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Plumbagin B16F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं में -MSH- प्रेरित मेलानोजेनेसिस को टायरोसिनेस गतिविधि भाग 2 को रोककर दबा देता है

May 09, 2023

3. चर्चा

प्लंबेगिन एक पौधा-व्युत्पन्न माध्यमिक मेटाबोलाइट है और कई जैविक कार्यों को दिखाता है, जिसमें विरोधी भड़काऊ, कैंसर-रोधी, एलर्जी-विरोधी और जीवाणुरोधी गतिविधियां [8,9] शामिल हैं। हालांकि, यह ज्ञात नहीं था कि हाइपरपिग्मेंटेशन और मेलेनोमा से जुड़े मेलानोजेनेसिस पर प्लंबगिन का निरोधात्मक प्रभाव था या नहीं। इस अध्ययन में, हमने प्रदर्शित किया कि प्लंबेगिन बी16एफ10 मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनोजेनेसिस को दृढ़ता से दबा देता है, और यह काम प्लंबेगिन की एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटी-एलर्जिक, जीवाणुरोधी और एंटी-मेलानोजेनेसिस गतिविधियों के आधार पर त्वचा की देखभाल करने वाले सौंदर्य प्रसाधन विकसित करने का अवसर प्रदान कर सकता है।

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार, सिस्टंच एक सामान्य जड़ी-बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी-बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य घटक सिस्टेनोसाइड है, जिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसे कि एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ और प्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना। सिस्टैच और स्किन व्हाइटनिंग के बीच का तंत्र सिस्टैच ग्लाइकोसाइड्स के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित है। मानव त्वचा में मेलेनिन टाइरोसिनेस द्वारा उत्प्रेरित टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता है, और ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। Cistanche में cistanoside होता है, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता है, इस प्रकार मेलेनिन उत्पादन को रोकता है।

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अधिक जानकारी के लिए:

david.deng@wecistanche.com व्हाट्सएप:86 13632399501

क्योंकि रक्त के साथ-साथ ट्यूमर के ऊतकों में अतिव्यक्त टाइरोसिनेस के स्तर के साथ घातक मेलेनोमा में मेलेनोजेनेसिस का अपचयन अक्सर देखा जाता है, यह स्पष्ट है कि मेलेनोजेनेसिस घातक मेलानोमा [1] के कीमोथेरेपी के लिए एक संभावित लक्ष्य है। वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया कि प्लंबेगिन मेलानोजेनेसिस (चित्र 6) से जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी से स्वतंत्र टायरोसिनेस गतिविधि को सीधे दबा देता है। इसलिए, हमारे परिणाम बताते हैं कि घातक मेलेनोमा के प्रबंधन के लिए प्लंबगिन एक निवारक और चिकित्सीय रणनीति का एक संभावित घटक हो सकता है। दरअसल, मेलेनोमा थेरेपी पर प्लंबेगिन के एंटी-मेलेनोमा, केमोसेंसिटाइजिंग और रेडियोसेंसिटाइजिंग प्रभावों की सूचना दी गई है [17-21]।

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प्लंबेगिन के एंटी-कैंसर और एंटी-इंफ्लेमेटरी प्रभावों से निपटने वाले पिछले अध्ययनों में, लगभग 5–10 µM प्लंबेगिन (इस अध्ययन में उपयोग की गई सांद्रता से अधिक) का इन विट्रो मॉडल में उपयोग किया गया है [17,22 23]। इसलिए, हमने प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं में प्लंबेगिन के विषाक्त प्रभाव की जांच की, जिसमें सामान्य केराटिनोसाइट्स (HaCaT) और लेंस उपकला कोशिकाएं (B3) शामिल हैं, जो त्वचा की देखभाल करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। हमारे परिणामों ने प्रदर्शित किया कि कम सांद्रता, लगभग 0.5–1 µM प्लंबेगिन, सामान्य केराटिनोसाइट्स और लेंस उपकला कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं हैं, लेकिन टायरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन संश्लेषण को कम करने के लिए पर्याप्त प्रभावी हैं। इसके अलावा, हमने यह भी पाया कि प्लंबेगिन 1 मिमी अर्बुटिन या 0.2 मिमी कोजिक एसिड की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से मेलेनोजेनेसिस को दबा देता है, जो कि त्वचा को गोरा करने वाला एजेंट है। इन परिणामों से पता चलता है कि प्लंबेगिन त्वचा को गोरा करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों के विकास के लिए एक घटक के रूप में उपयोग के लिए सुरक्षित है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने L-DOPA ऑक्सीकरण पर आधारित सेलुलर और सेल-फ्री टायरोसिनेस गतिविधि परख का उपयोग करके टाइरोसिनेस एंजाइम प्रतिक्रिया पर प्लंबेगिन के निरोधात्मक प्रभावों का अध्ययन किया। फिर भी, हमने एक सटीक आणविक तंत्र का सुझाव नहीं दिया कि प्लंबगिन टायरोसिनेस गतिविधि को कैसे रोकता है। यह निर्धारित करने के लिए इस तंत्र की आगे जांच की जानी चाहिए कि क्या प्लंबेगिन सीधे टाइरोसिनेस के साथ संपर्क करता है और इसकी ऑक्सीडेज गतिविधि को रोकता है या क्या इसके अप्रत्यक्ष प्रभाव हैं जो टायरोसिनेज गतिविधि को कम करते हैं।

4. सामग्री और तरीके

4.1। अभिकर्मकों और एंटीबॉडी

Plumbagin, -MSH (M4135), arbutin (A4256), kojic acid (K3125), L-DOPA (333786), और tyrosinase (T3824) मशरूम से शुद्ध सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदे गए थे। MITF के खिलाफ एंटीबॉडी (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-AKTT308 (#13038), p-CREB (#9198), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), H2AX (#9718), PARP (#5625), और कैसपेज़ -3 (#9665) सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (डेनवर, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। टायरोसिनेस (sc -7833), और -ट्यूबुलिन (sc -9104) को सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (डलास, TX, यूएसए) से खरीदा गया था।

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4.2। सेल संस्कृति और सेल व्यवहार्यता परख

B16F10 (माउस मेलानोमा कोशिकाएं), B3 (मानव लेंस उपकला कोशिकाएं), और HaCaT (मानव केराटिनोसाइट) कोशिकाओं को Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम और 25 mM ग्लूकोज के साथ संवर्धित किया गया। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 95 प्रतिशत हवा और 5 प्रतिशत CO2 के आर्द्र वातावरण में ऊष्मायन किया गया था। व्यवहार्यता को मापने के लिए, कोशिकाओं को 48 या 72 घंटे के लिए डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग प्लंबगिन की विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, सुसंस्कृत कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और फिर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.5 प्रतिशत क्रिस्टल वायलेट धुंधला समाधान के साथ ऊष्मायन किया गया। ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए, सना हुआ कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के घोल से उकेरा गया था, और प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व को एक अवशोषक रीडर (बायोटेक) का उपयोग करके 570 एनएम (OD570) पर मापा गया था। वीनोस्की, वीटी, यूएसए)।

4.3। immunoblotting

संवर्धित कोशिकाओं को 1 प्रतिशत IGEPAL (octylphenoxypolyethoxyethanol), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaF और एक प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल का उपयोग करके लिसीज़ बफर में रखा गया था। प्रोटीन के नमूनों को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) के माध्यम से अलग किया गया था, और अलग किए गए प्रोटीनों को फिर एक पॉलीविनाइलिडीन डिफ़्लुओराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (मिलिपोर, बिलरिका, एमए, यूएसए) में स्थानांतरित कर दिया गया था। झिल्लियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (1:1000) के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया, और फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:10,000) के साथ ऊष्मायन किया गया। ईसीएल प्राइम किट (जीई हेल्थकेयर पिट्सबर्ग, पीए, यूएसए) का उपयोग करके प्रोटीन की कल्पना की गई थी।

4.4। इंट्रासेल्युलर और एक्स्ट्रासेलुलर मेलेनिन सामग्री का मापन

मामूली संशोधन [2,24] के साथ पहले वर्णित विधि का उपयोग करके मेलेनिन सामग्री निर्धारित और मात्रा निर्धारित की गई थी। मेलेनिन सामग्री विश्लेषण के लिए, बी16एफ10 कोशिकाओं को फिनोल रेड-फ्री डीएमईएम में संवर्धित किया गया जिसमें 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम था। 3 या 4 दिनों के लिए प्लंबगिन की अनुपस्थिति या उपस्थिति में -MSH उपचार के साथ B16F10 कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया। सुसंस्कृत कोशिकाओं या मीडिया को काटा गया और छर्रों को 1N NaOH में 10% DMSO युक्त 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए भंग कर दिया गया। मेलेनिन सामग्री को 475 एनएम (OD475) पर एक अवशोषक रीडर का उपयोग करके मापा गया था, और मेलेनिन सामग्री को सेलुलर प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

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4.5। आरएनए अलगाव और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA) का उपयोग करके B16F10 कोशिकाओं से कुल RNA निकाला गया और कुल RNA के 2 माइक्रोग्राम का उपयोग सीडीएनए संश्लेषण के लिए उच्च क्षमता वाले सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वॉलथम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया। SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। PCR प्राइमरों (50-30) के अनुक्रम इस प्रकार थे: MITF के लिए TCAAGTTTCCAGAGACGGGT और CATCATCAGCCTGGAATCAA; TYR के लिए ATAGGTGCATTGGCTTCTGG और TCTTCACCATGCTTTTGTGG; TYRP1 के लिए CATTTCCAG CTGGGTTTCTC और TGGTCTGTGAATCCTTGGAA।

4.6। सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि परख

सेलुलर टाइरोसिनेस गतिविधि संशोधन [25,26] के साथ पहले वर्णित विधि का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। संवर्धित B16F1 0 कोशिकाओं को -MSH के साथ प्लंबेगिन की अनुपस्थिति या उपस्थिति में ऊष्मायन किया गया था, और कोशिकाओं को तब धोया गया था और पीबीएस के साथ धोया गया था जिसमें 1 प्रतिशत सोडियम डीऑक्सीकोलेट और 0। 5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स {{8} था। }. प्रोटीन सांद्रता निर्धारित होने के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2.0 एमएम एल-डीओपीए और 0.1 एम पीबीएस (पीएच 6.8) के साथ 5 0 माइक्रोग्राम प्रोटीन ऊष्मायन किया गया था। L-DOPA के ऑक्सीकरण को अवशोषक रीडर का उपयोग करके 475 एनएम (OD475) पर मापा गया था। गतिविधि को निम्न सूत्र का उपयोग करके मापा गया था: टायरोसिनेस गतिविधि (प्रतिशत)=(नमूना का OD475/नियंत्रण का OD475) × 100।

4.7। सेल-फ्री टायरोसिनेस गतिविधि परख

टाइरोसिनेस गतिविधि पर प्लंबेगिन के निरोधात्मक प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, शुद्ध मशरूम टायरोसिनेस को 2 घंटे के लिए 0.1 एम पीबीएस (पीएच 6.8) और 2 मिमी एल-डीओपीए युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ अनुपस्थिति या प्लंबगिन की उपस्थिति में लगाया गया था। . डोपाक्रोम में एल-डीओपीए के ऑक्सीकरण को अवशोषक पाठक के साथ 475 एनएम (ओडी475) पर मापा गया था। गतिविधि को निम्न सूत्र का उपयोग करके मापा गया था: टायरोसिनेस गतिविधि (प्रतिशत)=(नमूना का OD475/नियंत्रण का OD475) × 100।

4.8। DPPH रेडिकल स्कैवेंजिंग गतिविधि परख

प्लंबगिन की कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि को निर्धारित करने के लिए, मेथनॉल में एक {{0}}.2 मिमी डीपीपीएच समाधान तैयार किया गया और इसका उपयोग किया गया। प्रत्येक नमूने को आसुत जल से 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, और 5 mg/mL (प्लम्बगिन), या { {13}}.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, और 0.5 मिलीग्राम/एमएल (विटामिन सी)। प्रतिक्रिया के बाद, एक अवशोषक पाठक का उपयोग करके ऑप्टिकल घनत्व (OD) को 517 एनएम (OD517) पर मापा गया था। नि: शुल्क रेडिकल स्कैवेंजिंग गतिविधि की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की गई: DPPH रेडिकल स्कैवेंजिंग गतिविधि (प्रतिशत)=10 - ((ODs/ODc) × 100), जहां ODs नमूनों के अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है, और ODc अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है वाहन नियंत्रण।

4.9। सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रिज्म (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, ला जोला, सीए, यूएसए) का उपयोग करके कई तुलनाओं के लिए टकी के पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ दो प्रायोगिक तुलनाओं के लिए एक अप्रकाशित छात्र के टी- टेस्ट और विचरण (ANOVA) के एक तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करके सभी डेटा का विश्लेषण किया गया। डेटा को ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। माध्य मानों के बीच के अंतरों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था जब संबद्ध p-मान 0.05 से कम था।

प्र. 5। निष्कर्ष 

इस अध्ययन के प्रमुख निष्कर्ष यह हैं कि प्लंबेगिन (i) टाइरोसिनेस गतिविधि को रोककर -MSH- प्रेरित मेलेनिन संश्लेषण को दबा देता है; (ii) मेलानोजेनेसिस से जुड़े AKT और ERK1 / 2 सक्रियण सहित MITF-लिंक्ड ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी और सिग्नल ट्रांसडक्शन कैस्केड को प्रभावित नहीं करता है; और (iii) सामान्य केराटिनोसाइट्स (HaCaT) और लेंस एपिथेलियल (B3) कोशिकाओं में विषाक्तता का कारण नहीं बनता है जब इसकी सांद्रता 5 µM से कम थी। एक साथ लिया गया, प्लंबेगिन सीआरईबी-एमआईटीएफ ट्रांसक्रिप्शनल अक्ष से स्वतंत्र टाइरोसिनेस गतिविधि को रोककर -एमएसएच-प्रेरित मेलेनिन संश्लेषण को निरस्त करता है। इसलिए, ये परिणाम त्वचा को गोरा करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों के विकास में इसका उपयोग करके हाइपरपिग्मेंटेशन को कम करने के लिए एक आशाजनक और सुरक्षित प्राकृतिक उत्पाद प्लंबेगिन का सुझाव देते हैं।

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स्वीकृतियां:इस काम को 2016 में कोंकुक यूनिवर्सिटी ने सपोर्ट किया था।
लेखक योगदान:जी-हांग लिम ने कल्पना की और प्रयोगों को डिजाइन किया; ताएक-इन ओह, जेओंग-एमआई यून, यून-जी पार्क, और यंग-सीन किम ने प्रयोग किए; जी-होंग लिम, ताएक-इन ओह, और यूं-एमआई ली ने डेटा का विश्लेषण किया; जी-हांग लिम और यून-एमआई ली ने पांडुलिपि लिखी।
हितों का टकराव:ऑथर ने किसी हित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

लघुरूप

-एमएसएच अल्फा-मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन
टीआईआर टायरोसिनेज
एल-डोपा एल -3, 4- डायहाइड्रॉक्सीफेनिलएलानिन
MITF माइक्रोफथाल्मिया-जुड़े प्रतिलेखन कारक
TYRP1 टाइरोसिनेज-संबंधित प्रोटीन 1
CREB cAMP प्रतिक्रिया तत्व बाइंडिंग प्रोटीन
पीकेए प्रोटीन किनेज ए
ERK1/2 बाह्य संकेत-विनियमित किनासे 1/2

संदर्भ

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