पोर्सिन प्लेसेंटल अर्क मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स में सेलुलर एनएडी स्तर को बढ़ाता है

एंटी-एजिंग-हर्बल सिस्टैंच के लिए सर्वोत्तम जड़ी-बूटियाँ

निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड(एनएडी) कई रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं के लिए एक शास्त्रीय सहकारक है और ऑक्सीकृत (एनएडी प्लस) और कम (एनएडीएच) रूपों में सभी जीवित कोशिकाओं में मौजूद है। एनएडी प्लस को एनएडी प्लस-उपभोग करने वाले एंजाइम जैसे सिर्टुइन (एसआईआरटी) और पॉली एडीपी-राइबोस पोलीमरेज़ (पीएआरपी) के लिए एक आवश्यक सह-सब्सट्रेट के रूप में भी जाना जाता है। क्योंकि ये एंजाइम डीएनए मरम्मत, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय और तनाव प्रतिरोध सहित विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, असंतुलित एनएडी होमियोस्टैसिस उनकी महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है। उम्र के साथ ऊतक/अंग एनएडी स्तर में गिरावट आती है, जिसके परिणामस्वरूप असंतुलित एनएडी होमियोस्टैसिस 2-6 होता है। इसलिए, अब इस बात पर आम सहमति है कि एनएडी के स्तर को बनाए रखने से उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित बीमारियों की रोकथाम और उपचार किया जा सकता है। एनएडी को विभिन्न मार्गों के माध्यम से जैवसंश्लेषित किया जाता है, जिसमें ट्रिप्टोफैन से डे नोवो जैवसंश्लेषण, निकोटिनिक एसिड से प्रीस-हैंडलर मार्ग और निकोटिनमाइड (एनएएम)8 से बचाव मार्ग शामिल है। स्तनधारियों में, बचाव मार्ग सेलुलर एनएडी स्तर9 को बनाए रखने का प्रमुख मार्ग है। इस मार्ग में, NAM को NAM फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज़ (NAMPT) द्वारा निकोटिनमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड (NMN) में परिवर्तित किया जाता है और फिर NMN एडेनिलिलट्रांसफेरेज़ द्वारा NAD में परिवर्तित किया जाता है। निकोटिनमाइड राइबोसाइड (एनआर) को एनआर किनेसेस द्वारा एनएमएन में परिवर्तित किया जाता है और फिर बचाव मार्ग में एकीकृत किया जाता है। एनएडी इंटरमीडिएट मेटाबोलाइट्स, जैसे एनएमएन और एनआर, को विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में एनएडी स्तर को बढ़ाने और उम्र से संबंधित बीमारियों में सुधार करने के लिए दिखाया गया है।

घाव भरने के लिए पारंपरिक चिकित्सा में प्लेसेंटल अर्क (पीई) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। पीई कई बायोएक्टिव घटकों का एक समृद्ध स्रोत है, जिसमें अमीनो एसिड, न्यूक्लिक एसिड, फैटी एसिड, खनिज, विटामिन, हार्मोन, बायोएक्टिव पेप्टाइड्स, साइटोकिन्स और वृद्धि कारक शामिल हैं। यह विभिन्न औषधीय गतिविधियों के लिए जाना जाता है, जैसे कि एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटी-ऑक्सीडेंट, पुनर्योजी और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव12। इस प्रकार, मानव पीई (एचपीई) के चमड़े के नीचे और इंट्रा-मस्कुलर इंजेक्शन का उपयोग नैदानिक ​​​​रूप से कई बीमारियों के इलाज के लिए किया गया है, जिसमें रजोनिवृत्ति के लक्षण और पुरानी यकृत रोग 13 शामिल हैं। इसके अलावा, एचपीई का उपयोग नैदानिक ​​रूप से एक एंटी-रिंकल एजेंट के रूप में मुख्य रूप से एशियाई देशों में किया जाता है क्योंकि इसका कोशिका वृद्धि और कोलेजन संश्लेषण14 पर प्रभाव पड़ता है। चूंकि जापान जैसे कुछ देशों में एचपीई का उपयोग चिकित्सा अनुप्रयोगों तक ही सीमित है, पोर्सिन पीई (पीपीई) को हाल ही में एचपीई के विकल्प के रूप में विकसित किया गया था और स्वास्थ्य खाद्य पदार्थों और सौंदर्य प्रसाधनों में कच्चे घटक के रूप में उपयोग किया गया था। माउस संपर्क जिल्द की सूजन मॉडल का उपयोग करके एक विवो अध्ययन से पता चला है कि सामयिक पीपीई का त्वचा पर विरोधी भड़काऊ और एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव होता है। नैदानिक ​​अध्ययनों से पता चला है कि सामयिक पीपीई पुराने न भरने वाले घावों के उपचार और झुर्रियों के गठन को रोकने के लिए फायदेमंद है।16,17। इसके अलावा, पीपीई के मौखिक सेवन के त्वचा लाभों को मान्य करने के लिए स्वस्थ वयस्क महिलाओं में एक यादृच्छिक, डबल-ब्लाइंड, प्लेसबो-नियंत्रित नैदानिक ​​​​परीक्षण किया गया और पता चला कि पीपीई सेवन समूह की त्वचा की स्थिति में काफी सुधार हुआ था18। ये रिपोर्टें इस अवधारणा का समर्थन करती हैं कि पीपीई उपचार त्वचा की उम्र बढ़ने को कम या रोक सकता है।

पीई का उपयोग परंपरागत रूप से किया गया हैबुढ़ापा रोधी एजेंट, और कई नैदानिक ​​अध्ययनों ने इसे स्थापित किया हैबुढ़ापा रोधी गुण. हालाँकि, पीई के एंटी-एजिंग प्रभावों के पीछे का तंत्र अस्पष्ट बना हुआ है। इस रिपोर्ट से पता चला है कि पीपीई में कई एनएडी अग्रदूत होते हैं, जैसे एनएमएन और एनआर, और सामान्य मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स (एनएचईके) में इंट्रासेल्युलर एनएडी स्तर बढ़ाता है। हमारे निष्कर्ष उस तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जिसके माध्यम से पीई इंट्रासेल्युलर एनएडी होमियोस्टैसिस को बनाए रखकर अपने एंटी-एजिंग प्रभाव डालता है।

परिणाम

पीपीई इंट्रासेल्युलर एनएडी स्तर को बढ़ाता है। यह जांचने के लिए कि क्या पीपीई सेलुलर एनएडी स्थितियों को बदलता है, हमने एनएचईके को पीपीई के साथ पूरक माध्यम में संवर्धित किया और उनके इंट्रासेल्युलर एनएडी प्लस और एनएडीएच स्तरों को निर्धारित किया। परिणामों से पता चला कि पीपीई ने खुराक पर निर्भर तरीके से एनएचईके में एनएडी प्लस और एनएडीएच दोनों की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि की (चित्र 1ए)। 1 मिलीग्राम/एमएल पीपीई से उपचारित कोशिकाओं का कुल एनएडी (एनएडी प्लस प्लस एनएडीएच) स्तर अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में लगभग 1.5 गुना अधिक था (चित्र 1ए)। इसके अलावा, एक समय-कोर्स प्रयोग में, 1 मिलीग्राम/एमएल पीपीई (छवि 1 बी) के साथ 4 घंटे के उपचार के बाद एनएडी प्लस, एनएडीएच और कुल एनएडी स्तरों में महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई। Te {{10}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{15}}diphenyltetrazolium bromide (MTT) परख ने पुष्टि की कि {{20} }.5-2 मिलीग्राम/एमएल पीपीई का कोशिका चयापचय गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जबकि 5 मिलीग्राम/एमएल पीपीई या सकारात्मक नियंत्रण (0.2 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100 [टीएक्स-100]) ने महत्वपूर्ण कोशिका विषाक्तता प्रदर्शित की (चित्र 1सी)। चूंकि पीपीई में एनएडी का शायद ही पता लगाया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया है), पीपीई का एनएडी-उत्पादक प्रभाव एनएचईके में पीपीई व्युत्पन्न एनएडी के प्रवाह के कारण प्रतीत नहीं होता था। इस प्रकार, ये परिणाम बताते हैं कि पीपीई इंट्रासेल्युलर एनएडी स्तर को बढ़ा सकता है। पीपीई के सक्रिय तत्व छोटे अणु हैं, प्रोटीन नहीं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या पीपीई एनएडी बचाव मार्ग में एनएएमपीटी प्रतिक्रिया के माध्यम से सेलुलर एनएडी जैवसंश्लेषण को बढ़ावा देता है, हमने एनएएमपीटी अवरोधक एफके 866 (छवि 2 ए) का उपयोग करके एनएडी पुनर्प्राप्ति परख की। एफके866 ने जोड़ने के 24 घंटे बाद कुल एनएडी स्तर को काफी कम कर दिया (चित्र 2बी)।

दिलचस्प बात यह है कि एनएचईके के भीतर एनएएमपीटी गतिविधि की अनुपस्थिति के बावजूद, पीपीई ने खुराक-निर्भर तरीके से एनएडी की कमी को प्रेरित करते हुए एफके को दबा दिया (चित्र 2बी)। कई रिपोर्टों से पता चला है कि पीई में साइटोकिन्स और वृद्धि कारक13,19,20 जैसे प्रोटीन होते हैं। इसलिए, हमने माना कि पीपीई में मौजूद कुछ बायोएक्टिव प्रोटीन या पोर्सिन एनएएमपीटी एनएचईके में इंट्रासेल्युलर एनएडी जैवसंश्लेषण को बढ़ा सकते हैं। अपनी परिकल्पना की पुष्टि करने के लिए, हमने एक केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस (कटऑफ: 3 केडीए) का उपयोग करके पीपीई को उच्च और निम्न-आणविक-भार (एचएमडब्ल्यू, एलएमडब्ल्यू) अंशों में अलग किया। चूँकि FK866 का उपयोग करके NAD पुनर्प्राप्ति परख ने NAD जैवसंश्लेषण पर PPE के प्रभाव को FK866 (चित्र 1A और 2B) की अनुपस्थिति की तुलना में अधिक स्पष्ट रूप से दिखाया, हम PPE में सक्रिय अवयवों की पहचान करने के लिए आगे बढ़े। इस परख का उपयोग करना. अप्रत्याशित रूप से, एचएमडब्ल्यू-पीपीई को एनएडी स्तरों की महत्वपूर्ण बहाली के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, जबकि एलएमडब्ल्यू-पीपीई ने 0.25 मिलीग्राम/एमएल की कम सांद्रता पर भी एफके {{17} प्रेरित एनएडी कमी को स्पष्ट रूप से सुधार दिया है (चित्र) . 2सी और डी). इस प्रकार, इन परिणामों से पता चलता है कि पीपीई में प्राथमिक सक्रिय तत्व विकास कारक और साइटोकिन्स जैसे प्रोटीन के बजाय 3 केडीए से कम के छोटे अणु हैं।

पीपीई में एनएमएन और एनआर जैसे एनएडी अग्रदूत शामिल हैं। हमने रिवर्स-चरण उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके एलएमडब्ल्यू-पीपीई को 12 अंशों में विभाजित किया और जांच की कि किस अंश ने एफके 866- प्रेरित एनएडी कमी की बहाली में योगदान दिया। एलएमडब्ल्यू-पीपीई का एक विशिष्ट एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम चित्र 3ए में दिखाया गया है। टीई एनएडी पुनर्प्राप्ति परख से पता चला कि केवल अंश 3 ने एफके 866- उपचारित एनएचईके (चित्र 3बी) में एनएडी स्तर को स्पष्ट रूप से बढ़ाया है। NAD अग्रदूत, जैसे NMN और NR, NHEKs10,21 सहित विभिन्न सेल लाइनों में NAMPT हस्तक्षेप के बिना इंट्रासेल्युलर NAD स्तर को बढ़ाते हैं। चूंकि एलएमडब्ल्यू-पीपीई ने अभी भी एनएचईके में एनएडी सामग्री को बढ़ाया है, तब भी जब एनएएमपीटी एफके द्वारा बाधित किया गया था, हमने अनुमान लगाया कि पीपीई में निहित एनएडी अग्रदूत इंट्रासेल्युलर एनएडी उत्पादन को बढ़ाते हैं। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हमने एनएडी अग्रदूतों का पता लगाने के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) का उपयोग करके अंश 3 का विश्लेषण किया। परिणामों से पता चला कि एनएमएन (एम/जेड 335→123), एनआर (एम/जेड 255→123), और एनएएम (एम/जेड 123→80) के अनुरूप तीन आयन शिखर अंश 3 में पाए गए ( चित्र 3सी)। परिमाणीकरण विश्लेषण से पता चला कि पूरे पीपीई में निहित एनएमएन, एनआर और एनएएम की सांद्रता क्रमशः 0.22, 17.62 और 0.14 एनजी/मिलीग्राम थी (तालिका 1)। ये परिणाम बताते हैं कि कम से कम तीन एनएडी अग्रदूत, एनएमएन, एनआर और एनएएम, पीपीई में मौजूद हैं और इंट्रासेल्युलर एनएडी-बूस्टिंग में भाग लेते हैं।

चित्र 2. पीपीई एनएचईके में एफके866 द्वारा एनएडी की कमी को सुधारता है। (ए) एनएडी जैवसंश्लेषण का बचाव मार्ग। Te NHEK को 30 मिनट के लिए FK 866 के साथ पूर्व-उपचार किया गया और 24 घंटे के लिए संकेतित सांद्रता पर पूरे-पीपीई (बी), एचएमडब्ल्यू-पीपीई (सी), या एलएमडब्ल्यू-पीपीई (डी) के साथ ऊष्मायन किया गया। कुल NAD स्तर NAD प्लस /NADH परख किट का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे। †पी<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस पर पीपीई का सामयिक प्रशासन ऊतकों के एनएडी स्तर को बढ़ाता है। पीपीई के एनएडी-बूस्टिंग प्रभाव में प्राथमिक सक्रिय तत्व छोटे अणु होते हैं, जिनसे विकास कारकों जैसे बड़े प्रोटीन की तुलना में अधिक ट्रांसडर्मल अवशोषण क्षमता होने की उम्मीद की जा सकती है। इसलिए, त्वचा के ऊतकों में एनएडी के स्तर को बढ़ाने के लिए त्वचा पर पीपीई का सामयिक अनुप्रयोग एक उपयुक्त विकल्प प्रतीत होता है। यह जांचने के लिए कि क्या पीपीई का सामयिक प्रशासन स्ट्रेटम कॉर्नियम के नीचे के एपिडर्मिस में एनएडी स्तर को प्रभावित करता है, 3-आयामी पुनर्निर्मित मानव एपिडर्मिस (आरएचई) को स्ट्रेटम कॉर्नियम पक्ष पर पीपीई के साथ इलाज किया गया था और उपस्थिति या अनुपस्थिति के साथ एक माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। एफके का 866 (चित्र 4ए)। पीपीई के सामयिक अनुप्रयोग ने एफके की अनुपस्थिति या उपस्थिति में एनएडी स्तर को क्रमशः 9.1 प्रतिशत (महत्वपूर्ण नहीं) या 7.3 प्रतिशत (महत्वपूर्ण) बढ़ा दिया (चित्र 4बी)। 10 मिलीग्राम/एमएल तक परीक्षण करने पर पीपीई का कोशिका चयापचय गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जबकि 1 प्रतिशत टीएक्स -100 स्पष्ट रूप से कम हो गया (चित्र 4सी)। टेस परिणाम बताते हैं कि पीपीई में सक्रिय तत्व उपकोर्नियल त्वचा में घुसपैठ कर सकते हैं और हानिकारक प्रभाव पैदा किए बिना त्वचा एनएडी स्तर बढ़ा सकते हैं।

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