भाग 1 यूपीएलसी-क्यूटीओएफ/एमएस और डीएनए बारकोडिंग के आधार पर हर्बा के रासायनिक और आनुवंशिक भेदभाव

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सार

सिस्टांचेस हर्बा(रौ कांग रोंग), जिसे ''रेगिस्तान के जिनसेंग'' के रूप में जाना जाता है, का ताकत और पोषण पर विशेष रूप से यांग को मजबूत करने के लिए गुर्दे के सुदृढीकरण में एक प्रभावशाली उपचारात्मक प्रभाव पड़ता है। हालांकि, सिस्टांचेस हर्बा, सिस्टैंच डेजर्टिकोला और सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के दो पौधों की उत्पत्ति, औषधीय कार्रवाई और रासायनिक घटकों के संदर्भ में भिन्न होती है। सिस्टांचेस हर्बा के पौधे की उत्पत्ति में भेदभाव करने के लिए, इस अध्ययन में सबसे पहले रासायनिक और आनुवंशिक-यूपीएलसी-क्यूटीओएफ/एमएस प्रौद्योगिकी और डीएनए बारकोडिंग की एक संयुक्त विधि प्रणाली को नियोजित किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि पीसीए और ओपीएलएस-डीए विश्लेषण द्वारा दो मूलों में भेदभाव करने के लिए तीन संभावित मार्कर यौगिकों (कैंपनियोसाइड II, सिस्टानोसाइड सी, और सिस्टानोसाइड ए का एक आइसोमर) प्राप्त किया गया था। डीएनए बारकोडिंग ने दो मूलों को सटीक रूप से अलग करने में सक्षम बनाया। एनजे ट्री ने दिखाया कि दो मूल दो समूहों में बंटे हुए हैं। हमारे निष्कर्षों से पता चलता है कि सिस्टांचेस हर्बा के दो मूल अलग-अलग रासायनिक संरचना और आनुवंशिक विविधताएं रखते हैं। यह सिस्टांचेस हर्बा के दो मूल का पहला रिपोर्ट किया गया मूल्यांकन है, और यह खोज गुणवत्ता नियंत्रण और इसके नैदानिक ​​​​अनुप्रयोग की सुविधा प्रदान करेगी।

सिस्टांचे हर्बा

परिचय

सिस्टांचेस हर्बा(रौ कांग रोंग), जिसे ''रेगिस्तान के जिनसेंग'' के नाम से जाना जाता है, की उत्पत्ति सूखे रसीले तनों से होती हैसिस्टांचे डेजर्टिकोलावाईसी मा औरसिस्टैंच ट्यूबुलोसा(श्रेंक) विग चीनी फार्माकोपिया (2010 संस्करण) के अनुसार, और किडनी-यिन को टोन करने, जीवन सार को लाभ पहुंचाने और आंत्र को आराम देने के लिए लोकप्रिय है। वर्तमान में,सिस्टांचेस हर्बामुख्य रूप से उत्तर पश्चिमी चीन में शुष्क और गर्म रेगिस्तान में वितरित किया जाता है, विशेष रूप से झिंजियांग और भीतरी मंगोलिया प्रांतों में। हालांकि, के दो मूलसिस्टांचेस हर्बाउनकी औषधीय गतिविधि और रासायनिक घटकों के संदर्भ में भिन्न। तू एट अल। तीन सिस्टैंच प्रजातियों के काढ़े की जांच की (सी. डेजर्टिकोला, सी ट्यूबुलोसा, सिस्टैंच साल्सा) और पाया किसी ट्यूबुलोसायांग की कमी वाले माउस मॉडल [1] में सबसे कम प्रभाव दिखाया। झांग एट अल। के बीच औषधीय गतिविधि की तुलनासी. डेजर्टिकोला, सी ट्यूबुलोसा,तथासी साल्सा,और पाया कि इन प्रजातियों में औषधीय कार्य थे जैसे कि थकान और हाइपोक्सिया सहिष्णुता, लेकिन उसी हद तक नहीं [2]। पिछले शोध ने रासायनिक घटक की सूचना दी और पौधों की उत्पत्ति के लिए रासायनिक घटक और सामग्री के अंतर का संकेत दियासिस्टांचेस हर्बा[3]। एक टॉनिक के रूप में नैदानिक ​​​​अनुप्रयोग और बाजार परिसंचरण के लिए,सी ट्यूबुलोसापारंपरिक रूप से रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने वाले एजेंट के रूप में और जापान में नपुंसकता, बाँझपन, लम्बागो, शरीर की कमजोरी के उपचार में इस्तेमाल किया गया है [4-8]। नतीजतन, दो मूल के बीच भेदभाव करना बहुत महत्वपूर्ण हैसिस्टांचेस हर्बागुणवत्ता नियंत्रण और नैदानिक ​​अनुप्रयोग के लिए। हालांकि, दो मूल के भेदभाव पर कोई शोध फोकस नहीं हैसिस्टांचेस हर्बा. माइक्रोस्कोपी, पराबैंगनी, और इन्फ्रारेड डिटेक्शन, इंटर-सिंपल सीक्वेंस रिपीट विधि सहित कई शोध विधियों का उपयोग जीनस की पहचान के लिए किया गया है।सिस्टांचेस, लेकिन न केवल दो मूल के लिए विशेष रूप से [9-20]। यहां, हमने रासायनिक और आणविक तकनीकों का उपयोग सिस्टैंच हर्बा, यूपीएलसी क्यूटीओएफ/एमएस (अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी के साथ क्वाड्रुपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री) और डीएनए बारकोडिंग के दो मूल को अलग करने के लिए किया है। UPLC-QTOF/MS अन्य तकनीकों की तुलना में अधिक तेजी से और कुशलता से जानकारी प्रदान करता है। UPLC-QTOF/MS की उच्च चयनात्मकता और संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण दोनों के साथ-साथ पारंपरिक चीनी चिकित्सा [21-22] में मेटाबोलाइट विश्लेषण और जटिल यौगिकों की पहचान के लिए इसका आवेदन हुआ है। संभावित मार्कर यौगिकों की पहचान करने के लिए प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और अव्यक्त संरचना विभेदक विश्लेषण (ओपीएलएसडीए) के लिए ऑर्थोगोनल प्रोजेक्शन भी विकसित किए गए हैं। डीएनए बारकोडिंग, एक आसान और अधिक सार्वभौमिक आणविक मार्कर तकनीक, प्रजातियों या प्रजातियों की पहचान करने के लिए डीएनए टुकड़े का उपयोग करती है। यह पारंपरिक पहचान विधियों और अन्य आणविक मार्कर प्रौद्योगिकियों की तुलना में उद्देश्यपूर्ण, अधिक सटीक और प्रदर्शन करने में आसान है। इसके अलावा, औषधीय पौधों [23-26] सहित जानवरों और पौधों की पहचान के लिए डीएनए बारकोडिंग को सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इस शोध का उद्देश्य दो पौधों की उत्पत्ति के भेदभाव के लिए एक वैज्ञानिक पद्धति प्रणाली, संयुक्त यूपीएलसी-क्यूटीओएफ/एमएस और डीएनए बारकोडिंग स्थापित करना है।सिस्टांचेस हर्बा.

पूरी जड़ें

सामग्री और तरीके

नैतिकता कथन हम पुष्टि करते हैं कि क्षेत्र अध्ययन में लुप्तप्राय या संरक्षित प्रजातियों को शामिल नहीं किया गया था। जीपीएस निर्देशांक नमूना जानकारी में शामिल किए गए हैं, कृपया तालिका 1 देखें।"

संयंत्र सामग्री और अभिकर्मक

मई 2012 में इनर मंगोलिया, किंघई प्रांतों, झिंजियांग उइगुर स्वायत्त क्षेत्र, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना (तालिका 1) में जंगली रेगिस्तानी क्षेत्रों से सिस्टांच हर्बा के रसीले तने एकत्र किए गए थे। शोध के नमूने सभी जंगली रेगिस्तानी क्षेत्रों में एकत्र किए गए थे, न कि निजी भूमि में, जहां किसी विशेष अनुमति की आवश्यकता नहीं थी। तनों की वानस्पतिक पहचान की पुष्टि डॉ. लिनफैंग हुआंग ने की थी। वाउचर के नमूने औषधीय पादप विकास संस्थान में जमा किए गए थे। यूपीएलसी विश्लेषण के लिए उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) -ग्रेड एसीटोनिट्राइल (मर्क केजीए, डार्मस्टैड, जर्मनी) और फॉर्मिक एसिड (टेडिया, यूएसए) का उपयोग किया गया था। एक मिलि-क्यू प्रणाली (मिलिपोर, बेडफोर्ड, एमए, यूएसए) का उपयोग करके विआयनीकृत पानी को शुद्ध किया गया था। सभी अन्य रसायन विश्लेषणात्मक श्रेणी के थे।

नमूना तैयार करना

सिस्टैंच हर्बा के नमूने (1.0 g, 65-मेष) को एक 50-mL शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित किया गया, और 70 प्रतिशत मेथनॉल का 50 mL जोड़ा गया। 30 मिनट के लिए भिगोने के बाद, अल्ट्रासोनिकेशन (35 kHz) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए किया गया था। 10 मिनट के लिए 10, 000 रेव/मिनट पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था और विश्लेषण के लिए यूपीएलसी-क्यूटीओएफ/एमएस सिस्टम में इंजेक्शन से पहले 0. 22- मिमी झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था।

यूपीएलसी-क्यूटीओएफ/एमएस

यूपीएलसी विश्लेषण के लिए, निम्नलिखित प्रणालियों/पैरामीटरों का उपयोग किया गया था: वाटर्स एम्पावर 2 डेटा स्टेशन से जुड़े बाइनरी सॉल्वेंट डिलीवरी पंप, ऑटो-सैंपलर और पीडीए डिटेक्टर से लैस वाटर्स एक्विटी सिस्टम (वाटर्स); अल्ट्रासोनिकेशन (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, China); और एक इलेक्ट्रॉनिक विश्लेषणात्मक संतुलन मॉडल AB135-2 (मेट्लर टोलेडो।, ग्रीफेंस, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड)। वाटर्स एक्विटी UPLC BEH C18 कॉलम (1.7 मिमी, 2.161 0 0 मिमी, वाटर्स) और वाटर्स C18 गार्ड कॉलम (समान सामग्री, पानी) का उपयोग और रखरखाव 30uC पर किया गया था। मोबाइल चरण 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड जलीय घोल (ए) और एसीटोनिट्राइल (बी) एक ढाल कार्यक्रम के साथ निम्नानुसार था: 0-3 मिनट, 10-22 प्रतिशत बी; 3-4 मिनट, 22-23 प्रतिशत बी; 4-6 मिनट, 23-35 प्रतिशत बी; 6-8 मिनट, 35-37 प्रतिशत बी; 8-11 मिनट, 37-42 प्रतिशत बी; 11- 12 मिनट, 42-48 प्रतिशत बी; 12-15 मिनट, 48 प्रतिशत -50 प्रतिशत बी 0.3 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर। इंजेक्शन की मात्रा 5 एमएल थी।

UPLC / MS विश्लेषण एक QTOF Synapt G2 HDMS सिस्टम (वाटर्स, मैनचेस्टर, यूके) पर किया गया था, जो नकारात्मक-आयन मोड में संचालित इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोत से लैस है। N2 का उपयोग विलुप्त होने वाली गैस के रूप में किया गया था। उजाड़ने का तापमान 45 {{1 0}} uC पर 800 L/h की प्रवाह दर पर सेट किया गया था, और स्रोत का तापमान 120 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया था। केशिका और शंकु वोल्टेज क्रमशः 2500 और 40 वी पर सेट किए गए थे। डेटा को 50-1200 दा के बीच 0.1-s स्कैन समय और 0.01-s इंटरस्कैन विलंब के साथ 15-मिनट विश्लेषण समय के साथ एकत्र किया गया था। आर्गन को 7.06661023 Pa के दबाव में टक्कर गैस के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सभी एमएस डेटा को लॉकस्प्रे सिस्टम का उपयोग करके बड़े पैमाने पर सटीकता और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए एकत्र किया गया था। [MH] - m/z 554.2615 पर ल्यूसीन-एनकेफेलिन का आयन नकारात्मक ईएसआई मोड में लॉक मास के रूप में उपयोग किया गया था।

डेटा विश्लेषण

संभावित विभेदक चरों की पहचान करने के लिए सिस्टैंच हर्बा नमूनों के लिए UPLC-QTOF/MS डेटा का विश्लेषण किया गया। मार्कर लिंक्स एप्लिकेशन मैनेजर, संस्करण 4.1 (वाटर्स, मैन चेस्टर, यूके) का उपयोग करके ईएस कच्चे डेटा की चोटी की खोज, संरेखण और फ़िल्टरिंग की गई। उपयोग किए गए पैरामीटर इस प्रकार थे: 0-15 मिनट का अवधारण समय (tR), 5 का द्रव्यमान0–1200 Da, 0.02 मिनट की अवधारण समय सहिष्णुता, और बड़े पैमाने पर सहिष्णुता 0.02 दा. प्रत्येक भौगोलिक स्थान से एकत्र किए गए तीन प्रतिकृति नमूनों का उपयोग किया गया (n=3)। मॉडल बनाने के लिए कुल 6,339 चर का उपयोग किया गया था।

डीएनए बारकोडिंग: डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण

सी. डेजर्टिकोला और सी. ट्यूबुलोसा (30 मिलीग्राम) के सूखे मांसल तनों से लिए गए नमूनों को 30 आर/एस की आवृत्ति पर 2 मिनट के लिए रगड़ा गया। निर्माता के निर्देशों (तियांगेन) के अनुसार डीएनए निकाला गया था। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल को इस तरह संशोधित किया गया था कि क्लोरोफॉर्म को क्लोरोफॉर्म के मिश्रण से बदल दिया गया था: आइसोमाइल अल्कोहल (समान मात्रा में 24:1), और आइसोप्रोपेनॉल (समान मात्रा) के साथ बफर समाधान GP2। घिसे हुए पाउडर को 1.5 मिली eppendorf ट्यूबों में डाल दिया गया था, 10-20 एस के लिए भंवर का उपयोग करके मिश्रण करने के लिए 700 एमएल 65 डिग्री सेल्सियस प्रीहीटेड जीपी1 और 1 एमएल बी-मर्कैप्टोएथेनॉल मिलाया गया, और 65 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया; क्लोरोफॉर्म का 700 मिलीलीटर मिश्रण जोड़ना: आइसोमाइल अल्कोहल (24:1), 12000 आरपीएम (134006 ग्राम) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र; एक नई ट्यूब में पिपेट सतह पर तैरनेवाला, 700 मिलीलीटर isopropanol जोड़कर, 15-20 मिनट के लिए सम्मिश्रण; स्पिन कॉलम CB3 में सभी मिश्रण को पाइप करना और 12000 rpm पर 40 s के लिए केंद्रापसारक; छानना त्यागना और 500 एमएल जीडी जोड़ना (उपयोग से पहले मात्रात्मक निर्जल इथेनॉल जोड़ना), 40 एस के लिए 12000 आरपीएम पर केंद्रापसारक; छानना त्यागना और 700 एमएल पीडब्लू (उपयोग से पहले मात्रात्मक निर्जल इथेनॉल जोड़ना) झिल्ली को धोने के लिए, 12000 आरपीएम पर 40 एस के लिए केंद्रापसारक; छानना त्यागना और 500 मिलीलीटर पीडब्लू जोड़ना, 12000 आरपीएम पर 40 एस के लिए केंद्रापसारक; अवशिष्ट वॉश बफर पीडब्लू को हटाने के लिए 12000 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए छानना और केंद्रापसारक को त्यागना; स्पिन कॉलम CB3 को एक साफ 1.5 मिली eppendorf ट्यूब में स्थानांतरित करना, और कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट के लिए सुखाना; कुल डीएनए प्राप्त करने के लिए 12000 rpm पर 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए प्राइमर पहले बताए गए अनुक्रमों पर आधारित थे [4,5]। पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण में 2-एमएल डीएनए टेम्पलेट, 8.5- एमएल डीडीएच2ओ, 12.5-एमएल 26टाक पीसीआर मास्टर मिक्स (बीजिंग ट्रांसजेन बायोटेक कं, चीन), 1/{{57 शामिल हैं। }}एमएल फॉरवर्ड/रिवर्स (एफ/आर) प्राइमर्स (2.5 एमएम), 25 एमएल की अंतिम मात्रा में। पीसीआर प्रवर्धन क्रेस एट अल द्वारा वर्णित के रूप में आयोजित किया गया था । [4]। पीसीआर प्रतिक्रिया के प्राइमर fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) और रेव TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39) थे। 1 प्रतिशत agarose gel वैद्युतकणसंचलन द्वारा PCR उत्पादों को अलग किया गया और उनका पता लगाया गया। पीसीआर उत्पादों को निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद शुद्ध किया गया और सीधे अनुक्रमण के अधीन किया गया।

सिस्टैंच का मुख्य प्रभावी यौगिक: एक्टियोसाइड

परिणाम

यूपीएलसी-क्यूटीओएफ/एमएस प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम द्वारा टेंटेटिव पीक असाइनमेंट विभिन्न उत्पादक क्षेत्रों से सी। डेजर्टिकोला और सी। ट्यूबुलोसा को चित्र 1 में दिखाया गया है। फिंगरप्रिंट क्रोमैटोग्राम ने सिस्टैंच हर्बा नमूनों के बीच समानता का संकेत दिया। कुल 23 योग्य द्रव्यमान चोटियों का पता लगाया गया था और 16 चोटियों की पहचान अवधारण समय और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा से पहले की रिपोर्ट की गई (तालिका 2) [29-35] के साथ की गई थी। चोटियों 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22, और 23 को अस्थायी रूप से सिस्टानोसाइड एफ, मुसैनोसाइड एसिड, सिस्टेनबुलोसाइड सी1/सी2 के रूप में पहचाना गया। , कैंपनेओसाइड II का आइसोमर, इचिनाकोसाइड, सिस्टानोसाइड ए, एक्टोसाइड, आइसोएक्टोसाइड, सिरिंगलाइड ए -39-एएल-रमनोपाइरानोसाइड, सिस्टानोसाइड सी, 29-एसिटाइलैक्टोसिड, ऑस्मानथ्यूसाइड बी, सिस्टानोसाइड डी, ट्यूबलोसाइड बी, और सिस्टेनसीनसाइड ए, क्रमशः . रासायनिक घटकों को मुख्य रूप से फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (पीएचजी) के रूप में निर्धारित किया गया था, जबकि एक यौगिक, मुसैनोसाइड एसिड, एक इरिडोइड पॉलीसेकेराइड था। गुर्दे की कमी, और एंटीऑक्सीडेंट और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावों के उपचार के मामले में पीएचजी मुख्य सक्रिय यौगिक हैं [36]

सी. डेजर्टिकोला और सी. ट्यूबुलोसा का पीसीए

पीसीए को विभिन्न पौधों की प्रजातियों के नमूनों में अंतर करने के लिए नियोजित किया गया था। पीसीए एक अनियंत्रित बहुभिन्नरूपी डेटा विश्लेषण पद्धति है जिसका उद्देश्य द्वितीयक मेटाबोलाइट संरचना [37] के बहुभिन्नरूपी डेटा के भीतर समानता और/या अंतर की कल्पना करना है। दो-घटक पीसीए मॉडल ने संचयी रूप से 46.04 प्रतिशत भिन्नता (पीसी 1, 36.43 प्रतिशत; पीसी 2, 9.61 प्रतिशत) के लिए जिम्मेदार है। चित्रा 2 से पता चलता है कि प्रजातियों की उत्पत्ति के अनुसार प्लॉट किए गए पीसीए स्कोर में 24 नमूनों को दो समूहों में क्लस्टर किया गया था, यह दर्शाता है कि सी। डेजर्टिकोला और सी। ट्यूबुलोसा की रासायनिक संरचना में काफी अंतर है।

सिस्टैंच का मुख्य प्रभावी यौगिक: इचिनाकोसाइड