Herba Cistanche से फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड हाइपोक्सिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में सुधार करते हैं और ऑक्सिप्लिप्टिन के प्रभाव को बढ़ाते हैं

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लाइमेई वेन1,2*, जूनपिंग एचयू1*, जियावेई झांग1 और जियानहुआ यांग1,2

सार।लिवर कैंसर सबसे आम प्रकार के घातक ट्यूमर में से एक है और इसकी विशेषता उच्च घातकता, तेजी से प्रगति, उच्च रुग्णता और मृत्यु दर है। ऑक्सिप्लिप्टिन (OXA) को सहनीय विषाक्तता के साथ उन्नत यकृत कैंसर के खिलाफ उल्लेखनीय दक्षता की सूचना मिली है। ठोस ट्यूमर में, हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट एपिथेलियल-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) को बढ़ावा देता है, जो प्लैटिनम दवाओं के लिए यकृत कैंसर के दवा प्रतिरोध को भी प्रेरित कर सकता है। Herba Cistanche (Cistanche tubulosa) का उपयोग अक्सर पारंपरिक चीनी चिकित्सा में किया जाता है और Herba Cistanche (CPhGs) से फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड प्रमुख सक्रिय घटक हैं। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य लीवर कैंसर कोशिकाओं की व्यवहार्यता, एपोप्टोसिस, प्रवास और आक्रमण पर सीपीएचजी के प्रभावों की जांच करना है। HepG2 लीवर कैंसर कोशिकाओं को नियंत्रण में विभाजित किया गया था, DMSO, CoCl2, OXA, OXA plus CoCl2and CPhGs plus OXA plus CoCl2 समूह। इसके बाद, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल फैक्टर 1 (एचआईएफ -1), लाइसिल ऑक्सीडेज-जैसे 2 (एलओएक्सएल 2), और ईएमटी-संबंधित जीन और प्रोटीन (यानी, ई) की अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया गया था। कैडरिन और ट्विस्ट), ताकि लीवर कैंसर पर सीपीएचजी के प्रभावों की जांच की जा सके। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि CPhGs लीवर कैंसर पर OXA के प्रभाव को बढ़ा सकते हैं, और लीवर कैंसर कोशिकाओं के प्रवास, आक्रमण और एपोप्टोटिक दर को रोक सकते हैं। इसके अतिरिक्त, CPhGs उपचार ने HIF-1, LOXL2 और ट्विस्ट के डाउनरेगुलेशन और E-Cadherin के अपग्रेडेशन को प्रभावी ढंग से प्रेरित किया। वर्तमान निष्कर्षों ने संकेत दिया कि CPhGs ने OXA के प्रति संवेदनशीलता में उल्लेखनीय वृद्धि की और HIF-1 सिग्नलिंग मार्ग को बाधित करके यकृत कैंसर में हाइपोक्सिया-प्रेरित EMT के दमन को ट्रिगर किया। इसलिए, CPhGs को एक प्रभावी प्लैटिनम ड्रग सेंसिटाइज़र माना जा सकता है, जो लीवर कैंसर के रोगियों में कीमोथेराप्यूटिक प्रभावकारिता में सुधार कर सकता है।

सिस्टैंचसकता हैकीमोथेरेपी प्रभावकारिता में सुधारयकृत कैंसर के रोगियों में।

परिचय

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 2030 तक लीवर कैंसर से संबंधित मौतें, और नए पुष्ट मामलों में, मुख्य भूमि चीन में 46.6 प्रतिशत मामले होंगे।

ऑक्सिप्लिप्टिन (OXA) को क्लिनिकल सेटिंग्स में सहनीय विषाक्तता के साथ लीवर कैंसर के विकास पर निरोधात्मक प्रभाव डालने के लिए सूचित किया गया है। फिर भी, प्लैटिनम-आधारित ड्रग थेरेपी की समग्र दक्षता ट्यूमर सेल प्रतिरोध (4) से बाधित होती है। यह सर्वविदित है कि लीवर कैंसर अन्य प्रकार के कैंसर की तुलना में कीमोथेरेपी के प्रति कम संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है। यकृत कैंसर के बहुऔषध प्रतिरोध ने कई चिकित्सीय एजेंटों के प्रतिरोध में योगदान दिया है (5)। पिछले अध्ययन में, Xie और Zhong (6) ने बताया कि HepG2 कोशिकाओं ने हाइपोक्सिक परिस्थितियों में एड्रियामाइसिन, 5-फ्लूरोरासिल और सिस्प्लैटिन के प्रति खराब संवेदनशीलता प्रदर्शित की। इस तथ्य के बावजूद कि प्लैटिनम-आधारित कीमोथेरेपी एजेंट कैंसर के लिए प्रमुख उपचार विकल्प हैं, इन दवाओं का प्रतिरोध रोगियों में मौजूद है। इसके अलावा, यकृत कैंसर के रोगियों का पूर्वानुमान खराब रहता है (7,8)। आज तक, लीवर कैंसर के रोगियों में दवा प्रतिरोध की जांच करने और दवा संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए व्यापक प्रयास किए गए हैं।

हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, कैंसर कोशिकाओं में पुनरोद्धार होता है, जिससे उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) और संवहनी मिमिक्री (वीएम) हो सकती है। EMT और VM बाद में आक्रमण और दूर के मेटास्टेसिस को बढ़ावा दे सकते हैं। इसके अलावा, EMT को कैंसर की प्रगति (9) के लिए प्रेरक शक्ति के रूप में भूमिका निभाने का अनुमान लगाया गया है। इसके अलावा, हाइपोक्सिया-इंड्यूसीबल कारक (एचआईएफ) नियोवेसल गठन, ऊर्जा चयापचय, सेलुलर प्रसार, आक्रमण और मेटास्टेसिस (10) में शामिल हैं।

Lysyl oxidase (LOX) जैसा 2 (LOXL2) प्रोटीन LOX परिवार का सदस्य है और कोलेजन और इलास्टिन के सहसंयोजक क्रॉस-लिंकिंग से निकटता से संबंधित है, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रोसिस हो सकता है और बाह्य मैट्रिक्स की अखंडता के लिए महत्वपूर्ण है ( 1 1)। पिछले अध्ययन में, LOXL2 को कैंसर कोशिकाओं के मेटास्टेसिस (12) से निकटता से संबंधित माना जाता था। इसके अलावा, LOXL2 को अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर मार्गों के माध्यम से कई प्रकार के घातक कैंसर के रोगजनन और प्रगति को संशोधित करने के लिए दिखाया गया है, जो खराब रोग का निदान (13,14) के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण संकेतक थे।

Herba Cistanche एक टॉनिक जड़ी बूटी है जो आमतौर पर रेगिस्तानी क्षेत्रों में वितरित की जाती है, जिसका उपयोग अक्सर पारंपरिक चीनी चिकित्सा (15,16) में किया जाता है। सिस्टैंच ट्यूबुलोसा (सी। ट्यूबुलोसा) एक प्राकृतिक हर्बल दवा है जिसे आमतौर पर झिंजियांग स्वायत्त क्षेत्र में लगाया जाता है। Herba Cistanche (CPhGs) से फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड Herba Cistanche के प्रमुख सक्रिय घटकों में से एक के रूप में कार्य करता है। इससे पहले, हू एट अल (17) ने संकेत दिया था कि सीपीएचजी एच 22 ट्यूमर-असर वाले चूहों में जिगर की चोट को कम कर सकते हैं और कैंसर कोशिकाओं के विकास को रोक सकते हैं। यह सुझाव दिया गया था कि अंतर्निहित तंत्र सीरम-भ्रूणप्रोटीन में कमी से संबंधित हो सकता है और चूहों में प्रतिरक्षा को बढ़ा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, CoCl2 का उपयोग करके HepG2 यकृत कैंसर कोशिकाओं के एक हाइपोक्सिक मॉडल को प्रेरित किया गया था। इस आधार पर, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत सीपीएचजी की उपस्थिति में कैंसर कोशिकाओं के प्रसार, एपोप्टोसिस, प्रवास और आक्रमण पर ओएक्सए के प्रभावों की जांच करना है। इसके अलावा, HIF-1, LOXL2, E-Cadherin और Twist के mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाया गया। इसके अलावा, लीवर कैंसर के रोगजनन पर सीपीएचजी के प्रभावों के अंतर्निहित सटीक तंत्र की जांच की गई।

सामग्री और तरीके

कोशिका की परत।

लीवर कैंसर सेल लाइन HepG2, जैसा कि एसटीआर विधि का उपयोग करके पहचाना गया है, को क्लिनिकल रिसर्च इंस्टीट्यूशन, झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी (उरुमकी, चीन) के पहले संबद्ध अस्पताल द्वारा प्रदान किया गया था। कोशिकाओं को उच्च ग्लूकोज DMEM (HyClone; Cytiva) में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS; Hyclone; Cytiva) में 37˚C पर 5 प्रतिशत CO2 युक्त एक इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया गया था।

सीपीएचजी की तैयारी।

C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. The content of CPhGs was >80 प्रतिशत, जिसमें इचिनाकोसाइड और वर्बस्कोस की सामग्री क्रमशः 44.5 और 16.1 प्रतिशत थी। सी. ट्यूबुलोसा (श्रेन्क) वाइट के तने अक्टूबर 2016 में चीन के शिनजियांग से एकत्र किए गए थे। पौधे की पहचान डॉ. जुनपिंग हू ने की थी। ये सभी वाउचर नमूने (नंबर 201610) प्लांट हर्बेरियम, स्कूल ऑफ फार्मेसी, झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी, झिंजियांग, चीन में जमा किए गए हैं।

कॉस्टांचेनिचोड़सेहेटियन डिचेन बायोटेक कं, लिमिटेड

प्रयोगात्मक परिरूप।

HepG2 कोशिकाओं (5x104/ml) को CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 और 500 µg/ml) के विभिन्न सांद्रणों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस (बोने के बाद 24 घंटे) पर 48 घंटे के लिए उपचारित किया गया। स्क्रीनिंग CPhGs‑L/M/H खुराक। HepG2 कोशिकाओं (5x104/ml) को निम्नलिखित समूहों में विभाजित किया गया था: i) उच्च ग्लूकोज DMEM में सुसंस्कृत नियंत्रण समूह; ii) डीएमएसओ समूह, 0.1 प्रतिशत डीएमएसओ (v/v) में सुसंस्कृत; iii) CoCl2 समूह (हाइपोक्सिया मॉडल समूह), सीरम मुक्त DMEM में संवर्धित 100 µM CoCl2; iv) OXA समूह (सकारात्मक नियंत्रण समूह), 5 µM OXA (बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) में सुसंस्कृत; v) OXA प्लस CoCl2group, 5 µM OXA में सुसंस्कृत 100 µm CoCl2 के साथ संयुक्त; और vi) CPhGs समूह, जिन्हें CPhGs‑L/M/H (क्रमशः 25, 50 और 100 µg/ml) से उपचारित किया जाता है, 5 µM OXA और 100 µM CoCl2 के साथ संयुक्त।

सेल व्यवहार्यता परख।

सेल व्यवहार्यता निर्माता के निर्देशों (बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) और जैसा कि पहले वर्णित (18) के अनुसार सेल काउंटिंग किट -8 (CCK-8) परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। सेल (2.0x103 सेल/वेल) को 96-वेल प्लेट्स में रखा गया था। इसके बाद, बोने के बाद ~ 24 घंटे, प्रत्येक समूह में उपचार की स्थिति के अनुसार 48 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज किया गया। तब माध्यम को 100 μl उच्च-ग्लूकोज DMEM के साथ बदल दिया गया था, इसके बाद 10 μl CCK-8 अभिकर्मक को जोड़ा गया; कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। ऑप्टिकल घनत्व को 450 एनएम पर मल्टी-डिटेक्शन माइक्रोप्लेट रीडर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) का उपयोग करके मापा गया था। प्रत्येक स्थिति के लिए छह प्रतिकृति तैयार की गई थी।

एपोप्टोटिक दर का निर्धारण।

एपोप्टोटिक दर एक एनेक्सिन वी / पीआई एपोप्टोटिक डिटेक्शन किट (बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। HepG2 कोशिकाओं (5x105) को 6-वेल प्लेटों में 37˚C पर 5% CO2 में टीका लगाया गया था। इसके बाद, उपचार के बाद ~ 24 घंटे, कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए सीरम-मुक्त डीएमईएम में सुसंस्कृत किया गया। कोशिकाओं को तब 0.25 प्रतिशत ट्रिप्सिनाइज्ड (गिब्को; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) का उपयोग करके पचाया गया था, इसके बाद प्री-कूल्ड पीबीएस के साथ कम से कम तीन वॉश किए गए थे। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 167.7 xg पर सेंट्रीफ्यूजेशन पर, कोशिकाओं को 1X बाइंडिंग बफर के साथ फिर से जोड़ा गया और एकाग्रता को 1 ~ 5x106 / एमएल में समायोजित किया गया, और फिर 15 मिनट के लिए 5 μl एनेक्सिन V‑FITC और 5 μl PI के साथ दाग दिया गया। कमरे के तापमान पर। कोशिकाओं ने तब बीडी एलएसआरफोर्टेसा फ्लो साइटोमीटर (बीडी बायोसाइंसेज) और फ्लोजो 10.6.2 सॉफ्टवेयर (ट्री स्टार, इंक.) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री से गुजरना शुरू किया।

तालिका I. प्राइमर अनुक्रम

घाव भरने वाला परख।

सेल प्रवास पर सीपीएचजी के निरोधात्मक प्रभावों की जांच घाव भरने वाले परख (19) द्वारा की गई। कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से प्लेटों में तब तक रखा गया जब तक कि 1 0 0 प्रतिशत मिला हुआ मोनोलेयर प्राप्त नहीं हो गया। इसके बाद, कोशिकाओं को 200-μl पिपेट टिप का उपयोग करके घायल कर दिया गया, पीबीएस से धोया गया और सीरम-मुक्त माध्यम में उपचार के साथ ऊष्मायन किया गया। दवा उपचार के बाद, घाव भरने की गति क्रमशः 0, 12, 24 और 48 घंटे मापी गई। x10 के आवर्धन के तहत एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (Nikon Ti‑S, Japan) का उपयोग करके घाव की छवियां प्राप्त की गईं। घाव के बंद होने को प्रत्येक अवधि में घाव की दूरी से मापा जाता था और 0 घंटे पर प्रारंभिक घाव की दूरी के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता था।

ट्रांसवेल परख।

सेल आक्रमण का मूल्यांकन ट्रांसवेल assays द्वारा किया गया था। कोशिकाओं (1x105 कोशिकाओं/एमएल) को FBS के बिना 200 μl उच्च-ग्लूकोज DMEM में निलंबित कर दिया गया था। कोशिकाओं को तब एक पॉलीइथाइलीन टेरेफ्थेलेट फिल्टर झिल्ली (छिद्र आकार, 8.0 माइक्रोन) के साथ कवर किए गए मैट्रीगेल-लेपित ऊपरी कुओं पर रखा गया था। कुल 500 μl उच्च ग्लूकोज DMEM 10 प्रतिशत FBS युक्त निचले कक्ष में रखा गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के बाद फिल्टर की ऊपरी सतह पर कोशिकाओं को हटाने के लिए कपास झाड़ू का इस्तेमाल किया गया था। झिल्ली के माध्यम से आक्रमण करने वाली कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.1 प्रतिशत क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग दिया गया। x100 के आवर्धन पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (Nikon Ti‑S) के तहत हमलावर कोशिकाओं को देखा गया।

चित्रा 1. 48 घंटे के बाद HepG2 सेल व्यवहार्यता पर CPhGs के विभिन्न सांद्रता के प्रभाव।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर)।

TRIzol® अभिकर्मक (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) का उपयोग करके HepG2 कोशिकाओं से कुल RNA निकाला गया और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार PrimeScript RT अभिकर्मक किट (Takara Bio, Inc.) का उपयोग करके cDNA संश्लेषण किया गया। qPCR को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार TB ग्रीन™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) का उपयोग करके 7500 रीयल-टाइम PCR सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.) पर प्रदर्शित किया गया था। QPCR के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों को तालिका I में सूचीबद्ध किया गया है। PCR स्थितियों में 30 सेकंड के लिए 95˚C पर विकृतीकरण शामिल है, इसके बाद 5 सेकंड के लिए 95˚C पर विकृतीकरण के 40 चक्र और 30 सेकंड के लिए 60˚C पर एनीलिंग शामिल हैं। अंत में, 2‑ΔΔCq विधि (20) का उपयोग करके प्रवर्धन परिणामों का विश्लेषण किया गया।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण।

प्रोटीज और फॉस्फेटस इनहिबिटर युक्त RIPA lysis बफर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) में होमोजेनाइजेशन द्वारा 48 घंटे के लिए उपचारित कोशिकाओं से प्रोटीन निकाले गए। सेल प्रोटीन सामग्री बीसीए विधि का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। प्रोटीन (4 0 माइक्रोग्राम) को तब एसडीएस-पेज द्वारा 10 प्रतिशत जेल पर अलग किया गया और एक पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्ली को 5 प्रतिशत नॉनफैट दूध में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध किया गया था, और निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था: actin (1:5,000; cat. no. bs‑0061R; BIOSS), HIF 1 (1:1,000; बिल्ली नं। ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; बिल्ली संख्या ab179810; Abcam), ई-कैडरिन (1:1,000 ; कैट. नं. bs‑10009R; BIOSS) और Twist1 (1:500; cat. no. bs‑2441R; BIOSS) रात भर 4˚C पर। झिल्ली को तब कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एच एंड एल माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 2,000; बिल्ली संख्या ab205718; Abcam) के साथ ऊष्मायन किया गया था। टीबीएस 0.05 प्रतिशत ट्वीन -20 के साथ धोने के बाद, एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस सिस्टम (एमर्शम; साइटिवा) का उपयोग करके धमाकों की कल्पना की गई थी। ImageJ2x सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.1.4.7; रावक सॉफ्टवेयर इंक) का उपयोग करके डेंसिटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा बैंड की सापेक्ष तीव्रता को अर्ध-मात्राबद्ध किया गया था, और परिणामों के डेंसिटोमेट्रिक भूखंडों को ‑actin की तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

चित्रा 2. 48 घंटे पर HepG2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर OXA के साथ संयुक्त CPhGs के प्रभाव ।

सांख्यिकीय विश्लेषण।

डेटा विश्लेषण के लिए SPSS 19.0 सॉफ्टवेयर (SPSS, Inc.) का उपयोग किया गया था। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और एकतरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया और उसके बाद तुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट किया गया। पी<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" all="" experiments="" were="" performed="" at="" least="" in="">

परिणाम

सेल व्यवहार्यता पर CPhGs का प्रभाव।

हेपजी2 कोशिकाओं को 48 घंटे (बोने के बाद 24 घंटे) के लिए सीपीएचजी (5, 25, 50, 100, 200 और 500 माइक्रोग्राम/एमएल) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, नियंत्रण समूह (पी) की तुलना में 200 और 500 माइक्रोग्राम / एमएल सीपीएचजी के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं की व्यवहार्यता में उल्लेखनीय गिरावट आई है।<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhGs लीवर कैंसर पर OXA के प्रभाव को बढ़ाते हैं।

OXA-संग्राहक HepG2 सेल व्यवहार्यता पर CPhGs के प्रभावों का बाद में मूल्यांकन किया गया (चित्र 2)। ~ 48 घंटे के बाद, CPhGs और OXA के संयोजन ने OXA प्लस CoCl2 समूह की तुलना में HepG2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को काफी कम कर दिया। विशेष रूप से, CPhGs‑M प्लस OXA प्लस CoCl2 और CPhGs‑H प्लस OXA प्लस CoCl2 ने OXA प्लस CoCl2 समूह (P) की तुलना में HepG2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया।<0.05 and=""><0.01,>

चित्रा 3. 48 घंटे में हेपजी 2 कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण पर ओएक्सए के साथ संयुक्त सीपीएचजी के निरोधात्मक प्रभाव।

CPhGs लीवर कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण को रोकता है।

CPhGs और OXA के साथ उपचार के बाद लीवर कैंसर कोशिकाओं की आक्रामक क्षमता और प्रवासी क्षमता का और अध्ययन करने के लिए, घाव भरने और ट्रांसवेल assays का प्रदर्शन किया गया। घाव भरने वाले परख ने संकेत दिया कि, DMSO समूह की तुलना में, CoCl2, OXA, और CPhGs (200 या 500 µg/ml) (P) के साथ उपचार के बाद HepG2 कोशिकाओं का प्रवासन कम हो गया था।<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" were="" markedly="">

एपोप्टोसिस पर सीपीएचजी और ओएक्सए का प्रभाव।

48 घंटे के लिए CPhGs और OXA के संयोजन के साथ उपचार के बाद, HepG2 कोशिकाओं को एनेक्सिन V‑FITC और PI के साथ दाग दिया गया, इसके बाद सेलुलर एपोप्टोसिस का निर्धारण करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया गया। जैसा कि चित्र 4A में दिखाया गया है, सह-उपचार समूहों (CPhGs-L/M/H plus OXA plus CoCl2) ने CPhGs की सांद्रता में वृद्धि के साथ एपोप्टोटिक कोशिकाओं के अनुपात में क्रमिक उन्नयन प्रदर्शित किया। CPhGs और OXA से उपचारित अधिकांश कोशिकाएँ Q4 क्षेत्र में स्थानीयकृत थीं, जिसने संकेत दिया कि CPhGs और OXA के संयोजन ने प्रारंभिक अवस्था में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया। OXA प्लस CoCl2 समूह की तुलना में, OXA, CoCl2 और CPhGs (P) की मध्यम या उच्च खुराक के साथ इलाज किए गए समूहों में कोशिकाओं की एपोप्टोटिक दर में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला था।<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

CPhGs और OXA सह-ऊष्मायन के बाद HIF-1, LOXL2, E-Cadherin और ट्विस्ट के mRNA अभिव्यक्ति स्तर।

There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; अंजीर। 5A‑D)। इसके विपरीत, CoCl2 ने DMSO समूह (P) की तुलना में LOXL2, HIF-1 और ट्विस्ट के mRNA अभिव्यक्ति स्तरों में उल्लेखनीय वृद्धि को प्रेरित किया।<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

चित्रा 4. 48 घंटे में एपोप्टोटिक हेपजी2 कोशिकाओं के प्रतिशत पर ओएक्सए के साथ संयुक्त सीपीएचजी का प्रभाव, जैसा कि एनेक्सिन-वी/पीआई डबल धुंधला द्वारा निर्धारित किया गया है।

CPhGs और OXA सह-ऊष्मायन के बाद HIF-1, LOXL2, E-Cadherin, और ट्विस्ट के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर। पश्चिमी सोख्ता के परिणामों से पता चला कि HIF-1, LOXL2 और ट्विस्ट के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर को DMSO समूह की तुलना में हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत अपग्रेड किया गया था। इसके विपरीत, E-Cadherin के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर को हाइपोक्सिक स्थितियों (P .) के तहत डाउनग्रेड किया गया था<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" the="" dmso="" group,="" the="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" induced="" by="">

सिस्टैंच कोलेस्ट्रॉल को कम करता है

बहस

हाइपोक्सिया कैंसर माइक्रोएन्वायरमेंट में एक सामान्य विशेषता है; यह मुख्य रूप से इस तथ्य से जुड़ा है कि कैंसर कोशिकाओं का प्रसार असामान्य नववाहिकाओं के संवहनी गठन की तुलना में अधिक तेजी से होता है। इसके अलावा, प्रसार, मेटास्टेसिस और दवा संवेदनशीलता सहित अन्य जैविक प्रक्रियाएं हाइपोक्सिया (21) से प्रभावित होती हैं। ट्यूमर हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट कैंसर के रोगजनन और प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है, और यह दवा प्रतिरोध और यकृत कैंसर (22) के संवहनीकरण में भी महत्वपूर्ण है।

वर्तमान अध्ययन में, हेपजी2 कोशिकाओं को सीपीएचजी की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, जिनमें से सीपीएचजी (200 माइक्रोग्राम/एमएल) सेल व्यवहार्यता में कमी को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित कर सकते हैं। विशेष रूप से, CPhG एक खुराक पर निर्भर तरीके से सेलुलर व्यवहार्यता को संशोधित कर सकते हैं। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, ओएक्सए और सीपीएचजी (50 या 100 माइक्रोग्राम / एमएल) के संयोजन ने अकेले ओएक्सए उपचार की तुलना में हेपजी 2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को काफी बाधित किया। इसी तरह की खुराक पर निर्भर प्रवृत्ति यकृत कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण assays में देखी गई थी। वर्तमान में, यकृत रोग (23-26) के रोगजनन में कैंसर कोशिका एपोप्टोसिस की भूमिकाओं की जांच के लिए व्यापक अध्ययन किए गए हैं। एपोप्टोसिस (27-29) को बढ़ावा देकर लीवर कैंसर के इलाज के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं; इसलिए, हेपजी2 सेल एपोप्टोसिस में हस्तक्षेप लीवर कैंसर की रोकथाम और उपचार के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार के रूप में काम कर सकता है। अकेले OXA से उपचारित कोशिकाओं की तुलना में CPhGs‑M / ‑H और OXA के संयोजन के साथ उपचार के बाद HepG2 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस में काफी वृद्धि हुई थी। इसलिए, यह संकेत दिया गया था कि CPhGs OXA के ट्यूमर-विरोधी प्रभावों को काफी बढ़ा सकते हैं।

HIF-1, E-Cadherin, N-Cadherin, और Vimentin के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ-साथ Snail1/2, Zeb1 और Twist1 जैसे कुछ ट्रांसक्रिप्शन कारकों को भी अपग्रेड कर सकता है। इसके बाद, इससे सेलुलर ध्रुवीयता का नुकसान हो सकता है, सेल-सेल जंक्शनों का ढीला होना, साइटोस्केलेटल प्रोटीन में परिवर्तन, और कैंसर कोशिकाओं का प्रवास और आक्रमण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बेसिलर झिल्ली के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं को संचार प्रणाली में स्थानांतरित किया जा सकता है। और बाद में मेटास्टेसिस (30)। वर्तमान अध्ययन में, CoCl2 का उपयोग हाइपोक्सिया के एक मॉडल को प्रेरित करने के लिए किया गया था, जिससे HepG2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता में वृद्धि हुई, साथ ही साथ सेल प्रवास और आक्रमण भी हुआ। इसके अलावा, HIF-1 के mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी, जो दर्शाता है कि CoCl2 ने हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट की पीढ़ी को प्रेरित किया। CPhGs और OXA के संयोजन के साथ उपचार ने हाइपोक्सिया से प्रेरित HIF-1 के mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों को स्पष्ट रूप से बाधित किया। इन निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि CPhG एक खुराक पर निर्भर तरीके से लीवर कैंसर के सूक्ष्म वातावरण को कम कर सकते हैं।

E-Cadherin एक Ca2 प्लस-निर्भर आसंजन अणु है, जिसकी कोशिका-कोशिका आसंजन, ऊतक संरचना की अखंडता के रखरखाव और सिग्नलिंग ट्रांसमिशन में महत्वपूर्ण भूमिका होती है। डाउनरेगुलेशन या आसंजन समारोह के नुकसान के मामलों में, कैंसर कोशिकाएं अनियंत्रित प्रसार और समर्पण का प्रदर्शन कर सकती हैं, जो कैंसर कोशिकाओं के बढ़ते आक्रमण और बाद में मेटास्टेसिस को बढ़ावा दे सकती हैं (31)। इसके अलावा, ई-कैडरिन कैंसर कोशिकाओं के ईएमटी को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, जो कि कई उपकला विकृतियों के भेदभाव, आक्रमण, मेटास्टेसिस और रोग का निदान के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। EMT- उत्प्रेरण प्रतिलेखन कारक (EMT-TFs), जैसे कि ट्विस्ट, घोंघा और Zeb, EMT के लिए महत्वपूर्ण हैं। हाइपोक्सिया को सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करने के लिए सूचित किया गया है जो ईएमटी-टीएफ अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है; विशेष रूप से, यह इन कारकों (32) के ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण के माध्यम से सीधे ईएमटी को बढ़ावा दे सकता है। ट्विस्ट एक अत्यधिक संरक्षित हेलिक्स-रिंग-हेलिक्स ट्रांसक्रिप्शन कारक है जिसे हाल के वर्षों में पहचाना गया है। कई प्रकार की कैंसर कोशिकाओं (33) में हाई ट्विस्ट एक्सप्रेशन का पता चला है। इसलिए, ट्विस्ट अभिव्यक्ति और कैंसर कोशिकाओं के प्रवास या मेटास्टेसिस के साथ-साथ नैदानिक ​​​​रोकथाम और मेटास्टेसिस (34) के उपचार के बीच संबंध की जांच करना आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन में, यह पता चला था कि ई-कैडरिन के एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर हाइपोक्सिया की उपस्थिति में डाउनग्रेड किए गए थे, जबकि ट्विस्ट के एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर ऊंचे थे। ये निष्कर्ष आक्रमण और प्रवासन assays के परिणामों के अनुरूप थे, जिसका अर्थ था कि हाइपोक्सिया EMT की घटना में योगदान कर सकता है। ओएक्सए के साथ उपचार के बाद, ई-कैडरिन के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर को डाउनग्रेड किया गया था; इसने संकेत दिया कि ओएक्सए ने यकृत कैंसर कोशिकाओं के विकास को रोकने में खराब दक्षता का प्रदर्शन किया, जबकि यह ईएमटी को बढ़ावा दे सकता है। हालांकि, CPhGs के संयोजन में, OXA के लिए HepG2 कोशिकाओं की संवेदनशीलता ने हाइपोक्सिया की उपस्थिति में उल्लेखनीय सुधार प्रदर्शित किया। इसके अलावा, CPhGs और OXA के साथ सह-उपचार सेलुलर व्यवहार्यता, प्रवासन और HepG2 कोशिकाओं के आक्रमण को रोक सकता है। वर्तमान अध्ययन ने केवल ट्विस्ट और ई-कैडरिन अभिव्यक्ति का पता लगाया; इसलिए, भविष्य के अध्ययनों का उद्देश्य लीवर कैंसर में हाइपोक्सिया-प्रेरित ईएमटी पर सीपीएचजी के निरोधात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अधिक ईएमटी-संबंधित मार्करों पर ध्यान केंद्रित करना है।

HIF-1 को LOXL2 की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने और यकृत कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है, जो कि यकृत कैंसर (30) के खराब रोग से निकटता से संबंधित हो सकता है। पिछले अध्ययन में, कैंसर के ऊतकों (35) की तुलना में आसन्न यकृत कैंसर के ऊतकों में LOXL2 के अभिव्यक्ति स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, यह यकृत कैंसर के आक्रमण और मेटास्टेसिस से निकटता से संबंधित था। छोटे हस्तक्षेप आरएनए द्वारा LOXL2 जीन साइलेंसिंग ने HepG2 और SMCC-7721 कोशिकाओं के प्रसार को रोक दिया, जिसके परिणामस्वरूप कैंसर कोशिकाओं की कोशिका चक्र गिरफ्तारी हुई और एपोप्टोसिस (36) में वृद्धि हुई। शाओ एट अल (35) ने लीवर कैंसर के नमूनों में LOXL2 के बीच सहसंबंध की जांच की, क्लिनिकोपैथोलॉजिकल कारक, वीएम, और 201 मामलों में रोग का निदान, जो उपचार के लिए सर्जरी प्राप्त करते थे। यह अनुमान लगाया गया था कि LOXL2 ने यकृत कैंसर के रोगजनन और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जो दवा विकास के लक्ष्य के रूप में काम कर सकता है। इसके अलावा, पेंग एट अल (37) ने प्रदर्शित किया कि LOXL2 घोंघा / ई-कैडरिन और एसआरसी किनसे / फोकल आसंजन किनसे सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय कर सकता है, जो गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं के ईएमटी के रोगजनन और प्रगति में योगदान कर सकता है। वर्तमान अध्ययन में, हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, LOXL2 के mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि हुई थी, जबकि OXA के साथ उपचार के बाद इसकी अभिव्यक्ति को डाउनग्रेड किया गया था। इसके अलावा, CPhGs और OXA के संयोजन के साथ उपचार के परिणामस्वरूप LOXL2 अभिव्यक्ति में स्पष्ट गिरावट आई है, जो लीवर कैंसर पर OXA के एंटीट्यूमर प्रभाव को प्रभावी ढंग से सहायता कर सकती है।

कॉस्टांचेप्रभावी रूप सेएंटीट्यूमर प्रभाव में मदद करता हैकालीवर कैंसर पर OXA.

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वर्तमान अध्ययन की कुछ सीमाएँ हैं। वर्तमान अध्ययन में SMCC-7721 सेल लाइन सहित दो और लीवर कैंसर सेल लाइनों का उपयोग किया जाना चाहिए था, लेकिन इनका उपयोग नहीं किया जा सकता था क्योंकि इन सेल लाइनों को खरीदना संभव नहीं था क्योंकि उन्हें गलत पहचान लिया गया था और वे हेला कोशिकाओं से प्राप्त हुए थे। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन ने कोशिकाओं में सीपीएचजी के विभिन्न सांद्रता के एंटीऑक्सीडेंट प्रभावों का विश्लेषण नहीं किया।

अंत में, CPhGs HIF-1 सिग्नलिंग मार्ग को संशोधित करके यकृत कैंसर कोशिकाओं के हाइपोक्सिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को वैकल्पिक कर सकते हैं। इसके अलावा, सीपीएचजी और ओएक्सए के संयोजन के साथ उपचार के जवाब में ओएक्सए के लिए यकृत कैंसर कोशिकाओं की संवेदनशीलता काफी बढ़ गई थी। ये निष्कर्ष लीवर कैंसर की कीमोथेरेपी के प्रति संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए एक नई उपचार रणनीति प्रदान कर सकते हैं।