भाग Ⅱ: टीजीएफ में मानव प्राथमिक रेनल फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका- 1-मध्यस्थ फाइब्रोसिस-नकल करने वाले उपकरण

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भाग Ⅱ: टीजीएफ में मानव प्राथमिक रेनल फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका- 1-मध्यस्थ फाइब्रोसिस-नकल करने वाले उपकरण

सेओंग-हाई ह्वांग, यूं-मी ली और एट अल।

सार

रेनल फाइब्रोसिसएक प्रगतिशील क्रोनिक किडनी रोग है जो अंततः अंतिम चरण के गुर्दे की विफलता की ओर जाता है। मुकाबला करने के कई तरीकों के बावजूदगुर्दे की फाइब्रोसिस, वर्तमान में उपलब्ध दवाओं के मूल्यांकन के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल आदर्श नहीं है। हमने ट्यूबल इंटरस्टिटियम की तीन अलग-अलग परतों, अर्थात् उपकला, फाइब्रोब्लास्टिक और एंडोथेलियल परतों के साथ डिज़ाइन किए गए त्रि-आयामी (3 डी) सह-संस्कृति उपकरणों का उपयोग करके बी-नकल मॉडल विकसित किए। हमने मानव वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (HK -2), मानव गर्भनाल नसों की एंडोथेलियल कोशिकाओं और रोगी-व्युत्पन्न वृक्क फाइब्रोब्लास्ट की शुरुआत की, और के प्रभावों का मूल्यांकन कियाtपरिवर्तनकारी वृद्धि कारक- (टीजीएफ-)तथाटीजीएफ-इस पर अवरोधक उपचारगुर्देफाइब्रोसिसनमूना। की अभिव्यक्तिफाइब्रोसिसमार्कर अल्फा-चिकनी पेशी एक्टिन परटीजीएफ- 1एक 3डी रोग मॉडल में मोनोलेयर-सुसंस्कृत एचके-2 कोशिकाओं में उपचार को संवर्धित किया गया था। संवहनी डिब्बे मेंगुर्देफाइब्रोसिसमॉडल, जहाजों के घनत्व में वृद्धि और कमी हुई थीटीजीएफ--उपचारित समूह औरटीजीएफ--अवरोधक उपचार समूह, क्रमशः। मल्टीप्लेक्स एलिसा में सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करटीजीएफ--उत्तेजक 3डी मॉडल से पता चला है कि प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन और इंटरल्यूकिन -1 बीटा, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा, बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर, और ग्रोथ फैक्टर लेवल शामिल हैं।टीजीएफ- 1, टीजीएफ- 2, तथाटीजीएफ- 3वृद्धि हुई थी, जो मानव गुर्दे के फाइब्रोटिक सूक्ष्म वातावरण की नकल करती थी। यह अध्ययन मानव के निर्माण में सक्षम हो सकता हैगुर्देफाइब्रोसिस- पारंपरिक संस्कृति प्रयोगों से परे डिवाइस मॉडल की नकल करना।

कीवर्ड: गुर्दे फाइब्रोब्लास्ट; तंतुमयता; टीजीएफ- 1

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3. चर्चा

टीजीएफ- 1वृक्क फाइब्रोजेनेसिस में मैट्रिक्स संचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और अधिकांश कोशिकाओं में प्रसार को रोकता है, जिसमें ग्लोमेरुलर एपिथेलियल और एंडोथेलियल कोशिकाएं, साथ ही ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाएं 【1】 शामिल हैं। हालांकि, टीजीएफ-ß1 बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक (एफजीएफ -2) [8] को शामिल करके मानव गुर्दे के फाइब्रोब्लास्ट में प्रसार को प्रेरित करता है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने एक की स्थापना कीफाइब्रोसिसमानव प्राथमिक वृक्क फाइब्रोब्लास्ट्स, रीनल ट्यूबलर एपिथेलियल कोशिकाओं और मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित तीन आवश्यक सेलुलर घटकों का उपयोग करने वाला उपकरण और इसका मूल्यांकन एक के रूप में किया गयागुर्देफाइब्रोसिसमॉडल पर आधारितटीजीएफ- 1उत्तेजना पैदा करनागुर्देफाइब्रोसिस-ऑन-ए-चिप, हमने वृक्क रोग मॉडलिंग से जुड़ी बाधाओं को दूर करने के उद्देश्य से ऊतक के तीन अलग-अलग हिस्सों के साथ डिजाइन की गई एक उपन्यास 3 डी-संस्कृति प्रणाली की स्थापना की। हमारे अध्ययन से पता चला है किटीजीएफ- 1प्रेरित सेलुलर प्रतिक्रियाएं, जिसमें उपकला कोशिकाओं के ट्यूबलर एपिथेलियल-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी), एंडोथेलियल कोशिकाओं के माइक्रोवास्कुलर परिवर्तन और गुर्दे के फाइब्रोब्लास्ट में साइटोकाइन परिवर्तन शामिल हैं। पेश करने वाला यह पहला अध्ययन है aफाइब्रोसिस-नकल करने वाला उपकरण जिसमें मानव गुर्दे से प्राप्त प्राथमिक फ़ाइब्रोब्लास्ट होते हैं और रोगियों से पृथक उत्तेजित फ़ाइब्रोब्लास्ट होते हैंटीजीएफ- 1, फाइब्रोटिक प्रतिक्रियाओं का एक ज्ञात संकेतक आमतौर पर नकल करने के लिए मानक के रूप में उपयोग किया जाता हैफाइब्रोसिससेल संस्कृतियों में [9]। ये परिणाम बताते हैं किटीजीएफ- 1-उपचारित उपकला कोशिकाओं को मेसेनकाइमल कोशिका जैसे फेनोटाइप में बदल दिया जाता है। कबटीजीएफ- 1फ़ाइब्रोब्लास्ट को प्रशासित किया जाता है, फ़ाइब्रोोटिक प्रक्रियाओं के प्रेरण को प्रतिबिंबित करने के लिए विभिन्न साइटोकिन्स को बदल दिया जाता है। यह स्पष्ट है कि मेंगुर्देफाइब्रोसिसमॉडल, फाइब्रोब्लास्ट टीजीएफ उत्तेजना के माध्यम से स्थापित संस्कृति प्रणाली के विकास के पीछे मुख्य बल हैं।

डेविस एट अल ने बताया कि एंडोथेलियल कोशिकाओं की 3डीकल्चर कोशिकाओं के आक्रमण और लुमेन और ट्यूब नेटवर्क बनाने के लिए पर्याप्त है, विवो में एक अक्षुण्ण जीव के बाद [10,11]। कई समूहों ने बताया है कि 3डी-संस्कृति मॉडल 2डी सेल-संस्कृति मॉडल [12] की तुलना में नेफ्रोटॉक्सिसिटी के उच्च स्तर का प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, नेफ्रोटॉक्सिसिटी-और सूजन-संबंधी जीन की अभिव्यक्ति वृक्क 3डी सेल-संस्कृति मॉडल में एक विशिष्ट2डी संस्कृति की तुलना में काफी अधिक थी [13]।

इस अध्ययन में, मानव की संस्कृति मीडियागुर्देफाइब्रोसिस-ऑन-ए-चिप में 2डीकल्चर की तुलना में साइटोकिन्स का स्तर काफी अधिक था। हमारे समूह ने दिखाया है कि रोगी-व्युत्पन्न फ़ाइब्रोब्लास्ट एंडोथेलियल और एपिथेलियल सेल परतों सहित देशी गुर्दे के ऊतकों को फिर से बना सकते हैं, हमारे सुझाव के माध्यम सेफाइब्रोसिस-ऑन-ए-चिप मॉडल। नतीजतन, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है किगुर्देफाइब्रोसिस-ऑन-ए-चिप मॉडल मानव गुर्दे के सूक्ष्म भौतिक वातावरण का सटीक रूप से अनुकरण करता है। इसके अलावा, क्योंकि चिप में सुसंस्कृत फ़ाइब्रोब्लास्ट रोगियों से प्राप्त होते हैं, अन्य चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक रोगी मॉडल आसानी से और स्पष्ट रूप से सुरक्षित तरीके से प्राप्त किए जा सकते हैं। इसलिए, मानवगुर्देफाइब्रोसिस-ऑन-ए-चिप मॉडल प्रणाली उपकला और एंडोथेलियल कार्यों के संवेदनशील माप के साथ व्यक्तिगत दवा के विकास की अनुमति दे सकती है। हमारे प्रयोगों में,फाइब्रोसिसऔर एंजियोजेनेसिस में कमी आई थीटीजीएफ-अवरोधक-उपचारित समूह। TGF- अवरोधक TGF- के प्राकृतिक विरोधी हैं, जिन्हें विभिन्न वृक्क रोग मॉडल का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। ऐसा प्रतीत होता है कि इस टीजीएफ-अवरोधक जैसे चिकित्सीय एजेंटों का उपयोग करके रोग मॉडल में उपचार की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए प्रयोग करना संभव है। इसलिए, इस चिप ने कोशिका आकृति विज्ञान और कार्य को मापने के लिए वृक्क फाइब्रोसिस के एक बेहतर मॉडल को विकसित करने का एक साधन प्रदान किया है और फार्मास्यूटिकल्स के लिए नेफ्रोटॉक्सिसिटी आकलन करने में उपयोगी हो सकता है।

टीजीएफ-गुर्दे की विभिन्न बीमारियों में प्रमुख रोगनिरोधी कारक है [14] और एंजियोजेनेसिस [15] में भूमिका निभाता है। टीजीएफ- के एंजियोजेनिक प्रभाव बहुत जटिल हैं और सेटिंग और विभिन्न नियामक कारकों [16] के आधार पर प्रोएंगोजेनिक या एंटीजेनोजेनिक गतिविधि हो सकती है। एंजियोजेनिक वृद्धि कारक जैसे वीईजीएफ़ और एफजीएफ -2 विवो में एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करते हैं, विवो [17-20] में एंजियोजेनेसिस के मॉड्यूलेशन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। कुछ सबूत इंगित करते हैं कि ये दो कारक एंडोथेलियल सेल मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं [21,22] को बढ़ावा देने के लिए सहक्रियात्मक रूप से कार्य कर सकते हैं। हमने सबूत दिया है कि वीईजीएफ़ एमआरएनए अभिव्यक्ति और एफजीएफ -2 प्रोटीन स्राव 2डी संस्कृति की तुलना में 3डी चिप्स में टीजीएफ- 1 द्वारा काफी बढ़ा हुआ है।

हमारे की सीमाफाइब्रोसिसमॉडल हो सकते हैं कि वे अपेक्षाकृत कम समय अवधि, 24 घंटे में बनाए गए थे। टीजीएफ-बीटा में शुरुआती दिनों में प्रो-फाइब्रोटिक और एंटी-इंफ्लेमेटरी गुण होते हैंफाइब्रोसिसप्रक्रिया, पुरानी प्रक्रिया में नहीं। परंपरागत रूप से,टीजीएफ-मुख्य रूप से साइटोकिन-प्रेरित . में उपयोग किया गया हैफाइब्रोसिसमॉडल। हालाँकि, चूंकि विवो में केवल एक साइटोकाइन का प्रतिनिधित्व नहीं किया जा सकता है,फाइब्रोसिसकई अतिरिक्त उम्मीदवार पदार्थों का उपयोग करते हुए प्रेरण मॉडल जैसे किटीजीएफ-और BMP7 प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, विवो में पुन: पेश करने के लिए दो या तीन साइटोकिन्स अभी भी पर्याप्त नहीं हैं। हमने इस्तेमाल कियाटीजीएफ-प्रारंभिक बिंदु के रूप में; हालाँकि, हमने अधिक विविध साइटोकिन तूफान को प्रेरित करके चिप पर इन विवो माइक्रोएन्वायरमेंट को लागू करने का प्रयास किया। फाइब्रोब्लास्ट, का एक प्रमुख सेलुलर घटकफाइब्रोसिस, पेश किया गया था, और अधिक विविध साइटोकिन्स की माध्यमिक उत्तेजना (IL-1 , TNF- , b-FGF,टीजीएफ- 1, टीजीएफ-2, तथाटीजीएफ-3) से प्रेरित फाइब्रोब्लास्ट में प्रेरित किया गया थाटीजीएफ-. इस प्रकार, जैसा वातावरणफाइब्रोसिसमानव शरीर में पुनरुत्पादित किया गया था।

सिस्टैंच डेजर्टिकोला अर्क: गुर्दे की बीमारियों का इलाज

4. सामग्री और तरीके

4.1. सेल संस्कृतियां

Kidney fibroblasts(KFs)were isolated from biopsies of the normal tissue portion of renal cell carcinoma patients with an estimated glomerular filtration rate (eGFR)>60 mL/मिनट/1.73 m2 के बाद रोगियों ने अनुसंधान उद्देश्यों के लिए दूसरी बायोप्सी के लिए अपनी सहमति दी थी। KFs को फ़ाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ माध्यम (FGM -2, लोन्ज़ा, स्विटज़रलैंड) में सुसंस्कृत किया गया था, और प्रयोगों के लिए 3 से 4 मार्ग का उपयोग किया गया था। गुर्दे के फ़ाइब्रोब्लास्ट 1-2 सप्ताह के लिए संस्कृति से तब तक बिखरे हुए थे जब तक कि कोशिकाओं ने एक मोनोलेयर का गठन नहीं किया। संस्कृति को दूषित करने वाली उपकला कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, पहले मार्ग के बाद चुंबकीय एंटी-फाइब्रोब्लास्ट बीड्स (मिल्टनी बायोटेक इंक, ऑबर्न, सीए, यूएसए) का उपयोग करके फ़ाइब्रोब्लास्ट का चयन किया गया था। कोशिकाओं को 0.05 प्रतिशत ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (EDTA) (वेलजीन, ग्योंगसन, कोरिया) का उपयोग करके अलग किया गया था, जो एंटी-फाइब्रोब्लास्ट मोतियों के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और एक चुंबकीय स्तंभ का उपयोग करके अलग किया गया था, और प्रवाह- के माध्यम से एकत्र किया गया था। शुद्ध प्राथमिक फ़ाइब्रोब्लास्ट को पीई-संयुग्मित एंटी-फ़ाइब्रोब्लास्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल-सॉर्टिंग (एफएसीएस) विश्लेषण की विशेषता थी। कोमल चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) डिसोसिएटर का उपयोग कोमल किडनी ऊतक की मिनिंग के लिए किया गया था। माइक्रोबीड-लेबल वाली कोशिकाओं की शुद्धि के लिए लागू किए गए MACS LS कॉलम (प्लगर्स के साथ) के साथ एक Octo MACSTM मैग्नेटिक सेपरेटर Miltenyi Biotec Inc. (ऑबर्न, CA, USA) से खरीदा गया था। कोमल MACS C ट्यूब (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) का उपयोग कोशिका पृथक्करण के लिए गुर्दे की मिनिंग के लिए किया गया था। MACS स्मार्ट स्ट्रेनर्स (70 um) Miltenyi Biotec Inc. (ऑबर्न, CA, USA) से प्राप्त किए गए थे। कॉलम बफर का उपयोग कॉलम धोने और सेल छर्रों को फिर से करने के लिए किया गया था। बफर को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) (पीएच 7.4) में 2 मिमी ईडीटीए के साथ 0.5 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) युक्त समाधान के रूप में तैयार किया गया था और मिल्टनी बायोटेक इंक (ऑबर्न, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त करने वाली मानव गर्भनाल-नस एंडोथेलियल कोशिकाएं (GFP-HUVECs, Lonza, Switzerland) को एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम (EGM -2, लोन्ज़ा, स्विटज़रलैंड) में सुसंस्कृत किया गया था, और 3 से 4 मार्ग में कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। मानव समीपस्थ ट्यूबलर सेल लाइन (मानव किडनी -2 (HK -2) कोशिकाएं अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC) से प्राप्त की गई थीं। सेल लाइन को उच्च-ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में उगाया गया था। 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन (100 U/mL), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 ug/mL) के साथ पूरक। अभिकर्मकों को गिब्को (रॉकविले, एमडी, यूएसए) से खरीदा गया था। 0.05 प्रतिशत ट्रिप्सिन का उपयोग करके सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया गया था- EDTA और 37 डिग्री और 5 प्रतिशत CO2 पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में बनाए रखा। KFs को FGM-2 में 4×10 डिग्री कोशिकाओं/एमएल की एक सेल एकाग्रता पर फिर से निलंबित कर दिया गया। मानव किडनी ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं (HK{{49) }}) को उच्च-ग्लूकोज DMEM में 2×10 डिग्री कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर फिर से निलंबित कर दिया गया था। ईजीएम में 2×10 डिग्री कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर जीएफपी-एचयूवीईसी को फिर से निलंबित कर दिया गया था -2।

4.2.अभिकर्मक

मैट्रिक्स फाइब्रिन जैल से बना था, जिसमें गोजातीय प्लाज्मा से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फाइब्रिनोजेन, गोजातीय फेफड़े से एप्रोटीनिन और गोजातीय प्लाज्मा से थ्रोम्बिन शामिल हैं। उपरोक्त तीन सामग्री सिग्मा (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदी गई थी। फाइब्रिनोजेन को एल × पीबीएस में पानी के स्नान (37 डिग्री) में 3 0 मिनट के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में भंग कर दिया गया था। थ्रोम्बिन और एप्रोटीनिन को 50 यूनिट/एमएल और 4 टीआईयू/एमएल की सांद्रता में विआयनीकृत पानी में भंग कर दिया गया था। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करके तीन समाधानों को निष्फल किया गया था। पुनः संयोजक मानवटीजीएफ- 1पेप्रोटेक ईसी लिमिटेड (लंदन, यूके) से प्राप्त किया गया था। TGF-बीटा रिसेप्टर किनसे, SB431542 का एक विशिष्ट अवरोधक, Tocris Cookson, Inc. (Ellisville, MO, USA) से खरीदा गया था।

4.3. डिवाइस में सेल पैटर्निंग

टाइट बॉन्डिंग की सुविधा के लिए सेल सीडिंग से पहले, डिवाइस को एक प्लाज्मा मशीन (फेमटो साइंस इंक, सुवन, कोरिया) में 1 मिनट के लिए 7 0 डब्ल्यू, 50 हर्ट्ज की शक्ति के साथ इलाज किया गया था। प्लाज्मा उपचार-प्रेरित सतह हाइड्रोफिलिसिटी और जेल पैटर्निंग और मीडिया लोडिंग को सुविधाजनक बनाने में मदद की। हाइड्रोफिलिसिटी में बदलाव से बचने के लिए, प्लाज्मा उपचार के बाद 30 मिनट के भीतर प्रयोग किए गए। उपकरणों के भीतर विभिन्न सेलुलर पैटर्निंग को अत्यधिक अनुकूलन योग्य तरीके से किया जा सकता है। पहले से प्रतिरूपित किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के सेल की संरचना और एकाग्रता का निर्धारण करना महत्वपूर्ण था। सेलुलर हाइड्रोजेल निलंबन के लिए, सेल निलंबन के 37.5 μL और 10 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान के 12.5 μL के एक अलग विभाज्य 10 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान के 250 μL 4 टीआईयू / एमएल एप्रोटीनिन के 40 μL के साथ तुरंत मिश्रित होने के लिए तैयार किए गए थे। लोड करने से पहले। लोड करने से तुरंत पहले, सेल निलंबन के 37.5 μL को समरूप होने तक 10 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन के 12.5 μL के साथ मिलाया गया था। हाइड्रोजेल के 50uL को थ्रोम्बिन की 1 uL छोटी बूंद (0.5 यूनिट/एमएल) के साथ मिलाया गया था। मिश्रण के तुरंत बाद, GFP-HUVECs (2 × 10 'कोशिकाओं/एमएल की सेल एकाग्रता) के फाइब्रिन निलंबन के साथ थ्रोम्बिन को बाहरी चैनल (चित्रा 3, जेल ए) के बाहरी किनारे में इंजेक्ट किया गया था। हमने फाइब्रिनोजेन क्रॉसलिंकिंग के पूरा होने के लिए 3 मिनट इंतजार किया। मिश्रण के तुरंत बाद, KFs (4×10 डिग्री कोशिकाओं/एमएल की सेल एकाग्रता) के फाइब्रिन निलंबन के साथ थ्रोम्बिन को जलाशय के फर्श के प्रत्येक तरफ प्रति कुएं (चित्रा 3, जेल सी) पर रखा गया था। केएफ के इस फाइब्रिन निलंबन को 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर क्रॉसलिंक करने की अनुमति दी गई थी। 10 μL मानव वृक्क समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (HK -2) के एक सेल निलंबन को आंतरिक चैनल (चित्रा 3, जेल बी) के इंजेक्शन पोर्ट में इंजेक्ट किया गया था। एचके -2 को दीवार से जोड़ने के लिए। GFP-HUVECs चैनल में फाइब्रिन जेल, डिवाइस को 90 डिग्री घुमाया गया और 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए 5 प्रतिशत सीओ, एक इनक्यूबेटर में रखा गया। एचके -2 बस गए और फाइब्रिन जेल के किनारे एक सेल शीट का गठन किया।

एचके को संलग्न करने के बाद-2, उपकरण ईजीएम से भर गया था-2। डिवाइस को 5 प्रतिशत CO, इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया गया था। माध्यम को 5ng/mL . के साथ या उसके बिना बदल दिया गया थाटीजीएफ- 1और 5ng/mL . के साथटीजीएफ- 1और 10 उमटीजीएफ- 1ऊष्मायन के तीन दिनों के बाद अवरोधक (चित्र 3)।

सिस्टैंच क्या है?

4.4. इम्यूनोसाइटोफ्लोरेसेंस

डिवाइस में सह-सुसंस्कृत ऊतकों को 2 0 मिनट के लिए पीबीएस (वेलजीन, ग्योंगसन, कोरिया) में 4 प्रतिशत (डब्ल्यू / वी) पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान (बायोसांग, सेओंगनाम, कोरिया) के साथ तय किया गया था, इसके बाद 20 के साथ पारगम्यीकरण किया गया था। 0.15 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 (सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में न्यूनतम विसर्जन। नमूनों को तब 1 घंटे के लिए 3 प्रतिशत बीएसए (सिग्मा, यूएसए) के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को Abcam से खरीदे गए एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-साइटोकैटिन 8 और एंटी-ओ-एसएमए थे, जिन्हें 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दिया गया था। एलेक्सा फ्लोर 647 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (एच प्लस एल) को द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था। आरटी पर 3 घंटे के लिए Hoechst33342 (थर्मो साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) के 1:250 कमजोर पड़ने के साथ डीएनए लेबलिंग का प्रदर्शन किया गया। छवियों को एक Zeiss LSM 710 कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) को ImageJ और एक प्रतिदीप्ति-तीव्रता विश्लेषक का उपयोग करके मापा गया था।

4.5. साइटोकिन्स का मल्टीप्लेक्स विश्लेषण

MSD V-Plex साइटोकाइन और एंजियोजेनेसिस पैनल 1 मानव किट (रॉकविल, एमडी, यूएसए) का उपयोग इंटरल्यूकिन को मापने के लिए किया गया था-1 बीटा （IL-1ß） और बुनियादी फ़ाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक （b-FGF-सांद्रता एकल नमूनों में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार। सभी नमूनों का आईएल -1 और बी-एफजीएफ के कुल प्रोटीन स्तर के लिए मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक माप के मानक वक्र से राशि (pg/mL में) निर्धारित की गई थी।

4.6. मल्टीप्लेक्स बीड इम्यूनोसे

मल्टी-प्लेक्सिंग तकनीक (xMAP; Luminex, Austin, TX, USA) के आधार पर, मल्टीप्लेक्स बीड इम्युनोसे सिस्टम (Procarta Cytokine Assay Kit; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) का उपयोग करके साइटोकाइन सांद्रता का विश्लेषण किया गया। निर्माता के निर्देशों। निर्माता के निर्देशों के अनुसार डेटा एक Luminex-संगत वर्कस्टेशन और उसके प्रबंधक सॉफ़्टवेयर (बायो-प्लेक्स वर्कस्टेशन और संस्करण 6.0 सॉफ़्टवेयर; बायो-रेड, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके हासिल किया गया था। मानव TGF- 1, TGF- 2, और TGF- 3 संबंधित हैंफाइब्रोसिसपतला नमूनों में एक साथ प्रक्रिया का विश्लेषण किया गया। isoforms ofटीजीएफ-बायो-प्लेक्स 200 सिस्टम और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बायो-प्लेक्स प्रोटीएम ह्यूमन का उपयोग करके पता लगाया गया थाटीजीएफ-assays (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक); निर्माता द्वारा प्रदान की गई जानकारी के आधार पर। मल्टीप्लेक्स परख किट सतह पर तैरनेवाला से कई साइटोकिन्स को मात्रात्मक रूप से 1 पीजी/एमएल प्रति साइटोकाइन की कम सीमा के साथ माप सकता है। एकत्रित सतह पर तैरनेवाला की सीमित मात्रा के लिए प्रत्येक नमूने को एकल माप के रूप में चलाया गया था।

4.7. रीयल-टाइम पीसीआर

TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) का उपयोग करके RNA निष्कर्षण किया गया था। मास्टर मिक्स और एक रिवर्ट एड फर्स्ट स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट का इस्तेमाल कुल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए किया गया था। एप्लाइड बायोसिस्टम्सटीएम पॉवरअपटीएम एसवाईबीआरटीएम ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) का उपयोग करके क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। विशिष्ट प्राइमर बायोनर (डेजॉन, कोरिया) द्वारा तैयार किए गए थे और इस प्रयोग में निम्नानुसार उपयोग किए गए थे। प्राइमर अनुक्रमों को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है।

PowerUp SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स के दस माइक्रोलिटर, सीडीएनए के 4 μL, और प्रत्येक प्राइमर के 2 pmol का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर के लिए 20 μL की अंतिम मात्रा में किया गया था। प्रतिक्रिया 1s के लिए 95 डिग्री पर और 45 चक्रों के लिए 20 s के लिए 60 डिग्री पर विकृतीकरण के बाद 95 डिग्री पर 20 s के लिए की गई थी। प्रत्येक नमूने के लिए दो प्रतियों या तीन प्रतियों में पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। सीडीएनए का स्तर चक्र थ्रेसहोल्ड के एक मानक वक्र का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। प्रत्येक सीडीएनए के लिए सभी डेटा इसी मानक वक्र के भीतर थे। प्राप्त डेटा को -एक्टिन सीडीएनए के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

4.8. सांख्यिकीय विश्लेषण

मात्रात्मक डेटा को कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± एसडी या एसई के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। दो-पूंछ वाले छात्र के t -est का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। हमने केवल 95 प्रतिशत विश्वास स्तर या उच्चतर (p .) पर एक महत्वपूर्ण अंतर पर विचार किया<>

5। निष्कर्ष

संक्षेप में, इस अध्ययन में प्रोटोकॉल ने मानव के निर्माण को सक्षम कियागुर्देफाइब्रोसिस-एक मॉडल के रूप में उपकरणों की नकल करना और विभिन्न प्रभाव दिखाए जो 2डी-संस्कृति प्रयोगों में संभव नहीं हैं। हमें विश्वास है कि इस अध्ययन में प्रस्तावित मूल्यांकन रणनीति से विस्तृत जानकारी की बेहतर समझ होगीफाइब्रोसिसके दौरान पैथोलॉजिकल परिवर्तनों में शामिल तंत्रगुरदे की बीमारी. विकसित 3डी रीनल फाइब्रोसिस-ऑन-ए-चिप का उपयोग इन विट्रो मॉडल में एक क्षमता के रूप में किया जा सकता है, जो हमें एक उन्नत किडनी-ऑन-ए-चिप मॉडल बनाने के करीब लाएगा।

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संदर्भ

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