भाग 1: अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी वाले मरीजों में एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाओं को प्रसारित करने की पुनर्योजी क्षमता को बढ़ाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण

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सार: परिसंचारी अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाएं (ईपीसी) गुर्दे सहित कई अंगों में संवहनी मरम्मत की सुविधा प्रदान करती हैं, लेकिन अंत-चरण में उत्तरोत्तर कम हो जाती हैंगुर्दे की बीमारी(ESKD) रोगी, जो हृदय संबंधी परिणामों और संबंधित मृत्यु दर से संबंधित हैं। हम इस प्रकार निर्धारित करते हैं कि मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (बीएम-एमएससी) के ऊतक-पुनरावर्ती प्रभावों को बढ़ाने से पुनः संयोजक मानव रिलैक्सिन (आरएलएक्स) के वास्कुलोजेनिक प्रभाव ईपीसी प्रसार और कार्य को बढ़ावा दे सकते हैं। सीडी34 प्लस ईपीसी को स्वस्थ और ईएसकेडी रोगियों के रक्त से अलग किया गया था, देर से ईपीसी बनने तक सुसंस्कृत किया गया था, फिर बीएम-एमएससी-व्युत्पन्न स्थिति मीडिया (सीएम; 25 प्रतिशत ओ), आरएलएक्स (1 या 10एनजी / एमएल), या दोनों से प्रेरित किया गया था। उपचार संयुक्त। जबकि अकेले आरएलएक्स ने इन विट्रो में ईपीसी प्रसार, केशिका ट्यूब गठन और घाव भरने को प्रेरित किया, इन उपायों को स्वस्थ और ईएसकेडी रोगियों दोनों से प्राप्त ईपीसी में बीएम-एमएससी-व्युत्पन्न सीएम और आरएलएक्स के संयुक्त प्रभावों से अधिक तेजी से और स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था। इन निष्कर्षों के महत्वपूर्ण नैदानिक ​​​​प्रभाव हैं, जिन्होंने एक उपन्यास संयोजन चिकित्सा की पहचान की है जो ईएसकेडी रोगियों में ईपीसी संख्या और कार्य को बहाल और बढ़ा सकती है।

कीवर्ड: एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाएं; अंत-चरण गुर्दे की बीमारी; अस्थि-मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल; रिलैक्सिन; जख्म भरना; वाहिकाजनन; पुनर्जनन

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1 परिचय

गुर्दे की पुरानी बीमारी(सीकेडी) एक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या है, जिसे ग्लोमेर्युलर निस्पंदन दर (जीएफआर) में कमी के रूप में परिभाषित किया गया है, जो 60 एमएल/मिनट/1.73 एम² से कम या उसके बराबर है, जो अक्सर अंत-चरण-चरण वी की ओर जाता है) गुर्दे की बीमारी (ईएसकेडी; के रूप में परिभाषित) जीएफआर 15 एमएल/मिनट/1.73मी2 से कम या उसके बराबर)[2]। सीकेडी की रोग संबंधी विशेषताओं में वृक्क केशिकाओं और पोडोसाइट्स में कमी, वृक्क एंडोथेलियल कोशिकाओं के विनाश और विकास के साथ जुड़े ट्यूबलर शोष शामिल हैं।गुर्दे की फाइब्रोसिस[3,4]। इन प्रक्रियाओं के दौरान किडनी एंडोथेलियम से समझौता किया जाता है, जिससे बिगड़ा हुआ एंजियोजेनेसिस और किडनी फंक्शन [5] हो जाता है। निम्नलिखितगुर्दे खराब, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाओं (ईपीसी) को ऊतक की मरम्मत की सुविधा के लिए चोट की जगहों पर भर्ती किया जाता है [6]। ईपीसी गुर्दे की एंडोथेलियल कोशिकाओं की परिपक्वता और प्रसार, संवहनी अखंडता और क्षतिग्रस्त एंडोथेलियम की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, ईएसकेडी रोगियों [7-9] में परिसंचारी ईपीसी संख्या उत्तरोत्तर कम हो जाती है, जो प्रतिकूल हृदय परिणामों [9,10] और दीर्घकालिक मृत्यु दर से संबंधित है।

मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल्स (MSCs) को EPC प्रोग्रामिंग को उत्तेजित करके एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए सूचित किया गया है। हालाँकि, जबकि MSCs का मूल्यांकन विभिन्न नैदानिक ​​परीक्षणों [13] में किया गया है, गुर्दे की एंडोथेलियल पुनर्जनन को सुविधाजनक बनाने की उनकी क्षमता की जांच नहीं की गई है। हमारी प्रयोगशाला के हाल के अध्ययनों ने मानव अस्थि मज्जा (BM)-व्युत्पन्न MSCs को एक एंटी-फाइब्रोटिक एजेंट, अर्थात् पुनः संयोजक मानव (जीन -2) रिलैक्सिन (सेरेलेक्सिन; RLX [14) के साथ जोड़ने की बढ़ी हुई चिकित्सीय क्षमता की पहचान की है। गुर्दे खराब,सूजन और जलनऔर रोग के प्रीक्लिनिकल मॉडल में फाइब्रोसिस। जबकि आरएलएक्स अकेले मानव रक्त-व्युत्पन्न ईपीसी प्रसार और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) उत्पादन को इन विट्रो में और विवो [18] में चूहों में वास्कुलोजेनेसिस को उत्तेजित कर सकता है, यह अज्ञात रहता है यदि बीएम-एमएससी के साथ इसके संयुक्त प्रभाव ईपीसी को तेज और / या बढ़ा सकते हैं- व्युत्पन्न एंजियोजेनेसिस और घाव भरने। इस प्रकार, इस अध्ययन ने स्वस्थ बनाम ईएसकेडी रोगी-व्युत्पन्न ईपीसी प्रसार, एंजियोजेनेसिस, और इन विट्रो में घाव भरने पर आरएलएक्स और बीएम-एमएससी-व्युत्पन्न वातानुकूलित मीडिया (सीएम) के संयोजन की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन किया।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1.ईपीसी अलगाव और संस्कृति परिधीय रक्त से

एक हस्ताक्षरित रोगी सहमति प्रपत्र प्राप्त होने पर, ऑस्ट्रेलियाई रेड क्रॉस रक्त सेवा से स्वस्थ पुरुष नियंत्रणों से लगभग {0}} एमएल रक्त एकत्र किया गया था। इसके विपरीत, मोनाश मेडिकल सेंटर से पुरुष ईएसकेडी रोगियों के स्वास्थ्य की स्थिति के कारण केवल ~ 5 एमएल अधिकतम रक्त एकत्र किया गया था। सभी रक्त के नमूने संग्रह समय के 24 घंटे के भीतर संसाधित किए गए थे। सभी रक्त के नमूनों को 1 × हांक के संतुलित नमक के घोल (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) से 2 0 mL की कुल मात्रा में पतला किया गया था। फिर, फिकोल-पैक प्लस (जीई हेल्थकेयर, उप्साला, स्वीडन) के 15 एमएल से अधिक रक्त को ध्यान से 5 0 एमएल फाल्कन ट्यूब (बीडी बायोसाइंसेज, सैन जोस, सीए, यूएसए) में स्तरित किया गया और 400 × पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। जी कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए पहले वर्णित [19,20] के रूप में घनत्व ढाल पृथक्करण विधि का उपयोग करके बफी कोट को अन्य घटकों से अलग करने के लिए। क्रमिक पृथक्करण के बाद, प्लाज्मा और प्लेटलेट्स वाली ऊपरी परत को सावधानीपूर्वक एक सीरोलॉजिकल पिपेट डालकर हटा दिया गया, जिससे परिधीय रक्त (PBMCs) से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं वाले बफी कोट को छोड़ दिया गया, जिसमें एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाओं (EPCs) शामिल थे। एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडिया (ईजीएम) -2 माइक्रोवास्कुलर (एमवी) बुलेट किट (उत्पाद #CC -3162, लोन्ज़ा, हेवर्ड, सीए, यूएसए) के 2 मिलीलीटर में गोली को फिर से जोड़ा गया; 5 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 0.04 प्रतिशत हाइड्रोकार्टिसोन, 0.4 प्रतिशत मानव फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक (एचएफजीएफ), और 0.1 प्रतिशत संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ), आर 3- इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक (आईजीएफ) के साथ पूरक )-1, एस्कॉर्बिक एसिड, ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (एचईजीएफ), और जेंटामाइसिन सल्फेट / एम्फोटेरिसिन (जीए -1000), कल्चर आइसोलेटेड ईपीसी के लिए। फ़ाइब्रोनेक्टिन-लेपित कल्चर प्लेट्स/फ्लास्क पर लगाए जाने से पहले कोशिकाओं को एक काउंटेसएम ऑटोमेटेड सेल काउंटर (इनविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके गिना जाता था।

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>कॉलोनी बनाने वाली इकाई (CFU) परख का उपयोग करके 50 कोशिकाओं/कॉलोनी)।

2.2. सुसंस्कृत बीएम-एमएससी से वातानुकूलित मीडिया (सीएम) की तैयारी

चूंकि ईपीसी संस्कृतियों में बीएम-एमएससी के जुड़ने से ईपीसी से जुड़े समापन बिंदुओं को मापा जाएगा, इसलिए यह निर्णय लिया गया कि ईपीसी फ़ंक्शन पर बीएम-एमएससी-व्युत्पन्न सीएम के प्रभावों का विश्लेषण करना बेहतर होगा, जैसा कि पहले विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। अन्य समापन बिंदुओं के [19]। संक्षेप में, BM-MSCs को अल्फा-न्यूनतम आवश्यक मीडिया (-MEM; सिग्मा-एल्ड्रिच, कैसल हिल, NSW, ऑस्ट्रेलिया) में उगाया गया, 16 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1 प्रतिशत 2 0 0 mM के साथ पूरक एल-ग्लूटामाइन, और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन। एक बार जब कोशिकाएं ~ 80 प्रतिशत संगम तक पहुंच गईं, तो बीएम-एमएससी को आगे उप-सुसंस्कृत किया गया और एक 12-वेल प्लेट में ~ 0.5×10 डिग्री प्रति कुएं के घनत्व पर चढ़ाया गया और 24-48 घंटे के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया। सेलुलर लगाव सुनिश्चित करने के लिए। BM-MSCs से वातानुकूलित मीडिया (CM) तैयार करने के लिए, संक्षेप में कोशिकाओं को 1 × HBSS के प्री-वार्म्ड 1 mL से तीन बार धोया गया। धोने के चरणों के बाद, सीरम के 500 μL और विकास कारक-मुक्त एंडोथेलियल सेल बेसल मीडिया-ईबीएम; उत्पाद #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) को कोशिकाओं में जोड़ा गया और आगे 24 घंटे के लिए 5 प्रतिशत CO, 37 डिग्री पर संस्कृति में बनाए रखा गया। इस ऊष्मायन अवधि के अंत में, सीएम को तब एकत्र किया गया था और किसी भी सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 400 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। 500 μL विभाज्य में CM को भविष्य के उपयोग तक -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था।

2.3. कार्यात्मक परख

2.3.1. सुसंस्कृत देर से ईपीसी का उपचार

एक बार देर से ईपीसी काटा जाने के बाद, कार्यात्मक assays का प्रदर्शन किया गया। सभी प्रयोग पैसेज 3-6 में किए गए। (i) 25 प्रतिशत BM-MSC व्युत्पन्न वातानुकूलित मीडिया (25 प्रतिशत CM) [20]; (ii) 1 [RLX -1] या 10 [RLX -10 के प्रभाव की जांच के लिए कार्यात्मक परख की गई। ]एनजी/एमएल [18] आरएलएक्स (गर्भवती महिलाओं में पाए जाने वाले एच2 रिलैक्सिन के परिसंचारी स्तरों का प्रतिनिधित्व करता है [21]); या (i) 25 प्रतिशत सीएम और 1 या 10 एनजी/एमएल आरएलएक्स का संयुक्त प्रभाव; (iv) 20 प्रतिशत एफबीएस का उपयोग नियंत्रण रोगियों से प्राप्त देर से ईपीसी के प्रसार और ट्यूब गठन (एंजियोजेनिक) क्षमता पर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। . उपचार समूहों की तुलना अनुपचारित कोशिकाओं से की गई।

2.3.2.व्यवहार्यता और प्रसार परख

देर से ईपीसी की व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता का निर्धारण {0}}(4,5-डाइमेथीथियाज़ोल-2-yl)-2,5- का उपयोग करके किया गया था। निर्माता के निर्देशों (सिग्मा-एल्ड्रिच, मेलबर्न, वीआईसी, ऑस्ट्रेलिया) के अनुसार डिपेनिल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख। संक्षेप में, ~ 5 × 103 सेल प्रति कुँए 96-वेल प्लेट्स (बीडी फाल्कन, नॉर्थ राइड, एनएसडब्ल्यू, ऑस्ट्रेलिया) में लगाए गए थे, जिसके बाद, कोशिकाओं को बीएम-एमएससी व्युत्पन्न सीएम, आरएलएक्स (10 एनजी /) के साथ इलाज किया गया था। mL), या 24 घंटे के लिए CM और RLXat 1 या 10ng/mL का संयोजन। ऊष्मायन अवधि के अंत में, एमटीटी लेबलिंग अभिकर्मक के 10 μL को 0.5 मिलीग्राम / एमएल, सिग्मा-एल्ड्रिच, मेलबर्न, वीआईसी, ऑस्ट्रेलिया) जोड़ा गया था और एक और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री कैंड 5 प्रतिशत सीओ 2 में ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं को 100 μL घुलनशीलता समाधान सिग्मा-एल्ड्रिच, मेलबर्न, वीआईसी ऑस्ट्रेलिया) के अतिरिक्त द्वारा घुलनशील किया गया था, और देर से ईपीसी की प्रसार क्षमता को माइक्रो-प्लेट का उपयोग करके 590 एनएम पर प्रत्येक नमूने के अवशोषण को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था। रीडर (जैव-रणनीति, बलविन नॉर्थ, वीआईसी, ऑस्ट्रेलिया) और विंडोज ओएस के लिए सॉफ्टमैक्स प्रो सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया (देखें। 7.3, आणविक उपकरण एलएलसी, सीए, यूएसए)। प्रत्येक उपचार समूह का प्रदर्शन और विश्लेषण छह प्रतिकृति में किया गया था।

2.3.3. ट्यूब गठन परख

देर से ईपीसी की एंजियोजेनिक क्षमता को बढ़ावा देने के लिए विभिन्न उपचारों के प्रभाव, एक ट्यूब गठन परख का उपयोग करके μ-एंजियोजेनेसिस परख अबिडी, फिचबर्ग, WI, यूएसए） का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, ग्रोथ फैक्टर-कम (जीएफआर) मैट्रीगेल (उत्पाद # 356231, कॉर्निंग, ट्यूक्सबरी, एमए, यूएसए) के 10 μL को एंजियोजेनेसिस परख किट (एबिडी, फिचबर्ग, WI, यूएसए) के μ-स्लाइड के आंतरिक कुएं में जोड़ा गया था। ) देर से ईपीसी की मिली-जुली संस्कृतियों को लेपित कोशिकाओं पर रखा गया और बीएम-एमएससी-व्युत्पन्न सीएम, आरएलएक्स (10 एनजी / एमएल), या सीएम और आरएलएक्स के संयोजन के साथ 10 एनजी / एमएल पर इलाज किया गया। प्रत्येक कुएं पर ~ 1 × 104 कोशिकाओं वाले 50 μL सेल निलंबन की कुल मात्रा लागू की गई थी। छवियों को तुरंत कैप्चर किया गया और 0-घंटे के समय-बिंदु के रूप में लेबल किया गया। विभिन्न उपचारों के तहत कोशिकाओं की क्षमता

प्रपत्र ट्यूब देखे गए थे और छवियों को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 2-24 h पोस्ट-सेल सीडिंग पर कैप्चर किया गया था। ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ट्यूबों की संख्या, ट्यूब की लंबाई और शाखाओं के बिंदुओं की संख्या निर्धारित की गई थी।

2.3.4.वाउंड हीलिंग परख

देर से ईपीसी की पुनर्योजी क्षमता पर विभिन्न उपचारों के प्रभाव को घाव भरने वाले परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। परख करने के लिए, ~ 1 × 10 कोशिकाओं को 50 μL ग्रोथ मीडिया में निलंबित कर दिया गया और घाव भरने वाले परख (अबिडी इंक, फिचबर्ग, WI, यूएसए) के लिए 35 मिमी डिश में 2 अच्छी तरह से सिलिकॉन में बीज दिया गया। व्यंजन के भीतर कृत्रिम घावों को एक बाँझ चिमटी (अंतर दूरी =500 ± 100μm） का उपयोग करके सिलिकॉन कुओं को धीरे से हटाकर बनाया गया था। व्यंजनों को 2 एमएल 50 प्रतिशत ईजीएम -2 के साथ भर दिया गया था, जिसमें विभिन्न बीएम-एमएससी व्युत्पन्न सीएम, आरएलएक्स (10 एनजी/एमएल), या 1 या 10एनजी/एमएल पर सीएम और आरएलएक्स के संयोजन सहित उपचार। घाव को बंद करने के लिए माइग्रेट की गई कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया था। के फोटोमाइक्रोग्राफ माइग्रेट किए गए कोशिकाओं को 0-24 एच पोस्ट-ट्रीटमेंट पर कब्जा कर लिया गया था। छवि] सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अंतराल बंद करने वाले क्षेत्र का प्रतिशत निर्धारित किया गया था।

2.3.5.छवि विश्लेषण

कार्यात्मक assays के लिए सभी छवि विश्लेषण MacOS (Ver। 1.8, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी, यूएसए) के लिए ImageJ का उपयोग करके किए गए थे। देर से ईपीसी की ट्यूब निर्माण क्षमता के लिए, एंजियोजेनेसिस परख प्लगइन का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण किया गया था, और चार अलग-अलग मापदंडों को दर्ज किया गया था, जिसमें कुल लंबाई, मेश की संख्या, जंक्शनों की संख्या और शाखाओं की संख्या शामिल थी। घाव भरने वाले परख के लिए, प्रत्येक समय बिंदुओं पर सेल-मुक्त क्षेत्र को मैन्युअल रूप से चिह्नित करके घाव बंद करने वाले क्षेत्र का विश्लेषण किया गया था। भिन्नता को नियंत्रित करने के लिए सभी माप कम से कम 3 बार किए गए।

2.3.6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

रिलैक्सिन फैमिली पेप्टाइड रिसेप्टर 1 (RXFP1; कॉग्नेट RLX रिसेप्टर) सुसंस्कृत ईपीसी में प्रोटीन स्थानीयकरण इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। सबसे पहले, ~ 1 × 1 {{2 0}} डिग्री कोशिकाओं को 13 मिमी ग्लास कवरस्लिप (पॉली-डी-लाइसिन के साथ लेपित) पर एक 12- अच्छी तरह से प्लेट में 4 प्रतिशत पीएफए ​​​​में तय किया गया था। कमरे के तापमान पर 15 मि. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए 1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) का उपयोग करके गैर-विशिष्ट प्रोटीन बंधन के लिए निश्चित कोशिकाओं को अवरुद्ध कर दिया गया था। ऊष्मायन अवधि के अंत में, कोशिकाओं को 5 मिनट (3 बार) के लिए पीबीएस में धोया गया था और एक खरगोश पॉलीक्लोनल आरएक्सएफपी 1 एंटीबॉडी (आ 609-624; ए 9227; 1: 2000; इम्यूनोडायग्नोस्टिक एजी, बेन्सहेम, जर्मनी) के साथ ऊष्मायन किया गया था। ) 0.01 प्रतिशत बीएसए रातोंरात 4 डिग्री पर। कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 0.01 प्रतिशत बीएसए में बकरी-विरोधी खरगोश एलेक्सा-फ्लोर 594 माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500; इंविट्रोजन, स्कोर्सबी, विक्टोरिया, ऑस्ट्रेलिया) के साथ ऊष्मायन किया गया। वेक्टाशील्ड माउंटिंग मीडियम (वेक्टर लेबोरेटरीज, बर्लिंगम, सीए, यूएसए) में डीएपीआई के 40 μL को जोड़कर परमाणु काउंटरस्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया और कवर किया गया। इम्यूनोरिएक्टिव RXFP1 प्रोटीन की कल्पना × 40 आवर्धन (ओलिंप BX51) पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की गई थी और इमेजेज सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को मिला दिया गया था।

2.4. सांख्यिकीय आंकड़े

सभी डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दिखाया गया है और सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म'एम (Ver। 9; ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किए गए थे। देर से ईपीसी के प्रसार (एमटीटी परख) और एंजियोजेनिक (ट्यूब गठन परख) क्षमता पर विभिन्न उपचारों के प्रभाव की तुलना करने के लिए एक तरह-एनोवा का उपयोग किया गया था, इसके बाद उपचार समूहों के बीच कई तुलनाओं की अनुमति देने के लिए तुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण किया गया था। समय के साथ देर से ईपीसी द्वारा घाव को बंद करने पर विभिन्न उपचारों के प्रभाव की तुलना करने के लिए दोहराए गए उपाय- टू वे-एनोवा का उपयोग किया गया था, इसके बाद प्रत्येक उपचार समूहों की तुलना करने के लिए तुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण किया गया था। 0.05 से कम का पी-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।