भाग IV चूहों में 5-Fu/5-Fu+L-OHP-प्रेरित अस्थि मज्जा दमन के मॉडल पर अध्ययन

वर्तमान में, अस्थि मज्जा दमन के पशु मॉडल के निर्माण के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियों में विकिरण मॉडलिंग [1,2], साइक्लोफॉस्फेमाईड इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन मॉडलिंग [3-5], 5-फ्लूरोरासिल ({{4%)फ्लूरोरासिल, { शामिल हैं। {5}}एफयू) इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन मॉडलिंग [6,7], विकिरण के साथ संयुक्तकीमोथेरेपी दवायौगिक मॉडलिंग [8,9], मिरगी-विरोधी दवा कार्बामाज़ेपिन गैवेज मॉडलिंग [10], आदि। विभिन्न मॉडलिंग विधियां अस्थि मज्जा दमन के विभिन्न तंत्रों का कारण बनती हैं, और विभिन्न रक्त कोशिकाओं पर प्रभाव और उनकी डिग्री अलग-अलग होती हैं; विभिन्न कीमोथेरेपी दवाएं, उनकी क्रिया के विभिन्न तंत्रों के कारण, अस्थि मज्जा हेमटोपोइजिस पर उनके प्रभाव में कुछ अंतर भी दिखाती हैं। इसलिए, अस्थि मज्जा हेमटोपोइजिस पर कीमोथेरेपी दवाओं के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अस्थि मज्जा दमन का एक आदर्श पशु मॉडल बहुत महत्वपूर्ण है।

नैदानिक ​​अभ्यास में,कोलोरेक्टल कैंसर के लिए सहायक कीमोथेरेपीमुख्य रूप से ऑक्सिप्लिप्टिन (ऑक्सिप्लिटिन, एल-ओएचपी) के साथ संयुक्त 5-एफयू आहार और 5-फू को अपनाता है। अस्थि मज्जा दमन के एक पशु मॉडल के निर्माण के लिए अकेले 5-फू के उपयोग पर प्रासंगिक अध्ययन हुए हैं। हालाँकि, फू के उपयोग का दायरा अपेक्षाकृत व्यापक है। साहित्य रिपोर्ट में मॉडलिंग के लिए डी1 और डी5 पर 110 मिलीग्राम/किग्रा, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (आईपी) शामिल है [7, 150 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी, मॉडलिंग 16, 11 के लिए डी1], मॉडलिंग के लिए 200 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी, डी1 [{{ 15}}], और 250 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी, डी1 मॉडलिंग के लिए [16]। हालाँकि, अस्थि मज्जा दमन के पशु मॉडल के निर्माण के लिए एल-ओएचपी के साथ फू के उपयोग पर कोई रिपोर्ट नहीं दी गई है। यू लिंगहोंग एट अल। [17] जिगर की चोट का एक पशु मॉडल स्थापित करने के लिए एल-ओएचपी के साथ संयुक्त रूप से फू का इस्तेमाल किया गया। साहित्य की प्रशासन पद्धति और खुराक का उल्लेख करते हुए, टीम ने हड्डी का एक पशु मॉडल स्थापित करने के लिए एल-ओएचपी के साथ संयुक्त रूप से 5-फू की खुराक का प्रारंभिक अन्वेषण किया।मज्जा दमन, और 5-Fu 200 mg/kg, ip, d1 की मॉडलिंग विधि और 5-Fu 187.5 mg/kg + L-OHP 9 mg/kg, ip, d1 की मॉडलिंग विधि की तुलना की। नतीजों से पता चला कि इन दोनों मॉडलों की खुराक बहुत बड़ी थी। इसलिए, इस अध्ययन का लक्ष्य फू-प्रेरित अस्थि मज्जा दमन पशु मॉडल की इष्टतम खुराक और एल-ओएचपी मॉडलिंग के साथ संयुक्त फू की खुराक का पता लगाना जारी रखना है, ताकि प्रदान किया जा सके। के लिए सबसे आदर्श पशु मॉडलप्रभावकारिता का अध्ययन करने का अगला चरणऔरकितु एर्ज़ी नुस्खे का तंत्र.

किडनी के स्वास्थ्य के लिए हर्ब सिस्टान्चे

वेसिस्टैंच की सहायक सेवा

ईमेल:wallence.suen@wecistanche.com

व्हाट्सएप/टेलीभाष:+86 15292862950

सामग्री और तरीके

1 प्रायोगिक सामग्री

1.1 प्रायोगिक जानवर

100 विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ़) BALB/c नर चूहों, जिनका वजन 20 ग्राम ± 2 ग्राम था, को एसबीईएफ (बीजिंग) बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड से खरीदा गया था और ज़ियुआन अस्पताल के प्रायोगिक पशु केंद्र, चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल में पिंजरों में रखा गया था। विज्ञान (योग्यता का प्रमाण पत्र: SYXK (बीजिंग) संख्या 2015-0011)। सभी चूहों को 1 सप्ताह तक अनुकूल रूप से भोजन दिया गया, और भोजन अवधि के दौरान उन्हें पानी और भोजन तक निःशुल्क पहुंच प्राप्त थी। भोजन की स्थिति: इनडोर तापमान 20-26 डिग्री, सापेक्षिक आर्द्रता 40%~60%, प्रकाश/अंधेरा समय 12 घंटे/12 घंटे। यह प्रयोग ज़ियुआन अस्पताल, चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज की प्रायोगिक पशु प्रबंधन आचार समिति के प्रासंगिक नियमों का कड़ाई से अनुपालन करता है और पशु नैतिकता मानकों का अनुपालन करता है।

1.2 मुख्य प्रायोगिक औषधियाँ एवं अभिकर्मक

5-फू (फ्लूरोरासिल इंजेक्शन) इंजेक्शन के लिए ऑक्सालिप्लाटिन

0.01एम फॉस्फेट बफर (पीबीएस बफर) रक्त कोशिका विश्लेषण के लिए पतला (एमईके{2}})

रक्त कोशिका विश्लेषण के लिए सफाई समाधान (एमईके-680) रक्त कोशिका विश्लेषण के लिए हेमोलिटिक एजेंट (एमईके-680) रक्त कोशिका विश्लेषक के लिए सफाई समाधान

हैरिस हेमेटोक्सिलिन दाग 0.5% ईओसिन दाग

तटस्थ गम सीलिंग माध्यम

खनिज अम्ल प्रकार ऊतक नमूना डीकैल्सीफिकेशन समाधान

1.3 मुख्य उपकरण और उपकरण

स्वचालित रक्त कोशिका काउंटर (MEK6318) केशिका रक्त संग्रह ट्यूब (20 μL)

1000μL पिपेट टिप

ऊतक-TEK VIP6 जैविक ऊतक निर्जलीकरण ऊतक-TEK TEC जैविक ऊतक एम्बेडिंग मशीन Leica RM2235 ऊतक स्लाइसर

लेईका HI1210 स्लाइस पिकर लेईका HI1220 स्लाइस बेकिंग मशीन

लेइका ST5020 स्वचालित स्टेनर लेइका CV5030 स्वचालित कवरस्लिपर ओलंपस Bx53 माइक्रोस्कोप

पथ क्यूसी पैथोलॉजी गुणवत्ता नियंत्रण और डेटा प्रबंधन प्रणाली

अन्य: पिपेट, साधारण इलेक्ट्रॉनिक स्केल, सर्जिकल कैंची, चिमटी, 75% अल्कोहल, मेडिकल धुंध, बाँझ कपास की गेंदें, सीरिंज, आदि।

1.4 कीमोथेरेपी दवाओं की तैयारी

(1) एकल-दवा 5-फू आहार

स्टैंडबाय उपयोग के लिए 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की सांद्रता वाला घोल तैयार करने के लिए 40 मिलीलीटर 0.9% NaCl घोल में {0}}Fu (0.25 ग्राम/10 मिली) घोलें।

(2) 5-फू को एल-ओएचपी आहार के साथ जोड़ा गया

स्टैंडबाय के लिए 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की सांद्रता वाला घोल तैयार करने के लिए 40 मिली 0.9% NaCl घोल में फू (0.25 ग्राम/10 मिली) को घोलें। उपयोग। एल-ओएचपी (50 मिलीग्राम) की 1 ट्यूब को 5% ग्लूकोज समाधान के 5 मिलीलीटर में घोलें, और उपयोग के लिए 0.5 मिलीग्राम/एमएल समाधान में 5% ग्लूकोज समाधान के साथ पतला करना जारी रखें।

तालिका 4-1 दवा आहार की मॉडलिंग

उपरोक्त खुराक नियम के अनुसार, सभी चूहों का वजन किया गया और शरीर के वजन के अनुसार व्यक्तिगत रूप से खुराक दी गई। दोहरे दवा समूह में, 5-फू और एल-ओएचपी प्रशासन के बीच का समय अंतराल 5 घंटे से अधिक था [17]।

(2) अस्थि मज्जा दमन मॉडल के मूल्यांकन संकेतक

अस्थि मज्जा दमन मॉडल के मूल्यांकन संकेतकों में परिधीय रक्त कोशिका गिनती में कमी [18-22], या अस्थि मज्जा न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं के साथ संयुक्त परिधीय रक्त कोशिका गिनती शामिल है [9.23-25]। इस अध्ययन में मॉडलिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए दूसरी विधि का उपयोग किया गया।

2.2 अवलोकन संकेतक और सामग्री

2.2.1 चूहों की सामान्य स्थिति

प्रयोग के दौरान हर दिन चूहों के प्रत्येक समूह के आहार, शौच, गतिविधि, स्थिति, मानसिक स्थिति और बालों की स्थिति देखी गई। यदि चूहे मर गए, तो उन्हें समय पर दर्ज किया गया।

2.2.2 प्रत्येक समूह में चूहों के वजन में परिवर्तन

मॉडलिंग के दिन खुराक देने से पहले प्रत्येक चूहे का वजन तौलें और रिकॉर्ड करें (डी0), और मॉडलिंग के बाद हर दूसरे दिन प्रत्येक चूहे का वजन करें और उसका वजन रिकॉर्ड करें।

2.2.3 परिधीय रक्त कोशिका गिनती में परिवर्तन

माउस फिक्सर से माउस को ठीक करें, पूंछ को बाहर निकालें और पूंछ को 45-50 डिग्री गर्म पानी में भिगोएँ। पूँछ सूखने के बाद, पूँछ के सिरे का 1-2 मिमी काट दें। तेजी से और धीरे से पूंछ को आधार से सिरे तक 2-3 बार सहलाएं। 20μL रक्त इकट्ठा करने के लिए एक केशिका रक्त संग्रह ट्यूब का उपयोग करें, इसे तैयार रक्त कोशिका मंदक में पतला करें, और मशीन पर रक्त कोशिका विश्लेषण करें। प्रतिदिन एक निश्चित समय पर रक्त एकत्र करें; सभी रक्त संग्रह एक व्यक्ति द्वारा पूरा किया जाता है। पहचान संकेतकों में शामिल हैं: श्वेत रक्त कोशिकाएं, लाल रक्त कोशिकाएं, हीमोग्लोबिन और प्लेटलेट्स।

2.2.4 अस्थि मज्जा केन्द्रित कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन

नमूना लेने से एक दिन पहले, 1000 μL पीबीएस समाधान लेने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और इसे 2 मिलीलीटर ईपी ट्यूब में पतला करें, और बाद में उपयोग के लिए इसे 4 डिग्री रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत करें। डी6 पर, प्रत्येक समूह से 8 चूहों को यादृच्छिक रूप से चुना गया और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मार दिया गया। एक बाँझ साफ बेंच के नीचे, फीमर के पास के फर को काटने, दाहिनी फीमर को हटाने और बचे हुए नरम ऊतकों को हटाने के लिए इसे मेडिकल धुंध से लपेटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग किया गया था। ईपी ट्यूब में पीबीएस समाधान निकालने के लिए 1 मिलीलीटर सिरिंज सुई (नंबर 4 सुई) का उपयोग करें, अस्थि मज्जा को ईपी ट्यूब में प्रवाहित करने के लिए फीमर के एक छोर में ड्रिल करें; अस्थि मज्जा कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए बार-बार फ्लश करें और कई बार एस्पिरेट करें जब तक कि फीमर सफेद न हो जाए। तैयार अस्थि मज्जा कोशिका निलंबन को एक {{7}जाल नायलॉन जाल के माध्यम से पारित किया गया था। अस्थि मज्जा न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक स्वचालित रक्त कोशिका काउंटर का उपयोग करें। d13 पर, शेष चूहों को उसी तरह मार दिया गया और नमूने एकत्र किए गए।

2.2.5 अस्थि मज्जा विकृति विज्ञान एचई धुंधलापन

डी6 पर, प्रत्येक समूह में चूहों को गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मारने के बाद, एक बाँझ साफ बेंच के नीचे फीमर के पास फर को काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग किया गया, बाईं फीमर को हटा दिया गया, मोम ब्लॉक, स्लाइस और एचई धुंधला बना दिया गया।

(1) वैक्स ब्लॉक की तैयारी और सेक्शनिंग चरण

① नमूनाकरण: 24 घंटे से अधिक के लिए 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ ऊतक को ठीक करें, 24-48 घंटे के लिए डीकैल्सीफिकेशन समाधान में भिगोएँ, ऊतक को पिन से चुभाएँ, नरम होने के बाद ऊतक को काटें और ट्रिम करें, और इसे मोम ब्लॉक में डालें डिब्बा;

② निर्जलीकरण: ऊतक को क्रमिक रूप से 70% अल्कोहल (2 घंटे), 80% अल्कोहल (1.5 घंटे), 95% अल्कोहल I (1.5 घंटे), 95% अल्कोहल II (1.5) में रखा जाता है। घंटे), 100% अल्कोहल I (0.5 घंटे), और 100% अल्कोहल II (0.5 घंटे), और क्रमिक तरीके से निर्जलित।

③ पारदर्शिता: ऊतक को क्रमिक रूप से निर्जल इथेनॉल और जाइलीन समाधान (मात्रा अनुपात 1:1), जाइलीन I, और जाइलीन II में प्रत्येक 40 मिनट के लिए रखा जाता है।

④ मोम विसर्जन: ऊतक को क्रमिक रूप से जाइलीन और पैराफिन (1:1), पैराफिन I और पैराफिन II के मिश्रण में प्रत्येक 20 मिनट के लिए रखा जाता है। पैराफिन को पिघलाए रखने के लिए 58 डिग्री पर स्थिर तापमान वाले उपकरण में मोम की डिपिंग की जाती है।

⑤ एंबेडिंग: टिश्यू ब्लॉक को लेबल करने के बाद, चिमटी को पहले से गर्म करें, पिघले हुए पैराफिन को मोल्ड में डालें, और फिर टिश्यू ब्लॉक को अंदर डालें और पैराफिन के जमने का इंतजार करें।

⑥ स्लाइसिंग: एम्बेडिंग के बाद, टिश्यू वैक्स ब्लॉक को स्लाइसर पर रखें, स्लाइसर के कोण को समायोजित करें, और टिश्यू ब्लॉक को 4-5 μm की मोटाई के साथ स्लाइस में काटें।

⑦ चिपकाना: पैराफिन स्लाइस को 42 डिग्री पानी में फैलाएं, स्लाइस को एक-एक करके स्लाइड से उठाएं और स्लाइड पर चिपका दें।

⑧ बेकिंग: फंसी हुई स्लाइड को लगभग 70 डिग्री तापमान वाले एक स्थिर तापमान वाले बॉक्स में रखें और 1.5 घंटे तक बेक करें।

(2) वह धुंधला चरण:

① ज़ाइलीन I और II को प्रत्येक 15 मिनट तक भिगोकर डीवैक्स करें।

② 100% अल्कोहल I और II में 5 मिनट के लिए भिगोएँ।

③ 95%, 85%, और 75% ग्रेडिएंट अल्कोहल में 3 मिनट के लिए भिगोएँ, और आसुत जल से धो लें।

④ हेमेटोक्सिलिन का दाग 1-3 मिनट तक रखें, और आसुत जल से धोएं।

⑤ 2-3 सेकंड के लिए हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल विभेदन, आसुत जल से धोएं।

⑥ 1 मिनट के लिए अमोनिया पानी में डुबोकर नीला कर दें, आसुत जल से धो लें।

⑦ 5 मिनट के लिए ईओसिन धुंधलापन।

2 मिनट के लिए 75%, 85%, 95% ग्रेडिएंट अल्कोहल में डुबोएं।

⑨ प्रत्येक को 3 मिनट के लिए 100% अल्कोहल I, IⅡ में डुबोएं।

⑩ प्रत्येक को 5 मिनट के लिए xylene I, Ⅱ में डुबोएं।

⑪ न्यूट्रल गम से सील करें।

2.3 सांख्यिकीय तरीके

SPSS26.0 का उपयोग डेटा पर सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए किया गया था। मापन डेटा को माध्य ± मानक विचलन (x±s) के रूप में व्यक्त किया गया था। सबसे पहले, डेटा का सामान्यता और विचरण की एकरूपता के लिए परीक्षण किया गया था: सामान्य रूप से वितरित डेटा के लिए, कई समूहों के बीच तुलना के लिए एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था: जब विचरण बराबर था, तो एलएसडी परीक्षण का उपयोग जोड़ीदार तुलना के लिए किया गया था; यदि विचरण समान नहीं था, तो तम्हाने के t2 परीक्षण का उपयोग जोड़ीवार तुलना के लिए किया गया था; यदि यह सामान्य वितरण के अनुरूप नहीं था, तो एक गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग किया गया था। पी<0.05 was considered statistically significant.