अमूर्त

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा(शेंक) वाइट, ओरोबैंचेसी परिवार की एक बहुमूल्य खाद्य-औषधि घरेलू जड़ी-बूटी है, जिसकी खेती चीन के दक्षिणी झिंजियांग में व्यापक रूप से की जाती है। इसके प्रमुख बायोएक्टिव फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड घटक,इचिनाकोसाइडऔरएक्टियोसाइड (वर्बास्कोसाइड), एंटी-ऑक्सीकरण, एंटी-सूजन और प्रतिरक्षा विनियमन सहित कई औषधीय गतिविधियां प्रदान करता है। अमानकीकृत पारंपरिक प्रसंस्करण प्रक्रियाएं अक्सर इन मूल सक्रिय यौगिकों के पर्याप्त नुकसान का कारण बनती हैं, जिससे औषधीय और कार्यात्मक-खाद्य अनुप्रयोग सीमित हो जाते हैं।सिस्टैंच ट्यूबुलोसाकाढ़े के टुकड़े. इस शोध का उद्देश्य नए सिरे से आधुनिक प्रसंस्करण मापदंडों को अनुकूलित करना हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसाएक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड की रिकवरी को अधिकतम करने के लिए स्लाइस, और एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव और एंटी-इंफ्लेमेटरी बायोएक्टिविटी के साथ-साथ सेलुलर स्तर पर इष्टतम रूप से संसाधित काढ़े के टुकड़ों के अंतर्निहित आणविक तंत्र को स्पष्ट करता है।

स्लाइस की मोटाई, भाप लेने की अवधि और ओवन-सुखाने के तापमान के लिए उपयुक्त सीमाओं की जांच के लिए एकल-कारक प्रयोग किए गए। दोहरे मूल्यांकन संकेतक के रूप में एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड सामग्री का उपयोग करते हुए, बहु-कारक इंटरैक्शन मॉडल स्थापित करने के लिए एक तीन-कारक तीन-स्तरीय बॉक्स-बेनकेन प्रतिक्रिया-सतह पद्धति को अपनाया गया था। इसके बाद, लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस)-उत्तेजित RAW264.7 माउस मैक्रोफेज सेल मॉडल लिपिड पेरोक्सीडेशन और तीव्र सूजन क्षति का अनुकरण करने के लिए बनाया गया था। एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव क्षमता का आकलन करने और सिग्नल-ट्रांसडक्शन मार्गों का पता लगाने के लिए एमटीटी, आरओएस फ्लोरोसेंट डिटेक्शन, एलिसा और वेस्टर्न ब्लॉट सहित जैव रासायनिक परीक्षणों की एक श्रृंखला लागू की गई थी।

प्रायोगिक परिणामों के अनुसार, इष्टतम प्रसंस्करण मापदंडों को 0.6 सेमी की स्लाइस मोटाई, 6 मिनट के लिए भाप उपचार और 57 डिग्री पर सुखाने का तापमान निर्धारित किया गया था। इस व्यावहारिक प्रसंस्करण स्थिति के तहत, एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड की मापी गई सामग्री क्रमशः 7.25% और 31.62% तक पहुंच गई, जो सैद्धांतिक भविष्यवाणी मूल्यों के साथ अच्छी स्थिरता दिखाती है। सेल-आधारित परीक्षण से पता चला कि इसे बेहतर तरीके से संसाधित किया गया हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसाकाढ़े-टुकड़े के अर्क ने एलपीएस-चुनौतीपूर्ण RAW264.7 मैक्रोफेज में नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) और मैलोनडायल्डिहाइड (MDA) सांद्रता को काफी कम कर दिया। इस बीच, इसने ग्लूटाथियोन (जीएसएच) सामग्री में वृद्धि के साथ-साथ सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), कैटालेज (सीएटी), लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) की इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधियों को उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया। टीएनएफ‑, आईएल‑1 और आईएल‑6 सहित प्रो-इंफ्लेमेटरी मध्यस्थों के स्राव स्तर को भी खुराक पर निर्भर तरीके से दबा दिया गया था। वेस्टर्न-ब्लॉट डिटेक्शन ने इसकी पुष्टि कीसिस्टैंच ट्यूबुलोसाअर्क ने p38/AKT/JNK/NF‑κB सिग्नलिंग कैस्केड के भीतर प्रमुख प्रोटीनों के अत्यधिक फॉस्फोराइलेशन को रोका।

संक्षेप में, यह अनुकूलित आधुनिक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल प्रभावी रूप से विशिष्ट फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (एक्टोसाइड और इचिनाकोसाइड) की पैदावार में सुधार करता है।सिस्टैंच ट्यूबुलोसाकाढ़े के टुकड़े. प्रसंस्कृत हर्बल सामग्री एलपीएस-प्रेरित मैक्रोफेज चोट मॉडल में प्रमुख एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव और विरोधी-भड़काऊ प्रभाव डालती है, जिसका औषधीय तंत्र आंशिक रूप से p38/AKT/JNK/NF-κB सूजन सिग्नलिंग अक्ष के अति-सक्रियण को रोककर महसूस किया जाता है। यह कार्य मानकीकृत औद्योगिक विनिर्माण के लिए विश्वसनीय तकनीकी पैरामीटर प्रदान करता है और इससे प्राप्त एंटी-ऑक्सीडेंट कार्यात्मक भोजन के विकास के लिए प्रयोगात्मक सहायता प्रदान करता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसा.

कीवर्ड: सिस्टैंच ट्यूबुलोसा; काढ़ा-टुकड़ा प्रसंस्करण प्रौद्योगिकी; एक्टियोसाइड; इचिनाकोसाइड; एंटी-ऑक्सीडेटिव तनाव; RAW264.7 मैक्रोफेज; p38/AKT/JNK/NF‑κB सिग्नलिंग मार्ग

1 परिचय

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा(शेंक) वाइट ओरोबैंचेसी परिवार से संबंधित है, और इसका मांसल पपड़ीदार तना आधिकारिक औषधीय हिस्सा है। यह रेगिस्तानी औषधीय पौधा बड़े पैमाने पर चीन के शुष्क दक्षिणी झिंजियांग में लगाया जाता है। पारंपरिक चीनी हर्बल अभ्यास में,सिस्टैंच ट्यूबुलोसाकिडनी-यांग को टोन करने, सार-रक्त को फिर से भरने और मल त्याग को आराम देने के दस्तावेजी चिकित्सीय कार्यों के साथ एक क्लासिक टॉनिक जड़ी बूटी के रूप में कार्य करता है। चिकित्सकीय रूप से इसका उपयोग कमर और घुटनों के दर्द, कमजोरी, गुर्दे की कमी के कारण होने वाली बांझपन और आंतों की सूखापन से प्रेरित कब्ज आदि से राहत के लिए किया जाता है।

फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स सबसे महत्वपूर्ण बायोएक्टिव मार्करों के लिए खड़े हैंसिस्टैंच ट्यूबुलोसा. चीनी फार्माकोपिया निर्धारित करता है कि योग्य औषधीय सामग्रियों के लिए इचिनाकोसाइड प्लस एक्टियोसाइड की कुल सामग्री 1.50% से कम नहीं होनी चाहिए। फिर भी, वर्तमान मुख्यधारा विनिर्माणसिस्टैंच ट्यूबुलोसाकाढ़े के टुकड़े अभी भी ज्यादातर प्राचीन मैनुअल वर्कफ़्लो का पालन करते हैं: ताजी कच्ची जड़ी-बूटियों को भिगोना, अच्छी तरह से गीला करना, टुकड़े करना और प्राकृतिक रूप से सुखाना या वाइन-स्टीमिंग प्रसंस्करण। इन पारंपरिक दृष्टिकोणों में सटीक मात्रात्मक तकनीकी विशिष्टताओं का अभाव है। फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड की थर्मल अस्थिरता अक्सर प्रसंस्करण के दौरान गंभीर सक्रिय-घटक गिरावट का कारण बनती है, जो अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता को कम करती है और बड़े पैमाने पर उच्च गुणवत्ता वाले उत्पादन को प्रतिबंधित करती है। वर्तमान में, केवल सीमित अनुसंधान ही प्रसंस्करण-प्रौद्योगिकी अनुकूलन को जैविक-गतिविधि सत्यापन के साथ जोड़ता है; अधिकांश अध्ययन सेलुलर कार्यात्मक सत्यापन के बिना केवल रासायनिक घटक सामग्री का पता लगाते हैं, जिससे औद्योगिक परिवर्तन के लिए अंतराल पैदा होता है।

ऑक्सीडेटिव तनाव कई पुरानी चयापचय और सूजन संबंधी बीमारियों के लिए मुख्य रोगविज्ञानी ट्रिगर के रूप में कार्य करता है। अत्यधिक प्रतिक्रियाशील-ऑक्सीजन-प्रजाति (आरओएस) संचय रेडॉक्स होमियोस्टैसिस को बाधित करता है, आगे चलकर मैक्रोफेज अति-सक्रियण और बड़े पैमाने पर प्रो-इंफ्लेमेटरी-साइटोकिन रिलीज को उत्तेजित करता है, जिससे ऑक्सीकरण और सूजन के बीच एक दुष्चक्र बनता है। मौजूदा औषधीय जांच ने यह साबित कर दिया हैCistanche-उत्पत्ति फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड में एंटीऑक्सीडेंट और एंटी-इंफ्लेमेटरी गुण होते हैं। पिछले पशु प्रयोगों ने यह प्रदर्शित किया हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसाकुल ग्लाइकोसाइड्स ने Nrf2/HO-1 एंटीऑक्सीडेंट सिग्नलिंग को सक्रिय करके सेप्सिस कृंतक मॉडल में यकृत की चोट में सुधार किया। लिगनेन-ग्लाइकोसाइड घटकों को पृथक किया गयासिस्टैंच ट्यूबुलोसाRAW264.7 मैक्रोफेज में PI3K/AKT मार्ग को संशोधित करके LPS-उत्तेजित सूजन प्रतिक्रियाओं को कम कर सकता है। हालाँकि, नव-अनुकूलित प्रसंस्करण स्थितियों के तहत निर्मित काढ़े के टुकड़े शक्तिशाली एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव बायोएक्टिविटी को बनाए रखते हैं या नहीं, इसका व्यवस्थित मूल्यांकन नहीं किया गया है। ठोस आणविक नियामक तंत्र को अभी भी गहन अन्वेषण की आवश्यकता है।

LPS-उत्तेजित RAW264.7 मैक्रोफेज एक अच्छी तरह से स्वीकृत इन-विट्रो सूजन-ऑक्सीडेटिव-क्षति मॉडल है, जिसे प्राकृतिक-उत्पाद एंटी-ऑक्सीडेंट और एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभावों का आकलन करने के लिए व्यापक रूप से अपनाया जाता है। इस अध्ययन में, हम पहले उच्च एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड पैदावार को लक्षित करने वाले मानकीकृत स्लाइसिंग-स्टीमिंग-सुखाने वाले तकनीकी पैरामीटर प्राप्त करने के लिए बॉक्स-बेनकेन प्रतिक्रिया-सतह अनुकूलन के बाद एकल-कारक स्क्रीनिंग करते हैं। अनुकूलित डेकोक्शन-पीस उत्पाद प्राप्त करने के बाद, हम हर्बल अर्क तैयार करते हैं और एलपीएस-प्रेरित RAW264.7 सेलुलर चोट मॉडल को अपनाते हैं। ऑक्सीडेटिव-तनाव-जैव रासायनिक-मार्कर माप, साइटोकिन एलिसा मात्रा का ठहराव और वेस्टर्न-ब्लॉट पाथवे विश्लेषण सहित कई प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों का उपयोग एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव प्रभावकारिता और सिग्नल-ट्रांसडक्शन तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया जाता है। यह शोध उच्च गुणवत्ता के पायलट-स्केल उत्पादन के लिए व्यावहारिक प्रक्रिया पैरामीटर प्रदान करता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसास्थिर एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव गतिविधि के साथ काढ़े के टुकड़े, और झिंजियांग से प्राप्त कार्यात्मक भोजन और आहार-पूरक उत्पादों के बाद के विकास के लिए प्रयोगात्मक नींव रखते हैं।सिस्टैंच ट्यूबुलोसासंसाधन।

2। सामग्री और विधि

2.1 कच्चा माल, अभिकर्मक और उपकरण

ताजासिस्टैंच ट्यूबुलोसामांसल तनों को चीन के झिंजियांग उइघुर स्वायत्त क्षेत्र के हॉटन से शरद ऋतु में काटा गया था। RAW264.7 माउस मोनोसाइट-मैक्रोफेज ल्यूकेमिया सेल लाइन प्रोसेल लाइफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (वुहान, चीन) से खरीदी गई थी। क्रोमैटोग्राफ़िक-ग्रेड एसीटोनिट्राइल और मेथनॉल की आपूर्ति मर्क (जर्मनी) द्वारा की गई थी। संदर्भ-मानक पदार्थ इचिनाकोसाइड और एक्टियोसाइड (शुद्धता 98% से अधिक या उसके बराबर) बीजिंग नॉर्थ वेये मेट्रोलॉजी टेक्नोलॉजी रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्राप्त किए गए थे। डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) सिग्मा-वीईटीईसी (यूएसए) से खरीदा गया था। डीएमईएम उच्च-ग्लूकोज माध्यम, बीसीए कुल-प्रोटीन परख किट थर्मो फिशर साइंटिफिक (यूएसए) के उत्पाद थे। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) बीआई (इज़राइल) से खरीदा गया था। पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन डबल-एंटीबॉडी समाधान हाइक्लोन (यूएसए) से आया है। एनओ, एमडीए, एसओडी, सीएटी, जीएसएच के लिए वाणिज्यिक परख किट बेयोटाइम बायोटेक्नोलॉजी (शंघाई, चीन) से हासिल की गईं। एलडीएच डिटेक्शन किट और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस,ई कोलाई055:बी5) सोलरबियो (बीजिंग, चीन) से प्राप्त किए गए थे।

प्रमुख प्रयोगशाला उपकरणों में शिमदज़ु उच्च-प्रदर्शन तरल-क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली, लैबटेक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता, स्विंग-प्रकार उच्च गति चीनी-हर्ब पुलवेराइज़र, थर्मोस्टेटिक ब्लास्ट-सुखाने वाला ओवन, स्टीम-पॉट उपकरण, बायोटेक सिनर्जी-एच 1 मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर, एफए 1204 एन इलेक्ट्रॉनिक विश्लेषणात्मक संतुलन शामिल हैं। CF1524R रेफ्रिजेरेटेड सेंट्रीफ्यूज, BSC‑1300IIA2 जैव सुरक्षा कैबिनेट और BDS200‑PH उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप।

2.2 एकल-कारक प्रसंस्करण प्रयोग

ताजासिस्टैंच ट्यूबुलोसामांसल तनों को विभिन्न मोटाई (0.2 सेमी, 0.4 सेमी, 0.6 सेमी, 0.8 सेमी, 1.0 सेमी, 1.2 सेमी) के स्लाइस में काटा गया। स्लाइस को अलग-अलग अवधि (3 मिनट, 6 मिनट, 9 मिनट, 12 मिनट, 15 मिनट, 18 मिनट, 21 मिनट) तक भाप में पकाया गया। बाद में सामग्रियों को विभिन्न तापमान प्रवणताओं (परिवेश 25 डिग्री, 40 डिग्री, 50 डिग्री, 60 डिग्री, 70 डिग्री, 80 डिग्री) के तहत सुखाया गया। पूरी तरह से सूखे काढ़े-टुकड़े के नमूनों को चूर्णित किया गया और बाद में एचपीएलसी घटक मात्रा निर्धारण के लिए 40-मेष छलनी के माध्यम से छलनी किया गया।

2.3 एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड सामग्री का निर्धारण

नमूना-समाधान तैयार करना: बंद शंक्वाकार फ्लास्क में 1.0 ग्राम चूर्णित काढ़ा-टुकड़ा पाउडर को सटीक रूप से तौलें। 100 एमएल 50% मेथनॉल समाधान ठीक से जोड़ें। 30 मिनट भिगोने के बाद 40 मिनट अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण करें। ठंडा होने के बाद, 50% मेथनॉल के साथ विलायक वजन घटाने की भरपाई करें, समान रूप से मिलाएं और स्थैतिक निपटान की अनुमति दें। एचपीएलसी इंजेक्शन के लिए सतह पर तैरनेवाला को 0.22 माइक्रोन माइक्रोपोरस झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था।

संदर्भ-मानक-समाधान तैयार करना: एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड संदर्भ पदार्थों की उचित मात्रा का सटीक वजन करना, वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क के अंदर 50% मेथनॉल के साथ घोलना, सीरियल-ग्रेडिएंट मानक समाधान तैयार करना, 0.22 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के साथ फ़िल्टर करना।

क्रोमैटोग्राफ़िक सेटअप: COSMOSIL C₁₈ विश्लेषणात्मक स्तंभ; मोबाइल-चरण प्रणाली: मोबाइल-चरण ए: 0.1% फॉस्फोरिक एसिड जलीय घोल; मोबाइल-चरण बी: एसीटोनिट्राइल। डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य 330 एनएम के रूप में सेट किया गया था; स्तंभ तापमान 35 डिग्री ; प्रवाह दर 1 एमएल/मिनट। एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड सामग्री की मात्रात्मक गणना के लिए बाहरी-मानक विधि लागू की गई थी। व्यापक मूल्यांकन स्कोर=(इचिनाकोसाइड सामग्री × 50%) + (एक्टियोसाइड सामग्री × 50%)। व्यापक स्कोर प्रसंस्करण-स्थिति प्रदर्शन के लिए समग्र मूल्यांकन संकेतक के रूप में कार्य करते हैं।

2.4 बॉक्स‑बेनकेन रिस्पांस‑सतह प्रायोगिक डिजाइन

एकल-कारक प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर, डिज़ाइन-विशेषज्ञ 13.0 सॉफ़्टवेयर का उपयोग बॉक्स-बेनकेन तीन-कारक तीन-स्तरीय प्रयोगात्मक व्यवस्था को लागू करने के लिए किया गया था। स्लाइस की मोटाई (X₁, सेमी), स्टीमिंग-उपचार समय (X₂, मिनट), सुखाने का तापमान (X₃, डिग्री) को स्वतंत्र चर के रूप में चुना गया था। एक्टियोसाइड सामग्री (Y₁, %) और इचिनाकोसाइड सामग्री (Y₂, %) प्रतिक्रिया मान थे। प्रयोगों के सत्रह समूह आयोजित किए गए। प्रत्येक कारक के लिए शून्य स्तर का चयन एकल-कारक परीक्षणों में प्राप्त इष्टतम पैरामीटर के अनुसार किया गया था। प्रतिक्रिया-सतह परीक्षण समाप्त करने के बाद, मॉडल विचरण-विश्लेषण, 3डी-प्रतिक्रिया-सतह प्लॉटिंग और स्थिति-भविष्यवाणी पूरी की गई। सैद्धांतिक अनुमानित मापदंडों को परिचालन योग्य वास्तविक उत्पादन मूल्यों में समायोजित करने के बाद व्यावहारिक सत्यापन प्रयोग किए गए।

2.5 सेल कल्चर और नमूना तैयार करना

काढ़ा-टुकड़ा कच्चा माल अनुकूलित प्रसंस्करण स्थितियों के तहत निर्मित किया गया था। उपर्युक्त नमूना-तैयारी प्रोटोकॉल के बाद हर्बल पाउडर निकाला गया, जिसे रोटरी वाष्पीकरण द्वारा केंद्रित किया गया और ठोस अर्क पाउडर प्राप्त करने के लिए वैक्यूम-सूखा गया। स्टॉक समाधान डीएमएसओ में अर्क पाउडर को घोलकर तैयार किया गया था, जिसे सेलुलर प्रयोगों के लिए पूर्ण डीएमईएम माध्यम (10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) के साथ पतला किया गया था; अंतिम डीएमएसओ कार्यशील एकाग्रता 0.1% (v/v) से नीचे नियंत्रित की गई थी। RAW264.7 मैक्रोफेज को DMEM पूर्ण माध्यम में 37 डिग्री, 5% CO₂ आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर वातावरण में संवर्धित किया गया।

2.6 एमटीटी साइटोटोक्सिसिटी परख

RAW264.7 कोशिकाओं को 8 × 10⁴ कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व पर 96-वेल माइक्रोप्लेट्स पर रखा गया था। प्रायोगिक समूहों में विलायक-नियंत्रण समूह (0.1% डीएमएसओ माध्यम), एलपीएस-मॉडल समूह (अंतिम एलपीएस एकाग्रता 1 यूजी/एमएल), और एकाधिक शामिल थेसिस्टैंच ट्यूबुलोसासांद्रण समूह निकालें (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 यूजी/एमएल)। हर्बल नमूने के साथ 2 घंटे पूर्व ऊष्मायन के बाद, एलपीएस (1 यूजी/एमएल अंतिम एकाग्रता) को विलायक-नियंत्रण समूह को छोड़कर प्रत्येक समूह में पूरक किया गया था। ऊष्मायन 24 घंटे तक जारी रहा। फिर एमटीटी अभिकर्मक (5 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ा गया और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। सतह पर तैरनेवाला हटाएं, प्रति कुएं 150 μL डीएमएसओ डालें, 15 मिनट के लिए 37 डिग्री पर हिलाएं। 490 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण मूल्य माइक्रोप्लेट रीडर पर पढ़ा गया था, और सेल-उत्तरजीविता दर की गणना की गई थी। अनुवर्ती कार्यात्मक परीक्षणों के लिए सुरक्षित कार्य-सांद्रण सीमा निर्धारित की गई थी।

2.7 इंट्रासेल्युलर आरओएस मापन

RAW264.7 मैक्रोफेज को प्रति कुएं 4 × 10⁵ कोशिकाओं के घनत्व पर छह-वेल प्लेटों पर टीका लगाया गया था। कोशिका पालन के बाद, समूहीकरण उपचार किया गया: विलायक-नियंत्रण समूह, एलपीएस-मॉडल समूह, और सीटी अर्क उपचार समूह (12.5, 25, 50, 100 यूजी/एमएल)। नमूने के साथ 2-घंटे पूर्व-उपचार के बाद, विलायक-नियंत्रण समूह को छोड़कर एलपीएस 1 यूजी/एमएल जोड़ा गया, 24 घंटे इनक्यूबेट करें। किट निर्देशों के अनुसार फ्लोरोसेंट-जांच लोडिंग विधि का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर का पता लगाया गया था। प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रतिदीप्ति माइक्रोप्लेट रीडर (उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 525 एनएम) से मापा गया था।

2.8 एनओ, एमडीए, एसओडी, कैट, एलडीएच और जीएसएच का पता लगाना

संबंधित सेल उपचार के बाद, ग्रीज़ प्रतिक्रिया को अपनाते हुए एनओ माप के लिए सेल-कल्चर सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। संलग्न कोशिकाओं को पूर्व-ठंडा पीबीएस से धोया गया था, बर्फ पर रखा गया था, सेल लाइसेट सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूजेशन ({{1%) आर/मिनट, 4 डिग्री, 5 मिनट) के बाद काटा गया था। बीसीए किट ने प्रत्येक नमूने की कुल प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की। किट परिचालन मैनुअल का सख्ती से पालन करते हुए एमडीए, जीएसएच और एंजाइमैटिक गतिविधि संकेतक एसओडी, सीएटी, एलडीएच की सामग्री की जांच की गई।

2.9 एलिसा प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का निर्धारण

RAW264.7 कोशिकाओं को कुल 16 घंटों के लिए नमूना पूर्व-उपचार और एलपीएस उत्तेजना प्राप्त हुई। सेल-कल्चर सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला में टीएनएफ‑, आईएल‑1, आईएल‑6 की सांद्रता वाणिज्यिक एलिसा किट द्वारा निर्धारित की गई थी।

2.10 वेस्टर्न-ब्लॉट विश्लेषण

LPS और नमूना सह-ऊष्मायन के 45 मिनट के बाद, RAW264.7 कोशिकाओं को प्रोटीज-फॉस्फेटस अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक RIPA लिसीस बफर का उपयोग करके लाइज़ किया गया। सेल लाइसेट को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री से कम पर 10 000 आर/मिनट पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। बीसीए किट ने कुल प्रोटीन सांद्रता की मात्रा निर्धारित की। नमूना प्रोटीन (प्रति लेन 50 ग्राम) को 5 मिनट के लिए 100 डिग्री धातु स्नान में विकृत किया गया। एसडीएस-पेज जेल वैद्युतकणसंचलन ने लक्ष्य प्रोटीन को अलग कर दिया, जिसे बाद में पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया गया। 5% स्किम-दूध टीबीएसटी समाधान के साथ झिल्ली को 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था। p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑κB p65, p‑NF‑κB p65 और GAPDH को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी को रात भर 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। टीबीएसटी धोने के बाद, संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया था। बार-बार धोने के बाद, प्रोटीन-बैंड इमेजिंग के लिए ईसीएल अल्ट्रा-सेंसिटिव केमिलुमिनसेंट अभिकर्मक लगाया गया था। सापेक्ष फॉस्फोराइलेशन-प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के मूल्यांकन के लिए बैंड ग्रे-स्केल मात्रात्मक विश्लेषण लागू किया गया था।

2.11 सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड प्रिज्म 8.0.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग सांख्यिकीय गणना और ग्राफ प्लॉटिंग के लिए किया गया था। प्रायोगिक मात्रात्मक-डेटा परिणाम माध्य ± मानक विचलन (\\(\\bar{x} \\pm s\\)) के रूप में व्यक्त किए गए थे। अंतर-समूह तुलना के लिए वन-वे एनोवा और उसके बाद पोस्ट-हॉक मल्टीपल-तुलना परीक्षण लागू किया गया था। \\(पी<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. प्रायोगिक परिणाम

3.1 एकल-कारक प्रयोगों के परिणाम

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0.4 सेमी) ने आंतरिक-पदार्थ रिलीज में बाधा डाली, जिससे अंतिम पता लगाने योग्य घटक सामग्री कम हो गई। निश्चित स्टीमिंग-समय (10 मिनट) और सुखाने-तापमान (60 डिग्री) के तहत, 0.4 सेमी स्लाइस मोटाई ने उच्चतम व्यापक मूल्यांकन स्कोर हासिल किया।

स्टीमिंग-उपचार अवधि के परिणाम: जब स्लाइस की मोटाई 0.4 सेमी तय की गई और सुखाने का तापमान 60 डिग्री पर रखा गया, तो अपर्याप्त स्टीमिंग समय पौधे-सेल संरचना को पर्याप्त रूप से नष्ट नहीं कर सका, जिससे सक्रिय यौगिकों को घुलना मुश्किल हो गया। एक बार भाप लेने का समय 6 मिनट से अधिक हो गया, तो अधिक भाप लेने से हर्बल ऊतक क्षतिग्रस्त हो गए और इचिनाकोसाइड और एक्टियोसाइड का क्षरण हुआ। इसलिए प्रारंभिक रूप से 6 मिनट को बेहतर स्टीमिंग-प्रसंस्करण अवधि के रूप में पहचाना गया था।

ओवन-सुखाने-तापमान ढाल प्रयोगों के लिए: स्लाइस की मोटाई 0.4 सेमी और भाप लेने का समय 6 मिनट तय किया गया था। निश्चित सीमा के भीतर सुखाने के तापमान में वृद्धि के साथ घटक सामग्री में वृद्धि हुई। एक बार जब सुखाने का तापमान 60 डिग्री से अधिक हो गया, तो उच्च तापमान वाले थर्मल अपघटन के कारण लक्ष्य-पदार्थ सामग्री में उल्लेखनीय गिरावट आई। इसलिए बाद की प्रतिक्रिया-सतह अनुकूलन के लिए प्रारंभिक इष्टतम सुखाने-तापमान की स्थिति के रूप में 60 डिग्री को चुना गया था।

3.2 बॉक्स‑बेनकेन रिस्पांस‑सतह अनुकूलन और सत्यापन

डिज़ाइन मैट्रिक्स के अनुसार बॉक्स-बेनकेन प्रयोगात्मक रन के सत्रह समूह समाप्त हो गए। वेरिएंस-विश्लेषण परिणामों ने संकेत दिया कि एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड सामग्री दोनों के लिए प्रतिगमन मॉडल ने सांख्यिकीय महत्व हासिल किया (\\(पी)<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >स्लाइस की मोटाई.

मॉडल गणितीय गणना के माध्यम से, सैद्धांतिक इष्टतम प्रसंस्करण पैरामीटर थे: स्लाइस मोटाई 0.600 सेमी, स्टीमिंग-उपचार समय 5.685 मिनट, सुखाने का तापमान 57.009 डिग्री। वास्तविक औद्योगिक-संचालन व्यवहार्यता को ध्यान में रखते हुए, मापदंडों को स्लाइस की मोटाई 0.6 सेमी, भाप लेने का समय 6 मिनट, सुखाने का तापमान 57 डिग्री पर समायोजित किया गया था। तीन समानांतर सत्यापन प्रयोग किए गए। इस व्यावहारिक स्थिति के तहत, मापी गई एक्टियोसाइड सामग्री 7.25% थी, इचिनाकोसाइड सामग्री 31.62% तक पहुंच गई। मापे गए मूल्यों और सैद्धांतिक भविष्यवाणी के बीच विचलन 5% से नीचे रहा, जिससे साबित हुआ कि यह प्रतिक्रिया-सतह मॉडल वास्तविक-विश्व डेकोक्शन-टुकड़ा उत्पादन के मार्गदर्शन के लिए विश्वसनीय और लागू था।

3.3 अनुकूलित-प्रसंस्कृत की साइटोटोक्सिसिटी स्क्रीनिंगसिस्टैंच ट्यूबुलोसाRAW264.7 कोशिकाओं में निकालें

एमटीटी साइटोटॉक्सिसिटी परिणामों से पता चला कि 0-100 यूजी/एमएल तक की अर्क सांद्रता ने RAW264.7 मैक्रोफेज पर कोई स्पष्ट विषाक्त प्रभाव नहीं डाला, और यहां तक ​​कि हल्के सेल-प्रसार-प्रचार करने की प्रवृत्ति भी प्रदर्शित की। जब उपचार सांद्रता 200 ug/mL और 400 ug/mL तक चढ़ गई, तो विलायक-नियंत्रण समूह की तुलना में कोशिका-अस्तित्व दर में काफी कमी आई, जो एकाग्रता-निर्भर साइटोटोक्सिसिटी को दर्शाता है। इसलिए, 12.5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL की सांद्रता प्रवणता को बाद के ऑक्सीडेटिव-तनाव और सूजन-संबंधी सेलुलर परीक्षणों के लिए सुरक्षित कार्य सांद्रता के रूप में चुना गया था।

3.4 सिस्टैंच ट्यूबुलोसाएलपीएस-उत्तेजित मैक्रोफेज में कम इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर निकालें

विलायक-नियंत्रण समूह की तुलना में, एलपीएस-मॉडल समूह की इंट्रासेल्युलर आरओएस फ्लोरोसेंट तीव्रता में काफी वृद्धि हुई (\\(पी)<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration सिस्टैंच ट्यूबुलोसाअर्क, खुराक पर निर्भर फैशन में इंट्रासेल्युलर आरओएस संचय में गिरावट आई। प्रत्येक दवा-उपचार समूह ने आरओएस बनाम एलपीएस-मॉडल समूह (\\(पी) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी दिखाई<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 एनओ और एमडीए सामग्री पर प्रभाव

NO सक्रिय मैक्रोफेज द्वारा जारी क्लासिक सूजन मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है। एमडीए स्वर्ण-मानक बायोमार्कर है जो लिपिड-पेरोक्साइडेशन ऑक्सीडेटिव चोट को दर्शाता है। विलायक-नियंत्रण समूह की तुलना में, LPS उत्तेजना ने RAW264.7 कोशिकाओं में NO और MDA सामग्री को उल्लेखनीय रूप से बढ़ा दिया (\\(P)<0.001\)). Different dosages of सिस्टैंच ट्यूबुलोसाअर्क उपचार से NO सांद्रता काफी कम हो सकती है। एमडीए संकेतक के लिए: 12.5 यूजी/एमएल समूह ने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सुधार नहीं किया; 25‑100 यूजी/एमएल एकाग्रता समूहों में एमडीए स्तर (\\(पी) में उल्लेखनीय रूप से कमी आई है<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 एंटीऑक्सीडेंट-संबंधित जैव रासायनिक संकेतक एसओडी, सीएटी, एलडीएच, जीएसएच पर प्रभाव

एलपीएस चुनौती के बाद, इंट्रासेल्युलर एसओडी, सीएटी, एलडीएच एंजाइमैटिक-गतिविधि के साथ-साथ जीएसएच सामग्री विलायक-नियंत्रण समूह (\\(पी) के सापेक्ष तेजी से गिर गई<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed सिस्टैंच ट्यूबुलोसाडेकोक्शन-पीस अर्क एलपीएस से प्रेरित ऑक्सीडेटिव अपमान के खिलाफ सेलुलर अंतर्जात एंटी-ऑक्सीडेंट रक्षा क्षमता को बहाल कर सकता है।

3.7 प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकाइन टीएनएफ‑, आईएल‑1, आईएल‑6 रिलीज पर निरोधात्मक प्रभाव

एलिसा जांच परिणामों से पता चला कि एलपीएस उत्तेजना ने RAW264.7 मैक्रोफेज (\\(पी) से टीएनएफ‑, आईएल‑1, आईएल‑6 के स्राव को दृढ़ता से बढ़ावा दिया<0.001\)). With the increase of सिस्टैंच ट्यूबुलोसाउपचार एकाग्रता निकालने के बाद, इन तीन प्रमुख प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की रिलीज मात्रा को उत्तरोत्तर दबा दिया गया, जिससे स्पष्ट खुराक-प्रतिक्रिया सहसंबंध प्रस्तुत हुआ। इसने पुष्टि की कि हर्बल अर्क सक्रिय मैक्रोफेज से प्रो-इंफ्लेमेटरी-साइटोकिन स्राव को रोककर शक्तिशाली एंटी-इंफ्लेमेटरी कार्य करता है।

3.8 p38/AKT/JNK/NF‑κB सिग्नलिंग‑पाथवे फॉस्फोराइलेशन पर विनियमन

वेस्टर्न-ब्लॉट प्रयोगात्मक डेटा से पता चला है कि पी-पी38/पी38, पी-एकेटी/एकेटी, पी-जेएनके/जेएनके और पी-एनएफ-κबी/एनएफ-κबी का अनुपात एलपीएस-मॉडल समूह बनाम विलायक-नियंत्रण समूह (\\(पी) में काफी बढ़ गया था।<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage सिस्टैंच ट्यूबुलोसाअर्क हस्तक्षेप में उल्लेखनीय रूप से p‑p38/p38 और p‑JNK/JNK अनुपात में कमी आई (\\(P)<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that सिस्टैंच ट्यूबुलोसाकाढ़े-टुकड़े के अर्क ने p38/AKT/JNK/NF-κB सिग्नलिंग नेटवर्क के हाइपर-फॉस्फोराइलेशन सक्रियण को दबाकर ऑक्सीडेटिव-भड़काऊ चोट से राहत दी।

4. चर्चा

पारंपरिक प्रसंस्करण आवश्यकताओं को चीनी फार्माकोपिया में दर्ज किया गया हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसामुख्य रूप से स्लाइस की मोटाई, भाप लेने की अवधि और सुखाने के तापमान के लिए सटीक संख्यात्मक मापदंडों को निर्दिष्ट किए बिना अशुद्धता हटाना, धोना, गीला करना, टुकड़ा करना और सुखाना शामिल है। गैर-मानक मैन्युअल प्रसंस्करण वाणिज्यिक डेकोक्शन-पीस उत्पादों की गुणवत्ता में बड़े उतार-चढ़ाव लाता है। फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (इचिनाकोसाइड और एक्टियोसाइड) थर्मली-लैबाइल बायोएक्टिव यौगिक हैं। अनुचित तापन समय या तापमान रासायनिक अपघटन को गति देगा और औषधीय महत्व को कम करेगा। हमारे एकल-कारक प्रयोगों से पता चला कि अपर्याप्त और अत्यधिक भाप के साथ-साथ अत्यधिक-उच्च सुखाने वाले तापमान से लक्ष्य ग्लाइकोसाइड घटकों का नुकसान होगा। इसके अलावा बॉक्स-बेनकेन मल्टी-फैक्टर ऑप्टिमाइज़ेशन ने व्यावहारिक विनिर्माण पैरामीटर प्राप्त किए: स्लाइस की मोटाई 0.6 सेमी, स्टीमिंग 6 मिनट, सुखाने 57 डिग्री। इस स्थिति के तहत, एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड सामग्री 7.25% और 31.62% तक पहुंच गई, जो फार्माकोपिया की न्यूनतम गुणवत्ता सीमा से कहीं अधिक है। यह अनुकूलित प्रोटोकॉल झिंजियांग मूल के मानकीकृत औद्योगिक प्रसंस्करण के लिए व्यवहार्य मात्रात्मक तकनीकी संदर्भ प्रदान करता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसा.

ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन आपस में जुड़ी हुई रोग प्रक्रियाएं हैं। अतिरिक्त आरओएस लिपिड पेरोक्सीडेशन को प्रेरित करता है और एमडीए उत्पन्न करता है, जो जन्मजात-प्रतिरक्षा मैक्रोफेज को और सक्रिय करता है। सक्रिय मैक्रोफेज प्रचुर मात्रा में NO और मल्टीपल प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का स्राव करते हैं, जो इसके विपरीत इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन को बढ़ाते हैं, जिससे स्व-प्रवर्धित ऑक्सीडेटिव-इंफ्लेमेटरी दुष्चक्र बनता है। प्राकृतिक पौधों से प्राप्त एंटी-ऑक्सीडेंट पदार्थ अंतर्जात एंटी-ऑक्सीडेंट एंजाइम प्रणाली को बढ़ाकर और सूजन-संकेत पारगमन को रोककर इस रोग संबंधी लूप को तोड़ सकते हैं। इस इन-विट्रो अध्ययन में, बेहतर ढंग से संसाधित किया गयासिस्टैंच ट्यूबुलोसाएलपीएस-उत्तेजित RAW264.7 मैक्रोफेज में एसओडी, कैट, एलडीएच गतिविधियों और जीएसएच सामग्री को बढ़ाते हुए डेकोक्शन-पीस अर्क ने आरओएस, एनओ और एमडीए स्तर को कम किया। इसके साथ ही, इसने टीएनएफ‑, आईएल‑1, आईएल‑6 प्रो‑इंफ्लेमेटरी-साइटोकिन स्राव को रोक दिया, जो एकीकृत एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव और एंटी-इंफ्लेमेटरी क्षमता का प्रदर्शन करता है।

माइटोजेन-सक्रिय-प्रोटीन-किनेज परिवार के अणु p38, JNK, AKT और NF-κB के साथ मिलकर मैक्रोफेज सूजन-ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता करने वाले केंद्रीय सिग्नल-ट्रांसडक्शन हब की रचना करते हैं। एलपीएस उत्तेजना पर, अपस्ट्रीम सिग्नल पी38, जेएनके और एकेटी के फॉस्फोराइलेशन सक्रियण को ट्रिगर करता है, जो क्रमिक रूप से एनएफ-κबी पी65 सबयूनिट फॉस्फोराइलेशन और परमाणु अनुवाद को बढ़ावा देता है। सक्रिय एनएफ-κबी प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य करता है और प्रो-इंफ्लेमेटरी-साइटोकिन और ऑक्सीडेटिव-तनाव-संबंधित जीन के बड़े बैचों का प्रतिलेखन शुरू करता है। हमारे वेस्टर्न-ब्लॉट परिणामों ने यह प्रदर्शित कियासिस्टैंच ट्यूबुलोसाअर्क p38, JNK, AKT और NF‑κB p65 के फॉस्फोराइलेशन को दबा सकता है। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि इसकी एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव और एंटी-इंफ्लेमेटरी जैव-सक्रियता, कम से कम आंशिक रूप से, p38/AKT/JNK/NF-κB सिग्नलिंग अक्ष के अति-सक्रियण को अवरुद्ध करके प्राप्त की जाती है।

वर्तमान शोध में कई सीमाएँ हैं। सभी कार्यात्मक सत्यापन इन-विट्रो सेल-कल्चर स्तर तक सीमित हैं। अनुकूलित काढ़े के टुकड़ों के इन-विवो फार्माकोडायनामिक प्रदर्शन को सत्यापित करने के लिए आगे पशु-मॉडल इन-विवो प्रयोगों की आवश्यकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन में काढ़े के टुकड़ों से कुल मिश्रित अर्क को अपनाया गया, इसलिए हम इचिनाकोसाइड, एक्टियोसाइड और अन्य छोटे माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के व्यक्तिगत योगदान को अलग नहीं कर सकते हैं। अनुवर्ती अनुसंधान संबंधित एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव क्षमता की तुलना करने और संगतता-प्रभाव जांच करने के लिए मोनोमर यौगिकों को अलग कर सकता है। फिर भी, हमारा वर्तमान कार्य अभी भी विकास के लिए व्यावहारिक प्रसंस्करण-प्रौद्योगिकी पैरामीटर और प्रारंभिक यंत्रवत साक्ष्य प्रदान करता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसा-संबंधित स्वास्थ्य-देखभाल उत्पाद।

5। उपसंहार

निष्कर्ष में, बॉक्स‑बेनकेन प्रतिक्रिया‑सतह पद्धति (स्लाइस मोटाई 0.6 सेमी, भाप 6 मिनट, सुखाने का तापमान 57 डिग्री) द्वारा अनुकूलित आधुनिक प्रसंस्करण वर्कफ़्लो एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइड सामग्री में काफी वृद्धि कर सकता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसाकाढ़े के टुकड़े. इन सर्वोत्तम रूप से संसाधित हर्बल स्लाइस से तैयार अर्क एलपीएस-प्रेरित RAW264.7 मैक्रोफेज क्षति के खिलाफ प्रमुख एंटी-ऑक्सीडेटिव-तनाव और एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभाव डालते हैं। अंतर्निहित तंत्र इंट्रासेल्युलर एंटीऑक्सिडेंट-रक्षा प्रणाली की बहाली और p38/AKT/JNK/NF-κB सूजन सिग्नलिंग-मार्ग के अत्यधिक सक्रियण के निषेध से संबंधित है। यह अध्ययन मानकीकृत औद्योगिक उत्पादन और कार्यात्मक-खाद्य शोषण के लिए ठोस प्रयोगात्मक आधार प्रदान करता हैसिस्टैंच ट्यूबुलोसासंसाधन।

संदर्भ

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