भाग 2: गुर्दे की चोट अणु -1 सार्स-कोव -2 के लिए एक संभावित रिसेप्टर है

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कोरोनोवायरस की नैदानिक अभिव्यक्तियों

1. इनक्यूबेशन अवधि लंबी है, और मुख्य लक्षण बुखार, थकान, गले में खराश, और खांसी हैं। बुखार तेज बुखार, मध्यम बुखार, या कम बुखार हो सकता है;

2. शिशुओं और बुजुर्गों ठेठ नहीं कर रहे हैं और अक्सर घरघराहट और डिस्पनिया के साथ कर रहे हैं. गंभीर मामलों में, बहु-प्रणाली क्षति हो सकती है;

3. प्रारंभिक चरण में सूखी खांसी मुख्य रूप से पैरॉक्सिस्मल और गंभीर होती है, जो काली खांसी के समान होती है, जो नींद और गतिविधियों को प्रभावित करती है; बाद के चरण में, खांसी थूक है, थूक शातिर है, कभी-कभी रक्त की एक छोटी मात्रा होती है, और कुछ घरघराहट के साथ होते हैं;

4. कुछ रोगियों को हल्के लक्षण हैं और कोई बुखार नहीं हो सकता है। अधिकांश रोगियों में एक अच्छा पूर्वानुमान होता है, और रोगियों की एक छोटी संख्या गंभीर रूप से बीमार होती है या यहां तक कि मर जाती है;

5. तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम, सेप्टिक सदमे, दुर्दम्य चयापचय एसिडोसिस, और जमावट शिथिलता.

नए कोरोना वायरस को कैसे रोका जाए, अपनी इम्यूनिटी में सुधार करना लोगों के लिए वायरस से लड़ने का सबसे कारगर माध्यम है। Cistanche, जो प्राचीन काल से एक पौष्टिक खजाने के रूप में इस्तेमाल किया गया है, के रूप में जाना जाता है "रेगिस्तानजिनसेंग" और प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने का राजा है। Cistanche - प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने के राजा

आधुनिक चिकित्सा अनुसंधान ने साबित कर दिया है कि शरीर को पोषण और मजबूत करने के कार्यों के अलावा, Cistanche ट्यूमर को रोकने, एंटी-एजिंग, एंटी-अतालता, एपोप्टोसिस को रोकने और प्रतिरक्षा में सुधार करने में महत्वपूर्ण उपचारात्मक प्रभाव है। पक्ष।

वहीCistanche के कुल glucosidesप्रतिरक्षा समारोह को विनियमित करने के लिए जिनसेंग के सक्रिय घटक हैं, जो न केवल सामान्य लोगों के लिए बल्कि कम प्रतिरक्षा समारोह वाले लोगों के लिए भी प्रतिरक्षा समारोह में सुधार कर सकते हैं।

नैदानिक अवलोकन ने पुष्टि की है कि सिंशे का घातक ट्यूमर पर एक निश्चित उपचारात्मक प्रभाव पड़ता है, और ल्यूकोसाइट्स को बढ़ाने का स्पष्ट प्रभाव पड़ता है। रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी के दौरान जिनसेंग लेने से रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी के विषाक्त और दुष्प्रभावों को कम किया जा सकता है, क्षतिग्रस्त ऊतक की मरम्मत में तेजी आ सकती है, और ल्यूकोपेनिया को रोका जा सकता है;

चर्चा

के खिलाफ लड़ने के लिएCOVID-19 वैश्विक महामारी, कैसे की एक गहरी समझSARS-CoV-2मानव कोशिकाओं पर आक्रमण वारंट किया जाता है। अध्ययनों ने सार्स-कोव -2 के प्रत्यक्ष संक्रमण का संकेत दिया हैगुर्दाफेफड़ों के अलावा (ब्रौन एट अल। Farkash et al., 2020)। हालांकि, एसीई 2 एकमात्र अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त रिसेप्टर बना हुआ है जो इस आक्रमण की मध्यस्थता कर सकता है। इसके अलावा, सार्स-कोव -2 के वृक्क ट्रोपिज़्म और संबंधितगुर्दे की चोटवायरल आक्रमण (Kuba et al., 2005) पर ACE2 के अपेक्षाकृत कम स्तर से अस्पष्ट प्रतीत होता है। यहां, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि KIM1, गुर्दे की चोट के लिए एक काफी अपरेगुलेटेड बायोमार्कर (यांग एट अल।

हमने यह भी पाया कि सार्स-कोव-2-आरबीडी सार्स-कोव-आरबीडी और मर्स-सीओवी-आरबीडी की तुलना में उच्च आत्मीयता के साथ किम 1 को बांधता है, जो शायद सार्स-कोव -2 (राबान एट अल, 2020) के मजबूत संक्रमण को रेखांकित करता है; इसलिए, गुर्दे के संक्रमण और इन गंभीर श्वसन रोगों में KIM1 की भूमिकाओं को फिर से देखने के लायक है। विशेष रूप से, हमारे परिणाम वायरल आरबीडी पर KIM1 और ACE2 की अलग-अलग बाध्यकारी साइटों का सुझाव देते हैं, इस प्रकार यह जांचने योग्य है कि क्या और कैसे KIM1 और ACE2 इन अंगों में SARS-CoV-2 आक्रमण की मध्यस्थता करते हैं। इसके अलावा, चूंकि KIM1 क्लैथ्रिन-निर्भर मार्गों (झाओ एट अल., 2016) के माध्यम से एंडोसाइटोसेड है, इसलिए सेल झिल्ली के लिए वायरल लगाव के बाद KIM1-निर्भर प्रक्रिया का पता लगाना भी दिलचस्प होगा।

एसीई 2 सार्स-कोव -2 के लिए सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया गया रिसेप्टर है, फिर भी यह कोविड -19 के लिए एक आदर्श चिकित्सीय लक्ष्य नहीं है, क्योंकि यह व्यापक रूप से कई अंगों में व्यक्त किया जाता है और रक्तचाप को विनियमित करने और हृदय / गुर्दे की चोट को रोकने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (Imai et al., 2005); ली एट अल., 2020d)। इसके विपरीत, KIM1 गुर्दे समारोह के साथ एक मजबूत संबंध है और अत्यधिक केवल के बाद ही व्यक्त किया जाता हैवृक्क चोट(Kondratowicz et al,2011; युआन एट अल, 2015; कोस्टाफ्रेडा और कपलान, 2018), जो इसे गुर्दे की बीमारियों के साथ कोविड -19 रोगियों के लिए एक अधिक विशिष्ट और शायद सुरक्षित चिकित्सीय लक्ष्य बनाता है।

संक्षेप में, हमारे डेटा सार्स-कोव-2 के लिए एक संभावित रिसेप्टर के रूप में सार्स-कोव -2 वृक्क ट्रोपिज़्म में KIM1 की एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देते हैं। यहां, हम KIM1 और ACE2 (चित्रा 5G) द्वारा मध्यस्थता किए गए 'दुष्चक्र' के एक मॉडल का प्रस्ताव करते हैं, जो कोविड-19 रोगियों में SARS-CoV-2 के गुर्दे की ट्रोपिज्म की व्याख्या कर सकता है। सार्स-कोव-2 आक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान, उच्च शारीरिक स्तर (पूरक आंकड़ा एस 1) और बाध्यकारी आत्मीयता (पूरक तालिका एस 1) एसीई 2 को प्राथमिक लक्ष्य बनाते हैं, जो गुर्दे-विशिष्ट नहीं है। हालांकि, वायरस-प्रेरित AKl की शुरुआत के बाद, परिणामस्वरूप काफी हद तक upregulated KIM1 तेजी से KIM1 और ACE2 द्वारा मध्यस्थता एक माध्यमिक वायरल संक्रमण को बढ़ावा देता है, जो अधिक गुर्दे-विशिष्ट है, और परिणामस्वरूप एक दुष्चक्र (चित्रा 5 जी) में गुर्दे की क्षति को बढ़ाता है। ऐसे दृष्टिकोण जो सार्स-कोव -2 और किम 1 के बीच बातचीत को तोड़ सकते हैं, जिसमें एंटी-किम 1 एंटीबॉडी, छोटे अणु अवरोधक और केआईएम 1-व्युत्पन्न विरोधी पेप्टाइड्स शामिल हैं, कोविड -19 उपचार पर प्रकाश डाल सकते हैं।

सामग्री और तरीके

सामग्री

पुनः संयोजक SARS-CoV-2-RBD (T80302) Genscript से प्राप्त किया गया था। विरोधी पेप्टाइड 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, शुद्धता >95%) और विरोधी पेप्टाइड 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, शुद्धता >95%) को जेनस्क्रिप्ट द्वारा रासायनिक रूप से संश्लेषित किया गया था। एंटी-माउस-एलजीजी एंटीबॉडी (पी / एन 18-8816-33) और एंटी-खरगोश-एलजीजी एंटी-बॉडी (पी / एन 18-8817-33) रॉकलैंड से प्राप्त किए गए थे। SureBeads के साथ IgG "प्रोटीन जी चुंबकीय मोती (J2112LB-02) बायो-रेड से खरीदा गया था। DAPI (D9542) सिग्मा से था। एलेक्स आटा 594 लेबल phalloidin (C2205S) Beyotimes से था. KIM1 (NBP1-76701, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma), और ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था।

KIM1 और ACE2 की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अधिग्रहण और विश्लेषण

मानव ऊतकों के लिए KIM1 और ACE2 के व्यापक ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीन प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए, हमने मानव प्रोटीन एटलस (एचपीए, https://www.proteinatlas.org) से ट्रांसक्रिप्टोम डेटा और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री-आधारित प्रोटीन प्रोफाइल एकत्र और विश्लेषण किया, जिसने ऊतकों और अंगों में मानव प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण दिखाया, 37 सामान्य ऊतक से आरएनए (आरएनए-सेक) के गहरे अनुक्रमण के आधार पर और 44 ऊतक प्रकारों वाले ऊतक माइक्रोएरे पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (उहलेन एट अल। प्रोटीन-कोडिंग जीन के एचपीए आरएनए-सेक ऊतक को प्रति मिलियन (पीटीपीएम) माध्य प्रोटीन-कोडिंग टेपों के रूप में दर्ज किया गया था, जो प्रत्येक ऊतक से नमूनों के औसत मूल्यों के अनुरूप था। हिस्टोलॉजी-आधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का मैन्युअल रूप से चार स्तरों (पता नहीं चला, कम, मध्यम और उच्च) में विश्लेषण किया गया था। अनुपूरक चित्रा S1 में, KIM1 और ACE2 के शीर्ष 10 टिसुलर ट्रांसक्रिप्शनल स्तर और हिस्टोलॉजी-आधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर क्रमशः सूचीबद्ध हैं, और KIM1 और ACE2 की ओवरलैप अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

आणविक डॉकिंग और गतिशीलता सिमुलेशन

डॉकिंग जेड-डॉक (http://zdock umassmed.edu/) के माध्यम से आयोजित किए गए थे। सार्स-कोव-आरबीडी (पीबीडी आईडी 2एजेडएफ), सार्स-कोव-2-आरबीडी (पीडीबी आईडी 6एमओजे), मर्स-सीओवी-आरबीडी (पीडीबी आईडी 4एल 3 एन), एसीई 2 (पीडीबी आईडी 1आर 42), और किम 1 आईजी वी डोमेन (पीडीबी आईडी 5डीजेडओ) की क्रिस्टल संरचनाओं का उपयोग संभावित बाध्यकारी मॉडल की तलाश के लिए किया गया था। निम्नलिखित आणविक गतिशीलता सिमुलेशन के लिए सबसे अच्छा स्कोर किए गए प्रोटीन परिसरों का चयन किया गया था, जो डेसमंड सर्वर द्वारा आयोजित किए गए थे और Pymol2.3 और Maestro11.8.012 द्वारा विश्लेषण किए गए थे। एमएम-जीबीएसए बाध्यकारी मुक्त ऊर्जा की गणना हॉकडॉक (मिसिनी एलजींजाटोविक एट अल।

रूट माध्य वर्ग विचलन (RMSD) और रूट माध्य वर्ग उतार-चढ़ाव (RMSF)

RMSD का उपयोग एक विशेष फ्रेम के लिए परमाणुओं के चयन के विस्थापन में औसत परिवर्तन का अनुमान लगाने के लिए किया गया था जैसा कि वर्णित है (Li et al., 2011)। RMSF प्रोटीन श्रृंखला में विस्थापन परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए आयोजित किया गया था (Li et al., 2011)।

AKI माउस मॉडल और qPCR

I / R चोट C57BL / 6 चूहों पर की गई थी जैसा कि हमने पहले वर्णित किया था (चेन एट अल, 2015, 2017)। सिस्प्लैटिन-प्रेरित एकेआई के लिए, 30 मिलीग्राम / किलोग्राम बॉडीवेट सिस्प्लैटिन को 8 सप्ताह के पुरुष चूहों में इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था, और 3 दिन बाद चूहों की बलि दी गई थी। रक्त और गुर्दे के नमूने आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए थे, प्रत्येक प्रयोगात्मक पशु समूह के लिए एन = 4 के साथ। कुल आरएनए को आरएनएइसो प्लस (TaKaRa) द्वारा गुर्दे से अलग किया गया था और एम-एमएलवी फर्स्ट-स्ट्रैंड संश्लेषण प्रणाली (इनविट्रोजन) का उपयोग करके सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट किया गया था। विशिष्ट जीन टेपों की बहुतायत का मूल्यांकन qPCR द्वारा किया गया था। अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर प्रदान किए गए हैं (पूरक तालिका S4)।

Constructs

मानव KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 अवशेषa 20-127), KIM1 के लिए स्तनधारी अभिव्यक्ति plasmids (छोटा KIM1 के साथ-बाहर अवशेषों aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD (SARS-CoV-2-S अवशेष aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV-2-S, SARS-CoV-2-S, SARS-CoV-2-S, SARS-COV-2-S, SARS-COV-2-S संबंधित cDNA टुकड़ों के पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों को एक pRK प्रमोटर-आधारित वेक्टर में क्लोन किया गया था जिसमें या तो एचए या फ्लैग टैग होता है। सार्स-कोव-2 से संबंधित प्लास्मिड शेडोंग विश्वविद्यालय में डॉ P.H.Wang से दयालु उपहार थे।

सेल संस्कृति और अभिकर्मक

मानव किडनी ट्यूबलर सेल लाइन एचके -2 (टाइप कल्चर कलेक्शन के लिए चीन केंद्र से प्राप्त) को डीएमईएम / एफ 12 मीडिया (हाइक्लोन) में 17.5 एमएम ग्लूकोज और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं पर सार्स-कोव -2 के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, एचके -2 कोशिकाओं को सार्स-कोव -2-एस और सार्स-कोव -2-आरबीडी प्लास्मिड के साथ संक्रमित किया गया था और फिर आगे का पता लगाने के लिए एकत्र किया गया था।

सह-आईपी

संकेतित HK-2 / HEK293T कोशिकाओं (1×10) को 1 मिलीलीटर प्री-लाइसिस बफर (25 mM Tris-HCl, pH7.4,150mM NaCl, 1% NP-40, 1mM EDTA, 5% ग्लिसरॉल) में झूठ बोला गया था, जिसे पुलडाउन और आईपी assays के लिए तैयार किया गया है और मोतियों के लिए एक वॉश बफर के रूप में तैयार किया गया है। आईपी के लिए, सेल लिसेट को संकेतित एंटीबॉडी या संबंधित जीजी के साथ 4 सी पर रातभर में श्योरबीड्सटीएम प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों के साथ इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड किया गया था। 500 mM NaCl युक्त एक पूर्व-लाइसिस बफर के साथ धोने के बाद, मोतियों को लोडिंग बफर में उबाला गया था और इम्यूनोब्लॉटिंग (वान एट अल।

FRET परख

KIM1 और SARS-CoV-2-RBD के बीच इंट्रासेल्युलर इंटरैक्शन को एक मानक FRET-आधारित परख (Karpova and McNally, 2006) द्वारा KIM1-CFP और SARS-CoV-2-RBD-YFP का उपयोग करके पता लगाया गया था। संक्षेप में, KIM1-CFP या KIM1 Alg V-CFP को व्यक्त करने वाले स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लास्मिड सार्स-कोव-2-RBD-YFP के साथ-293T कोशिकाओं में सह-संक्रमित थे। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर-आधारित पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को एकत्र किया गया था और अभिकर्मक के बाद 24h पर झूठ बोला गया था, और लीसेट को तरंग दैर्ध्य स्कैन (500-600nm) और समय स्कैन (435/527 एनएम, उत्तेजना / उत्सर्जन) के माध्यम से एफ -2700 प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (हिताची) द्वारा पता लगाया गया था। कॉन्फोकल-आधारित पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को उच्च शक्ति उद्देश्य लेंस (40×) (सीएफपी चैनल: 435/485 एनएम, उत्तेजना / उत्सर्जन) के तहत एक लीका टीसीएस एसपी 8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था; YFP चैनल: 485/527nm, उत्तेजना / उत्सर्जन; FRET चैनल: 435/527 एनएम, उत्तेजना / उत्सर्जन) (ली एट अल, 2020b)। असंयुग्मित सीएफपी और वाईएफपी के सह-रूपांतरण को वर्णित के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था (कार्पोवा और मैकनेली, 2006)। KIM1 और इसके लिगैंड TIM4 के बीच बातचीत एक सकारात्मक नियंत्रण (Rong et al, 2011) के रूप में FRET परख द्वारा पता लगाया गया था।

CRISPR-Cas9-KIM1 के मध्यस्थता नॉकआउट

जीनोम इंजीनियरिंग के लिए CRISPR-Cas9-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग वर्णित के रूप में किया गया था (झांग एट अल। KIM1 के लिए गाइड आरएनए लक्ष्य अनुक्रम प्रदान किए गए हैं (अनुपूरक तालिका S4)।

FITC लेबलिंग और confocal माइक्रोस्कोपी

FITC लेबल के रूप में हम पहले वर्णित किया गया था (ली एट अल, 2020b; झांग एट अल., 2020)। संक्षेप में, सार्स-कोव-2-आरबीडी को रातभर एफआईटीसी (दाढ़ अनुपात 1: 5) के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और फिर प्रतिक्रिया को रोकने और अप्रभावित FITC को बुझाने के लिए 5 mM NHCl जोड़ा गया था। समाधान को दो बार डायलिज़ किया गया था और आगे के उपयोग के लिए लायोफिलाइज़ किया गया था।

HEK293T कोशिकाओं (5×109) या HK-2 कोशिकाओं (1×107) को मुफ्त FITC या FITC-SARS-CoV-2-RBD (2 के लिए 100μg / ml) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। पेप्टाइड-आधारित आंतरिककरण assays के लिए, AP1 या AP2 (50μM) को FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 μg / m) के साथ सह-जोड़ा गया था। 4% (डब्ल्यू / वी) फॉर्मेल्डिहाइड के साथ फिक्स-इंग के बाद, सेल झिल्ली को एलेक्स आटा 594 लेबल वाले फालोइडिन (2μg / एमएल) के साथ दाग दिया गया था, और नाभिक को डीएपीआई (1μg / m) द्वारा दाग दिया गया था, और फिर एक Leica TCS SP8 confocal माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। प्रत्येक समूह के लिए, एक उच्च शक्ति उद्देश्य लेंस (64×) के तहत पांच क्षेत्रों से कम से कम 100 कोशिकाओं को मूल्यांकन में शामिल किया गया था। प्रतिनिधि छवियों को प्रस्तुत किया गया था। छवियों का परिमाणीकरण ImageJ1.8.0 द्वारा आयोजित किया गया था।

सेल व्यवहार्यता assays

कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 3000-4000 कोशिकाओं पर चढ़ाया गया था। 80% संगम पर, सार्स-कोव-2-आरबीडी (100 μg / ml) के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं को AP1 या AP2 (10,50,100 μM) के साथ या बिना इलाज किया गया था। उसके बाद, 10μl एमटीटी (5 मिलीग्राम / एमएल प्रत्येक में जोड़ा गया था)

अच्छी तरह से 4h के लिए, माध्यम हटा दिया गया था, और DMSO जोड़ा गया था. 490nm पर मापा absorbance संबंधित नियंत्रण समूह के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा को माध्य±एसडी के रूप में व्यक्त किया गया था। महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन दो-पूंछ वाले छात्र के परीक्षण द्वारा किया गया था। एक दो तरफा P-मान<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">