भाग 1: गुर्दे के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन के बाद अकार्बनिक नाइट्रेट के नवीकरणीय प्रभाव

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सार

पार्श्वभूमि: गुर्दे की इस्किमिया-रीपरफ्यूजन (आईआर) की चोटका एक सामान्य कारण हैतीक्ष्ण गुर्दे की चोट(AKI), जो ऑक्सीडेटिव तनाव और कम नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) बायोएक्टिविटी से जुड़ा है, और विकसित होने का खतरा बढ़ जाता हैगुर्दे की पुरानी बीमारी(सीकेडी) और हृदय रोग (सीवीडी)। नई रणनीतियाँ जो रेडॉक्स संतुलन को बहाल करती हैं, AKI और संबंधित जटिलताओं के दौरान चिकित्सीय प्रभाव हो सकती हैं।

उद्देश्य: आईआर-प्रेरित गुर्दे और हृदय रोग के विकास के दौरान नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ मार्ग को बढ़ावा देने के चिकित्सीय मूल्य की जांच करना।

तरीकों: पुरुष C57BL/6 J चूहों को सोडियम नाइट्रेट (10 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी) या वाहन 2 घंटे पहले बाएं गुर्दे (45 मिनट) के गर्म इस्किमिया से पहले पीने के पानी में सोडियम नाइट्रेट पूरकता (1 मिमीोल/किग्रा/ दिन) अगले 2 सप्ताह के लिए। रक्तचाप और ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर को मापा गया और रक्त और गुर्दे को एकत्र किया गया और जैव रासायनिक और ऊतकीय विश्लेषण के साथ-साथ वृक्क पोत प्रतिक्रियाशीलता अध्ययन के लिए उपयोग किया गया। एंजियोटेंसिन के साथ या बिना हाइपोक्सिया-पुन: ऑक्सीकरण के संपर्क में आने वाली ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग यंत्रवत अध्ययन के लिए किया गया था।

परिणाम: आईआर गुर्दे की चोटों, सूजन, एंडोथेलियल डिसफंक्शन, एंग के स्तर में वृद्धि, और एंग II-मध्यस्थता वासोरिएक्टिविटी के संयोजन में कम गुर्दे समारोह और थोड़ा ऊंचा रक्तचाप से जुड़ा था, जो सभी नाइट्रेट द्वारा संशोधित थे। इसके अलावा, नाइट्रेट (विवो में) और नाइट्राइट (इन विट्रो) के साथ उपचार ने कोई बायोएक्टिविटी बहाल नहीं की और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव और चोटों को कम किया।

निष्कर्ष: रीनल इस्किमिया से पहले अकार्बनिक नाइट्रेट के साथ तीव्र उपचार एकेआई और सीकेडी को रोकने और विकसित होने के संबंधित जोखिम के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण के रूप में काम कर सकता है।हृदय रोग.

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1 परिचय

गुर्दे की इस्किमिया-रीपरफ्यूजन (आईआर) की चोट, प्रत्यारोपण, कार्डियक बाईपास सर्जरी और सदमे से जुड़ी, तीव्र गुर्दे की चोट (एकेआई) और बाद में क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) विकसित होने का एक बड़ा जोखिम है। अंतर्निहित तंत्र जटिल हैं और इसमें रीपरफ्यूजन से जुड़े ऑक्सीडेटिव तनाव, नाइट्रिक ऑक्साइड की कमी और प्रतिरक्षा सेल सक्रियण शामिल हैं, जो एक साथ एंडोथेलियल डिसफंक्शन [2, 3] का कारण बनते हैं। चल रहे शोध में एकेआई को रोकने और इलाज के लिए नए और प्रभावी उपचार खोजने और सीकेडी में इसकी प्रगति पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जैसे कि रिमोट इस्केमिक प्रीकंडीशनिंग, अस्थायी स्थानीय हाइपोथर्मिया और साथ ही नए औषधीय हस्तक्षेप [3,4]।

गैसीय संकेतन अणु नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) महत्वपूर्ण रूप से हृदय और वृक्क होमियोस्टेसिस के नियमन में योगदान देता है और आईआर चोटों [5,6] के दौरान एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इस्केमिक घटना के दौरान, ऑक्सीजन की कमी एंडोथेलियल नो सिंथेज़ (ईएनओएस) के कार्य से समझौता करती है, जो रीपरफ्यूजन चरण के दौरान इस्केमिक ऊतक में "नो-रिफ्लो घटना" में योगदान कर सकती है। यह बदले में एंडोथेलियल और ट्यूबलर एपिथेलियल सेल चोटों [7] का प्रसार करता है, जो कम गुर्दे के कार्य के विकास में योगदान देता है। इस्केमिक अवधि के दौरान हाइपोक्सिया के अलावा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का अत्यधिक उत्पादन निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) ऑक्सीडेज और माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा अधिक मात्रा में उत्पन्न होता है, जो पुनर्संयोजन चरण के दौरान NO [8] को साफ करता है। नए दृष्टिकोण जो ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करते हैं और NO बायोएक्टिविटी को बनाए रखते हैं, IR-प्रेरित गुर्दे की विफलता के खिलाफ लड़ाई में चिकित्सीय मूल्य हो सकते हैं।

अकार्बनिक नाइट्रेट (NO3) और नाइट्राइट (NOZ) को पहले NO चयापचय से प्राप्त अपेक्षाकृत निष्क्रिय उत्पादों के रूप में देखा जाता था। हालांकि, दो दशकों से अधिक समय तक किए गए शोध से पता चला है कि ये आयन क्रमिक कटौती के माध्यम से बायोकॉनवर्जन से गुजर सकते हैं, और फिर से NO और अन्य बायोएक्टिव नाइट्रोजन ऑक्साइड प्रजातियां [9] बना सकते हैं। इस वैकल्पिक नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ मार्ग की गतिविधि हाइपोक्सिया और निम्न पीएच के साथ स्थितियों के दौरान बढ़ जाती है जब शास्त्रीय एनओएस प्रणाली खराब हो सकती है [10]।

आहार, एनओएस प्रणाली के अलावा, नाइट्रेट और नाइट्राइट को प्रसारित करने का एक महत्वपूर्ण स्रोत है, उदाहरण के लिए हरी पत्तेदार सब्जियों में नाइट्रेट के उच्च स्तर के कारण। अकार्बनिक नाइट्रेट और नाइट्राइट के साथ अनुपूरण को प्रायोगिक और नैदानिक ​​दोनों अध्ययनों में रक्तचाप में कमी सहित अनुकूल हृदय संबंधी प्रभावों से जोड़ा गया है [11]। जिगर [12], मस्तिष्क [13], फेफड़े [14], और हृदय [12,15] के प्रायोगिक आईआर चोट मॉडल में अंग सुरक्षात्मक प्रभाव भी दिखाए गए हैं। हालांकि, गुर्दे की आईआर चोट में अकार्बनिक नाइट्रेट और नाइट्राइट का संभावित चिकित्सीय मूल्य विवादास्पद बना हुआ है। जैसा कि हाल ही में समीक्षा की गई है [5], नाइट्राइट थेरेपी का उपयोग करते हुए आईआर मॉडल में परिवर्तनशील परिणाम, शायद इस्तेमाल की जाने वाली खुराक में अंतर, प्रशासन के मार्ग, उपचार की अवधि, साथ ही साथ प्रायोगिक मॉडल [16,17] में अंतर के कारण। कई प्रायोगिक अध्ययनों ने कार्डियोरेनल रोग के मॉडल में आहार नाइट्रेट पूरकता के सुरक्षात्मक प्रभावों का प्रदर्शन किया है, जिसमें तंत्र के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करना और NO बायोएक्टिविटी में सुधार के साथ-साथ मॉडुलन भी शामिल है।भड़काऊ प्रतिक्रियाएं[5]। आज तक, गुर्दे की आईआर चोट में अकार्बनिक नाइट्रेट थेरेपी के प्रभावों के बारे में सीमित ज्ञान है। हमने पहले दिखाया है कि नाइट्रेट के साथ पुरानी आहार संबंधी दिखावा बाद में आईआर-प्रेरित गुर्दे की चोटों [18] को दर्शाता है। हालांकि, एकेआई और सीकेडी के विकास के जोखिम को कम करने के लिए आईआर की शुरुआत में नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ मार्ग को बढ़ावा देने के संभावित मूल्य के बारे में कम जानकारी है। यदि सुरक्षात्मक है, तो AKI विकसित होने के जोखिम वाले रोगियों में इसका व्यापक नैदानिक ​​अनुप्रयोग हो सकता है, उदाहरण के लिए जो प्रमुख सर्जरी से गुजर रहे हैं।

इस अध्ययन में, हमने इस्केमिक घटना से तुरंत पहले तीव्र नाइट्रेट उपचार के संभावित लाभों की जांच के लिए गुर्दे की आईआर चोट के एक माउस मॉडल का उपयोग किया। यह यंत्रवत पूर्व विवो पोत अध्ययन और नाइट्राइट उपचार के साथ इन विट्रो सेल संस्कृति प्रयोगों के साथ जोड़ा गया था। हमने अनुमान लगाया कि नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ पाथवे को बढ़ावा देने से ऑक्सीडेटिव तनाव और NO बायोएक्टिविटी के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के मॉड्यूलेशन के माध्यम से IR चोट के खिलाफ गुर्दे की सुरक्षा को बढ़ावा मिलेगा।

2. तरीके

2.1.अभिकर्मक

जब तक अन्यथा न कहा जाए, सभी अभिकर्मक सिग्मा-एल्ड्रिच, स्वीडन से प्राप्त किए गए थे।

2.2. पशु और गुर्दा ischemia-reperfusion मॉडल

C57BL / 6 J चूहों (पुरुष, 10 सप्ताह) को Janvier Lab-oratories (फ्रांस) से प्राप्त किया गया था और एक 12- h प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ जलवायु-नियंत्रित परिस्थितियों में करोलिंस्का इंस्टिट्यूट में हमारी पशु सुविधाओं में रखा गया था और प्रदान किया गया था। मानक कृंतक चाउ और नल के पानी के साथ। सभी पशु प्रक्रियाओं को पशु प्रयोगों के लिए क्षेत्रीय नैतिक समिति (प्रोटोकॉल आईडी: N139/15) द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के दिशानिर्देशों के अनुसार और यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 / EU के संचालन के लिए किया गया था। जानवरों में प्रयोग।

अनुकूलन के 1 सप्ताह के बाद, चूहों को बाएं गुर्दे के एकतरफा इस्किमिया से पहले प्लेसबो (NaCl) या सोडियम नाइट्रेट (NaNO3) इंट्रापेरिटोनियल (1 0 मिलीग्राम / किग्रा) 2 घंटे पहले प्रशासित किया गया था। दाहिनी किडनी का निरीक्षण किया गया था लेकिन अन्यथा बरकरार रखा गया था। शाम की सर्जरी उसी तरह से की गई, लेकिन बाईं किडनी को बंद किए बिना। चूहे को आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था और पूरे सर्जरी के दौरान एक हीटिंग लैंप और एक स्व-निगरानी वाले हीटिंग पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान को 37 ± 0.5 डिग्री पर रखा गया था। सर्जरी के बाद, चूहों को समाप्ति तक 2 सप्ताह के लिए या तो सोडियम नाइट्रेट (1 मिमीोल / किग्रा / दिन) या प्लेसबो के साथ इलाज किया गया था।

2.3. रक्तचाप माप

समाप्ति से पहले एक गैर-इनवेसिव टेल-कफ विधि का उपयोग करके चूहों में रक्तचाप को मापा गया था। चूहों को 35 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक गर्म प्लेट पर वातानुकूलित किया गया था और फिर प्लास्टिक निरोधकों में रखा गया था। एक वायवीय पल्स सेंसर के साथ एक कफ पूंछ से जुड़ा हुआ था, और रक्तचाप के मूल्यों को CODA सिस्टम (केंट साइंटिफिक, टॉरिंगटन, सीटी, यूएसए) के साथ दर्ज किया गया था। रक्तचाप की रिकॉर्डिंग से कम से कम तीन दिन पहले जानवरों को वार्मिंग प्लेट पर निरोधकों के साथ प्रशिक्षित किया गया था। लगातार 3 दिनों में सिस्टोलिक, डायस्टोलिक और माध्य धमनी दबाव एकत्र किया गया था और सभी स्वीकृत मूल्यों के व्यक्तिगत माध्य को मूल्यांकन के लिए संकलित किया गया था।

2.4.ऊतक कटाई

समाप्ति से पहले, चूहों को ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर (जीएफआर) की गणना के लिए मूत्र एकत्र करने के लिए चयापचय पिंजरों में रखा गया था। जानवरों को तब आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था और अवर वेना कावा के माध्यम से रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। सभी नमूनों को EDTA (सिग्मा-एल्ड्रिच, स्टॉकहोम, स्वीडन) की उपस्थिति में 6000 × g, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत सेंट्रीफ्यूज किया गया, 2 मिमी की अंतिम सांद्रता। प्लाज्मा के नमूनों को नई ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया और तुरंत सूखी बर्फ में स्नैप-फ्रोजन किया गया और अंत में -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। पूर्व विवो संवहनी समारोह प्रयोगों (इंटरलोबार धमनियों और अभिवाही धमनी), ऊतक विज्ञान के लिए गुर्दे को निकाला गया और कई भागों में काटा गया। एचई और पीएएस धुंधला), और एपोप्टोसिस और सूजन की मात्रा का ठहराव (टिशू-टेक इष्टतम कटिंग टेम्परा-ट्यूर (ओसीटी) कंपाउंड एम्बेडिंग और ट्यूनेल और एफ 4/80 धुंधला के लिए जमे हुए)।

2.5. नाइट्रेट, नाइट्राइट, सीजीएमपी, क्रिएटिनिन, रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन), और एंजियोटेंसिन II का मापन

एचपीएलसी (ईएनओ -20) द्वारा नाइट्राइट और नाइट्रेट का विश्लेषण किया गया था जैसा कि पहले 19】 में वर्णित है। प्लाज्मा के नमूने -10 उल को हैमिल्टन सिरिंज के साथ एचपीएलसी प्रणाली में इंजेक्ट किया गया था। इसके बाद, नाइट्राइट और नाइट्रेट को रिवर्स-फेज/आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया गया, जिसके बाद कैडमियम द्वारा नाइट्रेट को नाइट्राइट में कमी और तांबे को कम किया गया। डायज़ो यौगिक बनाने के लिए ग्रिस अभिकर्मक का उपयोग करके नाइट्राइट को व्युत्पन्न किया गया और 540 एनएम पर पता चला। cGMP के क्षरण को रोकने के लिए, प्लाज्मा को PDE अवरोधक, BMX (3-Isobutyl-1मिथाइलक्सैन्थिन; सिग्मा-एल्ड्रिच #I5879） युक्त ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया ताकि अंतिम एकाग्रता （10 μM） दिया जा सके। नमूने थे इसके बाद निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एलिसा किट (जीई हेल्थकेयर #आरपीएन226) के साथ सीजीएमपी का विश्लेषण करने से पहले -80 डिग्री पर फ्रीज और स्टोर किया जाता है।

प्लाज्मा और मूत्र क्रिएटिनिन के स्तर का पता क्रिएटिनिन वर्णमिति परख किट (केमैन केमिकल, #700460 और #500701) का उपयोग करके लगाया गया था। जीएफआर का अनुमान लगाने के लिए क्रिएटिनिन क्लीयरेंस फॉर्मूला (CLcr =Urinecrx मूत्र प्रवाह / Plasmacr) का उपयोग किया गया था। BUN Colorimetric डिटेक्शन किट (Invitrogen,#EIA-BUN) का उपयोग करके प्लाज्मा BUN स्तरों का पता लगाया गया। प्लाज्मा और गुर्दे के ऊतकों में Ang के स्तर को निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार Ang I ELISA किट (क्लाउड-क्लोन कॉर्प, # CEA005Mu) का उपयोग करके मापा गया था। हालांकि, ऊतक निकालने की तैयारी सिफारिश से थोड़ी भिन्न थी। 50 प्रतिशत EtOH में 10 वोल्ट 50 मिमी एचसीएल को ऊतक में जोड़ा गया था और 100 डिग्री पर 10 मिनट के लिए गर्म किया गया था, सेंट्रीफ्यूज्ड 10 000 × जी 10 मिनट। तत्पश्चात नमूनों को जमे हुए और विश्लेषण किए जाने से पहले -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। सभी अवशोषण रीडिंग SpextraMax iD3 में आण्विक उपकरणों से किए गए थे।

2.6. इंटरलोबार धमनियों का अलगाव और छिड़काव

बलिदान के बाद गुर्दे काटा गया और इंटरलोबार धमनियों के अलगाव तक बर्फ के ठंडे शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस) में रखा गया। गुर्दे की इंटरलोबार धमनियों को विच्छेदित किया गया (लंबाई में 2 मिमी) और a . में घुड़सवार किया गया

मायोग्राफ चैम्बर (मॉडल 620 M, डेनिश मायो टेक्नोलॉजी, डेनमार्क) PSs के साथ जैसा कि पहले बताया गया है [20]। पावरलैब सिस्टम (पॉवरलैब 4/30, एडी इंस्ट्रूमेंट्स, ऑस्ट्रेलिया) के साथ आइसोमेट्रिक तनाव दर्ज किया गया था। घुड़सवार होने के बाद, जहाजों को 37 डिग्री, पीएच 7.4 पर कार्बोजन (95 प्रतिशत ओ 2; 5 प्रतिशत सीओ 2) के साथ पीएस बुदबुदाते हुए 20 मिनट के लिए संतुलित किया गया था। फिर धमनियों के आराम तनाव को पहले [21] के रूप में वर्णित किया गया था, जो कि है मुलवानी की सामान्यीकरण प्रक्रिया [22] के अनुसार। एक दूसरे संतुलन के बाद, धमनी वलय व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए 0.1 mol/L KCl लागू किया गया था।

2.7. अभिवाही धमनी का अलगाव और सूक्ष्म छिड़काव

C57BL / 6 J चूहों को साँस के आइसोफ्लुरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था और किडनी को हटा दिया गया था और पहले से वर्णित [23-25] के रूप में जल्दी से काट दिया गया था। गुर्दे के स्लाइस को बर्फ-ठंडे डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) में रखा गया था। संलग्न ग्लोमेरुलस के साथ एक एकल अभिवाही धमनी को एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सूक्ष्म-विच्छेदित किया गया और एक में स्थानांतरित किया गया

एक उल्टे माइक्रोस्कोप के मंच पर तापमान-विनियमित कक्ष। ग्लोमेरुलस को एक होल्डिंग माइक्रोपिपेट के साथ तय किया गया था और अभिवाही धमनी को माइक्रोपिपेट के एक सेट के साथ कैन्युलेट और सुगंधित किया गया था। प्रयोगों के दौरान परफ्यूज्ड अभिवाही धमनी का इंट्राल्यूमिनल दबाव 60 mmHg पर बनाए रखा गया था। विच्छेदन और निम्नलिखित सूक्ष्म छिड़काव का समय माउस के बलिदान के बाद 120 मिनट तक सीमित था जैसा कि पहले बताया गया था [26]। 37 डिग्री पर 30 मिनट की संतुलन अवधि के बाद, Ang II (10-12 से 10-8 mol/L) तक संचयी खुराक-प्रतिक्रिया वक्र प्राप्त किए गए। आंग II की प्रत्येक सांद्रता को 2 मिनट के लिए सुगंधित किया गया था, कसना प्रतिक्रिया दर्ज की गई थी और फिर अभिवाही धमनी के व्यास को मापा गया था।

2.8. हिस्टोलॉजिकल परीक्षा

गुर्दे के नमूनों को काटा गया और 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड घोल में तय किया गया। स्थिर गुर्दे के ऊतकों को पैराफिन में अंतःस्थापित किया गया और उसके बाद हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए हेमटॉक्सिलिन-ईओसिन (एच एंड ई) या पीरियोडिक एसिड शिफ (पीएएस) के साथ कटा और दाग दिया गया। प्रत्येक प्रायोगिक समूह से चार यादृच्छिक रूप से चयनित जानवरों का विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। प्रत्येक खंड से दस बेतरतीब ढंग से चुने गए क्षेत्रों को 400 × आवर्धन के तहत कब्जा कर लिया गया था। सभी मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण अंधाधुंध तरीके से किए गए।

2.9. ट्यूनेल धुंधला हो जाना

TUNEL धुंधला के लिए OCT-एम्बेडेड किडनी के नमूनों का उपयोग किया गया था। 6-सुक्ष्ममापी मोटे वर्गों को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 20ug/mL प्रोटीनएज़ K के साथ ऊष्मायन किया गया था, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए Click-iTTM Plus TUNEL परख (Invitrogen C10618, USA) का उपयोग करके TUNEL प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था। प्रोटोकॉल के अंत में, DAPIstaining का प्रदर्शन किया गया। परिमाणीकरण के लिए, छवि के तीन जानवरों और तीन क्षेत्र क्षेत्रों (200 ×) को बेतरतीब ढंग से चुना गया था और Zeiss LSM 800- हवादार कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फोटो खींचे गए थे, ImageJ / फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सकारात्मक संकेतों की मात्रा निर्धारित की गई थी, और उनकी गणना की गई थी। डीएपीआई के लिए सकारात्मक संकेतों का अनुपात।

2.10. ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (F4/80)

OCT (टिशू-टेक, टॉरेंस, सीए, यूएसए) में किडनी जमी हुई थी और सेक्शन 6 सुक्ष्ममापी तैयार किए गए और आगे की प्रक्रिया की गई। जमे हुए वर्गों को 1 × पीबीएस से धोया गया और 30 मिनट के लिए पीबीएस में 2 प्रतिशत बीएसए के साथ अवरुद्ध किया गया और फिर 4 डिग्री में रात भर में एफ4/80(1:50, बीआईओ-आरएडी क्ल: ए 3-1) के साथ ऊष्मायन किया गया। कोल्ड रूम, और बाद में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200 सेल सिग्नलिंग टेक #4417) के साथ, इसके बाद 300 एनएमओएल/एल डीएपीआई(4'6-डायमिडीनो-2-फिनाइल के साथ काउंटरस्टेनिंग -इंडोल, डाइहाइड्रोक्लोराइड, इंविट्रोजन) 3 मिनट के लिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस संकेतों की कल्पना Zeiss LSM800-हवादार कन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत की गई थी। छवि के तीन जानवरों और तीन क्षेत्र क्षेत्र (200 ×) को यादृच्छिक रूप से चुना गया था। F4/80 सकारात्मक संकेतों को ImageJ/फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और DAPI को सकारात्मक संकेतों के अनुपात के रूप में गणना की गई थी।

2.11. कोश पालन

रैट ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल सेल्स (GECs) (DSMZ ACC262, जर्मनी) RPMI1640 (गिब्को 21870-076) माध्यम में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम और 2 मीटर एमएल-ग्लूटामाइन (गिब्को 25030-082), पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ सुसंस्कृत थे। (50 मिलीग्राम/लीटर, गिब्को 15140-122)। 5 प्रतिशत CO2 के आर्द्र वातावरण में कोशिकाओं को 37 डिग्री पर बनाए रखा गया था। हाइपोक्सिया प्रयोगों में, कोशिकाओं को एचबीएसएस (गिब्को 14025-092) में सीरम-मुक्त माध्यम के बजाय एक कक्ष में 1 प्रतिशत ऑक्सीजन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। हाइप-ऑक्सिया से पहले 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को नाइट्राइट 10 μM के साथ, xanthine ऑक्सीडोरक्टेज (XOR) अवरोधक फेबक्सोस्टैट (100 एनएम) के साथ / बिना पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन PrestoBlue- परख (Invitrogen, A13261, और A13262) द्वारा किया गया था, और सेल मृत्यु दर का मूल्यांकन ट्रिपैन ब्लू अपवर्जन परख (सिग्मा, टी 8154-20 एमएल) द्वारा किया गया था।

2.12. माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस का पता लगाना

माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड के स्तर का पता एक फ्लोरोजेनिक डाई (MitoSOXTM, Invitrogen M36008) से लगाया गया था। उपचार के बाद, एंडोथेलियल कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पर एक संस्कृति माध्यम में 2 μmol / L MitoSox के साथ ऊष्मायन किया गया था। तब कोशिकाओं को दो बार 1 × HBSS से धोया गया और फ्लोरोसेंट सिग्नल को मापा गया (स्पेक्ट्रामैक्स iD3 रीडर, आणविक उपकरण, यूएसए) और सेल व्यवहार्यता के लिए सामान्यीकृत किया गया।

2.13. इम्युनोब्लॉटिंग विश्लेषण

जमे हुए गुर्दे के नमूने या एंडोथेलियल कोशिकाओं को बफर में 10 मिमीोल / एल ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 150 मिमीोल / एल NaCl, 5 मिमीोल / एल ईडीटीए, 60 मिमीोल / एल एन-ऑक्टाइल-ग्लूकोसाइड, 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स {{9 }}, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, और प्रोटीन फॉस्फेट अवरोधक। सेल या ऊतक lysates को 5 मिनट के लिए 10, 000 × g पर 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला/प्रोटीन को नई ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया और बायो-रेड . का उपयोग करके इसकी मात्रा निर्धारित की गई

प्रोटीन परख। प्रोटीन के बराबर मात्रा में प्रोटीन के अर्क का विश्लेषण {0}} प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) का उपयोग करके किया गया था। प्रोटीन को 300 mA पर 1 घंटे के लिए एक इमोबिलोन पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड झिल्ली में स्थानांतरित किया गया था। झिल्ली को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4), 150 मिमी NaCl, और 0.1 प्रतिशत ट्वीन 20 (टीबीएस-टी) में 5 प्रतिशत वसा रहित में अवरुद्ध किया गया था। 1 घंटे के लिए दूध पाउडर और एंटी-टीएफएएम (1: 2000, एबी 131607), एंटी-ओएक्सपीएचओएस (1: 1000, एबी 110413), एंटी-विनकुलिन (1: 5000, एबी 129002) (एबकैम कैम्ब्रिज, यूके) और एंटी-एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षित -क्लीव्ड कास्पेज़ -3 (1:1000,#9664)(सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, बेवर्ली, एमए, यूएसए)। इम्युनोब्लॉट विश्लेषण के लिए सभी माध्यमिक एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से थे। पश्चिमी धब्बों के लिए, MW मार्करों के साथ अक्रॉप्ड, एनोटेट, पूर्ण-लंबाई वाले im-age को अनुपूरक फ़ाइल में दिखाया गया है।

2.14. सांख्यिकीय विश्लेषण

समूहों के बीच कई तुलनाओं का विश्लेषण एक या दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया, जिसके बाद अनुशंसित पोस्ट-हॉक परीक्षण किया गया। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सभी सांख्यिकीय गणना ग्राफपैड प्रिज्म 8.0 का उपयोग करके की गई थी। सांख्यिकीय महत्व को p . के रूप में परिभाषित किया गया था<>