भाग 1: एक्टोसाइड सी-फॉस इंडक्शन और एनएफ-केबी पाथवे को रोककर और आरओएस प्रोडक्शन को कम करके RANKL-मध्यस्थता वाले ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को दबा देता है

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

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सार

कई अध्ययनों ने बताया है कि भड़काऊ साइटोकिन्स ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं, जिससे अत्यधिक हड्डियों का पुनर्जीवन और ऑस्टियोपोरोसिस होता है।सिस्टैंच हर्ब से एक्टोसाइड, रहमानिया ग्लूटिनोसा का मुख्य सक्रिय यौगिक, जो पारंपरिक ओरिएंटल चिकित्सा में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, में विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सीडेंट क्षमता होती है। इस अध्ययन में, हमने पाया किएक्टोसाइडन्यूक्लियर फैक्टर-कप्पा (NF-kB) लिगैंड (RANKL) के रिसेप्टर एक्टिवेटर द्वारा उत्तेजित अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (BMM) और RAW264.7 मैक्रोफेज से ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और गठन को स्पष्ट रूप से बाधित किया।एक्टियोसाइडप्रीट्रीटमेंट ने खुराक पर निर्भर तरीके से परिपक्व ऑस्टियोक्लास्ट द्वारा हड्डियों के पुनर्जीवन को भी रोका। Acteoside (10 mM) ने p38 kinase, बाह्य संकेत-विनियमित किनेसेस, और c-Jun N-टर्मिनल किनसे के RANKL-उत्तेजित सक्रियण को देखा, और p65 सबयूनिट और अवरोधक kBa के फॉस्फोराइलेशन को रोककर NF-kB सक्रियण को भी दबा दिया। इसके अलावा, सी-फॉस और सक्रिय टी-कोशिकाओं के परमाणु कारक, साइटोप्लाज्मिक 1 (एनएफएटीसी 1) की अभिव्यक्ति में और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए, इंटरल्यूकिन (आईएल)-1बी के उत्पादन में RANKL की मध्यस्थता बढ़ जाती है। , और आईएल -6 स्पष्ट रूप से एक्टोसाइड प्रीट्रीटमेंट द्वारा बाधित थे। इसके अलावा, मौखिकएक्टोसाइडस्तरों को नियंत्रित करने के लिए ओवरीएक्टोमी-प्रेरित हड्डी हानि और भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन को कम किया। हमारा डेटा बताता है कि एक्टोसाइड ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव और ऑस्टियोक्लास्टिक अग्रदूतों से परिपक्वता को रोकता है, जो माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेसेस के RANKL- प्रेरित सक्रियण और NF-kB, c-Fos, और NFATc1 जैसे प्रतिलेखन कारकों को दबाता है। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि एक्टोसाइड ओस्टियोक्लास्ट सक्रियण को अवरुद्ध करके हड्डियों के नुकसान को कम करने के लिए एक एंटी-रिसोरप्टिव एजेंट के रूप में कार्य कर सकता है।

सिस्टैंच एक्टोसाइड

परिचय

संतुलित ऑस्टियोक्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट गतिविधि [1] द्वारा हड्डी को लगातार फिर से तैयार किया जाता है। ऑस्टियोक्लास्ट मोनोसाइट/मैक्रोफेज वंश के हेमटोपोइएटिक अग्रदूत कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, जबकि ऑस्टियोब्लास्ट मेसेनकाइमल वंश के होते हैं [2]। असामान्य ऑस्टियोक्लास्ट सक्रियण या कम ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस हड्डी के होमियोस्टेसिस को बाधित कर सकता है, अंततः ऑस्टियोपोरोसिस, गठिया और हड्डी के कैंसर जैसी बीमारियों का कारण बन सकता है [3,4]। ऑस्टियोपोरोसिस एक आम हड्डी की बीमारी है जिससे फ्रैक्चर का खतरा बढ़ जाता है। ऑस्टियोपोरोसिस का सबसे आम रूप रजोनिवृत्त महिलाओं में एस्ट्रोजन की कमी के कारण होता है। कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स और एंटी-एपिलेप्टिक्स जैसी दवाएं भी हड्डियों के पुनर्जीवन और गठन के बीच असंतुलन का कारण बन सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप ऑस्टियोपोरोसिस [5] हो सकता है।

ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज के लिए बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स, कैल्सीटोनिन, एस्ट्रोजन और चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर मॉड्यूलेटर सहित कई एंटी-रिसोरप्टिव इनहिबिटर का उपयोग किया गया है। ये अवरोधक ऑस्टियोक्लास्ट समारोह [6] को रोककर हड्डी के द्रव्यमान को बनाए रखते हैं। पोस्टमेनोपॉज़ल ऑस्टियोपोरोसिस को रोकने और उसका इलाज करने के लिए एस्ट्रोजन रिप्लेसमेंट थेरेपी सबसे लोकप्रिय उपचार है। हालांकि, लंबे समय तक एस्ट्रोजन रिप्लेसमेंट थेरेपी एंडोमेट्रियल और स्तन कैंसर के खतरे को बढ़ा सकती है। इसलिए, कई जांचकर्ताओं ने एक नया एंटी-रिसोरप्टिव एजेंट विकसित करने के अपने प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया है जिसका कोई साइड इफेक्ट नहीं है [7-10]। क्योंकि अस्थिशोषक अस्थि पुनर्जीवन में कार्य करते हैं, विशेष रूप से अस्थिशोषकों को रोकना कई अध्ययनों में मुख्य लक्ष्य माना गया है।

ऑस्टियोक्लास्ट बहु-केंद्रीय विशाल कोशिकाएं हैं जो मोनोसाइट/मैक्रोफेज परिवार के मोनोन्यूक्लियर पूर्वजों द्वारा हेमटोपोइएटिक अग्रदूत कोशिकाओं [11] के अनुक्रमिक प्रसार, भेदभाव और संलयन के माध्यम से बनाई गई हैं। मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक (एनएफ) के रिसेप्टर एक्टिवेटर (एनएफ) -केबी (आरएएनके) लिगैंड (आरएएनकेएल) ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव [12] के लिए आवश्यक कारक हैं। इसके अलावा, कई भड़काऊ साइटोकिन्स, जैसे कि ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF) और इंटरल्यूकिन (IL) -1 b, RANKL, ऑस्टियोप्रोटीन और M-CSF [7,13] के प्रेरण को संशोधित करके ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस में योगदान करते हैं। सेल सतह के लिए RANKL बाइंडिंग RANKL / RANK / TNFR संबद्ध कारकों (TRAF) परिसरों में RANK रिसेप्टर का परिणाम होता है जो क्रमिक रूप से NF-kB और माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेसेस (MAPKs) को सक्रिय करता है, जिसमें c-Jun N-टर्मिनल काइनेज (JNK), p38 शामिल है। किनेज, और बाह्य संकेत-संबंधी किनेज (ईआरके) [14]। यह सक्रियण ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव, सक्रियण और उत्तरजीविता की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। RANKL प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को भी सक्रिय करता है जैसे सक्रिय टी-कोशिकाओं का एक परमाणु कारक, साइटोप्लाज्मिक 1 (NFATc1), और c-Fos, जो ऑस्टियोक्लास्ट विकास [7,9] के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, RANKL सिग्नलिंग को एंटी-रिसोरप्टिव एजेंटों का मुख्य लक्ष्य माना जाता है जो ऑस्टियोक्लास्ट सक्रियण और हड्डियों के नुकसान को दबाते हैं।

एक्टियोसाइडरहमानिया ग्लूटिनोसा का मुख्य सक्रिय यौगिक है, जिसका व्यापक रूप से पारंपरिक ओरिएंटल चिकित्सा में उपयोग किया जाता है [15,16]। एक्टियोसाइड एक मजबूत एंटीऑक्सिडेंट है और इसमें एंटी-हेपेटोटॉक्सिक, एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटी-नोसिसेप्टिव गतिविधियां हैं [17-20]। हमने पहले पाया था कि एक्टियोसाइड ईआरके सिग्नलिंग [21] को विनियमित करके टाइरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन बायोसिंथेसिस को कम करता है, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) से संबंधित मसूड़े की क्षति [22] से बचाता है, और मायकोटॉक्सिन-मध्यस्थता कोशिका क्षति [23] को दबाता है। ये प्रभाव न्यूक्लियोसाइड्स की आरओएस को हटाने और एमएपीके-मध्यस्थता सिग्नलिंग को विनियमित करने की क्षमता से निकटता से संबंधित हैं। विशेष रूप से, आरओएस को ओस्टियोक्लास्ट में आरएएनसीएल-प्रेरित सिग्नलिंग मार्ग और सेलुलर घटनाओं की मध्यस्थता करने का सुझाव दिया जाता है। एंटीऑक्सिडेंट के साथ प्रीट्रीटमेंट ने NF-kB, ERK, और IkBa के RANKL- प्रेरित सक्रियण को रोक दिया, जिससे ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस [24] को दबा दिया गया। इन निष्कर्षों ने दृढ़ता से सुझाव दिया कि, विरोधी भड़काऊ गतिविधि के अलावा, एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि एक एंटी-रिसोरप्टिव एजेंट के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकार एक्टोसाइड RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को दबा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने पता लगाया कि क्या एक्टोसाइड का हड्डी के नुकसान पर चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है। हमने ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन और अस्थि पुनर्जीवन और इन विट्रो और विवो प्रायोगिक प्रणालियों का उपयोग करते हुए संबंधित सेलुलर तंत्र पर एक्टोसाइड के प्रभावों की जांच की।

सिस्टैंच एक्टोसाइड RANKL- प्रेरित ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को दबा देता है

सामग्री और तरीके

नैतिक वक्तव्य

पशु देखभाल और उपयोग प्रथाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग में नैतिकता पर चोनबुक नेशनल यूनिवर्सिटी कमेटी (परमिट नंबर सीबीयू 2010-0007) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में सभी प्रयोग विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।

चूहे, रसायन और प्रयोगशाला के सामान

चार-सप्ताह की मादा आईसीआर चूहों को ओरिएंट बायो इंक (सियोल, कोरिया) से खरीदा गया था और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र पर 2261 डिग्री सेल्सियस और 5565 प्रतिशत आर्द्रता पर रखा गया था। Acteoside (3,4-dihydroxy-bphenethyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Fig. S1) को रहमानिया ग्लूटिनोसा की पत्तियों से अलग किया गया था। Acteoside उपयोग करने से पहले फॉस्फेट-बफर खारा (PBS) में भंग कर दिया गया था। RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, और M-CSF को R & D सिस्टम्स (मिनियापोलिस, MN, USA) से खरीदा गया था। c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa, और b-actin के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (सांता क्रूज़, सीए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। ) P-p38 और p38 के लिए एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (Danvers, MA, USA) से खरीदे गए थे। सीरम जैव रासायनिक मापदंडों को निर्धारित करने के लिए कैल्शियम परख और ओस्टियोकैल्सिन (ओसी) ईआईए किट क्रमशः बायोसे सिस्टम्स (हेवर्ड, सीए, यूएसए) और बायोमेडिकल टेक्नोलॉजीज (स्टॉटन, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। सीरम TRAP5b स्तर को मापने के लिए माउस टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (TRAP) परख किट (इम्यूनोडायग्नोस्टिक सिस्टम, स्कॉट्सडेल, AZ, यूएसए) का भी उपयोग किया गया था। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, सिग्मा केमिकल कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से अतिरिक्त रसायन प्राप्त किए गए थे, और प्रयोगशाला के सामान एसपीएल लाइफ साइंसेज (पोचुन, दक्षिण कोरिया) से थे।

कोशिका संवर्धन

पहले वर्णित विधियों के अनुसार 6 सप्ताह की मादा आईसीआर चूहों के टिबिया और मादा से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त किया गया था [25]। 50 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ की उपस्थिति में बोन मैरो सस्पेंशन को 100-मिमी कल्चर डिश में इनक्यूबेट किया गया था। 3 दिनों के बाद, ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए आसन्न कोशिकाओं को अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (बीएमएम) के रूप में इस्तेमाल किया गया था। कुछ अस्थि मज्जा कोशिकाओं को भी एम-सीएसएफ के बिना 48 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था, और अनुयाई कोशिकाओं को एक ऑस्टियोब्लास्ट विभेदक माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था, जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [25]। RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 mM L-ग्लूटामाइन और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में संवर्धित किया गया था। ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस पर एक्टोसाइड के प्रभाव का पता लगाने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग बीएमएम के लिए एक समकक्ष सेल लाइन के रूप में किया गया था।

ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव और ट्रैप धुंधला हो जाना

बीएमएम को के विभिन्न सांद्रता (0–50 मिमी) के साथ दिखाया गया थाएक्टोसाइड100 एनजी/एमएल RANKL के साथ उत्तेजित करने से पहले 2 घंटे के लिए। संस्कृति मीडिया को 2 और 5 दिनों में ताजा मीडिया से बदल दिया गया था। ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद, संस्कृतियों को 4 प्रतिशत पीबीएस-बफ़र्ड पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिग्मा एल्ड्रिच किट का उपयोग करके टीआरएपी के साथ दाग दिया गया था। टीआरएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को ऑप्टिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गिना जाता था, और 3 या अधिक नाभिक वाली कोशिकाओं को ऑस्टियोक्लास्ट माना जाता था। 2 घंटे के लिए एक्टियोसाइड के साथ दिखावा करने के बाद रॉ 264.7 कोशिकाओं को 100 एनजी / एमएल आरएएनएल के संपर्क में लाया गया, और ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं को टीआरएपी धुंधला के लिए संसाधित किया गया।

सेल व्यवहार्यता का मापन

सेल व्यवहार्यता पानी में घुलनशील टेट्राजोलियम नमक (WST) -8 अभिकर्मक का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, BMM या RAW264.7 कोशिकाओं को एक विकास माध्यम में संवर्धित किया गया जिसमें 10 प्रतिशत FBS और एंटीबायोटिक दवाओं का इलाज 10 mM एक्टोसाइड या एक फेनोलिक यौगिक जैसे कि क्वेरसेटिन, ल्यूटोलिन, एपिजेनिन, या एपिगैलोकैटेचिन -3-गैलेट (EGCG) के साथ किया गया था। WST -8 अभिकर्मक को 48 घंटे के ऊष्मायन के बाद संस्कृतियों में जोड़ा गया था। अतिरिक्त 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, WST -8- विशिष्ट अवशोषण को माइक्रोप्लेट रीडर (पैकर्ड इंस्ट्रूमेंट कंपनी, डाउनर्स ग्रोव, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके 450 एनएम पर मापा गया था।

अस्थि पुनर्जीवन परख

बीएमएम (16105 सेल/एमएल) को 50 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ और 100 एनजी/एमएल आरएएनसीएल युक्त एक-एमईएम में निलंबित कर दिया गया था, फिर कैल्शियम फॉस्फेट नैनोक्रिस्टल (ओएएएस {{6} के साथ लेपित एक 24- अच्छी तरह से प्लेट में विभाजित किया गया था। }; ऑस्टियोक्लास्ट गतिविधि परख सब्सट्रेट, ओस्कोटेक इंक., चोंगनाम, दक्षिण कोरिया) 26104 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर एक्टियोसाइड के साथ और बिना। 7 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को 5 प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ प्लेटों से हटा दिया गया था, और एक ऑप्टिक माइक्रोस्कोप के तहत गड्ढे का गठन देखा गया था। पुनर्जीवित क्षेत्र को एक छवि विश्लेषक द्वारा भी मापा गया और नियंत्रण मूल्य के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण

पूरे प्रोटीन लाइसेट्स को एक लसीका बफर में तैयार किया गया था जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [26]। साइटोसोलिक और परमाणु प्रोटीन पहले वर्णित [25] के रूप में तैयार किए गए थे। प्रोटीन निकालने की समान मात्रा को 12-15 प्रतिशत एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और पॉलीविनाइल डिफ़्लुओराइड झिल्ली पर दाग दिया गया। 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धमाकों की जांच की गई थी। धब्बे थे

उन्नत रसायन विज्ञान (एमर्सहम फार्माशिया बायोटेक इंक, बकिंघमशायर, यूके) के साथ विकसित और एक्स-रे फिल्म (ईस्टमैन-कोडक कं, रोचेस्टर, एनवाई, यूएसए) के संपर्क में।

एमएपीके गतिविधि परख

कोशिकाओं का ढोंग किया गयाएक्टोसाइड2 घंटे के लिए और फिर एक अतिरिक्त -30 मिनट के लिए RANKL से प्रेरित। MAPK गतिविधियों को इम्युनोमेट्रिक परख किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसे कि p-p38 kinase परख किट (परख डिजाइन, इंक।, MI, यूएसए), p-ERK एंजाइम परख किट (परख डिजाइन), और p-SAPK / JNK सैंडविच एलिसा किट (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, एमए, यूएसए)। सभी प्रक्रियाओं ने निर्माता के निर्देशों का पालन किया, और एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा अवशोषण को मापा गया।

इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (EMSA)

डीएनए-प्रोटीन बाध्यकारी प्रतिक्रियाएं कमरे के तापमान पर 3 0 मिनट के लिए की गईं, 20 मिलीलीटर बफर में 10-15 मिलीग्राम प्रोटीन के साथ 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 0.5 मिलीग्राम / एमएल पॉली (डीआई-डीसी), 5 प्रतिशत ग्लिसरॉल , 1 एमएम डीटीटी, 1 एमएम पीएमएसएफ, 10 एमएम ट्रिस-सीएल (पीएच 7.5), 50 एमएम NaCl, 30, 000 सीपीएम [ए -32 पी] डीसीटीपी-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, और क्लेनो टुकड़ा डीएनए पोलीमरेज़ का। नमूनों को 6 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर अलग किया गया था, जो सूख गए थे और एक्स-रे फिल्म (ईस्टमैन कोडक कंपनी) के लिए 270 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 घंटे के लिए उजागर हुए थे। NF-kB के लिए विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर अनुक्रम 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 और 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A थे। -59.

एनएफ-केबी लूसिफ़ेरेज़ परख

निर्माता के निर्देशों के अनुसार 24-अच्छी तरह से प्लेटों में RAW264.7 मैक्रोफेज को 0.8 मिलीग्राम kB-luciferase रिपोर्टर वेक्टर के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। अभिकर्मक के बाद 24 घंटे में, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एक्टोसाइड की उपस्थिति और अनुपस्थिति में RANKL से प्रेरित किया गया था। 100 मिलीलीटर रिपोर्टर लसीका बफर में कोशिकाओं को फिर से जोड़ा गया

(पॉमेर्गा, मैडिसन, WI, यूएसए)। प्रोटीन के नमूनों की समान मात्रा को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में रखा गया और लूसिफ़ेरेज़ सब्सट्रेट के साथ मिलाया गया। Luminescence को एक माइक्रोप्लेट ल्यूमिनोमीटर (MicroLumat Plus LB 964, बर्थोल्ड टेक्नोलॉजीज, बैड वाइल्डबैड, जर्मनी) का उपयोग करके मापा गया था। इस प्रयोग में, एक पारगम्य NF-kB अवरोधक पेप्टाइड (BIOMOL, बटलर पाइक, PA, USA) को सकारात्मक kB अवरोधक के रूप में उपयोग किया गया था।

साइटोकिन्स का मापन

BMM या RAW264.7 कोशिकाओं को RANKL से 24-वेल कल्चर प्लेट्स में एक्टोसाइड की उपस्थिति में प्रेरित किया गया था। ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार TNF-a-, IL-1b- और IL-6-विशिष्ट OptEIATM किट का उपयोग करके एलिसा द्वारा संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्र और मूल्यांकन किया गया था।

रीयल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)

ओस्टियोक्लास्टिक मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति, जैसे कि सी-फॉस, एनएफएटी 1 और टीएनएफ-ए, वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, निर्माता के निर्देशों (Invitrogen) के अनुसार Trizol अभिकर्मक के साथ मैक्रोफेज से कुल RNA निकाला गया। सीडीएनए को सुपरस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस II और प्राइमरों (इंविट्रोजन) का उपयोग करके कुल आरएनए के 1 मिलीग्राम के साथ संश्लेषित किया गया था। पावर SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) का उपयोग एबीआई 7500 सीक्वेंस डिटेक्शन सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) के साथ साइकिल चलाने के दौरान पीसीआर उत्पाद के संचय का पता लगाने के लिए किया गया था। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के बाद, पीसीआर था

15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 3-विकृतीकरण के चरण चक्र, 1 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार का उपयोग करके प्रदर्शन किया। सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को कम से कम तीन प्रतियों में किया गया था, और उसी प्रतिक्रिया में हाउसकीपिंग जीन एचपीआरटी के लिए अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य किया गया था। इस अध्ययन में अन्यत्र वर्णित समान प्राइमर अनुक्रमों का उपयोग किया गया [7]।

इंट्रासेल्युलर आरओएस का मापन

29,79-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन-डायसेटेट (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, जर्मनी) का एक स्टॉक सॉल्यूशन DMSO में तैयार किया गया था और अंधेरे में 220uC पर संग्रहीत किया गया था। संक्षेप में, बीएमएम ({7}}वेल प्लेट्स में 106 सेल/एमएल) को 24 घंटे के लिए 50 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ के साथ सुसंस्कृत किया गया और फिर विभिन्न सांद्रता (0–10 एमएम) के साथ इलाज किया गया।एक्टोसाइड100 एनजी/एमएल रैंक के साथ उत्तेजना से पहले 2 घंटे। सह-ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, इन कोशिकाओं को बाद में 30 मिनट के लिए 25 मिमी DCFH-DA के साथ ऊष्मायन किया गया। 29,79-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन (DCF) की हरी प्रतिदीप्ति 515 एनएम (FL 1) पर एक FACS सहूलियत प्रणाली (बेक्टन-डिकिंसन, सैन जोस, सीए, यूएसए) और 10, 000 का उपयोग करके दर्ज की गई थी। प्रति नमूना घटनाओं की गणना की गई।

ओवरीएक्टोमी-प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस का प्रेरण

इस अध्ययन के लिए महिला आईसीआर चूहों (6 सप्ताह पुरानी) का इस्तेमाल किया गया। चूहे को एनेस्थीसिया के तहत एक दिखावा ऑपरेशन (शाम, एन =10) या सर्जिकल ओवरीएक्टोमाइज्ड (OVX, n =20) प्राप्त हुआ। सर्जरी के एक सप्ताह बाद, OVX चूहों को बेतरतीब ढंग से 10 चूहों के 2 समूहों में विभाजित किया गया था: द्विपक्षीय OVX और द्विपक्षीय OVX 200 मिलीलीटर के साथ पूरक

पीबीएस युक्त 1 मिमी एक्टोसाइड मौखिक रूप से (एसी समूह)। सर्जरी के बाद 8 सप्ताह तक हर 3 दिनों में एक बार ओरल एक्टियोसाइड दिया जाता था, और

पीबीएस की समान मात्रा को शाम और ओवीएक्स समूहों को प्रशासित किया गया था। पिछले प्रशासन के 1 दिन के बाद, चूहों की बलि दी गई और फिर सीरम में जैव रासायनिक मापदंडों और 3- आयामी हड्डी संरचना का विश्लेषण किया गया।

सीरम जैव रासायनिक पैरामीटर्स का निर्धारण

रक्त के नमूने कार्डियक पंचर के माध्यम से एकत्र किए गए और सीरम को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया। जैव रासायनिक मापदंडों के विश्लेषण के लिए सीरम के नमूने 280 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे। आईएल-1बी और आईएल-6 के सीरम स्तर का अनुमान ऊपर वर्णित एलिसा किट का उपयोग करके लगाया गया था, जबकि क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) गतिविधि को जैव रासायनिक वर्णमिति परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था जो पी की मात्रा को मापता है। -नाइट्रोफेनॉल एक पी-नाइट्रोफेनॉल फॉस्फेट सब्सट्रेट से उत्पन्न होता है, जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [27]। हड्डी के निर्माण और पुनर्जीवन के बायोमार्कर का अनुमान लगाने के लिए, निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार सीरम OC, कैल्शियम और TRAP5b का स्तर भी निर्धारित किया गया था।

अस्थि संरचना और रूपमितीय पैरामीटरों का विश्लेषण

चूहों के फीमोरा (शाम, ओवीएक्स, और एसी समूह) को यांत्रिक परीक्षण के लिए विच्छेदित और शारीरिक खारा से भर दिया गया था। फीमर की यांत्रिक शक्ति को अन्यत्र वर्णित [28] के रूप में मापा गया था। सही फीमर फ्रैक्चर के मध्य-शाफ्ट के बिंदु पर न्यूटन में फ्रैक्चर लोड को शिखर बल के रूप में दर्ज किया गया था। इसके अलावा, एक माइक्रो कंप्यूटर टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) प्रणाली (स्काईस्कैन 1076 माइक्रोफोकस एक्स-रे सिस्टम, कोंटिच, बेल्जियम) का उपयोग करके प्रत्येक जानवर के प्रकाश फीमर का हिस्टो-मॉर्फोमेट्रिक रूप से विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, स्कैन के दौरान सूखने से बचाने के लिए, 4 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड भंडारण में हड्डियों को प्लास्टिक की ''क्लिंग-फिल्म'' या पैराफिल्म में लपेटने से पहले कागज के ऊतक पर सतही रूप से सुखाया गया था। प्रत्येक प्लास्टिक-लिपटे हड्डी को प्लास्टिक/पॉलीस्टायर्न फोम ट्यूबों में रखा गया था, जो 1076 स्कैनर नमूना कक्ष में लंबवत रूप से क्षैतिज रूप से लगाए गए थे।

माइक्रो-सीटी इमेजिंग। 100 केवी स्रोत वोल्टेज और 35 मिमी रिज़ॉल्यूशन के साथ 140 एमए स्रोत वर्तमान का उपयोग करके स्कैनिंग की गई थी।

स्काईस्कैन सीटी एनालाइज़र संस्करण 1.11 का उपयोग करके फीमर की ट्रैब्युलर हड्डियों के त्रि-आयामी मॉडल का पुनर्निर्माण किया गया था। ट्रैब्युलर बोन मिनरल डेंसिटी (BMD, g/cm3), बोन वॉल्यूम (बोन वॉल्यूम (BV)/टिशू वॉल्यूम (TV), प्रतिशत), मोटाई (Tb.Th, mm), सेपरेशन (Tb.Sp) जैसे संरचनात्मक पैरामीटर , मिमी), और संख्या (Tb.N, 1/mm) को तब मापा गया।

ओस्टोजेनिक विभेदन और खनिजकरण परख {{{10}}}} में सुसंस्कृत अस्थि मज्जा कोशिकाओं को डीएजी (10 एनएम डेक्सामेथासोन, 50 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, और 20 मिमी बी-ग्लिसरोफॉस्फेट) के साथ इलाज किया गया था। 10 मिमी एक्टोसाइड की उपस्थिति। भेदभाव के 2 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए बर्फ-ठंडा 70 प्रतिशत (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ तय किया गया था और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए आसुत जल में 0.2 प्रतिशत एलिज़रीन लाल एस के साथ दाग दिया गया था। कोशिकाओं के नष्ट हो जाने और हवा में सूखने के बाद, सेल कल्चर प्लेटों का मूल्यांकन एक उल्टे माइक्रोस्कोप (Nikon TS100, Japan) का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। लाल डाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए, दाग को 10 प्रतिशत एसिटाइल पाइरिडिनियम क्लोराइड के साथ 20 मिनट तक हिलाकर साफ किया गया और अवशोषण 560 एनएम पर मापा गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल परतों में जमा कैल्शियम की मात्रा को कैल्शियम सी किट (वाको केमिकल इंक। ओसाका, जापान) का उपयोग करके भी मापा गया। इसके अलावा, हड्डी-विशिष्ट mRNA मार्करों की अभिव्यक्ति, जैसे रनट-संबंधित प्रतिलेखन कारक -2 (Runx2), osterix, बोन सियालोप्रोटीन (BSP), और OC वास्तविक समय RT-PCR द्वारा निर्धारित किया गया था। इन मार्करों के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों को प्राइमर एक्सप्रेस सॉफ्टवेयर 3.0 (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके 200 बीपी से कम उत्पाद आकार के साथ डिजाइन किया गया था जैसा कि अन्यत्र वर्णित है [27]।

सिस्टैंच एक्टोसाइड हड्डी के गठन को बढ़ावा देता है

परिणाम

एक्टोसाइड एक खुराक पर निर्भर तरीके से मैक्रोफेज द्वारा ऑस्टियोक्लास्ट गठन को रोकता है

ओस्टियोक्लास्ट में बीएमएम भेदभाव पर एक्टोसाइड के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं को 50 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ और 100 एनजी / एमएल की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए एक्टियोसाइड के विभिन्न सांद्रता (0 - 20 मिमी) के साथ सुसंस्कृत किया गया था। रैंक। एक्टियोसाइड ने खुराक पर निर्भर तरीके से ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या को कम कर दिया। जब कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए 10 मिमी एक्टोसाइड के साथ दिखाया गया था, तो एम-सीएसएफ और आरएएनसीएल (छवि 1 ए) के साथ पूरक कोशिकाओं की तुलना में ऑस्टियोक्लास्ट संख्या में 43 प्रतिशत की कमी आई है। अंजीर। 1B एक्टोसाइड के साथ संयुक्त उपचार द्वारा RANKL की मध्यस्थता वाले ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव और इसके निषेध को दर्शाता है। इस परिणाम के अनुरूप, एक्टियोसाइड प्रीट्रीटमेंट ने RAW264.7 कोशिकाओं और ऑस्टियोक्लास्ट गठन (अंजीर। 1C और D) के RANKL- उत्तेजित भेदभाव को कम कर दिया। जब बीएमएम पर एक्टोसाइड की एंटी-ऑस्टियोक्लास्टिक क्षमता की तुलना एक ही एकाग्रता (10 मिमी) पर कई फेनोलिक यौगिकों की एंटीओस्टियोक्लास्ट क्षमता के साथ की गई, तो ल्यूटोलिन ने उच्चतम गतिविधि (छवि 2 ए) दिखाई। हालांकि, ल्यूटोलिन, क्वेरसेटिन, या एपिजेनिन ने ही कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम कर दिया (चित्र 2बी)। सभी यौगिकों ने निम्नलिखित सापेक्ष गतिविधियों के साथ RAW264.7 मैक्रोफेज द्वारा ऑस्टियोक्लास्टिक भेदभाव को रोक दिया: ल्यूटोलिन। क्वेरसेटिन=एपिजेनिन।

सिस्टैंच एक्टोसाइड ओस्टियोक्लास्ट को रोकता है

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