भाग 1 इचिनाकोसाइड चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनलों में वोल्टेज-निर्भर सीए 2 प्लस एंट्री और प्रोटीन किनेज सी को दबाकर ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है

चेंग वेई लू 1,2, त्ज़ू यू लिन 1,2, शु कुई हुआंग 1 और सु जेन वांग 3,*

1 एनेस्थिसियोलॉजी विभाग, सुदूर-पूर्वी मेमोरियल अस्पताल, पैन-चियाओ जिला, न्यू ताइपे शहर 22060, ताइवान; drluchengwei@gmail.com (सीडब्ल्यूएल); drlin1971@gmail.com (टीवाईएल);nskh9450n@yahoo.com.tw (एसकेएच)

2 मैकेनिकल इंजीनियरिंग विभाग, युआन ज़ी विश्वविद्यालय, ताओयुआन 32003, ताइवान

3 स्कूल ऑफ मेडिसिन, फू जेन कैथोलिक यूनिवर्सिटी, नंबर 510, झोंगझेंग रोड।, झिंजुआंग जिला।, न्यू ताइपे 24205, ताइवान।

सार:ग्लूटामेटेरिक प्रणाली न्यूरोप्रोटेक्टेंट उपचारों के प्रभावों में शामिल हो सकती है। इचिनाकोसाइड, औषधीय चीनी जड़ी बूटी से निकाला गया एक फेनिलएथेनॉयड ग्लाइकोसाइडहर्बा सिस्टांचे,न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव पड़ता है। इस अध्ययन ने चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनलों (सिनेप्टोसोम) में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के प्रभावों की जांच की। इचिनाकोसाइड ने Ca . को रोक दिया^{2 प्लस}-निर्भर, लेकिन Ca . नहीं^{2 प्लस}-स्वतंत्र, 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से रिलीज। इचिनाकोसाइड ने साइटोप्लाज्मिक मुक्त Ca . में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित वृद्धि को भी कम कर दिया^{2 प्लस}एकाग्रता लेकिन सिनैप्टोसोमल झिल्ली क्षमता को नहीं बदला। 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के निरोधात्मक प्रभाव को cu-conotoxin MVIIC, Cav2.2 (N-type) और Cav2.1 (P/Q-type) चैनलों के व्यापक-स्पेक्ट्रम अवरोधक द्वारा रोका गया था। , लेकिन इंट्रासेल्युलर Ca . के प्रति असंवेदनशील था^{2 प्लस}रिलीज-अवरोधक डैंट्रोलिन और 7-क्लोरो-5-(2-क्लोरोफेनिल)-1,5-डायहाइड्रो-4,1-बेंजोडायजेपाइन{{ 8}}(3H)-एक (CGP37157)। इसके अलावा, इचिनाकोसाइड ने प्रोटीन किनसे सी के एमिनोपाइरीडीन-प्रेरित फॉस्फोराइलेशन को कम कर दिया, और प्रोटीन किनेज सी अवरोधकों ने ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड के प्रभाव को समाप्त कर दिया। इन परिणामों के अनुसार, हम सुझाव देते हैं कि विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड का निरोधात्मक प्रभाव कम वोल्टेज-निर्भर सीए से जुड़ा है^{2 प्लस}प्रोटीन कीनेस सी गतिविधि का प्रवेश और बाद में दमन।

कीवर्ड:इचिनाकोसाइड; ग्लूटामेट रिलीज; सेरेब्रोकोर्टिकल तंत्रिका टर्मिनल; वोल्टेज पर निर्भर Ca²प्लस चैनल; पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, और मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा का प्रोटीन किनेज सी[9-12]. हालांकि, जिस तंत्र के माध्यम से इचिनाकोसाइड न्यूरोप्रोटेक्शन को प्रेरित करता है, वह पूरी तरह से समझा नहीं गया है।

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इचिनाकोसाइडसिस्टैंच में कई कार्य हैं

1 परिचय

इचिनाकोसाइडमें मौजूद एक प्रमुख फेनिलएथेनॉयड ग्लाइकोसाइड हैहर्बा सिस्टांचे, एक प्रसिद्ध पारंपरिक चीनी दवा है जो विस्मृति, नपुंसकता और पुरानी कब्ज के इलाज के लिए प्रयोग की जाती है [1]।इचिनाकोसाइडएंटीऑक्सीडेशन, एंटी-इंफ्लेमेशन, एंटीकैंसर, हेपेटोप्रोटेक्शन और इम्यून मॉड्यूलेशन [2-4] जैसी विभिन्न बायोएक्टिविटीज हैं। विशेष रूप से,इचिनाकोसाइडन्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है; उदाहरण के लिए, यह प्राथमिक चूहे कॉर्टिकल न्यूरॉन्स, मानव न्यूरोब्लास्टोमा SH-SY5Y कोशिकाओं और फियोक्रोमोसाइटोमा (PC12) कोशिकाओं [5–8] में ऑक्सीडेटिव तनाव- या न्यूरोटॉक्सिन-प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी से रक्षा कर सकता है। आगे,इचिनाकोसाइडमस्तिष्क क्षति को कम करता है और पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, और मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा [9-12] के पशु मॉडल में संज्ञानात्मक कार्य में सुधार करता है। हालाँकि, वह तंत्र जिसके माध्यम सेइचिनाकोसाइडन्यूरोप्रोटेक्शन को प्रेरित करता है पूरी तरह से समझा नहीं गया है।

न्यूरोप्रोटेक्शन विषाक्त अपमान पर न्यूरोनल संरचना और कार्य को संरक्षित करने की एक जटिल प्रक्रिया है। ग्लूटामेट एक्साइटोटॉक्सिसिटी में कमी को मस्तिष्क के न्यूरोप्रोटेक्शन में शामिल एक संभावित तंत्र माना जाता है। ग्लूटामेट, एक उत्तेजक अमीनो एसिड न्यूरोट्रांसमीटर, मस्तिष्क के कई कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [13]। हालांकि, उच्च ग्लूटामेट सांद्रता के तहत ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की अधिकता इंट्रासेल्युलर सीए 2 प्लस अधिभार, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, मुक्त कट्टरपंथी उत्पादन और न्यूरोनल मौत [14,15] का कारण बनती है। यह रोग प्रक्रिया मस्तिष्क के इस्किमिया, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, मिर्गी, और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग [16,17] सहित कई मस्तिष्क विकारों में शामिल है। इसलिए, पैथोफिज़ियोलॉजिकल ग्लूटामेटेरिक ट्रांसमिशन को अवरुद्ध करने वाले अवरोधकों को संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव ड्रग्स माना जाता है। इनमें से उल्लेखनीय उदाहरण ग्लूटामेट रिसेप्टर विरोधी हैं [18,19]; हालांकि, कम प्रभावशीलता और अवांछित, या यहां तक ​​कि साइटोटोक्सिक साइड इफेक्ट [20,21] के कारण इन दवाओं के नैदानिक ​​परीक्षण विफल हो गए हैं। प्रत्यक्ष ग्लूटामेट रिसेप्टर नाकाबंदी के अलावा, ग्लूटामेट रिलीज अवरोधन न्यूरोप्रोटेक्शन के लिए एक प्रभावी रणनीति हो सकती है। कई न्यूरोप्रोटेक्टेंट्स (जैसे, मेमेंटाइन और रिलुज़ोल) चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में ग्लूटामेट रिलीज को कम कर सकते हैं [22-24]।

एक्साइटोटॉक्सिसिटी और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रोफाइल में ग्लूटामेट की भूमिका को ध्यान में रखते हुएइचिनाकोसाइड, वर्तमान अध्ययन में चूहे के सेरेब्रल कॉर्टेक्स से शुद्ध किए गए पृथक तंत्रिका टर्मिनलों (सिनैप्टोसम) का उपयोग किया गया था ताकि के प्रभाव की जांच की जा सकेइचिनाकोसाइडग्लूटामेट रिलीज पर और आगे संभावित तंत्र की खोज की। पृथक तंत्रिका टर्मिनल तैयारी किसी भी पोस्टसिनेप्टिक प्रभाव [25] की अनुपस्थिति में दवाओं द्वारा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के प्रीसानेप्टिक विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। इस मॉडल का उपयोग करके, हमने के प्रभाव का मूल्यांकन कियाइचिनाकोसाइडग्लूटामेट रिलीज, झिल्ली क्षमता, प्रीसानेप्टिक सीए 2 प्लस इनफ्लो, और प्रोटीन किनेज सी गतिविधि पर। साहित्य की हमारी समीक्षा के अनुसार, यह तंत्र का दस्तावेजीकरण करने वाली पहली रिपोर्ट है जिसके माध्यम सेइचिनाकोसाइडप्रीसानेप्टिक स्तर पर अंतर्जात ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है।

इचिनाकोसाइड एंटी-ऑक्सीडेशन कर सकता है

2. परिणाम

2.1. इचिनाकोसाइडवेसिकुलर एक्सोसाइटोसिस को कम करके रैट सेरेब्रोकोर्टिकल नर्व टर्मिनलों से 4-एमिनोपाइरीडीन-इवोक्ड ग्लूटामेट रिलीज को रोकता है

चित्र 1 की एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव दिखाता हैइचिनाकोसाइडशुद्ध चूहे सेरेब्रोकोर्टिकल सिनैप्टोसोम से {{0}}एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर। 1 मिमी CaCl2, 1 मिमी 4- के साथ ऊष्मायन किए गए सिनैप्टोसोम में 7.4 0.1 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट की ग्लूटामेट रिलीज उत्पन्न हुई, जो 1, 5, 10, 30, और 50 µ एम से कम हो गई थी।इचिनाकोसाइडसे 6.5 0.2, 5.8 0.3, 4.8 {{10}}.2, 4.1 0.1, या 2.3 ˘ 0.4 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट, क्रमशः (एफ(5,24)=67.1, पी=0।000)। के लिए IC50 मूल्यइचिनाकोसाइडएक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र से प्राप्त 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज का मध्यस्थता निषेध 24 माइक्रोन था। इसके अलावा, ग्लूटामेट रिलीज 1 एमएम 4-एमिनोपाइरीडीन द्वारा एक बाह्य सीए 2 प्लस -फ्री सॉल्यूशन में 3 0 0 माइक्रोन एथिलीन ग्लाइकोल बीआईएस (-एमिनोइथाइल ईथर) -एन, एन, एन 1, एन {{{{} 13}}टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए) 2.1 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट (एफ(2,12)=310.65, पी=0.000) था, और यह सीए2 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज का प्लस-स्वतंत्र घटक 20 माइक्रोन से अप्रभावित थाइचिनाकोसाइड(1.8 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; पी=0.58; चित्र 1)। सिनैप्टोसोम में 0.1 माइक्रोन बाफीफिलोमाइसिन ए1, एक वेसिकुलर ट्रांसपोर्टर अवरोधक [26], 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से कम किया गया था (2.2 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/ 5 मिनट; एफ (2,12)=249.518, पी=0।000)। बाफीफिलोमाइसिन ए1, 20 माइक्रोन इचिनाकोसाइड की उपस्थिति में ग्लूटामेट (2.1 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; पी=0.94; चित्रा की रिहाई को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करने में असफल रहा। 1) । इसके विपरीत, 10 माइक्रोन डीएल-थ्रेओ-बीटा-बेंजाइल-ऑक्सीस्पार्टेट (डीएल-टीबीओए, एक ग्लूटामेट रीपटेक इनहिबिटर) [27], 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज को बढ़ाकर 11.8 0.4 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट ( टी(8)=´11.31, पी=0.000)। DL-TBOA की उपस्थिति में भी, 20 µMइचिनाकोसाइडबाधित {0}}एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज महत्वपूर्ण रूप से (7.7 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; एफ (2,12)=87.23, पी=0।{{ 12}}; चित्र 1)

2.2. इचिनाकोसाइडसाइटोसोलिक Ca . को कम करता है²प्लसएकाग्रता लेकिन सिनैप्टोसोमल को नहीं बदलता है

झिल्ली क्षमता

1 मिमी 4-एमिनोपाइरीडीन के कारण सिनैप्टोसोम विध्रुवण Ca . में वृद्धि हुई²प्लस एकाग्रता(p= 0.000; तालिका एक)। 20 का आवेदन |vMइचिनाकोसाइडबराल Ca . को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया²प्लस एकाग्रता (t(8) = 0.06, p= 0.95) लेकिन 4-अमीनोपाइरीडीन-प्रेरित वृद्धि iia Ca . को काफी कम कर दिया²प्लस एकाग्रता (t(10) = 6.16, p =0.000). इसके अलावा, 1 एमएम 4-एमिनोपाइरीडीन 3',3',3'-डिप्रोपाइलथियाडाइकारबोसायनिन आयोडाइड [डीआईएससी] में वृद्धि हुई₃(5)] प्रतिदीप्ति (p= 0.000). इसके अलावा ओ⁽20 fdM इचिनाकोसाइड ने रेस्टिंग मेम्ब्रेन पोटेंशिअल को नहीं बदला (t(8)=0.976,p= 0.36) या DiSC में 4-अमीनोपाइरीडीन-मध्यस्थता वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से बदलें₃(5) प्रतिदीप्ति (t(8) = —0.014, p= 0.99; तालिका एक)।

सिस्टांचेइचिनाकोसाइडगुर्दे की बीमारी का इलाज कर सकते हैं

2.3. कम - CO2 प्लससीएवी2.2 (एन-टाइप) और सीएवी2.1 (पी/क्यू-टाइप) चैनलों के माध्यम से प्रवाह को 4-एमिनोपाइरीडीन-इवोक्ड ग्लूटामेट रिलीज के निषेध के साथ जोड़ा जा सकता है।इचिनाकोसाइड

आकृति 2 दर्शाता है कि 2 cu-conotoxin MVIIC, एक N-और पी / क्यू-प्रकार सीए²प्लस चैनल अवरोधक,

{0}}एमिनोपाइरीडीन से उत्पन्न ग्लूटामेट रिलीज को 7.4 0.2 से घटाकर 2.0 0.1 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). cu-conotoxin MVIIC की उपस्थिति में, 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर 20 pM इचिनाकोसाइड का प्रभाव निरर्थक था (1.8 0.2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1.06, p= 0.32)। डैंट्रोलीन (10 ^M), इंट्रासेल्युलर Ca . का अवरोधक²प्लस रिलीज क्रोम एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम [28], कम 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज (5.6 土 0.3 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट; एफ(2,14)=104। 95,p= 0.000). हालांकि, डैंट्रोलिन की उपस्थिति में, 20 पीजेएमइचिनाकोसाइडअभी भी ग्लूटामेट रिलीज को महत्वपूर्ण रूप से रोक सकता है (3.3 0.2 एनएमओएल/मिलीग्राम/5 मिनट;p= 0.000). इसी तरह के परिणाम 100 पी एम 7-क्लोरो-5-(2-क्लोरोफेनी)-1,5-डायहाइड्रो-4,1-बेंजोथियाजेपिन का उपयोग करके देखे गए। -2(3एच)-एक (सीजीपी37157), एक झिल्ली-परमियाहम माइटोकॉन्ड्रियल ना के अवरोधक^प्लस/सीए²प्लस एक्सचेंज। पांच जांच किए गए सिनैप्टोसोमल तैयारियों में, 20 बजेइचिनाकोसाइड100 pM CGP37157 के साथ मिलकर 4-अमीनोपाइरीडीन से उत्पन्न ग्लूटामेट रिलीज को 48.3 प्रतिशत 5.2 प्रतिशत (F(2,13) ​​= 136.79,p= 7.000), अकेले इचिनाकोसाइड द्वारा निषेध के समान (46.2 प्रतिशत 土 2.3 प्रतिशत;p = 0.89;

2.4. इचिनाकोसाइडरोकता है 4-एमिनोपाइरीडीन-इवोक्ड (प्रोटीन किनेज सी के माध्यम से सिग्नलिंग द्वारा ग्लूटामेट रिलीज

जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, 10 डिग्री jlM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) मेनिमाइड (GF109203X), एक सामान्य प्रोटीन काइनेज सी अवरोधक [29], रिड्यूस एड 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज (F(2,13) ​​= 19.46, p=0 .000)। GF109203X- उपचारित सिनैप्टोसोम में, 20 pM इचिनाकोसाइड ने 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज़ को केवल 5.5 प्रतिशत 1.8 प्रतिशत (p=0.89) से कम कर दिया, अकेले इचिनाकोसाइड से कम (42.4 प्रतिशत 土 2.3) प्रतिशत; पी=एफ.000)। इसी तरह के परिणाम 5,6,7, 13-टेट्राहाइड्रो-13-मिथाइल-5-ऑक्सो-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 के साथ प्राप्त किए गए थे। ,4-c]कार्बाज़ोल-12-प्रोपेननिट्राइल (Go6976), सीए2 प्लस-निर्भर प्रोटीन किनसे सी आइसोफॉर्म (ए, |3आई, |3II, वाई) [29] के लिए एक चयनात्मक। दोपहर 3 बजे गो6976, 20 बजे की उपस्थिति मेंइचिनाकोसाइडग्लूटामेट रिलीज को 11.9 प्रतिशत 2.9 प्रतिशत (पी=0.59) से कम कर दिया, जो कि अकेले इचिनाकोसाइड की तुलना में एक महत्वपूर्ण कमी को दर्शाता है (42.4 प्रतिशत 2.3 प्रतिशत; पी=0। 000; चित्र तीन)। इसके विपरीत, 3 pM रॉटलरिन, एक Ca2 प्लस-स्वतंत्र प्रोटीन किनसे C6 अवरोधक [30], ने 4- aminopyridine (1 mM) -वोक्ड ग्लूटामेट रिलीज़ (p=0.45) को महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित नहीं किया। फिर भी, रॉटलरिन की उपस्थिति में, 20 pM इचिनाकोसाइड ने प्रभावी रूप से 37.1 प्रतिशत 5.6 प्रतिशत रिलीज़ (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{33) के औसत अवरोध का कारण बना। }}), अकेले इचिनाकोसाइड के समान (p=0.41; चित्र 3)। इसके अलावा, माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनसे अवरोधक 2-(2-एमिनो-3-मेथोक्सीफेनिल)-4H-1-बेंजोपायरन-4-एक) (PD98059 ) (50 पी एम) और प्रोटीन काइनेज ए इनहिबिटर एन-[2-(पी-ब्रोमोसिनामाइलिनो)एथिल]-5-आइसोक्विनोलिनसल्फोनामाइड (एच89) (100पीएम) कम 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज (पी=0.000)। यहां तक ​​कि PD98059 या H89, 20 pM . की उपस्थिति में भीइचिनाकोसाइडरिलीज़ को प्रभावी ढंग से कम कर दिया (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; चित्र 3)।

चित्र 4 से पता चलता है कि tha11 mM 4-एमिनोपाइरीडीन ने सिनैप्टोसोम में प्रोटीन किनसे सी के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाया (t(4) = —6.871, p= 0.002)। जब 4- एमिनोपाइरीडीन, 4- को जोड़ने से पहले 10 मिनट के लिए 20 पी एम इचिनाकोसाइड के साथ सिनैप्टोसोम का ढोंग किया गया था, तो प्रोटीन किनेज सी के एमिनोपाइरीडीन प्रेरित फॉस्फोराइलेशन में काफी कमी आई (एफ(2)_a6) = 29.202, p = 0.00 1).

इचिनाकोसाइडमेंसिस्टैंचेबढ़ा सकते हैंप्रतिरक्षा तंत्र

2.5. इचिनाकोसाइड-ग्लूटामेट रिलीज के मध्यस्थ निषेध में गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड टाइप ए (जीएबी) शामिल नहीं है³A_A) रिसेप्टर

चित्र 5 में, SR95531 (GABA का एक विरोधी) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज पर इचिनाकोसाइड का प्रभाव_Aरिसेप्टर) की तुलना की गई। इसके अलावा, 100 pM SR95531 ने 4-अमीनोपाइरीडीन (1 mM) -वोक्ड ग्लूटामेट रिलीज़ को महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित नहीं किया। में

SR95531- ने सिनैप्टोसोम का इलाज किया, 20 pM इचिनाकोसाइड के अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप 4-एमिनोपाइरीडीन-विकसित ग्लूटामेट रिलीज़ (F(2,12)=42.63) पर 43 प्रतिशत अवरोध उत्पन्न हुआ।p= 0.000), जो अकेले इचिनाकोसाइड द्वारा उत्पादित निषेध (40 प्रतिशत ;p= 0.000). इसी तरह का परिणाम एक अन्य GABAa रिसेप्टर प्रतिपक्षी, bicuculline (50 pM) के साथ प्राप्त किया गया था। रिलीज को बाइक्यूकुललाइन की उपस्थिति में मापा जाता है और