सुरक्षात्मक प्रभाव और विवो और इन विट्रो भाग 1 में पार्किंसंस रोग पर Procyanidins के तंत्र

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सारांश:इस शोध ने न्यूरोटॉक्सिन 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपायरिडीन (एमपीटीपी) और इसके मेटाबोलाइट 1-मिथाइल-4-फेनिलपाइरिडिनियम (एमपीपी +) प्रेरित पार्किंसंस रोग (पीडी) मॉडल के खिलाफ प्रोसाइनिडिन्स (पीसी) के आणविक तंत्र का मूल्यांकन किया। इन विट्रो में, PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए पीसी या डेप्रेनाइल के साथ इनक्यूबेट किया गया था और फिर 24 घंटे के लिए 1.5 mM MPP + के संपर्क में लाया गया था। विवो में, ज़ेब्राफ़िश लार्वा (एबी स्ट्रेन) 3 दिन के बाद निषेचन (पीडीएफ) को 4 दिनों के लिए 400 यूएम एमपीटीपी में डेप्रेनाइल या पीसी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। अकेले एमपीपी * / एमपीटीपी की तुलना में, पीसी ने एंटीऑक्सिडेंट गतिविधियों (जैसे, ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच-पीएक्स), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), कैटालेज (कैट)) में काफी सुधार किया, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और मैलोन्डिएल्डिहाइड (एमडीए) के स्तर में कमी आई। इसके अलावा, पीसी ने पीसी 12 कोशिकाओं में परमाणु एनआरएफ 2 संचय में काफी वृद्धि की और अकेले एमपीपी * / एमपीटीपी की तुलना में एनक्यूओ 1, एचओ -1, जीसीएलएम और जीसीएलसिन दोनों पीसी 12 कोशिकाओं और ज़ेबराफ़िश की अभिव्यक्ति को बढ़ाया। वर्तमान अध्ययन से पता चलता है कि पीसी के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव हैं, परमाणु कारक-2-संबंधित कारक 2 (एनआरएफ 2) / एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया तत्व (एआरई) मार्ग को सक्रिय करते हैं, और एमपीपी + / एमपीटीपी-प्रेरित पीडी मॉडल में ऑक्सीडेटिव क्षति को कम करते हैं।

खोजशब्दों:procyanidins; पार्किंसंस रोग; PC12 कक्षों; ज़ेब्राफ़िश; NRF2/ARE Pathway

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1. परिचय

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव सिंड्रोम है जो सबस्टेंसिया निग्रा में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की अनुपस्थिति के कारण होता है। इसकी नैदानिक अभिव्यक्तियों में मोटर मंदता, कंपन, कठोरता और पोस्टुरल अस्थिरता [1-6] शामिल हैं। पीडी रोगियों में न्यूरोनल अध: पतन को रोकने या रिवर्स करने के लिए प्रभावी तरीके अभी भी अस्पष्ट हैं। इसलिए, उपन्यास एंटीपार्किंसनियन दवाओं की खोज और विकास पीडी उपचार की खोज में एक शीर्ष प्राथमिकता बनी हुई है।

यद्यपि पीडी का रोगजनन अस्पष्ट रहता है, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ऑक्सीडेटिव तनाव डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स [7,8] के नुकसान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। डोपामाइन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और इलेक्ट्रोफिलिक क्विनोन अणुओं [9] के उत्पादन का नेतृत्व करने के लिए ऑटो- या एंजाइम-उत्प्रेरित ऑक्सीकरण से गुजर सकता है, दोनों प्रक्रियाएं जो ऑक्सीडेटिव और इलेक्ट्रोफिलिक तनाव के लिए डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की भेद्यता को रेखांकित कर सकती हैं[10-12]। इसलिए, पीडी की रोकथाम या उपचार के लिए एक संभावित विधि अत्यधिक आरओएस को खत्म करने के लिए एंटीऑक्सिडेंट के साथ उपचार के पूरक के लिए हो सकती है। दरअसल, प्राकृतिक बायोएक्टिव यौगिक लाभप्रद होते हैं कि वे अक्सर उपभोक्ताओं के लिए सुरक्षित होते हैं और बहुत कम (यदि कोई हो) प्रतिकूल प्रतिक्रियाएं होती हैं [13]। इसलिए, प्राकृतिक संसाधनों से एंटीऑक्सिडेंट यौगिक पीडी के उपचार में सहायता कर सकते हैं।

Cistanche प्रतिरक्षा में सुधार कर सकते हैं

Procyanidins (पीसी) फ्लेवोनोइड्स के प्राकृतिक फेनोलिक यौगिक हैं, जिनमें मोनोमर कैटेचिन और एपिकेटेचिन के ओलिगोमर्स शामिल हैं [14]। पीसी प्राकृतिक पोषक तत्व और एंटीऑक्सिडेंट हैं जो एंटीऑक्सिडेंट प्रभावों के साथ विटामिन सी और ई की तुलना में मजबूत हैं [15]। Nrf2 / ARE मार्ग एक महत्वपूर्ण एंटीऑक्सिडेंट मार्ग है। Nrf2 को Keap1 से ROS द्वारा या इलेक्ट्रोफिलिक प्रतिक्रिया के माध्यम से जारी किया जाता है। इसके बाद, यौगिक तब नाभिक में एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया तत्व (एआरई) को बांधता है और पेरोक्सिरेडोक्सिन और चरण II विषहरण एंजाइमों (एचओ -1, जीसीएलसी, जीसीएलएम और एनक्यूओ -1) की अभिव्यक्ति की मध्यस्थता करता है, जो आरओएस के मैला ढोने वालों के रूप में कार्य करते हैं और कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाते हैं [16]।

भ्रूणीय ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में डोपामिनर्जिक, नॉरएड्रिनर्जिक और एड्रीनर्जिक न्यूरॉन्स के कई समूह होते हैं जो वयस्क मस्तिष्क में पाए जाने वाले स्थानों के समान होते हैं [17-19]। निषेचन के बाद 3 दिनों तक (पीडीएफ), डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को वेंट्रल डायनसेफेलन, प्रीटेकटम, लोकस कोएरूलस, घ्राण बल्ब और रेटिना [20] में देखा जाता है। प्रयोगात्मक चूहों के मॉडल की तुलना में, ज़ेब्राफ़िश मॉडल कम प्रयोगात्मक अवधि, कम लागत और जीन हेरफेर में कम जटिलता के साथ जुड़े हुए हैं [21] चूहे pheochromocytoma कोशिकाओं (PC12 कोशिकाओं) आकारिकी, संरचना, और समारोह में न्यूरॉन्स के लिए बहुत समान हैं [22]. वे प्राथमिक सुसंस्कृत तंत्रिका कोशिकाओं के साथ अत्यधिक सुसंगत हैं और आसान और स्थिर संस्कृति के फायदे हैं [23]। PC12 कोशिकाओं को व्यापक रूप से तंत्रिका कोशिकाओं [24-26] के अध्ययन के लिए मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है।

न्यूरोटॉक्सिन 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपायरिडिन (एमपीटीपी) को मनुष्यों में एक सिंड्रोम का कारण बनने के लिए दिखाया गया है जो पार्किंसंस रोग जैसा दिखता है। एमपीटीपी सब्सटेंसिया निग्रा में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के चयनात्मक अध: पतन का कारण बनता है, और रोगी झटके, अस्थिरता और एक फेरबदल चाल [27] सहित लक्षणों को प्रदर्शित करते हैं। एमपीटीपी को मस्तिष्क में ग्लियाल कोशिकाओं में 1-मिथाइल-4-फेनिलपाइरिडिनियम (एमपीपी) के लिए चयापचय किया जाता है। ग्लिया से रिलीज के बाद, एमपीपी + को डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (डीएटी) के माध्यम से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में ले जाया जाता है[28] और माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है, जहां माना जाता है कि यह श्वसन एंजाइमों को बाधित करके और ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनकर कोशिका मृत्यु का कारण बनता है [29,30]। पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि पीसी मादा चूहों की कुछ उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं को रोकते हैं [31] और नसों पर कुछ सुरक्षात्मक प्रभाव डालते हैं [32,33]। हालांकि, क्या पीसी एनआरएफ 2 / एआरई मार्ग को विनियमित करके पीडी में न्यूरोनल अध: पतन को रोक सकते हैं या रिवर्स कर सकते हैं, यह स्पष्ट नहीं है। इस अध्ययन ने पीडी के एक मॉडल पर पीसी के सुरक्षात्मक प्रभावों और संभावित तंत्र का आकलन करने के लिए एमपीपी-उपचारित पीसी 12 कोशिकाओं [34,35] और एमपीटीपी-उपचारित ज़ेबराफ़िश [36] को नियोजित किया।

2. परिणाम

2.1.MPP पर पीसी के प्रभाव +-PC12 कोशिकाओं की प्रेरित cytotoxicity

PC12 कोशिकाओं के इनक्यूबेशन 24 घंटे के लिए 1.5 mM MPP + के लिए 58.88% (चित्रा ला) की सेल व्यवहार्यता के परिणामस्वरूप। पीसी के साथ कोशिकाओं के pretreatment ने PC12 कोशिकाओं को MPP + से संरक्षित किया - सेल व्यवहार्यता (चित्रा 1b) को बढ़ाकर प्रेरित क्षति। 4ug/mL PC समूह और 30 μM deprenyl समूह (सकारात्मक नियंत्रण समूह) (चित्रा 1b) के बीच सेल उत्तरजीविता दर में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं था।

2.2. पीसी कम एमपीपी + - प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और बढ़ी हुई एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम गतिविधि

ROS और malondialdehyde (MDA) का स्तर ऑक्सीडेटिव क्षति की गंभीरता को इंगित करता है। PC12 कोशिकाओं को 1.5 mM MMP + के लिए 24 घंटे के लिए उजागर करने से ROS और MDA के स्तर में वृद्धि हुई, जो 4ug / mL (चित्रा 2a-c) पर पीसी द्वारा बाधित किए गए थे। एमपीपी + - उपचारित पीसी 12 कोशिकाओं की एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं पर पीसी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच-पीएक्स), कैटालेज (कैट), और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) गतिविधि को मापा और देखा कि एमपीपी + उपचार ने जीएसएच-पीएक्स, कैट और एसओडी गतिविधि को दबा दिया। हालांकि, इन एमपीपी + प्रभावों को पीसी एक्सपोजर द्वारा 4 μg / mL (चित्रा 2d-f) पर बचाया गया था।

2.3.Nrf2 पर पीसी के प्रभाव / एमपीपी में मार्ग हैं + प्रेरित PC12 कोशिकाओं

परमाणु कारक-2-संबंधित कारक 2 (Nrf2) की अभिव्यक्ति को अपरेगुलेटेड किया गया था, और पीसी उपचार (चित्रा 3 ए-सी) के बाद Keap1 के स्तर को कम कर दिया गया था। पीसी (4 μg / mL) ने MPP घाव की स्थिति (चित्रा 3d-f) के तहत Nrf2 के परमाणु स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान की। इसके अतिरिक्त, पश्चिमी धब्बा डेटा ने हीम ऑक्सीजनेज 1 (एचओ -1), क्विनोन ऑक्सीडोरेडक्टेस 1 (एनक्यूओ 1), ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगाज़ उत्प्रेरक सबयूनिट (जीसीएलसी) और ग्लूटामेट-सिस्टीन लिगाज़ सबयूनिट (जीसीएलएम) अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति में एक चिह्नित अपरेग्युलेशन दिखाया पीसी (4 यूजी / एमएल) उपचार के बाद, अकेले एमपीपीटी एक्सपोजर (चित्रा 3 जी-के) की तुलना में।

2.4.Nf2/ ARE सिग्नलिंग पीसीएस द्वारा मध्यस्थता न्यूरोप्रोटेक्टिव और एंटीऑक्सिडेंट प्रभावों से संबंधित है

SIRNA द्वारा Nrf2 के नॉकडाउन ने Nrf2 की अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से समाप्त कर दिया (चित्रा 4a, b)। दरअसल, Nrf2 siRNA उपचार ने MPP + - उपचारित ऑक्सीडेटिव क्षति के खिलाफ पीसी के सुरक्षात्मक कार्यों को रद्द कर दिया, जैसा कि Nrf2 siRNA-transfected समूह (चित्रा 4c) में कम सेल व्यवहार्यता से स्पष्ट है। इसके अलावा, एमडीए और एसओडी पर पीसी के प्रभावों को एमपीपी घाव की स्थिति के तहत एनआरएफ 2 नॉकडाउन द्वारा उलट दिया गया था (चित्रा 4 डी, ई।

2.5. MPTP उपचार पर Zebrafish Laroae गतिशीलता पर पीसी के प्रभाव

एमपीटीपी ने कुल दूरी को कम कर दिया ज़ेबराफ़िश तैरा। पीसी (4,8 और 16 यूजी / एमएल) उपचार ने एमपीटीपी-प्रेरित लोकोमोटिव घाटे को बचाया और एमपीटीपी समूह (चित्रा 5ए, बी) के सापेक्ष यात्रा की गई कुल दूरी में वृद्धि की। इसके अलावा, deprenyl एमपीटीपी-प्रेरित क्षति से सुरक्षा प्रदान करने के लिए दिखाई दिया और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। विशेष रूप से, पीसी (16 μg / mL) और deprenyl (40 μM) अकेले सामान्य ज़ेब्राफ़िश लार्वा के लोकोमोशन व्यवहार को प्रभावित नहीं करते थे।

2.6.Zbrafish में MPTP-प्रेरित डोपामिनर्जिक न्यूरॉन चोट पर पीसी के प्रभाव

एमपीटीपी के साथ इनक्यूबेट किए गए ज़ेब्राफ़िश भ्रूण ने टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (टीएच) घनत्व (चित्रा 6 ए, बी) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया। फिर भी, पीसी के 16 μg / mL के साथ उपचार ने THt सेल घनत्व (चित्रा 6a, b) में कमी को काफी उलट दिया।

चित्र 2. पीसी ने एमपीपी + प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव को कम कर दिया और एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम गतिविधि में वृद्धि की। (क) आरओएस स्तरों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग विश्लेषण द्वारा मापा गया था; (बी) आरओएस स्तरों को इमेजजेसॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था; (सी) एमडीए स्तर; (डी) जीएसएच-पीएक्स गतिविधि; (ई) कैट गतिविधि; (एफ) एसओडी गतिविधि। विचरण के एक तरफ़ा विश्लेषण के एफ और पी मान प्रत्येक चार्ट के ऊपर प्रस्तुत किए जाते हैं। Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण के परिणाम चयनित तुलनाओं के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं: ns, p>0.05;*,p<><0.01;,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

चित्र 3. Nrf2 पर पीसी के प्रभाव / एमपीपी में हैं / (क) NRF2 और Keep-1 के प्रोटीन स्तर, जैसा कि पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा निर्धारित किया गया है; (b) Nrf2 / GAPDH प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(c) Keap1 / GAPDH प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(d) परमाणु Nrf2 और साइटोप्लाज्मिक Nrf2 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर, जैसा कि पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा निर्धारित किया गया है; (ङ) नाभिकीय एनआरएफ2/लैमिनबी प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात); (च) साइटोप्लाज्मिक एनआरएफ2/जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(जी) एचओ-1, एनक्यूओ1, जीसीएलकेण्ड जीसीएलएम के प्रोटीन स्तर, जैसा कि पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा निर्धारित किया गया है; (एच) एचओ -1/ जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(i) एनक्यूओ 1/ जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(जे) जीसीएलसी / जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(के) जीसीएलएम / जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(के) जीसीएलएम / जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात)। विचरण के एक तरफा विश्लेषण के एफ और pvalues प्रत्येक चार्ट के ऊपर प्रस्तुत कर रहे हैं। Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण के परिणाम चयनित तुलना के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं: ns,p>0.05;*,p<><0.01;the error="" bars="" are="">

चित्र 4. Nrf2/ARE सिग्नलिंग पीसी द्वारा मध्यस्थता किए गए न्यूरोप्रोटेक्टिव और एंटीऑक्सिडेंट प्रभावों से संबंधित है। (ए) नॉकआउट दक्षता का पता पश्चिमी ब्लोटिंग का उपयोग करके एनआरएफ 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति के निर्धारण द्वारा लगाया गया था; (बी) एनआरएफ 2 / जीएपीडीएच प्रोटीन सापेक्ष अभिव्यक्ति (नियंत्रण के लिए अनुपात) ;(सी) सेल व्यवहार्यता; (डी) एमडीए स्तर; (ई) एसओडीएक्टिविटी। प्रत्येक चार्ट के ऊपर प्रसरण के एक-तरफ़ा विश्लेषण के मान ज्ञात कीजिये। Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण के परिणाम चयनित तुलना के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं: ns, p >0.05;*,p<0.05;**,p><0.01;**,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

चित्र 5. एमपीटीपी उपचार पर ज़ेबराफ़िश लार्वा गतिशीलता पर पीसी के प्रभाव। (क) प्रत्येक समूह में ज़ेब्राफ़िश लार्वा के तैराकी के निशान के विशिष्ट पैटर्न; (बी) प्रत्येक समूह में ज़ेबराफ़िश लार्वा की औसत कुल दूरी। प्रसरण के एक तरफ़ा विश्लेषण के एफ और पी मान चार्ट के ऊपर प्रस्तुत किए गए हैं। Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण के परिणाम चयनित तुलना के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं: **, पी<0.001; the="" error="" bars="" are="">

यह लेख निकाला गया है अणु 2021, 26, 5558। https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules