ऑक्सीडेटिव तनाव, निष्क्रिय ऊर्जा चयापचय, और अस्थिर करने वाले न्यूरोट्रांसमीटर ने नकली हेलिओक्स संतृप्ति डाइविंग के एक चूहे के मॉडल में सेरेब्रल मेटाबोलिक प्रोफाइल को 4. 0 एमपीए Ⅱ में बदल दिया।

ऊतक निष्कर्षण प्रक्रिया

जैसा कि रिपोर्ट किया गया है [18] ऊतक के नमूनों से ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स की निष्कर्षण प्रक्रिया एक मामूली संशोधन थी। पहले से तौले गए जमे हुए ऊतक के नमूनों को बर्फ पर पिघलाया गया और फिर बर्फीले-ठंडे एचपीएलसी-ग्रेड मेथनॉल-क्लोरोफॉर्म-पानी विलायक प्रणाली (4 {{18} 0 μL, 4 0 0) में यांत्रिक समरूपीकरण के अधीन किया गया। μL, और 285 μL, क्रमशः, प्रति 100 मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक) एक ऊतक होमोजेनाइज़र (प्रीसेलिस 24, बर्टिन टेक्नोलॉजीज, विलेर्बन, फ्रांस) का उपयोग करके। परिणामी होमोजेनेट्स को 30 मिनट की अवधि के लिए बर्फ पर रखा गया और फिर 4˚C पर 10 मिनट की अवधि के लिए 12,{12}} xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। फिर प्रत्येक नमूने के सतह पर तैरनेवाला को हटा दिया गया और फ्रीज ड्रायर (FD-1A-80, BIOCOOL, चीन) में ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स युक्त पाउडर प्राप्त करने के लिए लियोफिलाइज़ किया गया। प्रत्येक पाउडर नमूने को बाद में 0.1 प्रतिशत टीएसपी वाले 550 μL पीबीएस बफर के साथ पुनर्गठित किया गया था, और फिर सभी नमूनों को अच्छी तरह से रोटा-मिश्रित किया गया था और 4˚C पर 20 मिनट की अवधि के लिए 12, 000 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। फिर 500 μL सतह पर तैरनेवाला का एक विभाज्य 5.0 मिमी-व्यास एनएमआर ट्यूब (नॉरेल, यूके) में स्थानांतरित किया गया था। कॉर्टेक्स नमूने में प्रोटीन का निष्कर्षण सिद्धांत बिना किसी संशोधन के पहले वर्णित था। कॉर्टेक्स नमूनों की सटीक मात्रा को एक समरूपीकरण बफर (HEPES 25 mmol/L, pH 7.4, MgC{{32%) mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1.3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, में डाला गया था। 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100, एप्रोटीनिन, पेपस्टैटिन ए और ल्यूपेप्टिन 10 यूजी/एमएल प्रत्येक) और बर्फ के स्नान में मैन्युअल रूप से समरूप बनाया गया। मिश्रण को 4˚C पर 10 मिनट की अवधि के लिए 1,{43}} xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला का उपयोग ब्रैडफोर्ड परीक्षण का उपयोग करके मात्राबद्ध प्रोटीन सांद्रता के लिए किया गया था।

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जैव रासायनिक परख

चयापचय एंजाइमों Na-KATPase और AChE और न्यूरोट्रांसमीटर DA, E, NE, 5HT, और GABA की मात्रा निर्धारित करने के लिए परख किट के साथ एक संवेदनशील, प्रतिस्पर्धी एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (ELISA) लागू किया गया था। एलिसा ने निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख किट के साथ कॉर्टिकल ऊतक में एसओडी, एमडीए और जीपीएक्स के स्तर को भी निर्धारित किया।

एनएमआर माप

ऊतक मेटाबोलाइट्स की कुशल मात्रा का निर्धारण 6 {{11} 0 की आवृत्ति पर संचालित होने वाली उच्च-संवेदनशीलता क्रायोजेनिक जांच से सुसज्जित तरल उच्च-रिज़ॉल्यूशन ब्रूकर एवांस-III एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर आधारित एक विश्लेषणात्मक प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। 298 K पर 1 H अवलोकन के लिए 17 मेगाहर्ट्ज। एक जल-दबाया हुआ एक-आयामी 1 H ZGPR (TOPSPIN संस्करण 3. 0, ब्रुकर बायोस्पिन) पल्स अनुक्रम (RD -90˚-ACQ) लागू किया गया था प्रत्येक नमूने के लिए एनएमआर डेटा प्राप्त करें। चार डमी स्कैन और 128 क्षणिकों को 10.0 सेकेंड की छूट देरी और 2.73 सेकेंड के अधिग्रहण समय के साथ 20 पीपीएम की वर्णक्रमीय चौड़ाई का उपयोग करके 32 के डेटा बिंदुओं के समय डोमेन में दर्ज किया गया था। फूरियर परिवर्तन से पहले सभी मुक्त प्रेरण क्षय (एफआईडी) पर 0.3 हर्ट्ज का एक घातीय रेखा-प्रसारण फ़ंक्शन और 64 K डेटा बिंदुओं पर शून्य-भरण लागू किया गया था। रासायनिक बदलाव असाइनमेंट की पुष्टि करने के लिए चयनित नमूनों पर मानक पल्स कार्यक्रमों का उपयोग करके स्पंदित क्षेत्र ढाल सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (जीसीओएसवाई) और 2डी होमोन्यूक्लियर कुल सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (टीओसीएसवाई) के साथ अतिरिक्त द्वि-आयामी एनएमआर तकनीकों को नियोजित किया गया था। सभी स्पेक्ट्रा अधिग्रहण में निरंतर नमूना वितरण के लिए एक स्वचालित नमूना परिवर्तक का उपयोग किया गया था।

मेटाबोलाइट की पहचान और पुष्टि

स्पेक्ट्रा पर व्यक्तिगत अनुनादों के स्थान के आधार पर एनएमआर संकेतों की पहचान चेनोमक्स एनएमआर सुइट वी. 8.4 सॉफ्टवेयर पैकेज (मूल्यांकन संस्करण) में की गई थी। कुछ मेटाबोलाइट असाइनमेंट की पुष्टि 1 H-1 H COSY, 1 H-1 H TOCSY, सार्वजनिक NMR डेटाबेस जैसे COLMAR और ह्यूमन मेटाबोलोम से निकाली गई स्केलर कपलिंग की जानकारी के रूप में मेटाबोलाइट्स के रासायनिक बदलाव, युग्मन स्थिरांक और बहुलता पैटर्न पर विचार करते हुए की गई थी। डेटाबेस (HMDB), और साहित्य [18, 19]।

बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रत्येक 1डी 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम को प्रीप्रोसेस करने के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रीप्रोसेसिंग प्रोटोकॉल वही था जो हमारे पिछले काम [20] में वर्णित है। 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा को मेस्ट्रेनोवा (मेस्ट्रेलैब रिसर्च, एसएल, स्पेन) का उपयोग करके चरणबद्ध और बेसलाइन-सही किया गया था, और प्रत्येक मेटाबोलाइट के वर्णक्रमीय क्षेत्र को एक बाल्टी में एकीकृत किया गया था। सभी 1डी 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा में कार्बनिक विलायक सिग्नल और अवशिष्ट एच2ओ/एचओडी सिग्नल क्षेत्र की प्रतिध्वनि हटा दी गई थी। सभी स्पेक्ट्रा में एक 0.{{30}}03 हर्ट्ज बकेट प्रक्रिया और वर्णक्रमीय तीव्रता के योग को 10000 से गुणा करके सामान्यीकरण लागू किया गया था। अतिव्यापी संकेतों के कारण विभेदक मेटाबोलाइट्स की गलत व्याख्या से बचने के लिए अगले चरण के विश्लेषण के लिए केवल एक शिखर में सबसे बड़े बकेट मान का चयन किया गया था। इसके बाद, 47 मेटाबोलाइट्स के इंटीग्रल बकेट को निकाला गया और यूनीवेरिएट और मल्टीवेरिएट डेटा विश्लेषण के अधीन किया गया। प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) द्वारा अंधाधुंध विश्लेषण और आंशिक न्यूनतम वर्ग-विभेदक विश्लेषण (पीएलएस-डीए) द्वारा भेदभाव विश्लेषण और अव्यक्त संरचनाओं विभेदक विश्लेषण (ओपीएलएस-डीए) के लिए ऑर्थोगोनल अनुमान SIMCA-P प्लस 14.0 सॉफ्टवेयर पैकेज (यूमेट्रिक्स) का उपयोग करके किया गया था। , उमेआ, स्वीडन) को इकाई विचरण डेटा तक बढ़ाया गया। पीसीए और पीएलएस-डीए स्कोर प्लॉट को पहले और दूसरे प्रमुख घटकों (टी[1], टी[2]) के साथ चित्रित किया गया था, जबकि ओपीएलएस-डीए स्कोर प्लॉट में टी[1] और ऑर्थोगोनल घटक (टू[1) का उपयोग किया गया था। ]). ओवरफिटिंग के खिलाफ भेदभाव मॉडल की मजबूती का परीक्षण करने के लिए पैरामीटर Q2 (सह), R2Y (सह), और R2X (सह) की गणना की गई [21]। जैसा कि पहले बताया गया है, Q2 - 0.4 का गुणवत्ता मूल्यांकन मान एक विश्वसनीय मॉडल माना जाता है। पहले घटक के साथ सात गुना क्रॉस-वैलिडेशन रणनीति और क्रमपरिवर्तन परीक्षण 200 बार मॉडल ओवरफिटिंग के खिलाफ सुरक्षा के लिए लागू किया गया था और मॉडल की विश्वसनीयता और भरोसेमंदता को और अधिक मान्य किया गया था। यदि Q2 प्रतिगमन रेखा में एक नकारात्मक अवरोधन था और सबसे बाएं बिंदु में फिट किए गए Q2 मान क्रमपरिवर्तित परीक्षण में दाएं बिंदुओं के सभी Q2 मानों से अधिक थे, तो स्थापित ओपीएलएस-डीए मॉडल मजबूत था [22]। मॉडल ओवरफिटिंग से बचाव के लिए डिफ़ॉल्ट 10-फ़ोल्ड क्रॉस-वैलिडेशन रणनीति लागू की गई थी। सामान्य तौर पर, एक गुणवत्ता मूल्यांकन आँकड़ा (Q2) - 0.4 को एक विश्वसनीय मॉडल माना जाता है, जैसा कि पहले बताया गया है। ओपीएलएस-डीए मॉडल से निकाले गए सहसंबंध गुणांक (आर) और वीआईपी मूल्यों का उपयोग उन मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए किया गया था जिन्होंने दो समूहों के बीच अलगाव में महत्वपूर्ण योगदान दिया था। इसके अतिरिक्त, समूहों के बीच मेटाबोलाइट्स के गुना परिवर्तनों की गणना एक फ़ंक्शन का उपयोग करके की गई थी। आईए/आईबी, जहां आईए और आईबी क्रमशः ए और बी समूहों में मेटाबोलाइट इंटीग्रल के लिए औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। समूहों के बीच मेटाबोलाइट विविधताओं को समझने की सुविधा के लिए हीटमैप और बॉक्स चार्ट तैयार किए गए थे।

मेटाबोलाइट इंटीग्रल्स के यूनीवेरिएट आँकड़े

प्रत्येक समूह में मेटाबोलाइट्स का बकेट औसत माध्य ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। एनोवा (विचरण का विश्लेषण) का उपयोग करके यूनीवेरिएट विश्लेषण भी किया गया था। ग्राफपैड प्रिज्म वी 8.4.3 सॉफ्टवेयर (ग्राफ पैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) में लॉग रूपांतरण के बाद दो पूंछों के अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा समूहों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन किया गया था। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतरों को p के मानों द्वारा परिभाषित किया गया था (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

सिस्टम सांख्यिकीय चयापचय सहसंबंध विश्लेषण और श्रेणीबद्ध क्लस्टर विश्लेषण

पियर्सन की सहसंबंध गुणांक गणना और पदानुक्रमित क्लस्टर विश्लेषण छोटी स्क्रिप्ट के साथ आर स्टूडियो (संस्करण 1.4.1717) में मेटाबोलाइट्स के सापेक्ष अभिन्न अंग के आधार पर किया गया था। प्रत्येक समूह जोड़ी के लिए, सहसंबंध मैट्रिक्स को एक पिक्सेल मानचित्र में चित्रित किया गया था जैसा कि साहित्य में वर्णित है [21]। संक्षेप में, एक समूह में प्रत्येक चर के लिए, 0 से कम पी मान के साथ सहसंबंध। 05 को महत्वपूर्ण सांख्यिकीय सहसंबंध माना जाता था और मेटाबोलाइट्स के अव्यक्त संबंधों को चित्रित करने के लिए अंतिम सहसंबंध नेटवर्क का निर्माण करने के लिए रखा गया था। समूह और समूहों के बीच अशांत चयापचय संबंध। लाल वर्ग अधिक महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध दर्शाते हैं। नीले वर्ग अधिक महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध दर्शाते हैं। सफ़ेद वर्ग बिना किसी महत्व के सहसंबंध को दर्शाते हैं। एचएसडी के उत्तरदाताओं के रूप में बुलाए गए सबसे प्रासंगिक सेरेब्रल चयापचय मार्गों और नेटवर्क का विश्लेषण मेटाबोएनालिस्ट 3.0 टूल का उपयोग करके किया गया था। प्रदर्शन किए गए पाथवे टोपोलॉजी विश्लेषण के लिए, रैटस नॉरवेगिकस (चूहा) स्तनधारी पाथवे लाइब्रेरी का चयन किया गया था। इस दृष्टिकोण का उपयोग मार्ग प्रभाव, झूठी खोज दर (एफडीआर), और पी मूल्यों का अनुमान प्रदान करने के लिए भी किया गया था।

एचएसडी और कॉन समूहों से कॉर्टिकल जैव रासायनिक सूचकांक के परिणाम

मस्तिष्क के ऊतकों पर एचएसडी के चयापचय परिवर्तन प्रभावों को मान्य करने के लिए, Na-KATP, AChE, और LDH की ऊर्जा चयापचय-संबंधी चयापचय एंजाइमेटिक गतिविधियों, DA, E, NE, 5HT, और GABA के न्यूरोट्रांसमीटर सहित जैव रासायनिक मापदंडों, औरऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित प्रोटीनकाएसओडी, म्दा, और एचएसडी और कॉन चूहों के इप्सिलैटरल कॉर्टेक्स ऊतकों में जीपीएक्स भी निर्धारित किया गया था (तालिका 1)। नियंत्रण समूह की तुलना में, डीए, ई, एनई और एमडीए के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी, जबकि एचएसडी मॉडल में Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD और Gpx की सामग्री कम हो गई थी। वर्तमान कार्य में प्रयुक्त परख किटों का पता लगाने की सीमा पूरक सामग्री की फ़ाइल में S3 तालिका में सूचीबद्ध की गई थी।

तालिका 1. परख किट के साथ एलिसा द्वारा कॉर्टेक्स ऊतक CON और HSD जानवरों में जैव रासायनिक मापदंडों की मात्रा को मापा गया था। (मतलब ± एसडी)। सांख्यिकीय महत्व को दर्शाता है.

मस्तिष्क ऊतक नमूनों के 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा में मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई

चित्र 3 एचएसडी चूहे के कॉर्टेक्स (चित्र 3ए), हिप्पोकैम्पस (चित्र 3बी) और स्ट्रिएटम (चित्र 3सी) से तीन प्रतिनिधि 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा प्रदर्शित करता है। मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों के 1 एच एनएमआर डेटा के अनुसार प्रमुख मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला की पहचान की गई थी, और वे कार्बनिक अम्ल आयन (लैक्टेट (लाक), मैलोनेट (मालन), सक्सिनेट (सुक), मैलेट (माल), फ्यूमरेट (एफएमए) हैं। ), 2-हाइड्रॉक्सीब्यूटाइरेट (2-एचबी), एसीटेट (ऐस), फॉर्मेट (फॉर), टॉरिन (ताऊ), एस्कॉर्बेट(एएससी), 2-हाइड्रॉक्सीब्यूटाइरेट (2एचआईबी)), अमीनो एसिड (ल्यूसीन (ल्यू), आइसोल्यूसीन (इले), वेलिन (वैल), ऐलेनिन (एएलए), ग्लाइसिन (ग्लाइ), टायरोसिन (टायर), फेनिलएलनिन (पीएचई), एस्पार्टेट (एएसपी), ग्लूटामाइन (ग्लेन), ग्लूटामेट (ग्लू) , थ्रेओनीन (थ्र), सेरीन (सेर), लाइसिन (लिस), एस्पेरेगिन (एएसएन)), न्यूरोट्रांसमीटर (-एमिनोब्यूटाइरेट (जीएबीए)), ऊर्जा से संबंधित मेटाबोलाइट्स (क्रिएटिन (क्रे), एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट ( एएमपी)), फॉस्फोलिपिड संबंधित मेटाबोलाइट्स (ओफॉस्फोएथेनॉलमाइन (पीईए), ओ-फॉस्फोकोलिन (पीचो), एसएन-ग्लिसरो -3-फॉस्फोकोलाइन (जीपीसी)), और अन्य (मायो-इनोसिटोल (एमआई), निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी प्लस) ), निकोटिनु रिक एसिड (निक), एन-एसिटाइलस्पार्टेट (एनएए), निकोटिनमाइड-एडेनिन-डायन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपी प्लस), यूडीपी-एन-गैलेक्टोज (यूडीपीजीए), यूरिडीन (यूआरआई), यूरैसिल (यूरा), सिस्टिडाइन (साइट) , यूरिडीन 5'- मोनोफॉस्फेट (यूएमपी), इनोसिन 5'-मोनोफॉस्फेट (आईएमपी), इनोसिन (इनो), कोलीन (सीओ), कार नाइटीन (कार), ग्लूटाथियोन (जीएसएच)। S1 तालिका मेटाबोलाइट असाइनमेंट पर विस्तृत जानकारी दिखाती है।

मेटाबॉलिक विश्लेषण से मेटाबोलिक प्रोफाइल में बदलाव का पता चला

पीसीए, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में सभी मस्तिष्क निष्कर्षों से 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा का एक खोजपूर्ण और निष्पक्ष विश्लेषण दृष्टिकोण, पहली बार हाइपरबेरिक एक्सपोजर द्वारा 4 {25} {28}} एमएसडब्ल्यू द्वारा संचालित मुख्य चयापचय प्रवृत्तियों को प्रकट करने के लिए बनाया गया था। हेलिओक्स संतृप्ति वातावरण। इंटीग्रल बकेट डेटा के पीसीए (एस1ए-एस1सी चित्र) से प्राप्त पीसी1 बनाम पीसी2 स्कैटिंग प्लॉट से दोनों वर्गीकरणों के बीच कुछ ओवरलैप के साथ एक निश्चित भेदभाव का पता चला। पीएलएस-डीए (एस1ए'-एस1सी' चित्र) और ओपीएलएस-डीए (चित्र 4ए-4सी) मॉडल की पर्यवेक्षित जांच ने समूहों के बीच चयापचय प्रोफाइल के स्पष्ट वर्ग भेदभाव को प्रदर्शित किया। चित्र 4 कॉर्टेक्स क्षेत्र (ए), हिप्पोकैम्पस क्षेत्र (बी), और स्ट्रिएटम क्षेत्र (सी) के लिए ओपीएलएस-डीए मॉडल के स्कोर प्लॉट दिखाता है, जो एचएसडी समूहों और नियंत्रणों के बीच स्पष्ट भेदभाव दिखाता है। R2X और Q2 (S1A'–S1C' चित्र, चित्र 4A-4C) और क्रमपरिवर्तन परीक्षण प्लॉट (चित्र 4'-4C'A) के मानों द्वारा प्रतिबिंबित उच्च स्पष्ट भिन्नता और भविष्यवाणी की अच्छाई ने संकेत दिया उत्पन्न पर्यवेक्षित मॉडल की मजबूती। एस-लाइन प्लॉट्स से निकाले गए सहसंबंध गुणांक (आर), प्रक्षेपण में परिवर्तनीय महत्व (वीआईपी), और गैरपैरामीट्रिक यूनीवेरिएट परीक्षणों से पी-वैल्यू को वर्ग-भेदभाव पैटर्न के लिए जिम्मेदार महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स का आकलन करने के लिए एकत्र किया गया था। इसलिए, तीन मानदंडों में से किसी एक को पूरा करते हुए (आर का पूर्ण मान {{29%).50 से अधिक, वीआईपी का मान 1.0 से अधिक, साथ में पी मान 0.05 से कम), हमने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स का एक पैनल चुना (तालिका 1) CON और HSD समूहों के बीच अलगाव के लिए जिम्मेदार है। तालिका 1 में, 1 से अधिक तह-परिवर्तन मान एचएसडी समूह में बढ़े हुए स्तर को दर्शाते हैं, जबकि 1 से कम तह-परिवर्तन मान एचएसडी समूह में घटे हुए स्तर को दर्शाते हैं। विभेदक मेटाबोलाइट्स के औसत एसडी मान S2 तालिका में सूचीबद्ध हैं। मेटाबोलाइट्स के पदानुक्रमित क्लस्टर विश्लेषण और औसत लिंकेज विधि का उपयोग करते हुए, डेंड्रोग्राम के साथ उत्पन्न हीटमैप (चित्र 5ए-5सी) हीलियम ऑक्सीजन-संतृप्त वातावरण में हाइपरबेरिक एक्सपोजर के कारण होने वाले तीन मस्तिष्क क्षेत्र चयापचय परिवर्तनों के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है।

एचएसडी चूहों के मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में चयापचय संबंधी विकार देखे गए

विभिन्न समूहों में मेटाबोलाइट्स की बाल्टी ऊंचाई का उपयोग करके उपर्युक्त बहुभिन्नरूपी विश्लेषण और यूनीवेरिएट विश्लेषण ने एचएसडी घटनाओं से जुड़े संभावित न्यूरोलॉजिकल चयापचय परिवर्तनों को प्रकट करने वाले भेदभावपूर्ण मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए एक महान कार्य ट्यूब प्रदान की। एचएसडी के कॉर्टेक्स ऊतक में एएमपी, एफएमए, निक और पीएच में वृद्धि और अला, एएसएन, कार, चो, साइट, गाबा, जीएसएच, इनो, लैक, पचो, पीएचई, टायर, उरा और उरी में कमी पाई गई। समूह की तुलना CON समूह से की गई (चित्र 5A, तालिका 1)। इस बीच, हिप्पोकैम्पस में, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr, और Ura भी कम हो गए और HSD समूह में AMP बढ़ गया, जैसा कि उन्होंने कॉर्टेक्स में किया था। इसके अलावा, नियंत्रण के सापेक्ष एचएसडी समूह के हिप्पोकैम्पस अर्क में अपग्रेडित थ्र और डाउनरेगुलेटेड ग्लाइ, एटीपी, ताऊ, छोटा सा भूत, सुक, एएससी और डीएमए व्यक्त किए गए थे (चित्र 5बी, 5डी, तालिका 1)। CONS समूह की तुलना में, Cyt, GABA, Ura, Cho, और Thr की सामग्री भी कम हो गई, जैसा कि कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस में हुआ था। इसके अतिरिक्त, ब्रांच्ड-चेन अमीनो एसिड (बीसीएए, जिसमें ल्यू, इल, वैल) और लिस शामिल हैं, के स्तर में वृद्धि हुई और ग्लेन, एनएए, एनएडी प्लस, एनएडीपी प्लस, एएसपी, एटीपी, ताऊ, आईएमपी के मेटाबोलाइट्स की एक श्रृंखला के स्तर में कमी आई। और सुक, जो हिप्पोकैम्पस में भी कम हो गया, और अन्य दो मेटाबोलाइट्स, इनो और पीसीओ, जो कॉर्टेक्स में भी कम हो गए, एचएसडी समूह चूहों के स्ट्रिएटम ऊतकों में देखे गए (चित्र 5सी, 5डी, तालिका 1)। ऐसे कई मेटाबोलाइट्स हमेशा जटिलता और विविधता के साथ निहित आणविक मार्गों का संकेत देते हैं। विभेदक मेटाबोलाइट्स के अभिन्न बाल्टी मूल्यों को निर्धारित किया गया था, और हेलिओक्स-संतृप्ति-हाइपरबेरिक-एक्सपोज़्ड और नियंत्रण समूहों के बीच उनकी सांद्रता के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण गुना-परिवर्तन को तीन मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए एस 2 तालिका और तालिका 2 में संक्षेपित किया गया है।

चित्र 4. ऑर्थोगोनल आंशिक न्यूनतम वर्ग विभेदक विश्लेषण (ओपीएलएस-डीए) स्कोर प्लॉट और क्रमपरिवर्तन परीक्षण प्लॉट जो कॉर्टेक्स (सीओएनसी) में नियंत्रण समूहों से 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा पर 4 0 0 एमएसडब्ल्यू हेलिओक्स-संतृप्ति एक्सपोजर के प्रभाव को भेदभाव करते हैं। एन=8, एचएसडीसी, एन=8, ए और ए') (आर2एक्स=0.38; क्यू2=0.46), हिप्पोकैम्पस (सीओएनएच, एन {{12} }, एचएसडीएच, एन=8, बी और बी') (आर2एक्स=0.37; क्यू2=0.43), और स्ट्रिएटम (सीओएनएस, एन=8, एचएसडीएस, एन=8, सी और सी') (आर2एक्स=0.39; क्यू2=0.40)। ओपीएलएस-डीए स्कोर प्लॉट में क्यू2 पैरामीटर के मान, जो 0.40 के बराबर या उससे अधिक थे, क्रमपरिवर्तित मॉडल में सबसे बाएं बिंदु के क्यू2 मान के साथ मिलकर सही बिंदु के सभी फिट किए गए क्यू2 मान से अधिक थे (क्रमपरिवर्तन) परीक्षण 80 बार), यह दर्शाता है कि स्थापित ओपीएलएस-डीए मॉडल वैध थे।

Pcho, जो कॉर्टेक्स में भी कम हो गया, HSD समूह के चूहों के स्ट्रिएटम ऊतकों में देखा गया (चित्र 5C, 5D, तालिका 1)। ऐसे कई मेटाबोलाइट्स हमेशा जटिलता और विविधता के साथ निहित आणविक मार्गों का संकेत देते हैं। विभेदक मेटाबोलाइट्स के अभिन्न बाल्टी मूल्यों को निर्धारित किया गया था, और हेलिओक्स-संतृप्ति-हाइपरबेरिक-एक्सपोज़्ड और नियंत्रण समूहों के बीच उनकी सांद्रता के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण गुना-परिवर्तन को तीन मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए एस 2 तालिका और तालिका 2 में संक्षेपित किया गया है।

चित्र 5. कॉर्टेक्स (ए, ए', एचएसडीसी नमूने ऊपरी पैनल में हैं और सीओएनसी निचले पैनल में हैं), हिप्पोकैम्पस (बी, बी', एचएसडीएच) से भेदभावपूर्ण मेटाबोलाइट्स के बाल्टी मूल्यों से प्राप्त हीटमैप और सांख्यिकीय सहसंबंध प्लॉट समूह ऊपरी पैनल में स्थित है और CONH निचले पैनल में है), और स्ट्रिएटम (C, C', HSDS नमूने ऊपरी पैनल में हैं और CONS निचले पैनल में हैं) HSD और CON चूहों के ऊतक। हीटमैप पर मेटाबोलाइट्स को स्तर पैटर्न में समग्र समानता के आधार पर पदानुक्रमित क्लस्टरिंग द्वारा व्यवस्थित किया जाता है। वेन आरेख (डी) एचएसडीसी-सीओएनसी, एचएसडीएच-सीओएनएच और एचएसडीएस-सीओएनएस तुलनाओं के बीच मेटाबोलाइट ओवरलैप को दर्शाता है।

मेटाबोलाइट सहसंबंध विश्लेषण

मेटाबोलाइट्स के बीच या उनके बीच का संबंध चित्र 5ए'-5सी' में बहुत जटिल था। ऊर्जा मेटाबोलाइट्स के लिए, एचएसडीसी में एलएसी बनाम अला के लिए सकारात्मक सहसंबंध, एचएसडीएच में एएमपी बनाम आईएमपी, एचएसडीएस में एटीपी बनाम पीसीओ, एचएसडीएस में एसयूसी बनाम जीएबीए/ग्लान/टायर/एनएए, और एलएसी बनाम थ्र और जीएसएच बनाम के लिए नकारात्मक सहसंबंध एचएसडीएच में सुक, एचएसडीएस में सुक बनाम वैल मेटाबोलाइट सहसंबंध भूखंडों में मौजूद थे। न्यूरोट्रांसमीटर के लिए, HSDC में GABA बनाम कार, CONH में GABA बनाम Cho, और HSDS में GABA बनाम Suc/Ino/Gln के लिए सकारात्मक सहसंबंध मेटाबोलाइट सहसंबंध भूखंडों में मौजूद थे। CONC में GABA बनाम FMA और CONS में GABA बनाम NAA/ Ura/NADP प्लस के लिए नकारात्मक सहसंबंध मेटाबोलाइट सहसंबंध भूखंडों में मौजूद थे। से संबंधित मेटाबोलाइट्स के लिएऑक्सीडेटिव तनाव, दसकारात्मक सहसंबंधएचएसडीसी और सीओएनसी में जीएसएच बनाम एएसएन के लिए, एचएसडीएच में ताऊ बनाम लैक, सीओएनएच में ताऊ बनाम सुक/अला, एचएसडीएच में जीएसएच बनाम सुक के लिए नकारात्मक सहसंबंध, एचएसडीएच में ताऊ बनाम थ्र मेटाबोलाइट सहसंबंध में मौजूद थे। भूखंड.

मेटाबोलॉमिक्स मार्ग विश्लेषण

पाथवे संवर्धन विश्लेषण और पाथवे टोपोलॉजी से पाथवे प्रभाव से युक्त मात्रात्मक पाथवे विश्लेषण ने चयापचय मार्गों की एक श्रृंखला के लिए अत्यधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण एचएसडी-प्रेरित मॉड्यूलेशन का खुलासा किया। पाथवे प्रभाव स्कोर, झूठी खोज दर (एफडीआर) और पी मानों के साथ, चित्र 6 में वर्णित हैं। यदि पी मान 0 से कम थे, तो पाथवे को काफी समृद्ध माना जाता था। पाथवे (मैच स्थिति) के कुल मेटाबोलाइट्स के सापेक्ष प्रोफाइल किए गए मेटाबोलाइट्स (हिट) 1 से अधिक थे; और प्रभाव स्कोर (सापेक्षिक केंद्रीयता के नेटवर्क टोपोलॉजी माप के आधार पर मार्ग में महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित मेटाबोलाइट्स के प्रभाव का संकेत) 0 से अधिक थे। सबसे बड़े चयापचय प्रभाव मूल्य वाले कॉर्टेक्स (चित्र 6 ए) में मार्ग थेफेनिलएलनिन, टायरोसिन, औरट्रिप्टोफैन जैवसंश्लेषण>फेनिलएलनिन चयापचय> पाइरीमिडीन चयापचय > एलानिन, एस्पार्टेट और ग्लूटामेट चयापचय। हिप्पोकैम्पस में सबसे बड़े चयापचय प्रभाव वाले मार्ग थे फेनिलएलनिन, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन जैवसंश्लेषण > ग्लूटाथियोन चयापचय > ग्लाइसिन, सेरीन और थ्रेओनीन चयापचय > प्यूरीन चयापचय > पाइरीमिडीन चयापचय > एलानिन, एस्पार्टेट और ग्लूटामेट चयापचय > ब्यूटानोएट चयापचय . स्ट्रिएटम (चित्र 6सी) में सबसे बड़े चयापचय प्रभाव वाले मार्ग एलानिन, एस्पार्टेट और ग्लूटामेट चयापचय > निकोटिनेट और निकोटिनमाइड चयापचय > प्यूरीन चयापचय थे।

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