व्हाइटनिंग कॉस्मेटिक्स का एक बड़ा बाजार स्तर और व्यापक विकास संभावनाएं हैं, जबकि पारंपरिक चीनी दवाओं के व्हाइटनिंग उत्पाद हमेशा एक शोध आकर्षण का केंद्र रहे हैं। इस अध्ययन में, प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम (PGE) के व्हाइटनिंग एक्टिव एक्सट्रेक्ट को पहली बार अलग और शुद्ध किया गया था, और PGE की व्हाइटनिंग गतिविधि तंत्र और रासायनिक संरचना को स्पष्ट किया गया था। उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-एमएस) विश्लेषण के माध्यम से कुल 45 घटकों की पहचान की गई, जिसमें अर्बुटिन, सिरिंजिन, क्लोरोजेनिक एसिड, ग्लाइकोसाइड ई, प्लैटाइकोडिन डी3, बायिकलिन, प्लैटाइकोडिन डी, ल्यूटोलिन शामिल हैं। डीपीपीएच और एबीटीएस मुक्त कणों की ओर पीजीई की मैला ढोने की दर क्रमशः 98.03 प्रतिशत और 84.30 प्रतिशत थी। टाइरोसिनेस की ओर पीजीई की अवरोध दर 97.71 प्रतिशत तक थी। PGE का लिपोपॉलेसेकेराइड (LPS) द्वारा उत्तेजित RAW264.7 मैक्रोफेज पर महत्वपूर्ण विरोधी भड़काऊ प्रभाव था और a-MSH द्वारा प्रेरित B16F10 कोशिकाओं के टायरोसिनेस और मेलेनिन पीढ़ी पर महत्वपूर्ण निषेधात्मक प्रभाव था। परिणामों से पता चला कि PGE ने टायरोसिनेस, एंटीऑक्सीडेशन, एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभाव, एंजाइम गतिविधि और मेलेनिन पीढ़ी पर ऑक्सीजन मुक्त कणों की सक्रियता को रोककर एक सहक्रियात्मक श्वेत प्रभाव प्राप्त किया। प्राकृतिक पौधों से निकाले गए वाइटनिंग एजेंट के रूप में, PGE में प्लांट वाइटनिंग कॉस्मेटिक्स के शोध और विकास की उत्कृष्ट क्षमता है, जो प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम संसाधनों के आगे विकास और उपयोग के लिए एक नींव रखता है और हरे और जैविक वाइटनिंग कॉस्मेटिक्स के विकास के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान करता है।
प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार,धनियाएक आम जड़ी बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइडजिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसेएंटीऑक्सिडेंट, aविरोधी भड़काऊ, और प्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना। सिस्टंच और के बीच का तंत्रत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालासिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित है। मानव त्वचा में मेलेनिन द्वारा उत्प्रेरित टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता हैटायरोसिनेस, और ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। Cistanche में cistanoside होता है, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना।
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1 परिचय
वैश्विक सौंदर्य उद्योग में, कई प्रकार के वाइटनिंग कार्यात्मक सौंदर्य प्रसाधन हैं, और बाजार में हिस्सेदारी के और बढ़ने की उम्मीद है। कॉस्मेटिक योगों को गोरा करने और त्वचा को गोरा करने वाले प्रभाव को प्राप्त करने के लिए त्वचा को गोरा करने वाले एजेंटों की बढ़ती मांग को पूरा करने के लिए, कॉस्मेटिक उद्योग ने हाइड्रोक्विनोन, सिस्टीन, ग्लूटाथियोन, विटामिन ए और ग्लूकोकार्टिकोइड सहित कई रासायनिक योजक पेश किए हैं। इन यौगिकों का अच्छा श्वेत प्रभाव होता है; हालाँकि, उनमें से कुछ के जहरीले दुष्प्रभाव हैं; उदाहरण के लिए, "रोडोडेंड्रोन" उपयोगकर्ता की त्वचा में सफेद धब्बे का कारण बनता है, 1 "हाइड्रोक्विनोन" में साइटोटॉक्सिक और म्यूटाजेनिक गुण होते हैं, 2 "ग्लूकोकॉर्टिकॉइड" हार्मोन-निर्भर डर्मेटाइटिस का कारण बन सकता है। 3 वर्तमान में, इन सामग्रियों (रोडोडेंड्रॉन, हाइड्रोक्विनोन, ग्लूकोकार्टिकोइड) के अतिरिक्त ) सौंदर्य प्रसाधनों की अनुमति नहीं है। उत्पाद का प्रभाव एकमात्र मानक नहीं है जिसे उपभोक्ता सौंदर्य प्रसाधन खरीदते समय मानता है। हाल के वर्षों में, स्वास्थ्य की खोज में कॉस्मेटिक उत्पाद सुरक्षा समस्याओं का लगातार विस्फोट हुआ है। शोधकर्ताओं ने पाया है कि प्राकृतिक जड़ी-बूटियों से निकाले गए सक्रिय पदार्थ कम विषैले होते हैं और इनके बहुत कम दुष्प्रभाव होते हैं। उपभोक्ताओं की बढ़ती संख्या उत्पाद सुरक्षा को महत्व देती है। इसके अलावा, हरे, पर्यावरण के अनुकूल और जैविक उत्पाद अधिक लोकप्रिय हो गए हैं, जैसा कि कई डायरेक्ट-सेलिंग ब्रांडों के प्रचार से परिलक्षित होता है। इसलिए, आधुनिक विकास में सुरक्षित और स्वस्थ सफेदी वाली त्वचा देखभाल सामग्री का अनुसंधान और खोज एक प्रवृत्ति बन गई है। सौंदर्य प्रसाधनों में कच्चे माल के रूप में प्राकृतिक पौधों से चीनी हर्बल अर्क को लागू करना धीरे-धीरे सफेदी और त्वचा की देखभाल करने वाले उत्पादों के विकास में एक शोध केंद्र बन गया है।4
प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम, एक पारंपरिक चीनी औषधीय सामग्री है, जिसका उपयोग चीन में 2000 से अधिक वर्षों से किया जा रहा है। सबसे पुराने रिकॉर्ड को "शेनॉन्ग हर्बल क्लासिक" में वापस देखा जा सकता है। प्लैटाइकोडोन ग्रैंडियोस की पारंपरिक औषधीय कार्रवाई खांसी और कफ को कम करने के लिए है। प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम में सैपोनिन, रास्ते, फेनोलिक एसिड, स्टेरोल और पॉलीसेकेराइड होते हैं। 6–8 रासायनिक घटकों की जटिलता और विविधता उनकी जैविक गतिविधियों की विविधता निर्धारित करती है। 9 आधुनिक औषधीय अनुसंधान से पता चला है कि प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम में विरोधी भड़काऊ, बैक्टीरियोस्टेटिक, विरोधी है। -ट्यूमर, एंटी-ऑक्सीडेशन, प्रतिरक्षा-विनियमन, और अन्य औषधीय प्रभाव। 10,11 कोरिया और उत्तरी चीन में, प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम का व्यापक रूप से भोजन और सौंदर्य प्रसाधनों में कच्चे माल के रूप में उपयोग किया जाता है। प्लैटाइकोडोन ग्रैंडीफ्लोरम कच्चे माल से बने कॉस्मेटिक्स, जैसे व्हाइटनिंग एसेंस, व्हाइटनिंग मिल्क, और व्हाइटनिंग शॉवर जेल, कोरिया, जापान और अन्य एशिया देशों में उपभोक्ताओं द्वारा पसंद किए जाते हैं। 12 प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के अर्क को अंतरराष्ट्रीय कॉस्मेटिक रॉ में भी सूचीबद्ध किया गया है। सामग्री सूची। 13 हालांकि, प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के श्वेत सक्रिय तत्व और क्रिया तंत्र अभी भी अस्पष्ट हैं, और इसकी श्वेत गतिविधि पर कुछ प्रारंभिक अध्ययन किए गए हैं। गोंग एक्सजे एट अल। विभिन्न चीनी जड़ी बूटियों के टाइरोसिनेज निरोधात्मक गतिविधियों की तुलना की और पाया कि प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम का सबसे मजबूत निरोधात्मक प्रभाव था। 14 इस आधार पर, जू बीजे एट अल। टाइरोसिनेस निषेध प्रयोग के माध्यम से प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के प्रभावी घटक के श्वेत प्रभाव का मूल्यांकन किया और पाया कि प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम का प्रभावी घटक संभवतः कुल सैपोनिन सामग्री थी। , हमने अनुसंधान वस्तु के रूप में फार्माकोडायनामिक ट्रैकिंग विधि के माध्यम से प्राप्त प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के व्हाइटनिंग सक्रिय अर्क का उपयोग किया। गतिविधि और घटकों का अध्ययन करके, हम प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के वाइटनिंग सक्रिय पदार्थों की संरचना को स्पष्ट करते हैं और प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के वाइटनिंग सक्रिय पदार्थों के वाइटनिंग तंत्र का पता लगाते हैं। यह अध्ययन वाइटनिंग कॉस्मेटिक्स के लिए कच्चे माल के रूप में प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के बेहतर उपयोग के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान करेगा।
त्वचा को गोरा करने वाले प्रभावों में त्वचा में मेलेनिन उत्पादन में कमी शामिल है। मेलेनिन त्वचा और बालों के रंगों को नियंत्रित करने वाला मुख्य वर्णक है। यह जानवरों और पौधों में व्यापक रूप से वितरित एक उच्च-आणविक यौगिक है। जब अत्यधिक मेलेनिन का उत्पादन होता है, तो मेलेनिन त्वचा में जमा हो जाता है, जिससे धब्बे और झाइयां बन जाती हैं, जिससे गंभीर त्वचा कैंसर हो सकता है। 16 इसलिए, अत्यधिक त्वचा रंजकता को रोकने के लिए, मेलेनिन उत्पादन को रोकना आवश्यक है। मेलेनोसाइट्स एपिडर्मल बेसल परत में स्थित हैं और टाइरोसिनेस द्वारा नियंत्रित होते हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां टायरोसिनेज गतिविधि को सक्रिय करती हैं, और टायरोसिनेज डीओपीए क्विनोन का उत्पादन करने के लिए 3, 4- डायहाइड्रॉक्सीफेनिलएलानिन (डीओपीए) को उत्प्रेरित करता है और फिर ऑटोऑक्सीडेशन और एंजाइम प्रतिक्रिया के माध्यम से मेलेनिन का उत्पादन करने के लिए डीओपीए क्विनोन को उत्प्रेरित करता है। इसलिए, टायरोसिनेज और मेलानोसाइट प्रसार का अवरोध मेलेनिन उत्पादन को महत्वपूर्ण रूप से रोक सकता है। 17 इसके अलावा, अच्छे एंटीऑक्सीडेटिव और एंटी-भड़काऊ प्रभाव ऑक्सीकरण और त्वचा की सूजन के कारण होने वाले नुकसान को कम कर सकते हैं, त्वचा की उम्र बढ़ने में देरी कर सकते हैं, और त्वचा को लोचदार और चिकनी रख सकते हैं और इस प्रकार एक सिनर्जिस्टिक व्हाइटनिंग प्रभाव डालें। 18,19
इसलिए, वाइटनिंग, एंटीऑक्सीडेटिव और एंटी-इंफ्लेमेटरी गुणों के साथ प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम से एक प्राकृतिक सक्रिय अर्क खोजने के लिए, यह अध्ययन मुख्य रूप से प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम एक्सट्रैक्ट (PGE) के टाइरोसिनेस निषेध, इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस निषेध और सेल की निरोधात्मक गतिविधि पर ध्यान केंद्रित करता है। मेलेनिन पीढ़ी। अध्ययन का उद्देश्य टाइरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन पीढ़ी पर PGE के निरोधात्मक प्रभाव का विश्लेषण करना और PGE के सफेदी और त्वचा की देखभाल के प्रभाव और इसके एंटीऑक्सिडेंट और विरोधी भड़काऊ प्रभावों का व्यापक मूल्यांकन करना है। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) और तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के माध्यम से पीजीई की रासायनिक संरचना की पहचान और विश्लेषण किया गया था, और पीजीई की विशिष्ट श्वेत सक्रिय सामग्री को स्पष्ट किया गया था। नए प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम उत्पादों को विकसित करना और प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम उद्योग के विकास को बढ़ावा देना महत्वपूर्ण है।
2। सामग्री और विधि
2.1। सामग्री
फॉर्मिक एसिड, मेथनॉल, 2, 2- डाइफेनिल -1- पिक्रिलहाइड्रैज़िल (DPPH), 2, 20- कैसिनो-बीआईएस (3- एथिलबेन्जोथियाज़ोलिन -6- सल्फोनिक एसिड) (ABTS) ), एसिटाइलसिटोन, NaOH, K2S2O8, और एर्लिच अभिकर्मक बीजिंग केमिकल प्लांट से प्राप्त किए गए थे। प्लैटाइकोडिन डी, अर्बुटिन, प्लैटाइकोडिन डी 3, ग्लाइकोसाइड ई, सिरिंजिन, क्लोरोजेनिक एसिड, बायिकलिन और ल्यूटोलिन संदर्भ उत्पाद चाइना इंस्टीट्यूट ऑफ फार्मास्युटिकल बायोलॉजिकल प्रोडक्ट्स आइडेंटिफिकेशन से प्राप्त किए गए थे। जेटी बेकर कं, यूएसए से क्रोमैटोग्राफिक रूप से शुद्ध एसीटोनिट्राइल और मेथनॉल प्राप्त किए गए थे। Tyrosinase, L-tyrosine, सोडियम hyaluronate, और hyaluronate बीजिंग Solebo Technology Co., Ltd. से प्राप्त किए गए थे। मूल 264.7 कोशिकाओं और B16F10 कोशिकाओं को शंघाई इंस्टीट्यूट ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज, चीन के सेल रिसोर्स सेंटर से खरीदा गया था और इसमें संग्रहीत किया गया था। चीनी चिकित्सा के चांगचुन विश्वविद्यालय से संबद्ध एक मेडिकल कॉलेज की प्रयोगशाला। डल्बेको के संशोधित ईगल का माध्यम (डीएमईएम), भ्रूण गोजातीय सीरम, और एंटीबायोटिक्स (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) गिब्को यूएसए से प्राप्त किए गए थे। ट्राइटन एक्स -100, ए-एमएसएच, एलिसा किट (एनओ, आईएल -6, टीएनएफ-ए), और सेल काउंटिंग किट -8 (सीसीके -8) किट से प्राप्त किए गए थे चांगचुन बैजिन बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड शुद्ध पानी वहाहा फूड कंपनी लिमिटेड से प्राप्त किया गया था।
2.2। प्लैटाइकोडोन ग्रैंडीफ्लोरम वाइटनिंग एक्टिव एक्सट्रेक्ट तैयार करना
प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम की आपूर्ति हेबेई रेनक्सिन फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड द्वारा की गई थी। प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम को पाउडर के रूप में कुचला गया था, गर्म किया गया था, और 95 प्रतिशत इथेनॉल समाधान के साथ तीन बार, प्रत्येक बार 1 घंटे के लिए पुन: उपयोग किया गया था। फिर, उत्पाद को फ़िल्टर किया गया था, और छानना बरामद किया गया था और तीन अर्क से प्राप्त छानना के साथ विलय कर दिया गया था। फिल्ट्रेट को सुखाया गया और विभेदन के लिए आसुत जल के साथ मिलाया गया, और पानी से संतृप्त एन-ब्यूटेनॉल (1: 1 मात्रा) को पांच बार निकाला गया। n-butanol परत संयुक्त थी, n-butanol समाधान हटा दिया गया था, और PGE प्राप्त किया गया था। प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम से पीजीई की निकासी दर 8.9 प्रतिशत थी।
2.3। कोश पालन
B16F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं और RAW264.7 कोशिकाओं को DMEM में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 U mL-1 पेनिसिलिन, और 100 ग्राम mL-1 स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 37 डिग्री C पर 5 प्रतिशत CO2 की आर्द्र हवा में संवर्धित किया गया। संलयन अवस्था में उगाए गए थे, वे ट्रिप्सिन द्वारा पचाए गए थे और कोशिकाओं को हर दो दिनों में पारित किया गया था। दोहराव सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयोग तीन बार किए गए और तीन बार दोहराया गया।
2.4। सेल व्यवहार्यता परख
PGE की सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार CCK -8 विधि के माध्यम से B16F10 और RAW264.7 कोशिकाओं पर PGE के प्रभावों का निर्धारण किया गया। 20 पहले, B16F10 कोशिकाओं और RAW264.7 कोशिकाओं को {{ 10}} अच्छी तरह से 5 × 103 कोशिकाओं प्रति कुएं की सांद्रता और 1 × 10⒋ प्रति कुएं में 24 घंटे के लिए और फिर 72 घंटे के लिए अलग-अलग सांद्रता पर PGE या DMEM के साथ इलाज किया जाता है। उपचार के बाद, 10 एमएल CCK -8 अभिकर्मक को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया, और सेल को 2 घंटे के लिए और सुसंस्कृत किया गया। 450 एनएम पर अवशोषक को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था।
2.5। प्रतिउपचारक गतिविधि
PGE की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि DPPH और ABTS फ्री-रेडिकल स्कैवेंजिंग टेस्ट के माध्यम से निर्धारित की गई थी, और एस्कॉर्बिक एसिड को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 21,22 परिणाम प्रतिशत अवरोध दर के रूप में व्यक्त किए गए थे।
इसके अलावा, PGE समाधान, एस्कॉर्बिक एसिड, और प्लैटाइकोडिन डी विभिन्न सांद्रता के साथ ({{0}}.2, 0.4, 0.6, 0.8 , 1. 0, और 1.2 mg mL-1) को क्लॉग टेस्ट ट्यूब में जोड़ा गया। फिर, प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में 2 एमएल डीपीपीएच घोल डाला गया; नलियों को भंवर में डाला गया, मिश्रण को मिलाया गया और 3 0 मिनट के लिए एक अंधेरे कक्ष में प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई, और 520 एनएम पर अवशोषक A1 निर्धारित किया गया। फिर, अवशोषण मूल्य A2 निर्धारित करने के लिए DPPH समाधान के बजाय नियंत्रण समूह के रूप में 2 एमएल मेथनॉल का उपयोग किया गया था। अवशोषक मान A0 को रिक्त नियंत्रण समूह के रूप में 2 एमएल मेथनॉल के साथ नमूना समाधान को प्रतिस्थापित करके निर्धारित किया गया था। मेथनॉल के साथ अवशोषक मान को 0 पर समायोजित किया। DPPH कट्टरपंथी मैला ढोने की दर की गणना निम्न सूत्र के अनुसार की गई थी:
ABTS प्लस $ मदर लिकर तैयार करने के लिए, 35.2 mg ABTS और 6.139 mg पोटेशियम परसल्फेट को 10 mL की स्थिर मात्रा में मिलाया गया। कमरे के तापमान पर 12-16 घंटे की प्रतिक्रिया के बाद शराब को मेथनॉल से पतला किया गया था जब तक कि 734 एनएम पर समाधान का अवशोषण मूल्य लगभग 7.{{10}} × 0.2 था। फिर, 30 एमएल पीजीई समाधान, एस्कॉर्बिक एसिड, और प्लैटाइकोडिन डी विभिन्न सांद्रता के साथ (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 मिलीग्राम एमएल-1) 96- अच्छी तरह से एंजाइम-लेबल वाली प्लेट में 220 एमएल एबीटीएस प्लस सी समाधान के साथ मिलाया गया था, और 734 एनएम पर अवशोषण को 6 मिनट के लिए अंधेरे में प्रतिक्रिया के बाद मापा गया था।
जहाँ A0 खाली नमूने का अवशोषण है, और AS मापे जाने वाले नमूने का अवशोषण है।
2.6। RAW264.7 मैक्रोफेज की लिपोपॉलेसेकेराइड-प्रेरित विरोधी भड़काऊ गतिविधि
1 एमएल माध्यम में RAW264.7 मैक्रोफेज को 24- वेल प्लेट में 1 × 104 कोशिकाओं प्रति कुएं के साथ डाला गया, और रात भर सुसंस्कृत किया गया ताकि कोशिकाएं दीवार से चिपक जाएं। विभिन्न सांद्रता (10, 50, 100 mg mL-1) पर लिपोपॉलेसेकेराइड (LPS) और PGE अर्क के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया। सेल सुपरनेटेंट में NO, IL -6, और TNF-a की सांद्रता को एलिसा किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि निर्माता द्वारा निर्देशित किया गया था।23
2.7। टायरोसिनेज गतिविधि
फॉस्फेट बफर (25 mmol, pH=6.8) को विलायक के रूप में, L-टायरोसिन सब्सट्रेट सॉल्यूशन (0.5 mg mL-1), एक टाइरोसिन एंजाइम के साथ साहित्य में रिपोर्ट की गई विधि का उपयोग करना समाधान (50 यू एमएल-1), और 96- 240 एमएल कुल प्रतिक्रिया प्रणाली की अच्छी प्लेटों के साथ-साथ 120 एमएल सब्सट्रेट समाधान, 40 एमएल फॉस्फेट बफर, 40 एमएल नमूना समाधान, और ब्लेंडर में अन्य समाधान। फिर, उपरोक्त प्रणाली में 40 एमएल टाइरोसिन एंजाइम समाधान जोड़ा गया। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के निरंतर तापमान की प्रतिक्रिया नोट की गई, और अवशोषण 475 एनएम पर मापा गया।24
जहां ए समकक्ष बफर समाधान द्वारा प्रतिस्थापित नमूना समाधान का अवशोषण है, बी नमूना समाधान का अवशोषण है, टाइरोसिनेस समाधान समकक्ष बफर समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, सी नमूना समाधान का अवशोषण है, और डी का अवशोषण है tyrosinase समाधान (तालिका 1) के बजाय समतुल्य बफर समाधान ।
2.8। मेलेनिन गठन की निरोधात्मक गतिविधि
1 एमएल माध्यम में B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को 24- अच्छी कल्चर प्लेट में 1 × 104 कोशिकाओं प्रति कुएं के साथ डाला गया था, और कोशिकाओं को दीवार का पालन करने के लिए रातोंरात सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (100 एनएम ए-एमएसएच) के साथ संवर्धित किया गया और 24, 48 और 72 घंटे के लिए विभिन्न पीजीई और अर्बुटिन सांद्रता (100, 150, 200 मिलीग्राम एमएल-1) के साथ सुसंस्कृत किया गया।
प्रशासन के समय के बाद, कोशिकाओं को दो बार पीबीएस (पीएच=7 .2) से धोया गया और पीबीएस 200 एमएल के साथ मिलाया गया जिसमें 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 था। कोशिकाओं को ठंड और विगलन द्वारा lysed किया गया था। सिस्टम को 30 मिनट के लिए 12 000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था, और 10 प्रतिशत डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (300 एमएल) युक्त 1 एम NaOH को सेल ग्रैन्यूल में जोड़ा गया था; फिर कोशिकाओं में लाइसे मेलेनिन के लिए 2 घंटे के लिए 80 डिग्री पर प्रतिक्रिया की। 25 450 एनएम पर अवशोषण निर्धारित किया गया था।
2.9। सेल टायरोसिनेज गतिविधि
B16F1 0 मेलेनोमा कोशिकाओं को 1 एमएल माध्यम में 24- अच्छी कल्चर प्लेट में डाला गया, जिसमें 1 × 104 कोशिकाएं प्रति कुएं थीं, और कोशिकाओं को दीवार का पालन करने के लिए रात भर सुसंस्कृत किया गया। कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (100 एनएम ए-एमएसएच) के साथ संवर्धित किया गया और 24, 48 और 72 घंटों के लिए पीजीई और अर्बुटिन के विभिन्न सांद्रता (100, 150, 200 मिलीग्राम एमएल-1) के साथ सुसंस्कृत किया गया। प्रशासन के समय के बाद, कोशिकाओं को दो बार पीबीएस (पीएच =7 .2) से धोया गया और पीबीएस 200 एमएल के साथ मिलाया गया जिसमें 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 था। कोशिकाओं को ठंड और विगलन द्वारा lysed किया गया था। 30 मिनट के लिए 12 000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला 96- अच्छी प्लेट, 100 एमएल प्रति कुएं में जमा किया गया, और 100 एमएल 0.1 प्रतिशत एल-डीओपीए समाधान के साथ मिलाया गया। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन के बाद, 475 एनएम पर अवशोषण तुरंत निर्धारित किया गया था ।26
2.10। रासायनिक संरचना विश्लेषण
2.10.1। एचपीएलसी विश्लेषण।पीजीई नमूना समाधान का विश्लेषण शिमदज़ू एलसी {{0}} एएचटी एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग ईएलएसडी6 0 00 बाष्पीकरणीय प्रकाश बिखरने वाले डिटेक्टर (ऑलटेक सीएचआरओएम) के साथ किया गया था। 27 क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण एक सेपेक्स बायो पर किया गया था। -C18 कॉलम (4.6×250 मिमी, 5 मिमी, सेपैक्स टेक्नोलॉजीज, डेलावेयर, यूएसए से)। मोबाइल फेज सिस्टम मोबाइल फेज ए (एसीटोनिट्राइल) और मोबाइल फेज बी (0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड वाटर) से बना था। सॉल्वेंट ग्रेडिएंट तालिका 2 में प्रस्तुत किया गया है। क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां इस प्रकार थीं: प्रवाह दर 0.8 एमएल मिनट-1 थी, प्रारंभिक बाष्पीकरणीय प्रकाश बिखरने का पता लगाने (ईएलएसडी) तापमान 105 × सी था, गैस प्रवाह दर 2.8 एल मिनट- थी। 1, और इंजेक्शन की मात्रा 20 एल थी। पीजीई के बीस बैच तैयार किए गए थे।
2.10.2। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त एचपीएलसी के माध्यम से पीजीई रासायनिक संरचना का विश्लेषण।क्यू-ऑर्बिट्रैप उच्च-रिज़ॉल्यूशन एलसी/एमएस तकनीक का विश्लेषण और पहचान करने के लिए अल्टीमेट 3000 आरएस क्रोमैटोग्राफी सिस्टम पर क्यू एक्सएक्टिव हाई-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के संयोजन में उपयोग किया गया था। MS.28 के माध्यम से PGE नमूना समाधान की रासायनिक संरचना MS स्थितियाँ इस प्रकार हैं: आयन स्रोत: इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत; स्कैन मोड: सकारात्मक और नकारात्मक आयन स्कैनिंग स्विच; पता लगाने की विधि: पूर्ण द्रव्यमान/dd-MS2; संकल्प: 70 000 (पूर्ण द्रव्यमान), 17 500 (dd-MS2); स्कैनिंग रेंज: 150.0–2000.0 m/z; इलेक्ट्रोस्प्रे वोल्टेज: 3.8 केवी (सकारात्मक); केशिका तापमान: 300 डिग्री सेल्सियस; टक्कर गैस: उच्च शुद्धता आर्गन (शुद्धता $ 99.999 प्रतिशत); म्यान गैस: नाइट्रोजन (शुद्धता $ 99.999 प्रतिशत, 40 arb); सहायक गैस: नाइट्रोजन (शुद्धता $ 99.999 प्रतिशत, 350 डिग्री); डाटा अधिग्रहण का समय: 30.0 मिनट। क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां: रंगीन ग्राफिक कॉलम: RP-C18 (150 × 2.1 मिमी, 1.8 मिमी, वेल्च); प्रवाह दर: 0.30 एमएल मिनट- 1; जलीय चरण: 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड जलीय घोल; कार्बनिक चरण: 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड एसीटोनिट्रिल; सुई धोने का तरल: मेथनॉल; कॉलम तापमान: 35 डिग्री सेल्सियस; इंजेक्शन की मात्रा: 5.00 एमएल। सॉल्वेंट ग्रेडिएंट तालिका 3 में दिखाया गया है।
2.11। डेटा आँकड़े
सभी प्रयोग कम से कम तीन बार किए गए। डेटा को माध्य मान ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट किया गया था। SPSS 21.0 और उत्पत्ति 9.0 का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए। कई तुलनाओं के लिए, डेटा को एक तरफ़ा एनोवा (तुर्की का पोस्ट हॉक) के अधीन किया गया था और सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए टी-टेस्ट जोड़ा गया था। p <0.05 को समूहों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर माना गया।
3। परिणाम
3.1। B16F10 कोशिकाओं और 264.7 कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर PGE का प्रभाव
B16F1 0 मेलेनोमा कोशिकाओं और RAW264.7 मैक्रोफेज पर PGE के प्रभावों का पता CCK -8 विधि के माध्यम से लगाया गया। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए अलग PGE सांद्रता के साथ इलाज किया गया और फिर CCK -8 विधि का उपयोग करके पता लगाया गया। परिणाम नियंत्रण समूह के सापेक्ष उत्तरजीविता के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। 10–100 mg mL-1 (कोशिका व्यवहार्यता: 99.42 ±1.951–107.17 ±2.601 प्रतिशत ) की PGE सांद्रता के तहत, PGE ने कोई प्रदर्शित नहीं किया 264.7 कोशिकाओं पर साइटोटोक्सिसिटी (चित्र 1)। हालांकि, 200 मिलीग्राम एमएल -1 (सेल व्यवहार्यता: 74.91 ± 1.574 प्रतिशत) की पीजीई एकाग्रता में सेल गतिविधि में उल्लेखनीय कमी आई है। इसलिए, 10-100 mg mL-1 की एक खुराक सीमा (प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम में PGE की निष्कर्षण दर 8.9 प्रतिशत थी। PGE की 10-100 mg mL-1 की सांद्रता प्लैटाइकोडोन के 0.11-1.12 mg mL-1 के बराबर है। ग्रैंडिफ्लोरम। प्रति कुएं में 1 एमएल दवा युक्त माध्यम जोड़ना 0.11–0.12 मिलीग्राम प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम जोड़ने के बराबर है।) का चयन किया जाना चाहिए। यहां, 10 मिलीग्राम एमएल-1, 50 मिलीग्राम एमएल-1, और 100 मिलीग्राम एमएल-1 (पौधों की औषधीय सामग्री की एकाग्रता: 0.11 मिलीग्राम एमएल-1, 0.56 मिलीग्राम एमएल-1, 1.12 मिलीग्राम एमएल-1, क्रमशः) के रूप में चुने गए थे कम, मध्यम और उच्च सांद्रता।
B16F10 कोशिकाओं की गतिविधि 264.7 कोशिकाओं से थोड़ी अलग थी। जब PGE सांद्रता 10–200 mg mL―1 (कोशिका व्यवहार्यता: 99.03 ±1.965 प्रतिशत –91.48 ±1.382 प्रतिशत ) थी, B16F10 कोशिकाओं की गतिविधि नियंत्रण समूह की गतिविधि से काफी भिन्न नहीं थी। हालांकि, जब एकाग्रता 250 मिलीग्राम एमएल-1 (सेल व्यवहार्यता: 85.69 ± 2.284 प्रतिशत) थी, तो बी16एफ10 कोशिकाओं की गतिविधि में गिरावट शुरू हुई, और 1000 मिलीग्राम एमएल-1 (सेल व्यवहार्यता: 70.75) की पीजीई एकाग्रता के तहत सेल गतिविधि इसलिए, 10–200 m3.337 प्रतिशत की खुराक सीमा) सबसे कम थी। g mL-1 (प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम में PGE की निकासी दर 8.9 प्रतिशत थी। PGE की 100-200 mg mL-1 की सांद्रता प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम के 1.12-2.24 mg mL-1 के बराबर होती है। 1 एमएल दवा युक्त जोड़ना मध्यम प्रति कुएं 1.12-2.24 मिलीग्राम प्लैटाइकोडोन ग्रैंडिफ्लोरम जोड़ने के बराबर है।) का चयन किया जाना चाहिए। यहां, 100 मिलीग्राम एमएल-1, 150 मिलीग्राम एमएल-1, और 200 मिलीग्राम एमएल-1 (पौधों की औषधीय सामग्री की एकाग्रता: 1.12 मिलीग्राम एमएल-1, 1.68 मिलीग्राम एमएल-1 2.24 मिलीग्राम एमएल-1, क्रमशः ) को क्रमशः निम्न, मध्यम और उच्च सांद्रता के रूप में चुना गया (चित्र 2)।
3.2। PGE की एंटीऑक्सीडेंट क्षमता
पीजीई की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि को मापने के लिए डीपीपीएच और एबीटीएस फ्री-रेडिकल स्कैवेंजिंग टेस्ट का इस्तेमाल किया गया था। DPPH और ABTS रेडिकल की ओर PGE की सफाई गतिविधियों को विभिन्न PGE सांद्रता (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg mL-1) के तहत निर्धारित किया गया था। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्लैटाइकोडिन डी और एस्कॉर्बिक एसिड का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, सकारात्मक नियंत्रण समूह के परिणामों के समान, DPPH और ABTS मुक्त कणों की ओर PGE की मैला ढोने की गतिविधि खुराक पर निर्भर तरीके से बढ़ी। जब PGE सांद्रता 6.25 mg mL-1 थी, तो DPPH रेडिकल की ओर मैला ढोने की गतिविधि 98.03 ±0.60 प्रतिशत थी, लगभग एस्कॉर्बिक एसिड की मैला ढोने की गतिविधि के समान। इसके अलावा, PGE ने ABTS रेडिकल (84.30 ± 0.53 प्रतिशत) की ओर मजबूत मैला ढोने की गतिविधि भी दिखाई, जो कि प्लैटाइकोडिन D नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक थी।
3.3। RAW264.7 मैक्रोफेज के LPS-उत्तेजित भड़काऊ प्रतिक्रिया पर PGE कमी प्रभाव
धारा 3.1 में RAW264.7 मैक्रोफेज गतिविधि पर पीजीई के प्रभाव के परिणामों के अनुसार, प्रभाव का परीक्षण करने के लिए क्रमशः 10, 50, और 100 मिलीग्राम एमएल-1 की पीजीई सांद्रता को कम, मध्यम और उच्च खुराक के रूप में चुना गया था। LPS-उत्तेजित RAW264.7 मैक्रोफेज सूजन पर PGE का। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, PGE खुराक-निर्भरता ने LPS-उत्तेजित RAW264.7 मैक्रोफेज में NO उत्पादन को कम कर दिया और खुराक-निर्भरता ने IL -6 और TNF-एक भड़काऊ कारकों के स्तर को कम कर दिया।
3.4। मशरूम टाइरोसिनेस गतिविधि पर PGE के प्रभाव, B16F10 मेलानोसाइट्स में मेलेनिन सामग्री, और इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस गतिविधि
जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, PGE की tyrosinase निरोधात्मक गतिविधि में अर्क की सांद्रता में वृद्धि के साथ काफी वृद्धि हुई है। PGE सांद्रता जितनी अधिक होगी, टाइरोसिनेज की निरोधात्मक गतिविधि उतनी ही मजबूत होगी। 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, और 3.0 mg mL-1 पर PGE की tyrosinase निरोधात्मक गतिविधियां 6 थीं{ {29}}.29 प्रतिशत , 79.32 प्रतिशत , 85.14 प्रतिशत , 95.23 प्रतिशत , 96.43 प्रतिशत , और 97.71 प्रतिशत क्रमशः। हालाँकि, जब PGE सांद्रता 2.5–3.0 mg mL-1 थी, तो टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं हुई; इस प्रकार, उच्च सांद्रता के साथ प्रयोग करना आवश्यक नहीं था। समान परिस्थितियों में, 3.0 mg mL‵1 PGE (पौधों की औषधीय सामग्री की सांद्रता: 33.71 mg mL―1) की निषेध दर अर्बुटिन (3 mg mL―1, 96.97 ±1.849 प्रतिशत) के समान थी और उससे अधिक थी प्लैटीकोडिन डी (3 मिलीग्राम एमएल -1, 81.67 ± 2.331 प्रतिशत) का।
धारा 3.1 में B16F10 मेलानोसाइट्स की गतिविधि पर PGE के प्रभाव के अनुसार, मेलेनिन सामग्री पर PGE के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए 100, 150 और 200 mg mL-1 PGE की PGE सांद्रता को निम्न, मध्यम और उच्च खुराक के रूप में चुना गया था। और a-MSH द्वारा प्रेरित B16F10 मेलानोसाइट्स की टायरोसिनेस गतिविधि। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, 100 nM a-MSH (नियंत्रण समूह) द्वारा उत्तेजित B16F10 कोशिकाओं की टायरोसिनेस गतिविधि गैर-उत्तेजित कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक थी। PGE एकाग्रता में वृद्धि के साथ, B16F10 कोशिकाओं पर टायरोसिनेस और मेलेनिन उत्पादन की निरोधात्मक गतिविधियों में खुराक पर निर्भर तरीके से काफी वृद्धि हुई है। प्रशासन के समय में वृद्धि के साथ, B16F10 कोशिकाओं tyrosinase और मेलेनिन उत्पादन पर PGE की निरोधात्मक गतिविधि धीरे-धीरे बढ़ी।
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