलिए, जेएनके और पी38 मार्गों का विनियमन एकेआई में सूजन और ल्यूकोसाइट भर्ती को प्रभावित कर सकता है।

ओलिगोसैकेराइड्स सैकेराइड पॉलिमर हैं जिनमें 3-10 मोनोसैकेराइड्स होते हैं जो अपचनीय होते हैं और आहार योजक के रूप में कुल उपलब्ध प्रीबायोटिक्स का एक प्रमुख घटक बनते हैं [13]। मानव शरीर में अंतर्ग्रहण किए गए अधिकांश फ्रुक्टो-ऑलिगोसेकेराइड्स (एफओएस) पूरी तरह से कोलोनिक वनस्पतियों द्वारा किण्वित होते हैं, और एक छोटा सा अंश मूत्र में बरामद होता है [14]। गैलेक्टो-ओलिगोसेकेराइड्स (जीओएस) को रक्त में अवशोषित किया जा सकता है और बाद में मूत्र में उत्सर्जित किया जा सकता है [15]। यही स्थिति भूरे समुद्री शैवाल में फ्यूकोइडन पर भी लागू होती है [16]। अवशोषित ऑलिगोसेकेराइड जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं और कोशिका पहचान को प्रभावित कर सकते हैं [17]। हमारे पिछले अध्ययन से पता चलता है कि ऑलिगो-फ्यूकोइडन (एफसी) वृक्क ट्यूबलर कोशिका सतह प्रोटीन सीडी44 और इसके बाह्य कोशिकीय लिगैंड के बीच परस्पर क्रिया में हस्तक्षेप करता है, जिससे वृक्क अंतरालीय फाइब्रोसिस को रोका जा सकता है [18]। CD44 और इसके बाह्य कोशिकीय लिगेंड्स के बीच परस्पर क्रिया JNK सिग्नलिंग मार्ग को बढ़ावा देती है [19]। इसलिए, ऑलिगोसेकेराइड का दैनिक सेवन AKI वाले रोगियों में गुर्दे की सूजन को कम कर सकता है। हालाँकि, AKI पर इन पॉलिमर का प्रभाव अज्ञात बना हुआ है। इस अध्ययन ने हाइपोक्सिया-उपचारित रीनल ट्यूबलर कोशिकाओं और इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) वाले एकेआई चूहों पर एफसी, एफओएस और जीओएस के प्रभाव की जांच की। परिणामों से पता चला कि तीन ऑलिगोसेकेराइड्स ने सीडी44-मध्यस्थ गुर्दे की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबा दिया और एकेआई के बाद की गंभीरता को कम कर दिया। इसलिए, पोषण संबंधी पूरक के रूप में इन पॉलिमर का उपयोग एक नई AKI उपचार रणनीति प्रस्तुत करता है

2। सामग्री और विधि

2.1. सामग्री

FOS (पोलीमराइजेशन की औसत डिग्री <10), GOS (पोलीमराइजेशन की औसत डिग्री <8), और FC (पोलीमराइजेशन की औसत डिग्री <5) सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। कैट नंबर F8052), कार्बोसिंथ (बर्कशायर, यूके, कैट नंबर OG32134), और हाई-क्यू मरीन बायोटेक इंटरनेशनल (ताइपेई, ताइवान)। ओलिगोसेकेराइड्स को डबल-डिस्टिल्ड H2O में घोल दिया गया और 0.22 µm बाँझ फिल्टर (मर्क मिलिपोर, डार्मस्टेड, जर्मनी) का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया। हायल्यूरोनन (एचए) और अभिकर्मक ग्रेड के अन्य सभी रसायन सिग्मा से प्राप्त किए गए थे। जेएनके (एससी-7345), फॉस्फो-जेएनके (एससी-6254), एमसीपी-1 (एससी-52701), आईएल-1 (एससी{{17) के खिलाफ एंटीबॉडी }}), और टीएनएफ- (sc-52746) सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (डलास, TX, यूएसए) से खरीदे गए थे। सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (डेनवर, एमए, यूएसए) से पी38 (9212) और फॉस्फो-पी38 (9211) के खिलाफ एंटीबॉडी प्राप्त की गईं। Ly6G (ab25377) और F4/80 (ab100790) के खिलाफ एंटीबॉडी Abcam (कैम्ब्रिज, यूके) से खरीदी गई थीं। एचआईएफ-1 (एनबी100-105) के खिलाफ एंटीबॉडी नोवस बायोलॉजिकल (सेंटेनियल, सीओ, यूएसए) से खरीदे गए थे।

2.2. कोश पालन

चूहा समीपस्थ वृक्क ट्यूबलर कोशिकाएँ (NRK-52E) और माउस मैक्रोफेज लाइन RAW264.7 खाद्य उद्योग अनुसंधान और विकास संस्थान (सिंचु, ताइवान) से खरीदे गए थे; एंटीबायोटिक/एंटिफंगल समाधान और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक डीएमईएम में संवर्धित; और CO2 इनक्यूबेटर में 37 ◦C और 95% आर्द्रता पर रखा गया। 70% संगम तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को सीरम मुक्त माध्यम में संवर्धित किया गया और प्रयोग से पहले रात भर ऊष्मायन किया गया। हाइपोक्सिया प्रयोग के लिए, एनआरके -52ई कोशिकाएं और एनेरो पैक (मित्सुबिशी गैस केमिकल अमेरिका, न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए) को आयताकार जार (मित्सुबिशी गैस केमिकल अमेरिका) में जमा किया गया था, और पूरे सेटअप को 37 में रखा गया था। ◦C इनक्यूबेटर 4 घंटे के लिए। फिर कोशिकाओं को सामान्य परिस्थितियों में रात भर संवर्धित किया गया।

2.3. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

संक्षेप में, प्रत्येक लेन पर 15 माइक्रोग्राम एनआरके-52ई प्रोटीन लाइसेट लागू किया गया था, और परिणामों का विश्लेषण वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा किया गया था। बायोसॉफ्ट (कैम्ब्रिज, यूके) के क्वांटिस्कैन सॉफ्टवेयर द्वारा पांच स्वतंत्र प्रयोगों से सापेक्ष प्रोटीन बैंड स्तर की मात्रा निर्धारित की गई थी।

2.4. CD44 का लघु हस्तक्षेप (si)RNA अभिकर्मक

चूहा CD44 siRNA (4390771) थर्मो साइंटिफिक (वॉलथम, एमए, यूएसए) से खरीदा गया था। 70% संगम तक बढ़ने के बाद, कोशिकाओं को निर्माता के निर्देशों के अनुसार लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक (थर्मो साइंटिफिक) का उपयोग करके siRNA से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया।

2.5. कोशिका प्रसार परख

हाइपोक्सिक एनआरके -52ई कोशिकाओं को 24 घंटे तक सुसंस्कृत करने के बाद, उसी माध्यम का उपयोग RAW264.7 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट (2000 कोशिकाएं/वेल) में संवर्धित करने के लिए किया गया। ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एसआरबी परख किट (एबीकैम, कैट नंबर एबी235935) का उपयोग करके RAW264.7 कोशिकाओं के प्रसार का विश्लेषण किया गया।

2.6. सीडी44 एंटीजेनेसिटी परीक्षण

रीकॉम्बिनेंट चूहा CD44 को R&D सिस्टम्स (मिनियापोलिस, MN, USA, कैट नं. 6577-CD) से प्राप्त किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार HA के साथ बाइंडिंग प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया था। संक्षेप में, सीडी44 एंटीजेनेसिटी पर ओलिगोसेकेराइड के प्रभाव की जांच करने के लिए 20 एनजी/एमएल पुनः संयोजक चूहे सीडी44 को 10 मिनट के लिए एफसी, एफओएस, या जीओएस की विभिन्न सांद्रता के साथ मिलाया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार मिश्रण का विश्लेषण CD44 ELISA किट (Abcam, Cat. No. ab213928) का उपयोग करके किया गया।

2.7. प्रायोगिक पशु और वृक्क आईआरआई

आठ सप्ताह के नर 129S1/SvImJ चूहों को लास्को टेक्नोलॉजी (ताइपेई, ताइवान) से खरीदा गया था। सभी पशु प्रयोगों को ताइपे मेडिकल यूनिवर्सिटी कमेटी ऑफ एक्सपेरिमेंटल एनिमल केयर एंड यूज़ (अनुमोदन संख्या एलएसी -2019-0511) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड द्वारा गठित किया गया था। आईआरआई प्रेरण के लिए, चूहों (21-23 ग्राम वजन) को पार्श्व चीरा लगाकर 30 मिनट के लिए द्विपक्षीय वृक्क पेडिकल क्लैंपिंग के अधीन किया गया था [20]। चूहों को ऑपरेशन से पहले आइसोफ्लुरेन के साथ इनहेलेंट एनेस्थीसिया द्वारा एनेस्थेटाइज किया गया था। गुर्दे के पेडिकल्स की क्लैंपिंग को छोड़कर, शम-संचालित चूहों को एक समान ऑपरेशन से गुजरना पड़ा। आईआरआई सर्जरी के 1 दिन पहले से 2 दिन बाद तक सभी चूहों को मौखिक गैवेज के माध्यम से ओलिगोसेकेराइड खिलाया गया। प्रयोगात्मक चूहों को तीसरे दिन और सातवें दिन के परिणामों के लिए n=8 के साथ निम्नलिखित पांच समूहों में विभाजित किया गया था: (1) दिखावटी समूह; (2) एकेआई समूह; (3) एकेआई समूह को एफसी (10 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) खिलाया गया; (4) AKI समूह को FOS (10 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) खिलाया गया; और (5) एकेआई समूह को जीओएस (10 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) दिया गया। सर्जरी के 3 या 7 दिन बाद चूहों की बलि दी गई, और जैव रासायनिक विश्लेषक और एलिसा किट का उपयोग करके रक्त एकत्र किया गया और उसका विश्लेषण किया गया। AKI के विकास का आकलन करने के लिए प्रत्येक चूहे के सीरम क्रिएटिनिन स्तर का विश्लेषण किया गया। किडनी आकारिकी की जांच फॉर्मेलिन-निर्धारित 2 माइक्रोन पैराफिन अनुभागों में आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) धुंधलापन और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधलापन (आईएचसी) द्वारा की गई थी।

2.8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला हो जाना

गुर्दे के ऊतकों को पैराफिन में एम्बेडेड 4% बफर पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ तय किया गया था, और अल्ट्राविज़न क्वांटो डिटेक्शन सिस्टम एचआरपी डीएबी किट (थर्मो साइंटिफिक, फ़्रेमोंट, सीए, यूएसए) के साथ धुंधला करने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्राइम एंटीबॉडी के साथ संकरण के लिए 2 माइक्रोन वर्गों में काटा गया था। .

2.9. पीएएस धुंधला हो जाना

निर्माता के निर्देशों के अनुसार किडनी के हिस्सों को पीएएस स्टेन किट (एबीकैम, कैट नंबर एबी150680) से दाग दिया गया।

2.10. एलिसा परख

एनआरके -52 ई कोशिकाओं के सुसंस्कृत माध्यम और प्रयोगात्मक चूहों के सीरम नमूने एकत्र किए गए और एमसीपी -1 एलिसा किट (एबीकैम, कैट नंबर एबी208979) और आईएल -1 का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। एलिसा किट (एबकैम, कैट नं. ab197742)। सीरम नमूनों का विश्लेषण टीएनएफ-एलिसा किट (आर एंड डी सिस्टम्स, कैट नंबर एमटीए 00 बी) और न्यूट्रोफिल जिलेटिनेज-एसोसिएटेड लिपोकेलिन (एनजीएएल) एलिसा किट (आरएंडडी सिस्टम्स, कैट नंबर एमएलसीएन20) का उपयोग करके भी किया गया था। निर्माता के निर्देश.

2.11. सांख्यिकीय परीक्षण

छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके दोनों समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित किए गए थे। पी मानों के लिए अंतर को महत्वपूर्ण माना गया<0.05

3. परिणाम

3.1. ओलिगोसेकेराइड्स हाइपोक्सिक एनआरके-52ई कोशिकाओं में सीडी44 और साइटोकिन्स में वृद्धि को रोकता है

एफसी, एफओएस और जीओएस के साथ उपचारित एनआरके -52ई कोशिकाओं में सीडी44 अभिव्यक्ति की निगरानी सबसे पहले वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं पर ओलिगोसेकेराइड के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए की गई थी। हाइपोक्सिया-प्रेरित CD44 अभिव्यक्ति को सभी तीन ऑलिगोसेकेराइड द्वारा 0.05–0.5 mg/mL (चित्र 1A) की सीमा में बाधित किया गया था। इसलिए, निम्नलिखित सेल प्रयोगों में 0.1 मिलीग्राम/एमएल की ऑलिगोसेकेराइड खुराक का उपयोग किया गया था। तैयार प्रणाली में, हाइपोक्सिया उपचार ने उल्लेखनीय रूप से एनआरके -52 ई कोशिकाओं में हाइपोक्सिया मार्कर एचआईएफ -1 की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जो दर्शाता है कि कोशिकाएं हाइपोक्सिया अवस्था में थीं (चित्र 1बी)। हाइपोक्सिया ने फॉस्फोराइलेटेड जेएनके, एमसीपी -1, आईएल -1 और टीएनएफ- के स्तर को बढ़ा दिया, लेकिन ऑलिगोसेकेराइड्स (चित्र 1बी, सी) से उपचारित कोशिकाओं में नहीं। जेएनके अभिव्यक्ति हाइपोक्सिक कोशिकाओं में बढ़ी लेकिन एफसी-उपचारित या एफओएस-उपचारित कोशिकाओं में नहीं। जीओएस ने हाइपोक्सिक कोशिकाओं में जेएनके अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया लेकिन फॉस्फोराइलेटेड जेएनके के अपग्रेडेशन को दबा दिया। इसलिए, ऑलिगोसेकेराइड्स वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित जेएनके सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन और साइटोकिन अभिव्यक्ति को रोक सकते हैं। हालाँकि एफसी और जीओएस ने हाइपोक्सिक कोशिकाओं में फ़ॉस फ़ोराइलेटेड पी38 को अपग्रेड किया, लेकिन हाइपोक्सिक कोशिकाओं में इस प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं हुई। यह खोज इंगित करती है कि P38 एनआरके -52ई कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाता है।

3.2. सीडी44 और जेएनके हाइपोक्सिक एनआरके-52ई कोशिकाओं में साइटोकाइन वृद्धि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं

सीडी44, फॉस्फोराइलेटेड जेएनके और वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति ऑलिगोसेकेराइड्स से प्रभावित थी, लेकिन उनके संबंध को स्पष्ट किया जाना बाकी है। हाइपोक्सिक कोशिकाओं में जेएनके सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन और साइटोकिन अभिव्यक्ति में सीडी44 की भूमिका की जांच करने के लिए, एनआरके -52ई कोशिकाओं को सीडी44 सीआरएनए की विभिन्न खुराक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। CD44 siRNA ने 50 और 100 PM पर हाइपोक्सिया-बढ़ी हुई CD44 अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक अवरुद्ध कर दिया और फॉस्फोराइलेटेड JNK, MCP{10}}, IL-1, और TNF- (चित्र 2A) के स्तर में हाइपोक्सिया-प्रेरित वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से रोक दिया। जेएनके अभिव्यक्ति पर सीडी44 अवरोधन का प्रभाव siRNA खुराक से संबंधित था। हाइपोक्सिक कोशिकाओं में जेएनके की अभिव्यक्ति CD44 siRNA द्वारा 50 pM पर प्रेरित की गई थी लेकिन 100 pM पर बाधित हो गई थी। दोनों खुराकों ने फॉस्फोराइलेटेड जेएनके के अपग्रेडेशन को दबा दिया। जेएनके के लिए चयनात्मक अवरोधक, एसपी600125, ने हाइपोक्सिक एनआरके-52ई कोशिकाओं (चित्र 2बी) में एमसीपी-1, आईएल-1 और टीएनएफ- की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया। इन परिणामों से पता चलता है कि हाइपोक्सिया-प्रेरित साइटोकिन्स पर CD44 siRNA अभिकर्मक का निरोधात्मक प्रभाव फॉस्फोराइलेटेड जेएनके में कमी के लिए जिम्मेदार है।

चित्र 1. हाइपोक्सिक एनआरके-52ई कोशिकाओं में सीडी44 सिग्नल ट्रांसडक्शन पर ऑलिगोसेकेराइड का निरोधात्मक प्रभाव। कोशिकाओं को एफसी, एफओएस, या जीओएस से 3{7}} मिनट तक उपचारित किया गया और फिर हाइपोक्सिक कल्चर के अधीन किया गया। वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। (ए) सीडी44 अभिव्यक्ति पर ऑलिगोसेकेराइड्स का खुराक-निर्भर प्रभाव। (बी) सीडी से संबंधित संकेतों पर ऑलिगोसेकेराइड का प्रभाव। ओलिगोसेकेराइड सांद्रता 0.1 मिलीग्राम/एमएल निर्धारित की गई थी। प्रोटीन बैंड में सापेक्ष वृद्धि को बार चार्ट फॉर्म (सी) में भी प्रस्तुत किया गया है। परिणाम माध्य ± एसडी (एन=4) के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

चित्र 2. एनआरके -52 ई कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित सूजन प्रतिक्रियाओं में सीडी 44 और जेएनके की भूमिका। वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। (ए) फॉस्फोराइलेटेड जेएनके और साइटोकिन्स पर सीडी44 सीआरएनए ट्रांसफ़ेक्शन का निरोधात्मक प्रभाव। (बी) साइटोकिन्स पर एसपी600125 का निरोधात्मक प्रभाव। हाइपोक्सिया उपचार से पहले 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को 20 µM SP600125 से उपचारित किया गया। प्रोटीन बैंड में सापेक्ष वृद्धि को बार चार्ट के रूप में भी प्रस्तुत किया गया है। परिणाम माध्य ± एसडी (एन=4) के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

3.3. वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं में हाइपोक्सिया-प्रेरित साइटोकिन स्राव मैक्रोफेज प्रसार को बढ़ावा देता है

सूजन AKI में गुर्दे की चोट का मध्यस्थ है। इसलिए, ल्यूकोसाइट्स पर ओलिगोसैचा सवारी के प्रभाव की जांच की गई। चित्र 3ए से पता चलता है कि एफसी, एफओएस और जीओएस ने मैक्रोफेज RAW264.7 कोशिकाओं के प्रसार को प्रभावित नहीं किया। RAW264.7 कोशिकाओं के प्रसार को हाइपोक्सिक एनआरके -52ई कोशिकाओं (चित्रा 3बी) के लिए {{5}घंटे के कल्चर माध्यम द्वारा बढ़ावा दिया गया था, लेकिन हाइपोक्सिक एनआरके{8}ई कोशिकाओं के लिए माध्यम द्वारा नहीं। ऑलिगोसैकेराइड्स। पहले वाले में बाद वाले की तुलना में एमसीपी-1 और आईएल-1 का स्तर अधिक था (चित्र 3सी, डी)। सभी तीन ऑलिगोसेकेराइड्स ने हाइपोक्सिक एनआरके -52 ई कोशिकाओं के संवर्धन माध्यम में एमसीपी -1 और आईएल -1 को काफी कम कर दिया। इसलिए, एफसी, एफओएस और जीओएस हाइपोक्सिक रीनल ट्यूबलर कोशिकाओं में साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति और स्राव को कम कर सकते हैं और परिणामस्वरूप, घायल रीनल ट्यूबलर कोशिकाओं के कारण होने वाली सूजन को कम कर सकते हैं।