भाग 4: हिप्पोकैम्पस एनग्राम एन्सेम्बल में मेमोरी फॉर्मेशन और रिकॉल के दौरान एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक इंटरप्ले का मानचित्रण

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शाही सेना seq

उल न्यूक्लीज-मुक्त पानी), 37 सी पर 30 मिनट के लिए कोमल रॉकिंग के साथ। पीसीआर प्रतिक्रिया (1 चक्र; 5 मिनट - 72 सी, 30 सेकंड - 98 सी, 10 चक्र; 15 सेकंड - 98 सी, 30 सेकेंड - 60 सी, 3 मिनट - 72 सी) का उपयोग करके संवर्धित डीएनए टुकड़े प्रवर्धित और बारकोड किए गए थे। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, प्रवर्धित डीएनए को 1.8x AMPure मोतियों (AmpureXP मोती, बेकमैन कल्टर, A63880) का उपयोग करके साफ और शुद्ध किया गया था। पुस्तकालय के आकार और वितरण के लिए बायोएनलाइजर क्यूसी के बाद, एमआईटी बायोमाइक्रो सेंटर में इलुमिना नेक्स्टसेक 550 प्लेटफॉर्म पर पुस्तकालयों का अनुक्रम किया गया।

याददाश्त में सुधार के लिए सिस्टांचे और सिस्टांचेस

ATAC-seq विश्लेषण- 40-bp पेयर-एंड सीक्वेंसिंग रीड्स के कच्चे फास्टक डेटा को बॉटी 2 का उपयोग करके माउस mm9 रेफरेंस जीनोम से जोड़ा गया था।0 पेयर-एंड मोड50 में। Samtools संग्रह 51 का उपयोग पीसीआर डुप्लिकेट (आरएमडीयूपी), इंडेक्स बीएएम फाइलों (इंडेक्स) को हटाने, और पुस्तकालय के आंकड़ों की गणना करने के लिए किया गया था (फ्लैगस्टैट, पूरक तालिका 13 देखें)। BAM फ़ाइलों को ठीक से संरेखित, युग्मित और अद्वितीय रीड से 50M तक डाउनसैंपल किया गया था। खुले क्रोमेटिन चोटियों का विश्लेषण MACS252 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था डिफबाइंड v1.16.353 द्वारा डिफबाइंड v1.16.353 द्वारा डिफेंशियली एक्सेसिबल रीजन (DARs) की पहचान की गई थी, जो DESeq2 (कटऑफ; FDR <0.01; फोल्ड="" चेंजेस=""> 1.5) का उपयोग करने के लिए डिफ़ॉल्ट मापदंडों और सेटिंग्स के साथ था। सामान्यीकृत गणना (RPKM54) का पूर्ण मैट्रिक्स DiffBind पैकेज द्वारा पुनर्प्राप्त किया गया था। बिगविग ट्रैक्स की एक पीढ़ी के लिए, जीवनी प्रारूप में पाइलअप सिग्नल फाइल्स (फ्रैगमेंट पाइलअप प्रति मिलियन रीड्स) का निर्माण MACS2 कॉल पीक फंक्शन का उपयोग करके -B -SPMR फ्लैग्स के साथ किया गया था। फिर, इनपुट लैम्ब्डा ट्रैक्स पर सामान्यीकृत गुना संवर्धन (FE) सेटिंग - m FE के साथ MACS2 के bdgcmp फ़ंक्शन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। फिर बेडग्राफ फाइलों को बिगविग फॉर्मेट में बदल दिया गया।

IGV55 टूल का इस्तेमाल बिगविग फाइलों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया गया था। ChromHMM56 का उपयोग दो स्वतंत्र अध्ययनों से एक क्रोमैटिन राज्य मॉडल स्थापित करने के लिए किया गया था, जो पैर के झटके से पहले और बाद में थोक हिप्पोकैम्पस ऊतक का उपयोग करता था और राज्य मॉडल पर DAR के संवर्धन को निर्धारित करने के लिए निर्धारित करता था। मोटिफ संवर्धन विश्लेषण 57, 58 और चोटियों का एनोटेशन HOMER59 टूल द्वारा किया गया था। सभी कोड पूरक सॉफ्टवेयर फ़ाइल आरएनए निष्कर्षण और पुस्तकालय की तैयारी में उपलब्ध हैं - तुरंत निर्धारण और छँटाई का पालन करें (ऊतक की तैयारी देखें), प्रोटीज के 4 उल को पाचन बफर में जोड़ा गया था (FFPE, Life Technologies, AM1975 के लिए RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit) . नमूने 15 मिनट के लिए 5 0 डिग्री, फिर 15 मिनट 8 0 डिग्री पर हीट ब्लॉक में लगाए गए थे। इसके बाद, 0.75 एमएल ट्राईजोल एलएस (TRIzol™ LS रिएजेंट, थर्मो फिशर साइंटिफिक, 10296028) और 0.2 एमएल फिनोल: क्लोरोफॉर्म सॉल्यूशन (फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमाइल अल्कोहल, 1 फेज, VWR इंटरनेशनल, K169) प्रत्येक नमूने में जोड़ा गया। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए जोरदार झटकों। निलंबन को फेज लॉक जेल हेवी ट्यूब्स (पीएलजी, 5 प्राइम, 2302830) में रखा गया था और 5 मिनट के लिए 13, 000आरपीएम पर काता गया था। न्यूक्लिक एसिड के साथ जलीय चरण को 100 प्रतिशत इथेनॉल के बराबर मात्रा के साथ ट्यूबों से ताजा एपपेन्डोर्फ ट्यूब में निकाला गया था। निर्माता के निर्देश के अनुसार RNA शुद्धिकरण के लिए Direct-zol™ RNA MicroPrep किट (Zymo Research, R2060) द्वारा RNA शुद्धिकरण किया गया। RNA को eluted (10 ul, DEPC) किया गया और फिर इसे −80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। स्मार्ट स्ट्रैंडेड टोटल RNA-Seq किट v2 - पिको इनपुट स्तनधारी (Clontech, 635006) का उपयोग पुस्तकालय की तैयारी और प्रवर्धन के लिए किया गया था। पुस्तकालय की तैयारी के लिए 3 जैविक प्रतिकृति (एन =3) का उपयोग किया गया था। राइबोसोमल सीडीएनए और अंतिम पीसीआर प्रवर्धन (15 चक्र) की कमी के साथ बिना किसी अतिरिक्त विखंडन कदम (एफएफपीई, विकल्प 2, मैनुअल देखें) के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुस्तकालय तैयार किए गए थे। MIT बायोमाइक्रो सेंटर में Illumina HiSeq 2000 प्लेटफॉर्म पर पुस्तकालयों का अनुक्रम किया गया।

RNA-seq विश्लेषण- कच्चे फास्टक डेटा को माउस mm9 संदर्भ से जोड़ा गया था

बॉटी 2.0 का उपयोग कर जीनोम। ट्रांसक्रिप्ट बहुतायत का अनुमान लगाने के लिए UCSC mm9 संदर्भ जीन एनोटेशन के साथ कफ़लिंक 2.260 और DEseq261 द्वारा जीन निकायों (एक्सॉन और इंट्रोन्स सहित) से मैप किए गए रीड्स को संसाधित किया गया। DEseq2 और कस्टम R लिपियों का उपयोग करके डिफरेंशियल जीन एक्सप्रेशन और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण किए गए। प्रतिलेखों के सापेक्ष बहुतायत को एक्सॉन प्रति मिलियन टुकड़े मैप किए गए (एफपीकेएम) प्रति किलोबेस के टुकड़ों द्वारा मापा गया था।

ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन अलग-अलग के लिए किया गया थास्मृतिचरण (सक्रिय-प्रारंभिक, सक्रिय-देर से, पुन: सक्रिय) बेसल-अवस्था से उनके log2 गुना परिवर्तन (log2FC) द्वारा। विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) के 1095 ने कटऑफ मानदंड पारित किया, जिसमें हमने कम से कम पी-मूल्य की तुलना में देखा< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

याददाश्त में सुधार कर सकता है सिस्टैन्च

गुणसूत्र रचना कैप्चर (Hi-C)

स्थिर कोशिकाओं से नाभिक (ऊतक की तैयारी देखें) को 1.5 एमएल एपपॉर्फ ट्यूबों में क्रमबद्ध किया गया था जिसमें 5 0 0 उल ताजा बर्फ-ठंडा लसीका बफर (10 मिमी ट्रिस पीएच =8, 10 मिमी NaCl, 0.2 प्रतिशत इगेपल सीए {{ 9}}, पाई और पीसीआर ग्रेड पानी) और सूखी बर्फ पर जमे हुए और जब तक उनका उपयोग नहीं किया जाता तब तक उन्हें C80c पर संग्रहीत किया जाता है। हाई-सी पुस्तकालयों को दो जैविक प्रतिकृति में 100, 000 कोशिकाओं/प्रति समूह (दो जानवरों से एकत्र) से तैयार किया गया था, डोवेटेल ™ हाय-सी किट मैनुअल (v.1.03, डोवेटेल जीनोमिक्स, शिकागो, यूएसए) का उपयोग करके। छह हाई-सी पुस्तकालयों को इल्लुमिना नेक्स्टसेक 500 प्लेटफॉर्म पर अनुक्रमित किया गया था। होमर हाई-सी पाइपलाइन का उपयोग प्रायोगिक कलाकृतियों जैसे सर्कुलराइजेशन, सेल्फ-लिगेशन और पीसीआर डुप्लिकेट को फ़िल्टर करने के लिए किया गया था। फ़िल्टर किए गए रीड्स को संदर्भ माउस जीनोम (mm9) से जोड़ा गया और आगे HOMER HI-C पाइपलाइन का उपयोग करके संसाधित किया गया।

होमर के हाई-सी टूल का इस्तेमाल हाई-सी डेटा पर प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (पीसीए) करने के लिए 50 केबी रेजोल्यूशन पर सब-न्यूक्लियर कम्पार्टमेंट (ए और बी) की पहचान करने के लिए किया गया था (पूरक सॉफ्टवेयर देखें)। कम्पार्टमेंट स्विच विश्लेषण के लिए, हमने पहले समूहों के बीच PC1 मानों को घटाया। इसके बाद हमने शीर्ष BtoA ट्रांज़िशन को PC1 वाले क्षेत्रों के रूप में 90वें पर्सेंटाइल से ऊपर और शीर्ष AtoB ट्रांज़िशन को PC1 वाले क्षेत्रों के रूप में 10वें पर्सेंटाइल से नीचे परिवर्तन के रूप में पहचाना। चूंकि उप-परमाणु डिब्बों को कई सौ किलोबेस की इकाइयों के रूप में विनियमित किया जाता है, इसलिए हमने लगातार 50 Kb AtoB या BtoA खंडों को समेकित किया जो एक दूसरे से 100 Kb की दूरी के भीतर थे। समेकित डोमेन जिनका कुल आकार 200 Kb से कम था, हमने त्याग दिया। कम्पार्टमेंट स्विच को केवल तभी माना जाता था जब एक नकारात्मक मान को सकारात्मक मान (और इसके विपरीत) में बदल दिया जाता था। अंत में, पहले घटक के सकारात्मक और नकारात्मक मूल्यों की तुलना न्यूरॉन की सभी तीन आबादी (बेसल, सक्रिय - जल्दी और सक्रिय - देर से) के बीच की गई थी।

प्रमोटर कैप्चर हाय-सी

निर्धारण और छँटाई का पालन करें (ऊतक तैयार करना देखें) कोशिकाओं को 1.5 एमएल एपपॉर्फ ट्यूबों में सॉर्ट किया गया था जिसमें 5 0 0 उल ताजा बर्फ-ठंडा लसीका बफर (10 मिमी ट्रिस पीएच =8, 10 मिमी NaCl, 0.2 प्रतिशत इगेपल सीए { {9}}, पाई और पीसीआर ग्रेड पानी), सूखी बर्फ पर जमे हुए और उपयोग किए जाने तक C80c में संग्रहीत। हाय-सी पुस्तकालय 10, 000 कोशिकाओं / प्रति समूह (एन =3 -4) से तैयार किए गए थे, जैसा कि पहले वर्णित 62, कुछ संशोधन के साथ। नमूने नीचे काटे गए (4 डिग्री, 20 मिनट के लिए 1,600 ग्राम) और गोली को 1.2x कटस्मार्ट बफर (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स,

अमेरीका)। पहले प्रतिबंध पाचन को मूल प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में हिंद III (R3104L, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, यूएसए) के 1,500 यू के साथ 6- बेस कटर (मूल प्रोटोकॉल में BglII के बजाय) के रूप में वर्णित किया गया था। बायोटिन लेबलिंग और रातोंरात बंधाव (विवरण के लिए मूल प्रोटोकॉल देखें) के बाद, नमूने नीचे काता गया (4 डिग्री 15 मिनट के लिए 1,600 × जी) और पीबीएस के 25 उल में गोली को फिर से जोड़ा गया। निलंबन को 65c में 12-16 घंटे के लिए प्रोटीनएज़ K के 3 उल के साथ जोड़ा गया था। हाई-सी डीएनए का शुद्धिकरण मूल प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 100 उल स्ट्रेप्टाविडिन-बीड्स (डायनाबीड्स एम -280-स्ट्रेप्टाविडिन, लाइफ टेक्नोलॉजीज, 11205डी) के साथ किया गया था। दूसरे प्रतिबंध एंजाइम के लिए, हमने 4-बेस कटर Hpych4V (10 U /प्रति नमूना, R0620S, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, यूएसए) का उपयोग किया। ए-टेलिंग रिएक्शन (विवरण के लिए मूल प्रोटोकॉल देखें) के बाद, नमूनों को पीसीआर (17 चक्र) का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया और एएमपी्योर एक्सपी मोतियों से शुद्ध किया गया। हाई-सी पुस्तकालयों को 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.5) के 20 उल में सुसंस्कृत किया गया था। प्रमोटर कैप्चर हाई-सी के लिए बैट कैप्चर सिस्टम डिज़ाइन - स्कोनफेल्डर में पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से 5000 माउस जीन प्रमोटरों की एक सूची प्राप्त की गई थी। एट अल.29. सूची में केवल प्रोटीन-कोडिंग क्षेत्रों के बायोटाइप के साथ टेप शामिल हैं, जिसमें हिंद III प्रतिबंध टुकड़े साइट हैं। दो 120 बीपी कैप्चर प्रोब डिजाइन किए गए थे, एक टुकड़े के प्रत्येक छोर पर। प्रोब को एगिलेंट टेक्नोलॉजीज द्वारा स्योरसेलेक्ट लक्ष्य संवर्धन प्रणाली (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) के अनुसार संश्लेषित किया गया था।

प्रमोटर कैप्चर हाई-सी लाइब्रेरी की तैयारी और सीक्वेंसिंग - प्रमोटर सीक्वेंस वाले हाई-सी लिगेशन उत्पादों को पकड़ने के लिए, हमने पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग किया। संक्षेप में, हाई-सी डीएनए पुस्तकालयों में संकरण अवरोधक (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) जोड़े गए थे। हाइब्रिडाइजेशन बफर और कैप्चर बैट आरएनए निर्माता के निर्देशों (श्योरसेलेक्ट टारगेट एनरिचमेंट, एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) के अनुसार तैयार किए गए थे। इसके बाद, हाई-सी लाइब्रेरी डीएनए/हाइब्रिडाइजेशन ब्लॉकर्स को तापमान को 65 डिग्री तक कम करने से पहले 5 मिनट के लिए 95 डिग्री पर गर्म किया गया। हाई-सी लाइब्रेरी डीएनए को संकरण बफर (5 मिनट से 65 डिग्री के लिए प्रीवार्म किया गया) के साथ मिलाया गया था, और बाद में कस्टम-डिज़ाइन किए गए कैप्चर बैट सिस्टम (3 मिनट से 65 डिग्री के लिए प्रीवार्म) के साथ, जिसमें 10, 000 बायोटिनाइलेटेड शामिल थे। 5000 माउस जीन प्रमोटरों के हिंद III प्रतिबंध खंड को लक्षित करने वाले आरएनए (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, कैप्चर बैट डिजाइन के लिए पूरक सामग्री देखें)। पीसीआर मशीन में 65 डिग्री पर 24 घंटे के बाद, बायोटिन पुलडाउन (मायऑन स्ट्रेप्टाविडिन टी1 डायनाबिड्स; लाइफ टेक्नोलॉजीज) और वॉश को श्योरसेलेक्ट टारगेट संवर्धन प्रोटोकॉल (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का पालन करते हुए किया गया। अंतिम धोने के बाद, मोतियों को 30 μL NEBuffer 2 में पूर्व डीएनए क्षालन के बिना फिर से जोड़ा गया था, और बायोटिनाइलेटेड आरएनए के माध्यम से मोतियों से बंधे डीएनए पर एक पोस्ट-कैप्चर पीसीआर (इल्यूमिन यूनिवर्सल प्राइमरों का उपयोग करके चार प्रवर्धन चक्र) का प्रदर्शन किया गया था। कैप्चर हाई-सी लाइब्रेरी को पेयर-एंड सीक्वेंस किया गया था (नेक्स्टसेक 500, इलुमिना)।

प्रमोटर कैप्चर हाई-सी विश्लेषण - हाईकप पाइपलाइन63 को कच्चे फास्टक सीक्वेंसिंग रीड्स को संसाधित करने के लिए नियोजित किया गया था। इस पाइपलाइन का उपयोग माउस (mm9) जीनोम के खिलाफ रीड पेयर को मैप करने के लिए किया गया था, प्रायोगिक आर्टिफैक्ट्स (जैसे सर्कुलर रीड और री-लिगेशन) को फ़िल्टर करने के लिए और डुप्लिकेट रीड्स को हटाने के लिए। PC-HiC डेटा के लिए, परिणामी BAM फ़ाइलों का नमूनाकरण किया गया और महत्वपूर्ण इंटरैक्शन को कॉल करने के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का पालन करते हुए CHiCAGO संस्करण 1.2.064 का उपयोग करके संसाधित किया गया। इस पाइपलाइन का पूरा विवरण बाब्राहम जैव सूचना विज्ञान से उपलब्ध है

याददाश्त में सुधार कर सकता है सिस्टैन्च

स्टीरियोटैक्सिक एडेनो-एसोसिएटेड वायरस इंजेक्शन

ArcCreERT2 चूहों को एवर्टिन के साथ और AAV 9- EF1a-DIO-hChR 2- EYFP (यूएनसी वायरल कोर से प्राप्त सीरोटाइप 5) वायरस इन्फ्यूजन के लिए एनेस्थेटाइज किया गया था। सबसे पहले, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के ऊपर खोपड़ी में एक छोटा सा छेद बनाया गया था (ब्रेग्मा के सापेक्ष: पूर्वकाल-पश्च −2। 0 और औसत दर्जे का ± 1.5), एक 33- गेज सुई के साथ एक हैमिल्टन सिरिंज को उतारा गया था। से −1.8 DV और 500 l वायरस दोनों हिप्पोकैम्पी में 50 l प्रति मिनट की प्रवाह दर से संक्रमित थे। इंजेक्शन के 10 मिनट बाद की अवधि के बाद सुई को वापस ले लिया गया और चूहों को 4 दिनों तक ठीक होने दिया गया।