इचिनाकोसाइड पार्किंसंस रोग को कैसे रोकता है

संपर्क: emily.li@wecistanche.com

भाग Ⅰ: एमटीओआर सिग्नलिंग पाथवे बाय इचिनाकोसाइड के माध्यम से एमपीटीपी-प्रेरित पीडी चूहों में ऑटोफैगी विनियमन का तंत्र

सार:

उद्देश्य: वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य के प्रभाव की जांच करना हैइचिनाकोसाइड(ईसीएच) एमटीओआर सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से ऑटोफैगी-संबंधित संकेतकों पर, विशेष रूप से ऑटोफैगी सब्सट्रेट पी 62 और -सिन्यूक्लिन की निकासी पर प्रभाव, के मुख्य रोग संबंधी उत्पादपार्किंसंस रोग(पीडी), पीडी के इलाज के लिए नई रणनीति प्रदान करने के लिए (पार्किंसंस रोग) तरीके: सबस्यूट पीडी . का एक माउस मॉडल(पार्किंसंस रोग)1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा स्थापित किया गया था। सबसे पहले, प्रत्येक समूह के चूहों में न्यूरोबेहेवियरल लक्षणों का मूल्यांकन किया गया था, और प्रत्येक समूह में स्ट्रिएटम में मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर को उच्च-प्रदर्शन तरल चरण के साथ मापा गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस डबल स्टेनिंग को टाइरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच), - सिन्यूक्लिन, और एलसी 3 की अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए अपनाया गया था। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल थायरिया नाइग्रा में अल्ट्रास्ट्रक्चर में बदलाव और ऑटोफैगोसोम के गठन का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। फिर, पश्चिमी धब्बा द्वारा TH, -synuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR, और अपस्ट्रीम प्रोटीन AKT के भावों का पता लगाया गया। परिणाम: जब मॉडल समूह के साथ तुलना की जाती है, तो न्यूरोबिहेवियरल फ़ंक्शन में काफी सुधार होता हैईसीएच (इचिनाकोसाइड)समूह (P <{0}}.01), साथ="" में="" मस्तिष्क="" में="" th,="" da,="" और="" dopac="" की="" बढ़ी="" हुई="" अभिव्यक्ति="" (p=""><0.01)।>ईसीएच (इचिनाकोसाइड)समूह, जबकि बीक्लिन 1 और एलसी3-II की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई (पी <0.01), पी62 और -सिन्यूक्लिन के अभिव्यक्ति स्तर में काफी कमी आई (पी <0.01)।ईसीएच (इचिनाकोसाइड)उत्तरजीविता संकेत p-AKT/AKT के अभिव्यक्ति स्तर को बढ़ा सकता है और mTOR की अभिव्यक्ति को कम कर सकता है। निष्कर्ष:ईसीएच (इचिनाकोसाइड)एमटीओआर की अभिव्यक्ति को बाधित करके ऑटोफैगी को बढ़ा सकता है, जिससे -सिन्यूक्लिन की निकासी को बढ़ावा मिलता है और ऑटोफैगी सब्सट्रेट पी 62 का क्षरण होता है और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव को बढ़ाता है।

कीवर्ड: पार्किंसंस रोग, एमपीटीपी,इचिनाकोसाइड, -सिन्यूक्लिन, पी62, ऑटोफैगी, एमटीओआर

सिस्टांचे पार्किंसंस रोग का इलाज कर सकता है

परिचय

पार्किंसंस रोग (पीडी)एक पुरानी और प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है। पीडी . की एक विशिष्ट रोग संबंधी विशेषता(पार्किंसंस रोग)लेवी निकायों का गठन है, और -सिन्यूक्लिन और यूबिकिटिन लेवी निकायों के मुख्य घटक हैं। अधिक से अधिक साक्ष्य से पता चलता है कि ऑटोफैगी विनियमन के विकार से अंततः मिसफोल्डेड प्रोटीन और घायल ऑर्गेनेल का संचय होता है। ऑटोफैगी-लाइसोसोम मार्ग न केवल प्रोटीन को नीचा दिखा सकता है, जिसे सर्वव्यापी-प्रोटियासम मार्ग द्वारा नीचा नहीं किया जा सकता है, बल्कि पथ-मार्ग भी है। नीचा कर सकता है -सिन्यूक्लिन। इसलिए, ऑटोफैगी का नियमन पीडी . के उपचार के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकता है (पार्किंसंस रोग). ऑटोफैगी इंट्रासेल्युलर समुच्चय के क्षरण का मुख्य मार्ग है, और एमटीओआर किनेज ऑटोफैगी के लिए एक प्रमुख नियामक साइट है। इसलिए, पीडी . के बीच संबंध को स्पष्ट करना सैद्धांतिक और व्यावहारिक महत्व का है(पार्किंसंस रोग) और ऑटोफैगी को एमटीओआर सिग्नलिंग मार्ग द्वारा नियंत्रित किया जाता है। चूंकि -सिन्यूक्लिन का क्षरण मुख्य रूप से लक्ष्य के रूप में असामान्य प्रोटीन के उन्मूलन के साथ ऑटोफैगी-लाइसोसोमल प्रणाली पर निर्भर करता है, ऑटोफैगी को विनियमित करने में सक्षम न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं का विकास न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के उपचार के लिए दिशा-निर्देश प्रदान कर सकता है। ईसीएच (इचिनाकोसाइड) C35 H46 O20 का आणविक सूत्र है। यह चीनी दवा सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स का मुख्य घटक है। इसे सबसे पहले स्टोल एट अल द्वारा की जड़ से अलग किया गया थाEchinaceaएंगुस्टिफोलिया डीसी।ईसीएच (इचिनाकोसाइड)औषधीय प्रभावों की एक विस्तृत श्रृंखला है। इसमें विरोधी भड़काऊ, एंटी-ऑक्सीडेंट, तंत्रिका सुरक्षा, सीखने और स्मृति में सुधार, यकृत सुरक्षा, प्रतिरक्षा विनियमन और एंटी-ट्यूमर प्रभाव हैं। वर्तमान अध्ययन, पीडी . के मुख्य रोग तंत्र से शुरू होता है(पार्किंसंस रोग), के neuroprotective प्रभावों के नियमन की जांच करने के उद्देश्य सेईसीएच (इचिनाकोसाइड)एक माउस पीडी . में(पार्किंसंस रोग)ऑटोफैगी-लाइसोसोमल मार्ग से एमपीटीपी द्वारा प्रेरित मॉडल।

सामग्री और उपकरण

प्रायोगिक पशु

प्रायोगिक समूह में एसपीएफ़ ग्रेड के साथ 108 पुरुष C57BL/6J चूहे शामिल थे, आठ सप्ताह पुराने, वजन 20-22 ग्राम, प्रति पिंजरे चार चूहे, 22-25 डिग्री पर रखे गए थे। चूहों को शंघाई सेंटर फॉर लेबोरेटरी एनिमल्स, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज द्वारा प्रदान किया गया था, जो नानजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन में रखा गया था, और जानवरों को 22 के तापमान के साथ एसपीएफ़ ग्रेड रूम में राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देशों के अनुसार मानवीय देखभाल प्राप्त हुई थी। 25 डिग्री, सापेक्षिक आर्द्रता 55 प्रतिशत, और 12-घंटे के सर्कैडियन रिदम के तहत। चूहे भोजन और पानी लेने के लिए स्वतंत्र थे।

मुख्य अभिकर्मक

एमपीटीपी (सिग्मा कंपनी), चूहों एंटी-टीएच मोनोक्लोनल एंटी-बॉडी (सिग्मा कंपनी), एलेक्सा फ्लोर 555 एंटी-खरगोश एंटी-बॉडी (बाययुंटियन इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी), एलेक्सा फ्लोर 488 एंटी-खरगोश एंटीबॉडी (बायंटियन इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी), एचआरपी -बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (बाययुंटियन इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी), खरगोश पॉलीक्लोनल - सिन्यूक्लिन एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी कंपनी), एचआरपी-बकरी एंटी-माइस सेकेंडरी एंटीबॉडी (बायंटियन इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी),ईसीएच(इचिनाकोसाइड) (चेंगदू लिंगहांगज़े बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड), खरगोश एंटी-पी-एकेटी (सेर473) एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी कंपनी), रैपामाइसिन (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी कंपनी), क्लोरोक्वीन (सिग्मा कंपनी), वोर्टमैनिन (सिग्मा कंपनी), खरगोश पॉलीक्लोनल LC3 एंटीबॉडी (Abcam कंपनी), खरगोश पॉलीक्लोनल P62 एंटीबॉडी (एंज़ो लाइफ साइंस कंपनी), चूहों मोनोक्लोनल -एक्टिन एंटीबॉडी (सांता क्रूज़ कंपनी), बीक्लिन 1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (Abcam कंपनी)।

सामग्री की जानकारी:

एमपीटीपी (अमेरिका, सिग्मा कंपनी), चूहों के एंटी-टीएच मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (अमेरिका, सिग्मा कंपनी), खरगोश पॉलीक्लोनल -सिन्यूक्लिन एंटीबॉडी (अमेरिका, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी कंपनी), एचआरपी-बकरी एंटी-माइस सेकेंडरी एंटीबॉडी (चीन, बायंटियन इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) ),ईसीएच(इचिनाकोसाइड) (चीन, चेंगदू लिंगहांगज़े बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड), खरगोश एंटी-पी-एकेटी (सेर473) एंटीबॉडी (अमेरिका, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी कंपनी), रैपामाइसिन (अमेरिका, सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी कंपनी), क्लोरोक्वीन (अमेरिका, सिग्मा कंपनी), Wortmannin (अमेरिका, सिग्मा कंपनी), खरगोश पॉलीक्लोनल LC3 एंटीबॉडी (अमेरिका, Abcam कंपनी), खरगोश पॉलीक्लोनल P62 एंटीबॉडी (अमेरिका, एंज़ो लाइफ साइंस कंपनी), चूहों मोनोक्लोनल - एक्टिन एंटीबॉडी (अमेरिका, सांता क्रूज़ कंपनी), बीक्लिन 1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी ( अमेरिका, एबकैम कंपनी)।

इचिनाकोसाइड उपचारपार्किंसंस रोग

प्रयोगात्मक विधियों

प्रायोगिक पशुओं का समूहन

108 C57BL/6J चूहों को बेतरतीब ढंग से छह समूहों में विभाजित किया गया था, प्रत्येक समूह में 18 चूहों के साथ। विवरण इस प्रकार थे: सामान्य नियंत्रण समूह (सामान्य खारा समूह, एन समूह), मॉडल समूह (एमपीटीपी समूह, एम समूह),ईसीएच(इचिनाकोसाइड) समूह (एमपीटीपी प्लसईसीएच (इचिनाकोसाइड), ईएच समूह), प्रेरित ऑटोफैगी समूह (एमपीटीपी प्लस रैपामाइसिन समूह, आरए समूह), ऑटोफैगी अवरोधक ए समूह (एमपीटीपी प्लस)ईसीएच (इचिनाकोसाइड)प्लस क्लोरोक्वीन ग्रुप, सीक्यू ग्रुप), ऑटोफैगी इनहिबिटर बी ग्रुप (एमपीटीपी प्लस .)ईसीएच (इचिनाकोसाइड)प्लस वोर्टमैनिन समूह, डब्ल्यूओ समूह)। एमपीटीपी की खुराक 30 मिलीग्राम / किग्रा / डी थी, लगातार 7 दिनों तक इंजेक्शन।ईसीएच (इचिनाकोसाइड) 30mg/kg/d पर दिया गया था, इंट्रागैस्ट्रिक रूप से प्रशासित।9

प्रायोगिक जानवरों और दवा की मॉडलिंग

एन समूह और ईएच समूह को सामान्य खारा दिया गया औरईसीएच(इचिनाकोसाइड) मॉडलिंग से तीन दिन पहले, मॉडलिंग के सात दिन बाद तक। एमपीटीपी के अंतिम इंजेक्शन के बाद लगातार सात दिनों तक रैपामाइसिन, 1 0 वोर्टमैनिन, 11, और क्लोरोक्वीन का प्रशासन किया गया। रैपामाइसिन के टेल वेन इंजेक्शन की खुराक की गणना 2mg/kg/d के रूप में की गई थी। चूहों में क्लोरोक्वीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन की खुराक 50mg/kg/d थी। चूहों में wortmannin के टेल वेन इंजेक्शन की खुराक 0.7mg/kg/d (पूरक चित्र 1) थी।

न्यूरोबिहेवियरल ऑब्जर्वेशन

साहित्य के अनुसार, 12 मामूली संशोधन के साथ, पोल परीक्षण के लिए स्व-निर्मित उपकरण इस प्रकार था: उपकरण 55 सेमी लंबा, 1 सेमी व्यास पीवी ट्यूब था जिसमें शीर्ष पर 2 सेमी गोलाकार प्रक्षेपण का व्यास था। डिवाइस चूहों के लिए एक लगाव बिंदु के रूप में। चूहों को गिरने से बचाने के लिए डिवाइस को काले टेप से ढक दिया गया था। प्रत्येक माउस को परीक्षण के दौरान उसके सिर को ऊपर की ओर गोलाकार उभरे हुए बिंदु पर रखा गया था। रखी गई पट्टी के शीर्ष से सिर तक नीचे की ओर मुड़ने का समय (टी-टर्न) और रखी गई पट्टी के शीर्ष से ट्यूब के नीचे तक उतरने का कुल समय (टी-कुल) दर्ज किया गया।

स्वतःस्फूर्त गतिविधि

सहज गतिविधि, जिसे खुले क्षेत्र की गतिविधि के रूप में भी जाना जाता है, एमपीटीपी चोट के बाद दुर्लभ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक सामान्य संकेतक है। वर्तमान अध्ययन में, एक खुले क्षेत्र प्रयोग वीडियो विश्लेषण प्रणाली को अपनाया गया था। विशिष्ट ऑपरेशन इस प्रकार थे: प्रयोग से पहले, एक ही समूह के चार चूहों को एक अवलोकन बॉक्स (25 सेमी की लंबाई, 25 सेमी की चौड़ाई और ऊंचाई के साथ) में रखा गया था।

25 सेमी) 30 मिनट के लिए अनुकूलित करने के लिए। फिर उन्हें लगातार 30 मिनट तक वीडियो रिकॉर्ड किया गया। 30-मिनट ऑब्जर्वेशन टाइम विंडो में, ऊर्ध्वाधर आंदोलनों की संख्या (रियरिंग नंबर) को पांच मिनट के तीन असंतत अंतराल में अलग से गिना गया था। वीडियो विश्लेषण प्रणाली ने स्वचालित रूप से माउस की गतिविधियों के प्रक्षेपवक्र का विश्लेषण किया और क्षैतिज गति के संकेतक के रूप में एक 30-मिनट की कुल दूरी (कुल दूरी) प्राप्त की।

चाल विश्लेषण

चाल विश्लेषण: साहित्य के अनुसार, 14 एक स्व-निर्मित चाल विश्लेषण उपकरण का उपयोग किया गया था। यह उपकरण इस प्रकार था: एक लकड़ी का वॉकवे (42 सेमी की लंबाई के साथ, की चौड़ाई के साथ)

4.5 सेमी और ऊंचाई 12 सेमी), एक छोर खुला था, दूसरा छोर गिलहरी के पिंजरे की ओर ले गया। गिलहरी का पिंजरा काले कपड़े से ढका हुआ था। चूहे के पैरों के नीचे नीली स्याही डूबी हुई थी। फिर माउस को वॉकवे के खुले सिरे पर रखा गया। चूहा स्वाभाविक रूप से गिलहरी के पिंजरे के अंत में चला गया जो काले कपड़े से ढका हुआ था। तीन सबसे लंबे अग्र और पिछले अंगों के कदमों को क्रमशः मापा गया, और औसत मान लिया गया।

रोटारोड टेस्ट

माउस को एक चर-गति वाले रोटारोड पर रखा गया था, रोटारोड की गति को पांच मिनट के भीतर चार राउंड/मिनट से बढ़ाकर 40 राउंड/मिनट करने के लिए समायोजित किया गया था। रोटारोड रोटेशन की शुरुआत से लेकर रोटारोड से माउस के गिरने तक का समय हर बार गिरने की विलंबता के रूप में दर्ज किया गया था। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री डिटेक्शन (एचपीएलसी-ईसीडी) द्वारा स्ट्रिएटम में मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर की सामग्री का निर्धारण

नमूनाकरण और उपचार

चूहों को इच्छामृत्यु दी गई, और स्ट्रिएटम को जल्दी से बर्फ पर अलग किया गया और तौला गया। मस्तिष्क के 0.1 ग्राम (गीले वजन) के 5 प्रतिशत पर्क्लोरिक एसिड के 1 एमएल के अनुपात के अनुसार, प्रत्येक समूह के नमूनों को पर्क्लोरिक एसिड की संगत मात्रा वाले गिलास में डाला गया और एक घोल ट्यूब में समरूप बनाया गया। . होमोजेनेट को कम तापमान पर 13, 000 आर/मिनट के साथ 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। सतह पर तैरनेवाला लिया गया था, और centrifugation दोहराया गया था। सतह पर तैरनेवाला आगे की पहचान के लिए कम तापमान वाले रेफ्रिजरेटर में रखा गया था। एचपीएलसी-ईसीडी के लिए शर्तें इस प्रकार थीं: कूलोहेमेल 5300 इलेक्ट्रोकेमिकल क्रोमैटोग्राफी को अपनाया गया था। पता लगाने के साधन 5020 और 504 एलबी कोशिकाएं थीं, एमडी के क्रोमैटोग्राफिक कॉलम के साथ -150 (3.0 * 150 मिमी; 3 उम), एमडीटीएम का मोबाइल चरण -2, और 2uA की संवेदनशीलता। प्रवाह दर 0.6 एमएल/मिनट पर सेट की गई थी, इलेक्ट्रोड की क्षमता 220mV पर सेट की गई थी, और स्तंभ तापमान 30 डिग्री पर सेट किया गया था। इंजेक्शन की मात्रा 20 उल (पहले दस बार पतला) थी।

निम्नलिखित न्यूरोट्रांसमीटर की सामग्री का पता लगाया गया डोपामाइन (डीए), डायहाइड्रॉक्सीफेनिलैसेटिक एसिड (डीओपीएसी), उच्च वैनिलिक एसिड (एचवीए), नोरेपीनेफ्राइन (एनई), {{0}}हाइड्रॉक्सीट्रिप्टामाइन (5-एचटी), 5-हाइड्रॉक्सीइंडोलैसेटिक एसिड (5-HIAA)। TH, -सिन्यूक्लिन, LC3, और p62 के इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग चूहों (n=6 प्रति समूह) को डीप एनेस्थीसिया (5 प्रतिशत क्लोरल हाइड्रेट) के तहत euthanized किया गया था और 0.9 प्रतिशत सोडियम क्लोराइड के साथ सुगंधित किया गया था, इसके बाद बाएं कार्डियक वेंट्रिकल के माध्यम से 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड। दिमाग को तुरंत हटा दिया गया और 24 घंटे के लिए पोस्टफिक्स कर दिया गया, फिर फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) में स्थानांतरित कर दिया गया जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 0 प्रतिशत सुक्रोज था, जब तक कि वे डूब नहीं गए। ऊतक को पैराफिन में एम्बेड किया गया था, और कोरोनल सेक्शन (30 माइक्रोन) को एक स्लेज माइक्रो-टोम का उपयोग करके पर्याप्त नाइग्रा पार्स कॉम्पेक्टा (एसएनसी; −2.8 से −3.8 मिमी कॉडल टू ब्रेग्मा) के माध्यम से काटा गया था। वर्गों को डीवैक्स और हाइड्रेटेड किया गया था, और अंतर्जात पेरोक्साइड को 30 मिनट के लिए 0.3 प्रतिशत एच 2 ओ 2 से बुझाया गया था। गर्मी से प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति के बाद, स्लाइड्स को 0.5 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स 100 और फिर 5 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। तब वर्गों को एंटी - -सिन्यूक्लिन एंटीबॉडी, एंटी-टीएच एंटीबॉडी, एंटी-एलसी3 एंटीबॉडी, एंटी-पी62 एंटीबॉडी, और संबंधित फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। पीबीएस में तीन पांच मिनट के धोने के बाद , वर्गों को एक घंटे के लिए बायोटिनाइलेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी में ऊष्मायन किया गया था, इसके बाद 30 मिनट के लिए एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स। पेरोक्सीडेज गतिविधि की कल्पना 3.3-डायमिनोबेंज़िडाइन के साथ की गई थी।

पता लगानावेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटीन का

एसएनसी प्रोटीन निकाला गया (एन {0}} प्रति समूह चूहों), 12-15 प्रतिशत एसडीएस-पेज का उपयोग करके अलग किया गया, और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्ली को कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए 5 प्रतिशत नॉनफैट दूध के साथ अवरुद्ध किया गया था और टीएच, सिन्यूक्लिन, पी62, बीक्लिन 1, एलसी3, पी-एकेटी, एकेटी, पी-एमटीओआर, एमटीओआर, और जीएपीडीएच के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। . अगले दिन, झिल्ली को ट्रिस-बफर खारा से धोया गया जिसमें 0.1 प्रतिशत ट्वीन 20 था और 1.5 घंटे के लिए इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संकरण किया गया था। प्रोटीन को संवर्धित रसायनयुक्त रसायन का उपयोग करके देखा गया था, और प्रतिरक्षात्मक बैंड का विश्लेषण छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जेल डॉक्टर 1000- यूवी; बायो-रेड, रिचमंड, सीए) के साथ किया गया था ताकि GADPH के लिए सामान्यीकृत -सिन्यूक्लिन और TH बैंड के ऑप्टिकल घनत्व की गणना की जा सके।

एंटीबॉडी की जानकारी: खरगोश पॉलीक्लोनल LC3 एंटी-बॉडी: 1:1000। खरगोश पॉलीक्लोनल P62 एंटीबॉडी: 1:1000। बीक्लिन 1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी: 1:1000। चूहे विरोधी TH मोनो-क्लोनल एंटीबॉडी: 1:1000। खरगोश पॉलीक्लोनल -सिन्यूक्लिन एंटीबॉडी: 1:1000।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा मूल निग्रा के अल्ट्रास्ट्रक्चर का अवलोकन

चूहे (एन=6 प्रति समूह) को 5 प्रतिशत क्लोरल हाइड्रेट के साथ euthanized किया गया था और बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ सुगंधित किया गया था, इसके बाद पीबीएस में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड और 1 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड था। मस्तिष्क को हटा दिया गया और 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर छह घंटे के लिए पोस्टफिक्स किया गया। एसएनसी को लगभग 1 मिमी3 के ब्लॉक में काट दिया गया था और पीबीएस में तय किया गया था जिसमें 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड होता है और आगे की प्रक्रिया के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जाता है। टुकड़ों को एक ही बफर में 1 प्रतिशत ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में पोस्टफिक्स किया गया था, ग्रेडेड अल्कोहल के माध्यम से निर्जलित किया गया था, और एपोन 812 (शेल केमिकल कंपनी, ह्यूस्टन, TX) में एम्बेडेड किया गया था। अल्ट्राथिन (50 एनएम) वर्गों को एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके काटा गया, यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट का उपयोग करके दाग दिया गया, और एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (लीका टीसीएस एसपी2सीएलएसएम, स्कूल ऑफ मेडिसिन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर, फुडन यूनिवर्सिटी) के तहत विश्लेषण किया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

वर्तमान अध्ययन में सभी माप डेटा को ± मानक त्रुटियों के रूप में व्यक्त किया गया था, और सांख्यिकीय विश्लेषण को ग्राफपैड प्रिज्म 5.0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए) सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित किया गया था। पी<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

भाग के लिए यहां क्लिक करें