प्रीकंडीशनिंग-एक्टिवेटेड AKT MDM2–p53 पाथवे के माध्यम से इस्किमिया के लिए न्यूरोनल टॉलरेंस को नियंत्रित करता हैⅠ

अमूर्त

प्रीकंडीशनिंग-मध्यस्थता वाले न्यूरोप्रोटेक्शन के सबसे महत्वपूर्ण तंत्रों में से एक सेल एपोप्टोसिस का क्षीणन है, जो बाद के हानिकारक इस्किमिया के बाद मस्तिष्क की सहनशीलता को प्रेरित करता है। इस संदर्भ में, एंटीपैप्टोटिक PI3K / AKT सिग्नलिंग मार्ग सेल भेदभाव और उत्तरजीविता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

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सक्रिय AKT को murine डबल मिनट -2 (MDM2), एक E 3- ubiquitin ligase की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए जाना जाता है जो कैंसर कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए p53 को अस्थिर करता है। न्यूरॉन्स में, हमने हाल ही में दिखाया कि NMDA ग्लूटामेट रिसेप्टर के सबटॉक्सिक उत्तेजना के आधार पर MDM2-p53 इंटरैक्शन फार्माकोलॉजिकल प्रीकॉन्डिशनिंग द्वारा प्रबल है, जो इस्किमिया-प्रेरित न्यूरोनल एपोप्टोसिस को रोकता है।

हालाँकि, क्या यह तंत्र इस्केमिक प्रीकॉन्डिशनिंग (IPC) के दौरान न्यूरोनल टॉलरेंस में योगदान देता है अज्ञात है। यहाँ, हम दिखाते हैं कि IPC ने Ser473 में AKT के PI3K-मध्यस्थता वाले फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित किया, जो Ser166 में MDM2 को फॉस्फोराइलेट करता है। इस फॉस्फोराइलेशन ने MDM2 के परमाणु स्थिरीकरण को ट्रिगर किया, जिससे p53 अस्थिरता पैदा हुई, इस प्रकार इस्केमिक अपमान पर न्यूरोनल एपोप्टोसिस को रोका गया। Wortmannin के साथ या AKT साइलेंसिंग द्वारा PI3K/AKT पाथवे का निषेध साइटोसोलिक MDM2 के संचय को प्रेरित करता है, IPC- प्रेरित न्यूरोप्रोटेक्शन को निरस्त करता है।

इस प्रकार, IPC PI3K / AKT सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता को बढ़ाता है और MDM2-p53 इंटरैक्शन को नियंत्रित करके न्यूरोनल टॉलरेंस को बढ़ावा देता है। हमारे निष्कर्ष AKT सिग्नलिंग के मॉड्यूलेशन के माध्यम से IPC- प्रेरित न्यूरोप्रोटेक्शन में शामिल एक नया यंत्रवत मार्ग प्रदान करते हैं, यह सुझाव देते हुए कि AKT इस्केमिक चोट के खिलाफ एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है। कीवर्ड: एकेटी; एमडीएम2; p53; PI3K; इस्केमिक सहिष्णुता; शर्त

1 परिचय

मनुष्यों में, क्षणिक इस्केमिक हमले (टीआईए) के अस्तित्व को स्ट्रोक के रोगियों में कार्यात्मक परिणामों के लाभ के साथ एक अंतर्जात पूर्व शर्त के रूप में प्रकट किया गया है [1-3]। इस्केमिक प्रीकॉन्डिशनिंग (IPC) के रूप में जाना जाने वाला शॉर्ट, सबटॉक्सिक इस्केमिक स्टिमुलस से प्रेरित अंतर्जात न्यूरोप्रोटेक्शन को इस्केमिक चोट [4–6] के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्शन के उभरते क्षेत्र में एक रणनीति माना जाता है।

साक्ष्य से पता चलता है कि आईपीसी-प्रमोटेड न्यूरोप्रोटेक्शन ट्रांसक्रिप्शन, ट्रांसलेशन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल मैकेनिज्म पर निर्भर करता है, जो इस्किमिया [6-11] के बाद प्रमुख प्रोटीन के कार्य को बदल देता है। हालांकि, मानव मस्तिष्क [12,13] में आईपीसी-प्रेरित इस्कीमिक सहिष्णुता (आईटी) में शामिल तंत्र को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है।

आईपीसी-मध्यस्थ न्यूरोप्रोटेक्शन को समझने के लिए नए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का विकास मस्तिष्क आईटी [6] अंतर्निहित अंतर्जात तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें स्ट्रोक रोगियों में मस्तिष्क क्षति को कम करने के उद्देश्य से उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों का अनावरण करने की क्षमता है। पिछले दो दशकों में, एपोप्टोटिक न्यूरोनल सेल डेथ ने सेरेब्रल इस्केमिक चोट [14-16] में शामिल एक आवश्यक तंत्र के रूप में खुद को तैनात किया है। इस अर्थ में, प्रोटीन किनेज बी या एकेटी, एक सेरीन/थ्रेओनाइन किनेज जिसे सक्रिय करने के लिए एक कार्यात्मक फॉस्फॉइनोसाइटाइड किनेज (PI3K) की आवश्यकता होती है, को इस्किमिया [17,18] के बाद न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों के लिए एक आवश्यक लक्ष्य माना गया है।

हाल ही में, हमने प्रदर्शित किया कि PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग के अवरोधन से एक्साइटोटॉक्सिसिटी [19] के लिए न्यूरोनल संवेदनशीलता बढ़ जाती है। AKT एक जटिल एंटी-एपोप्टोटिक सिग्नलिंग नेटवर्क [20] में शामिल है, जिसके घटक ऊतक प्रकार [21,22] के आधार पर विभिन्न उपकोशिकीय स्थानों पर मौजूद हो सकते हैं। दिल में, AKT प्रीकंडीशनिंग-प्रमोटेड कार्डियोप्रोटेक्शन [23] में शामिल रहा है।

साक्ष्य से यह भी पता चलता है कि फॉस्फोराइलेटेड AKT सेरेब्रल इस्किमिया [24] की शुरुआत में न्यूरोनल उत्तरजीविता को बढ़ावा देता है। हालांकि AKT सक्रियण मस्तिष्क में IT को शामिल करने में योगदान दे सकता है [25], इसकी IPC-मध्यस्थ सक्रियता से जुड़ी सटीक तंत्र मायावी बनी हुई है। ट्यूमर कोशिकाओं में, PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण से Ser166/186 पर MDM2 फॉस्फोराइलेशन होता है, जो MDM2 [26,27] के परमाणु रूपांतरण को बढ़ावा देता है और इसकी सर्वव्यापी गतिविधि [28] को बढ़ाता है।

नाभिक में, MDM2 p53 से जुड़ता है और इसके सर्वव्यापकता और बाद में प्रोटीसोमल गिरावट को बढ़ावा देता है, जो p53 फ़ंक्शन [29] को रोकता है। तनाव की स्थिति में, p53 भी MDM2 ओवरएक्प्रेशन को ट्रिगर कर सकता है, जो नकारात्मक फीडबैक लूप [30] में p53 सक्रियण को दबा देता है। PI3K का निषेध AKT सक्रियण [31] और MDM2 फॉस्फोराइलेशन को पूर्वनिर्मित हृदय [32] में रोकता है।

इस संदर्भ में, हमने पहले पाया कि एमडीएम2 प्रोटीन स्तर की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर विवो ब्रेन प्रीकंडीशनिंग में क्षणिक मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (tMCAO) के बाद रोधगलितांश मात्रा को कम कर दिया। नतीजतन, MDM2-p53 कॉम्प्लेक्स ने प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स [33] में p53/PUMA/caspase -3 सिग्नलिंग पाथवे के इस्किमिया-प्रेरित सक्रियण को कमजोर कर दिया।

यहां, हम बाद की इस्केमिक चोट के साथ-साथ अंतर्निहित तंत्र के खिलाफ IPC की मध्यस्थता वाले न्यूरोनल टॉलरेंस में PI3K / AKT सिग्नलिंग पाथवे की भूमिका में खुदाई करते हैं, और हम मुख्य रूप से AKT सक्रियण और MDM2-p53 कॉम्प्लेक्स के बीच संभावित लिंक पर ध्यान केंद्रित करते हैं। .

2. परिणाम

2.1। आईपीसी-प्रमोटेड न्यूरोप्रोटेक्शन

Ser473 पर AKT के फास्फोराइलेशन द्वारा मध्यस्थता की जाती है, Ser166 पर MDM2 का फास्फोराइलेशन, और p53 डिस्टैबिलाइजेशन हमने पहले इस्किमिया [34] और IT [33] के लिए न्यूरोनल संवेदनशीलता पर MDM2-p53 इंटरैक्शन के प्रभाव का वर्णन किया था। यहाँ, हमने MDM2-p53 पाथवे में शामिल होने के लिए एक उम्मीदवार के रूप में IPC की मध्यस्थता वाले न्यूरोप्रोटेक्शन पर AKT की संभावित भूमिका का पता लगाया।

सबसे पहले, हमने पुष्टि की कि इस्किमिया ने न्यूरॉन्स में AKT सक्रियण को बढ़ावा दिया, जैसा कि Ser473 में AKT फॉस्फोराइलेशन द्वारा दर्शाया गया है। जैसा कि चित्र 1A में दिखाया गया है, लघु (20 मिनट) OGD ने महत्वपूर्ण रूप से p(Ser473) AKT और MDM2 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जबकि AKT प्रोटीन का स्तर अपरिवर्तित रहा (चित्र S1A)। हालाँकि, AKT फॉस्फोराइलेशन तब नहीं देखा गया जब न्यूरॉन्स लंबे समय तक OGD (90 मिनट) के अधीन थे। इसके अलावा, MDM2 प्रोटीन का स्तर कम था, जो कि p53 प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति के अनुरूप है जैसा कि चित्र 1A में दिखाया गया है।

OGD (चित्र 1B) के बाद MDM2 अभिव्यक्ति का समय-निर्भर अपरेगुलेशन यह पुष्टि करता है कि सबस्यूट इस्किमिया उन तंत्रों को प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो OGD के बाद p53 स्थिरीकरण को रोकते हैं, जैसा कि पहले बताया गया है [33]। हमने IPC (चित्र S1B) [33] के एक मॉडल के रूप में लघु OGD (20 मिनट) का उपयोग किया, जिसके बाद पुनर्संयोजन के 2 घंटे का उपयोग किया गया; इस प्रकार, हमने ओजीडी (ओजीडी/आर) के बाद या आईपीसी प्रोटोकॉल (आईपीसी प्लस ओजीडी/आर) से पहले ओजीडी के बाद पुनर्ऑक्सीकरण के 4 घंटे में एकत्रित न्यूरोनल अर्क का विश्लेषण किया। समानांतर में, न्यूरॉन्स को नॉर्मोक्सिया (Nx) या प्रीकॉन्डिशनिंग (IPC) सेटिंग्स (चित्र S1B) में इनक्यूबेट किया गया था।

जैसा कि चित्र 1C और चित्र S1C में दिखाया गया है, IPC ने AKT के शुरुआती सक्रियण को प्रेरित किया, जैसा कि Ser473 [35] में फॉस्फोराइलेशन द्वारा प्रकट किया गया था, इसके बाद MDM2 प्रोटीन स्थिरीकरण और Ser166 पर फॉस्फोराइलेशन हुआ। IPC ने OGD/R (चित्र 1C) से प्रेरित p53 स्थिरीकरण को भी रोका। दिलचस्प रूप से, चित्रा 1डी में दिखाए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से पता चला है कि आईपीसी ने न्यूरॉन्स में सेर473 में एकेटी फास्फारिलीकरण को बढ़ावा दिया, जो मुख्य रूप से नाभिक में जमा हुआ, और गैर-पूर्वानुकूलित न्यूरॉन्स (ओजीडी) की तुलना में ओजीडी/आर (आईपीसी प्लस ओजीडी/आर) के बाद पी53 स्थिरीकरण में कमी आई। /आर)।

नतीजतन, IPC ने क्रमशः फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा S1D) और फ्लोरोमेट्री एसेज़ (चित्र S1E) द्वारा मापे गए OGD/R के कारण होने वाले न्यूरोनल एपोप्टोसिस और कैस्पेज़ -3 सक्रियण को रोका। IPC की मध्यस्थता वाले न्यूरोप्रोटेक्शन में p53 की भूमिका की पुष्टि करने के लिए, हमने न्यूरॉन्स व्यक्त (जंगली-प्रकार; wt) या नहीं (नॉकआउट; ko) p53 प्रोटीन का उपयोग किया। हमारे परिणाम बताते हैं कि p53 (चित्र S1F) की कमी वाले न्यूरॉन्स p53 wt न्यूरॉन्स की तुलना में OGD- प्रेरित एपोप्टोसिस के प्रति अधिक प्रतिरोधी थे।

इसके अलावा, p53KO न्यूरॉन्स में एपोप्टोसिस का स्तर पूर्वानुकूलित (IPC plus OGD/R) wt न्यूरॉन्स (चित्र S1G) में देखे गए समान था, इस प्रकार IPC-मध्यस्थता न्यूरोप्रोटेक्शन [33] में p53 अस्थिरता की प्रमुख भूमिका की पुष्टि करता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि IPC ने एक तंत्र के माध्यम से एक इस्केमिक अपमान के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्शन को प्रेरित किया जिसमें Ser473 में AKT का फॉस्फोराइलेशन, Ser166 पर MDM2 स्थिरीकरण और फॉस्फोराइलेशन, और p53 अस्थिरता शामिल है।

2.2। PI3K/AKT पाथवे के माध्यम से Ser166 पर IPC ट्रिगर MDM2 फॉस्फोराइलेशन

PI3K / AKT सिग्नलिंग मार्ग इन विट्रो [36] और विवो [37] दोनों में न्यूरोनल आईटी में शामिल है। हालाँकि, MDM2-p53 कॉम्प्लेक्स के नियमन में PI3K / AKT पाथवे के IPC-मध्यस्थता सक्रियण की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। इसे स्पष्ट करने के लिए, न्यूरॉन्स को PI3K/AKT पाथवे, वोर्टमैनिन [19] के अपरिवर्तनीय और विशिष्ट अवरोधक के साथ जोड़ा गया।

जैसा कि चित्र 2ए में दिखाया गया है, वोर्टमैनिन ने आईपीसी-संवर्धित (सेर473) एकेटी फॉस्फोराइलेशन और पी53 अस्थिरता को निरस्त कर दिया, जैसा कि चित्र 1डी में दिखाया गया है। ये परिणाम OGD/R के बाद प्रेरित AKT सक्रियण और p53-मध्यस्थ न्यूरोनल एपोप्टोसिस (चित्र S1D) और कैसपेज़ -3 सक्रियण (चित्र S1E) के निषेध के बीच एक सीधा लिंक सुझाते हैं। P53 स्थिरीकरण का मुख्य नियामक, MDM2, AKT [26] का एक लक्ष्य है, जो Ser166 और Ser186 [26] पर MDM2 को फॉस्फोराइलेट करता है। Wortmannin के साथ PI3K निषेध ने IPC (चित्र 2B) द्वारा प्रेरित दोनों (Ser473) AKT और (Ser166) MDM2 के फॉस्फोराइलेशन को रोका।

IPC द्वारा प्रेरित Ser166 पर MDM2 के विशिष्ट Akt-मध्यस्थता फास्फारिलीकरण की पुष्टि एक छोटे से हस्तक्षेप करने वाले RNA (siRNA) का उपयोग करके की गई थी, जिसे विशेष रूप से AKT1 प्रोटीन (siAkt) के खिलाफ डिज़ाइन किया गया था, जो कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है, और जिसकी गतिविधि ischemia के बाद न्यूरोनल उत्तरजीविता के लिए आवश्यक है [ 38]। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, siAkt ने HEK -293T कोशिकाओं (चित्र 3A) और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (चित्र 3B) दोनों में ट्रांसफ़ेक्शन के बाद 3 दिन में कुल AKT और p(Ser473) AKT प्रोटीन के स्तर को कम कर दिया।

इसके अलावा, AKT नॉकडाउन (siAkt) ने (Ser166) MDM2 फॉस्फोराइलेशन (चित्र 3B) को रोका। इन परिणामों से पता चलता है कि IPC- सक्रिय PI3K / AKT सिग्नलिंग पाथवे MDM2 फॉस्फोराइलेशन को Ser166 पर बढ़ावा देता है, जो MDM2 स्थिरीकरण और इस्केमिक चोट के परिणामस्वरूप p53 अस्थिरता के लिए जिम्मेदार हो सकता है।

2.3। इस्किमिया के बाद IPC-सक्रिय AKT ट्रिगर परमाणु MDM2 प्रोटीन स्थिरीकरण

AKT की सक्रियता ट्यूमर कोशिकाओं [26] में MDM2 के परमाणु रूपांतरण में शामिल रही है। इस्केमिया [34] के बाद न्यूरोनल उत्तरजीविता के लिए परमाणु MDM2 स्थिरीकरण की प्रासंगिकता को ध्यान में रखते हुए, और अधिक विशेष रूप से, IPC [33] में इसकी न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका, हमने MDM2 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के नियमन में PI3K / AKT सिग्नलिंग मार्ग की प्रासंगिकता की जांच करने का निर्णय लिया। प्रोटीन।

इस प्रकार, न्यूरॉन्स या HEK -293टी कोशिकाओं को मानव MDM2-टैग प्रोटीन (MDM2-GFP) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। चार अलग-अलग प्रायोगिक स्थितियों (Nx, IPC, OGD/R, और IPC प्लस OGD/R) के बाद एक्टोपिक रूप से मानव MDM2 प्रोटीन को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स से ट्रांसफ़ेक्टेड HEK -293 के प्रतिनिधि धब्बे चित्र 4A और चित्र S1H में दिखाए गए हैं , क्रमश।

एमडीएम 2- जीएफपी की एक्टोपिक अभिव्यक्ति ने पुष्टि की कि आईपीसी गैर-पूर्वानुकूलित इस्केमिक (ओजीडी/आर) या नॉर्मोक्सिक (एनएक्स) न्यूरॉन्स (चित्रा 4ए, बी) की तुलना में एमडीएम2 परमाणु संचय को बढ़ावा देता है, जैसा कि परमाणु/साइटोसोलिक फ्लोरेसेंस अनुपात के परिमाणीकरण से पता चलता है। (चित्र S2B) और MDM 2- GFP (चित्र S2C) की परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता।

2.4। IPC p(Ser473)AKT और MDM2 इंटरेक्शन को बढ़ावा देता है, जो न्यूक्लियस में MDM2 स्थिरीकरण को बढ़ाता है और इस्किमिया पर प्रेरित न्यूरोनल एपोप्टोसिस को कम करता है

MDM2 के परमाणु स्थिरीकरण में PI3K/AKT पाथवे के IPC- संवर्धित सक्रियण की भूमिका के प्रदर्शन के बाद, हमने आगे जांच की कि क्या p(Ser473) AKT और MDM2 ने नाभिक (चित्र 6A) के भीतर परस्पर क्रिया की है। परमाणु प्रोटीन के अर्क से MDM2 इम्युनोप्रेजर्वेशन, इसके बाद MDM2 और p(Ser473) AKT के खिलाफ इम्युनोब्लॉटिंग ने खुलासा किया कि IPC ने OGD/R के बाद p(Ser473) AKT और MDM2 के बीच बातचीत को बढ़ावा दिया, इस प्रकार OGD/R- प्रेरित परमाणु p53 स्थिरीकरण को रोका। जैसा कि नाभिक इनपुट में दिखाया गया है (चित्र 6क)।

अंत में, हमने न्यूरोनल एपोप्टोसिस (चित्रा 6बी) पर PI3K/AKT मार्ग के व्यवधान के हानिकारक प्रभाव का अध्ययन किया। AKT निषेध ने OGD से पहले IPC के सुरक्षात्मक प्रभाव का प्रतिकार किया, जो IT के संदर्भ में AKT-MDM2 की न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका की पुष्टि करता है। इस प्रकार, हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि IPC AKT के फॉस्फोराइलेशन और सक्रियण को प्रेरित करता है, जो MDM2 फॉस्फोराइलेशन को Ser166 और न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन को बढ़ावा देता है, जहाँ यह p (Ser473) AKT के साथ इंटरैक्ट करता है। यह तंत्र MDM2 के परमाणु स्थिरीकरण को बढ़ाने में योगदान दे सकता है, जो IPC- प्रेरित इस्केमिक सहिष्णुता में एक आवश्यक भूमिका निभाता है।

कैसे Cistanche न्यूरॉन्स की रक्षा करता है?

यह सुझाव देने के लिए कुछ सबूत हैं कि Cistanche एपोप्टोसिस (क्रमादेशित कोशिका मृत्यु) को कम करके और न्यूरोनल उत्तरजीविता को बढ़ावा देकर न्यूरॉन्स की रक्षा कर सकता है। एपोप्टोसिस एक प्राकृतिक प्रक्रिया है जो शरीर में क्षतिग्रस्त या अवांछित कोशिकाओं को हटाने के लिए होती है, लेकिन यह अत्यधिक या अनुपयुक्त होने पर हानिकारक हो सकती है। प्रयोगशाला अध्ययनों में सिस्टैंच को एपोप्टोसिस को रोकने के लिए पाया गया है, और यह प्रभाव न्यूरॉन्स को नुकसान से बचाने में मदद कर सकता है।

इसके अलावा, Cistanche में कई बायोएक्टिव यौगिक होते हैं जिन्हें न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, इसमें इचिनेकोसाइड होता है, जो न्यूरॉन्स को ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन से बचाने के लिए दिखाया गया है। इसमें एक्टियोसाइड भी होता है, जिसमें एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटीऑक्सीडेंट गुण पाए जाते हैं।

करने के लिए जारी...

एमिलिया बैरियो 1,†, रेबेका वेसिनो 1,2,†, आइरीन सांचेज़-मोरान 1 , क्रिस्टीना रोड्रिग्ज 1,2,3, अल्बर्टो सुआरेज़-पिंडाडो 1 , जुआन पी. बोलानोस 1,2,3,4, एंजेल्स अल्मेडा 1, 2,3 और मारिया डेलगाडो-एस्टेबन 1,2,3,*

1 कार्यात्मक जीव विज्ञान और जीनोमिक्स संस्थान, सलामांका विश्वविद्यालय, सीएसआईसी, 37007 सलामांका, स्पेन; emibg7@gmail.com (ईबी); rebecavecino@usal.es (आरवी); आइरीन _sm@usal.es (आईएस-एम); c.rodriguez@usal.es (सीआर); Alsuap77@gmail.com (एएस-पी।); jbolanos@usal.es (जेपीबी); aaparra@usal.es (एए)

2 सलामांका के बायोमेडिकल रिसर्च संस्थान, सलामांका के विश्वविद्यालय अस्पताल, सलामांका विश्वविद्यालय, सीएसआईसी, 37007 सलामांका, स्पेन

3 जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान विभाग, सलामांका विश्वविद्यालय, 37007 सलामंका, स्पेन 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 मैड्रिड, स्पेन * पत्राचार: mdesteban@usal.es ; दूरभाष: प्लस 34-923-29-4908