एंग II-प्रेरित चूहा किडनी सेल की चोट पर एंडोथेलियल प्रोजेनिटर सेल माइक्रोवेसिकल्स के सुरक्षात्मक प्रभाव

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सार।क्रोनिक हाइपरटेंशन हो सकता हैगुर्दे खराब,उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी या उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोस्क्लेरोसिस के रूप में जाना जाता है। प्रभावी निदान और उपचार के लिए आणविक तंत्र की और समझ जिसके माध्यम से उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी विकसित होती है, आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन ने उन तंत्रों की जांच की जिनके द्वारा एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाएं (ईपीसी) प्राथमिक चूहे की मरम्मत करती हैंगुर्दासेल (पीआरके)। एलिसा, सेल काउंटिंग किट -8 और फ्लो साइटोमेट्री एसेज़ का उपयोग ईपीसी या ईपीसी-एमवी के ऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन, सेल प्रसार, एपोप्टोसिस और एंगआईआई द्वारा प्रेरित पीआरके के चक्र पर प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। एंजियोटेंसिन II (आंग II) का उपयोग करके एक पीआरके चोट मॉडल स्थापित किया गया था। एंग II इंडक्शन के बाद, पीआरके प्रसार कम हो गया, एपोप्टोसिस को बढ़ा दिया गया और एस चरण में प्रवेश करने से पहले जी 1 चरण में सेल चक्र को अवरुद्ध कर दिया गया। यह पाया गया कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और malondialdehyde के स्तर में वृद्धि हुई थी, जबकि ग्लूटाथियोन पेरोक्साइड और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज के स्तर में कमी आई थी। इसके अलावा, भड़काऊ साइटोकिन्स IL‑1, IL‑6 और TNF‑ के स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। इस प्रकार, एंग II ने ऑक्सीडेटिव तनाव को उत्तेजित करके और भड़काऊ प्रतिक्रिया को बढ़ावा देकर पीआरके को नुकसान पहुंचाया। हालाँकि, जब पीआरके को ईपीसी के साथ सह-संवर्धित किया गया था, तो एंग II द्वारा प्रेरित क्षति काफी कम हो गई थी। वर्तमान अध्ययन ने ईपीसी द्वारा स्रावित माइक्रोवेसिकल्स (एमवी) को एकत्र किया और उन्हें एंग II-प्रेरित पीआरके के साथ सह-संवर्धित किया, और पहचान की कि ईपीसी-एमवी ने पीआरके पर अपने सुरक्षात्मक प्रभाव को बरकरार रखा है। अंत में, ईपीसी गुप्त एमवी के माध्यम से पीआरके को एंग II-प्रेरित क्षति से बचाते हैं।

किडनी/गुर्दे की बीमारी में सुधार करेगा सिस्टैन्च

परिचय

उच्च रक्तचाप कार्डियोवैस्कुलर और सेरेब्रोवास्कुलर बीमारियों की घटनाओं और उनकी संबंधित मृत्यु दर (1) के लिए एक जोखिम कारक है।गुर्देउच्च रक्तचाप का कारण बन सकता है और उच्च रक्तचाप क्षति के लक्षित अंगों में से एक है (2)। दीर्घकालिकगुर्दे की बीमारी(सीकेडी) पिछले दो दशकों (3,4) में दुनिया भर में उच्च रक्तचाप वाले व्यक्तियों में मृत्यु दर में वृद्धि के प्रमुख कारणों में से एक रहा है। इस प्रकार, उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी के उपचार को बढ़ावा देने और इसके रोग तंत्र का अध्ययन करने की तत्काल आवश्यकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एंजियोटेंसिन II (आंग II) ने संवहनी क्षति को प्रेरित किया और कई तंत्रों के माध्यम से संवहनी रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई, जैसे उत्प्रेरण एपोप्टोसिस (5), सेल साइकल अरेस्ट (6), प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर में वृद्धि। 7), malondialdehyde (MDA) के स्राव को बढ़ाकर और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (GSH-Px) और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (SOD) (8,9) के स्राव को कम करके ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया को बढ़ावा देता है। Ang II भी सूजन से संबंधित कारकों के उत्पादन को बढ़ावा देता है, जैसे कि IL-6, IL-1 और TNF‑ (10-12)। इसलिए एंग II-प्रेरित क्षति का उपयोग प्राथमिक चूहे सहित इन विट्रो में उच्च रक्तचाप को मॉडल करने के लिए किया गया हैगुर्दाकोशिकाओं (पीआरके) (13,14)।

रोगियों के लिएगुर्दे समारोहहानि, एंडोथेलियल कोशिकाओं को नुकसान और पुनर्जनन में कमी और मरम्मत पेरिटुबुलर माइक्रोवेसिकल्स (एमवी) (15) के नुकसान के मुख्य कारण हैं। अस्थि मज्जा से प्राप्त एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाएं (ईपीसी) एंडोथेलियल मरम्मत (16,17) को बढ़ावा दे सकती हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ईपीसी हृदय पुनर्जनन (18) में सुधार कर सकते हैं और एंजियोजेनेसिस (19) को विनियमित कर सकते हैं, साथ ही तीव्र पर चिकित्सीय प्रभाव डाल सकते हैं।गुर्देischemia-reperfusion चोट (20) और रोगियों मेंगुर्दा प्रत्यारोपण(21)। हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी पर ईपीसी के प्रभाव को पहले नहीं बताया गया है। हमने अनुमान लगाया कि ईपीसी का उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रभाव हो सकता हैगुर्देकोशिकाएं। एमवी शरीर में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा लगातार स्रावित होते हैं, जैसे कि उपकला कोशिकाएं, ट्यूमर कोशिकाएं और स्टेम कोशिकाएं, और शरीर के कई तरल पदार्थों में मौजूद होती हैं, जैसे रक्त, मूत्र और दूध, जहां वे जैविक कार्यों में मध्यस्थता करते हैं (22)। संचित साक्ष्य ने सुझाव दिया है कि ईपीसी का सुरक्षात्मक प्रभाव एमवी की रिहाई के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है (23,24) वर्तमान अध्ययन में, सुरक्षात्मक प्रभावों और तंत्रों की जांच करके उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी के उपचार के लिए ईपीसी-एमवी के संभावित अनुप्रयोग की जांच की गई थी। जिसके माध्यम से ईपीसी-एमवी उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी के उपचार के लिए एक जैविक सैद्धांतिक आधार प्रदान करने के लिए एंग II-प्रेरित पीआरके चोट से रक्षा करते हैं।

कीवर्ड:ईपीसी-एमवी, उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी, एंग II, आरओएस, एमवी, सूजन, गुर्दे, गुर्दे

सामग्री और तरीके

जानवरों।बीजिंग वाइटल रिवर लेबोरेटरी एनिमल टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड (लाइसेंस) से कुल 12 8-सप्ताह के पुरुष विस्टार-क्योटो (WKY) विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त चूहे (वजन, 80-120 ग्राम) प्राप्त किए गए थे। नहीं। एससीएक्सके, ग्वांगडोंग, 2015‑0063)। चूहों को एक निरंतर तापमान और आर्द्रता (तापमान, 23 ± 2˚C; आर्द्रता, 50 ± 10 प्रतिशत) के साथ एक कमरे में रखा गया था, एक 12‑h प्रकाश / अंधेरे चक्र के तहत मानक चूहे के भोजन और पानी के लिए एड लिबिटम एक्सेस के साथ। एक पॉलीस्टाइनिन पिंजरे। सभी पशु प्रयोगों को हैनान मेडिकल यूनिवर्सिटी (हाइको, चीन; अनुमोदन संख्या HYLL-2021-053) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देशों (25) के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

सिस्टैंच से किडनी/गुर्दे की कार्यक्षमता में सुधार होगा

पीआरके का अलगाव और संस्कृति।पानी तक मुफ्त पहुंच वाले WKY चूहों ने प्रयोग से पहले 12 घंटे का उपवास रखा है। WKY चूहों को पेंटोबार्बिटल सोडियम (200 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके euthanized किया गया था, फिरगुर्देएसेप्टिक रूप से हटा दिए गए थे, और कॉर्टिकल भागगुर्दानिकाला गया और एक छोटे बीकर में प्रतिरोपित किया गया।गुर्देकॉर्टेक्स को ~ 1 मिमी 3 के ऊतक के टुकड़ों में काट दिया गया था, पीबीएस (गिब्को; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के साथ तीन बार धोया गया, 5 मिनट के लिए 25˚C पर 1, 000 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया गया। ऊतक के टुकड़े 1 g/l के अंतिम सांद्रण पर I कोलेजेनेज (गिब्को; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.) टाइप करने के लिए जोड़े गए थे, और ऊतक के टुकड़े 37˚C पर 3 0 मिनट के लिए दोलन और पच गए थे। 200-मेष (0.075 मिमी) स्टेनलेस स्टील स्क्रीन के माध्यम से निस्पंदन के बाद, कोशिकाओं को फिकोल (सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीए) घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (26) द्वारा अलग किया गया था। 2 मिनट के लिए 1, 000 xg पर 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, मध्यवर्ती निलंबन एकत्र किया गया और एमईएम / एफ 12 माध्यम (गिब्को; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) के साथ मिलाया गया, एक 6-वेल प्लेट में टीका लगाया गया और 5 प्रतिशत CO2 के तहत 37˚C पर सुसंस्कृत। 24 घंटे के बाद, माध्यम को हटा दिया गया और एक नए माध्यम से बदल दिया गया, और अनासक्तगुर्देकोशिकाओं और ऊतक को त्याग दिया गया था। 48 घंटे के बाद, माध्यम को फिर से हटा दिया गया, कोशिकाओं को दो बार पीबीएस से धोया गया और उन्हें पीआरके (27, 28) के रूप में दर्शाया गया; मुख्य गठन चूहा ग्लोमेरुलर मेसेंजियल कोशिकाएं थीं। पीआरके को तीन पीढ़ियों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और पीआरके की स्थापना के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंग II (1 माइक्रोन; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीए) के साथ इलाज किया गया था।गुर्दे की क्षतिनमूना। चूहे में आंग II-प्रेरित सूजनगुर्देट्यूबलर उपकला कोशिकाओं को पहले नायर एट अल (29) द्वारा वर्णित के रूप में प्रदर्शित किया गया था।

पीआरके की पहचान एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) परख का उपयोग करके की गई थी।पीबीएस के साथ तीन बार धोने और 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ फिक्सिंग के बाद, कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए ट्राइटन एक्स‑100 के साथ ऊष्मायन (25˚C) किया गया, इसके बाद 5 प्रतिशत बीएसए (बीजिंग) सोलर साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) 25˚C पर 30 मिनट के लिए। PRK को तब रात भर अंधेरे में smooth muscle actin (‑SMA; 1 µg/ml; cat. no. ab7817; Abcam) और vimentin (1:250; cat. no. ab92547; Abcam) के साथ 4˚C पर इनक्यूबेट किया गया। पीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद, कोशिकाओं को एलेक्सा फ्लोर® 488‑ (1:100; कैट। नं। ab150077; Abcam) या 647-लेबल (1:200; कैट। नंबर ab150075; Abcam) माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 37 पर ऊष्मायन किया गया था। C 1 घंटे के लिए। फिर, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर डीएपीआई (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल; बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी) के साथ दाग दिया गया। अंत में, छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (आवर्धन, x400; लीका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच) का उपयोग करके कैप्चर किया गया था।

ईपीसी की संस्कृति और पहचान।चूहे की फीमर और टिबिया को विच्छेदित किया गया था और प्रत्येक अस्थि मज्जा ट्यूब को बाँझ पीबीएस के साथ प्रवाहित किया गया था। परिणामी मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज किया गया (1,000 xg; 25˚C; 15 मिनट) और कणों को MEM/F12 माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया गया। कोशिकाओं को Ficoll (सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क KGaA) घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (1, 000 xg; 25˚C; 20 मिनट) द्वारा अलग किया गया था और फ़ाइब्रोनेक्टिन (BD Biosciences) के साथ लेपित 25-cm2 संस्कृति फ्लास्क में रखा गया था। मानक स्थितियों (37˚C; 5 प्रतिशत CO2) के तहत कोशिकाओं को एक पूर्ण माध्यम में बनाए रखा गया था। संस्कृति माध्यम को 4 दिनों के बाद बदल दिया गया था, और अनुयाई कोशिकाओं को अतिरिक्त 3 दिनों (30) के लिए सुसंस्कृत किया गया था। ईपीसी की पहचान के लिए दिल कॉम्प्लेक्स एसिटिलेटेड लो-डेंसिटी लिपोप्रोटीन (दिल-एसी-एलडीएल) स्टेनिंग (बीजिंग सोलर साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) का इस्तेमाल किया गया था। सह-संस्कृति प्रणाली के लिए, पीआरके (1x104) को सह-खेती प्लेट (कॉर्निंग, इंक.) के निचले कक्ष में 24 घंटे के लिए जोड़ा गया और फिर एंग II (1 माइक्रोन) या 200 μl पीबीएस और ईपीसी (3x104) को जोड़ा गया। आगे के सेल फ़ंक्शन विश्लेषण किए जाने से पहले ऊपरी कक्ष में जोड़ा गया और 24 घंटे के लिए 37˚C पर इनक्यूबेट किया गया। पीआरके और ईपीसी के सर्वोत्तम अनुपात की जांच करते समय, सेल संख्या अनुपात 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 और 1:7 थे।

ईपीसी (एमवी) की तैयारी. ईपीसी को पहले वर्णित (30) के रूप में 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, दो बार पीबीएस के साथ धोया गया और 12 घंटे के लिए सीरम भूखा रखा गया। इसके बाद, सुसंस्कृत ईपीसी युक्त MEM/F12 माध्यम एकत्र किया गया और 4˚C (1, 000 xg; 15 मिनट) पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और सतह पर तैरनेवाला 4˚C (100, 000 xg; 60 मिनट) गुप्त ईपीसी-एमवी के संग्रह के लिए। पोन 812 एपॉक्सी राल (स्ट्रक्चर प्रोब, इंक) में एम्बेड करने के बाद, इसे रातोंरात 37˚C पर रखा गया था। फिर, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप निर्धारण समाधान (वुहान सर्विस टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) को 4 घंटे, और यूरेनियम एसीटेट (2 प्रतिशत; वुहान सर्विस टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) और लेड साइट्रेट (वुहान सर्विस टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) के लिए जोड़ा गया। ) 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर दाग दिए गए थे। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एमवी की पुष्टि की गई। सह-संस्कृति प्रणाली में, 50 माइक्रोग्राम / एमएल ईपीसी-एमवी (31) को ट्रांसवेल परख प्लेट के शीर्ष कक्ष में जोड़ा गया था, और पार्कों को पहले वर्णित के रूप में नीचे के कक्ष में जोड़ा गया था, और 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था।

सेल प्रसार परख।पीआरके को ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया, 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 3x103 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर टीका लगाया गया और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया। 450 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को 10 µ l सेल काउंटिंग किट-8 अभिकर्मक (CCK-8; बीजिंग सोलर साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड) का उपयोग करके 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, मूल्यांकन करने के लिए मापा गया था। सेल प्रसार दर।

सिस्टांचे से किडनी/गुर्दे के दर्द में सुधार होगा

सेल एपोप्टोसिस परख।निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एनेक्सिन वी-एफआईटीसी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (बीडी बायोसाइंसेज) का उपयोग करके एक सेल एपोप्टोसिस परख की गई। पीआरके को काटा गया, दो बार बर्फ-ठंडे पीबीएस (गिब्को; थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक।) से धोया गया और 5 0 0 μl बाइंडिंग बफर में फिर से जोड़ा गया। फिर से निलंबित पीआरके को तब 5 μl एनेक्सिन वी‑एफआईटीसी और 5 μl पीआई के साथ अंधेरे में 15 मिनट के लिए 23 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। सेल एपोप्टोसिस का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™ सॉफ्टवेयर, संस्करण: 1.0; BD बायोसाइंसेज) का उपयोग करके किया गया था।

ईपीसी-एमवी और पीआरके फ्यूजन।यह देखने के लिए कि क्या ईपीसी-एमवी को पीआरके के साथ जोड़ा गया था, ईपीसी-एमवी को सह-ऊष्मायन से पहले एक लिपिड झिल्ली-एम्बेडेड फ्लोरोसेंट डाई (पीकेएच 26) के साथ लेबल किया गया था। संक्षेप में, 50 माइक्रोग्राम/एमएल ईपीसी-एमवी को 2 मिली पीकेएच26 (2x10-6 एम; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीए) के साथ जोड़ा गया और 5 मिनट के लिए 23 ± 2˚C पर मिलाया गया। लेबल किए गए मिश्रण को 2 मिली 1 प्रतिशत बीएसए (वी) में जोड़ा गया और 60 मिनट के लिए 100, 000 एक्सजी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, फिर ठंडे पीबीएस से धोया गया। अवक्षेप को 1 मिली MEM/F12 माध्यम में निलंबित कर दिया गया, PRK में जोड़ा गया और 24 घंटे के लिए 37˚C पर इनक्यूबेट किया गया। अंत में, 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर परमाणु धुंधलापन के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल डीएपीआई जोड़ा गया। सेल छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (आवर्धन, x400; लीका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच) का उपयोग करके हासिल किया गया था।

सेल चक्र परख।सेल साइकल डिटेक्शन किट (बीडी बायोसाइंसेज) का उपयोग करके सेल साइकल परख की गई। ईपीसी या पीआरके (1x1 0 6) काटा गया, पीबीएस के साथ दो बार धोया गया और फिर 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 500 μl 70 प्रतिशत बर्फ-ठंडा इथेनॉल में तय किया गया। कोशिकाओं को फिर ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोया गया और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीआई (400 μl) और RNase (100 μl) में ऊष्मायन किया गया। FCM (FACSCanto II) का उपयोग करके PI सिग्नल का पता लगाया गया था। G1, S और G2 चरण में कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना फ़्लोजो सॉफ़्टवेयर (संस्करण 10.0.6; फ़्लोजो एलएलसी) का उपयोग करके की गई थी।

एफसीएम द्वारा आरओएस माप।पीआरके को 60‑70 प्रतिशत संगम तक सुसंस्कृत किया गया और ट्रिप्सिनाइजेशन के माध्यम से काटा गया। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सभी कोशिकाओं को 1.0 माइक्रोन 2', 7'-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट के साथ ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं को फिर दो बार पीबीएस से धोया गया और एफसीएम के माध्यम से विश्लेषण किया गया ताकि उत्तेजना के लिए 488 एनएम लेजर और पता लगाने के लिए 535 एनएम लेजर का उपयोग करके आरओएस का पता लगाया जा सके।

एलिसा।सेंट्रीफ्यूजेशन (1, 000 xg; 25˚C; 5 मिनट) के बाद, प्रत्येक उपसमूह के सेल सतह पर तैरनेवाला को एमडीए, जीएसएच-पीएक्स, एसओडी और भड़काऊ कारकों आईएल -6, आईएल‑ के स्तर का विश्लेषण करने के लिए एकत्र किया गया था। 1 और टीएनएफ‑। निर्माता के निर्देशों के अनुसार निम्नलिखित किट का उपयोग किया गया था: माइक्रो एमडीए परख किट (बिल्ली नं। बीसी 00 20; बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड), जीएसएच-पीएक्स परख किट (कैट नं। BC1195; बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड), SOD एक्टिविटी डिटेक्शन किट (कैट नं। BC0170; बीजिंग सोलरबायो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड), रैट IL-1 एलिसा किट (कैट नं। RLB{ {13}}; आर एंड डी सिस्टम्स, इंक।), रैट आईएल-6 क्वांटिकाइन एलिसा किट (कैट। नं। आर 6000 बी; आर एंड डी सिस्टम्स, इंक।) और रैट टीएनएफ क्वांटिकाइन एलिसा किट (कैट नं। आरटीए 00; आर एंड डी सिस्टम्स, इंक। )

सांख्यिकीय विश्लेषण।सभी प्रयोगों को तीन बार दोहराया गया और सभी डेटा को ± एसडी के रूप में व्यक्त किया गया। SPSS सॉफ़्टवेयर संस्करण 21.0 (IBM Corp.) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। एकतरफा एनोवा और डननेट के पोस्ट हॉक टेस्ट का उपयोग करके कई समूहों के बीच अंतर का आकलन किया गया था। पी<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

परिणाम

Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated  EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A).  Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 प्रतिशत, इस बात की पुष्टि करते हुए कि ईपीसी को सफलतापूर्वक अलग कर दिया गया था। IF (vimentin/ SMA) के माध्यम से पृथक PRK का विश्लेषण किया गया। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि पीआरके में विमेंटिन / एमएएसएमए का अभिव्यक्ति स्तर उच्च और सकारात्मक था, जो पीआरके (छवि 1 बी) के सफल अलगाव का सुझाव देता है।

ईपीसी से पीआरके का इष्टतम अनुपात।एक सह-संस्कृति प्रणाली में पीआरके/ईपीसी के विभिन्न अनुपातों के संयोजन के प्रभाव की जांच की गई, और यह पाया गया कि 1:3 पीआरके/ईपीसी के अनुपात में उगाए गए पीआरके में 2 के साथ उगाए गए पीआरके की तुलना में प्रसार दर में वृद्धि नहीं हुई है: पीआरके/ईपीसी का 1, 1:1 या 1:2 अनुपात (चित्र 1सी)। इसके अलावा, ईपीसी के बढ़ते अनुपात (1:4, 1:5, 1:6 और 1:7) के परिणामस्वरूप ईपीसी (1:3) की तुलना में पीआरके प्रसार में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। इसलिए, बाद के प्रयोगों में अत्यधिक ईपीसी से संभावित हस्तक्षेप को रोकने के लिए आगे के अध्ययन के लिए 1:3 पीआरके/ईपीसी के अनुपात का चयन किया गया था।

एंग II-प्रेरित क्षति पर ईपीसी सह-संस्कृति का प्रभाव।पीआरके (1x104) को 24 घंटे पहले एक ट्रांसवेल प्लेट के निचले डिब्बे में टीका लगाया गया था। ऊपरी कक्ष में नियंत्रण समूह में 200 μl पीबीएस और प्रायोगिक समूह में 200 μl ईपीसी (3x104) शामिल थे। मॉडल के लिएगुर्दे खराब,1 µM Ang II को निचले डिब्बे में जोड़ा गया। 24 घंटे के बाद, PRK के प्रसार दर को मापने के लिए CCK-8 और FCM assays का प्रदर्शन किया गया। ईपीसी की अनुपस्थिति में एंग II प्राप्त करने वाले पीआरके में काफी कमी आई थी ( पी<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the=""  g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">गुर्दासेल मॉडल।

ईपीसी पीआरके को एंग II-प्रेरित क्षति से बचाते हैं, ईपीसी के साथ सह-संवर्धित पीआरके में एंग II द्वारा प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर की जांच की गई। FCM परख के परिणामों से पता चला कि Ang II में काफी वृद्धि हुई (P .)<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).=""  similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted=""  mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c=""  and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while=""  prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">

Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 बनाम पीआरके:ईपीसी, 2:1 समूह; * पी<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.=""  (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;=""  prks,="" primary="" rat="">गुर्दाकोशिकाएं; एफसीएम, प्रवाह साइटोमेट्री; CCK‑8, सेल काउंटिंग किट‑8; दिल-एसी-एलडीएल, दिल जटिल एसिटिलेटेड कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन; आयुध डिपो, ऑप्टिकल घनत्व; SMA, चिकनी पेशी एक्टिन; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं। इन एंजाइमों के स्राव के संबंध में विपरीत परिणाम। इसलिए आरओएस की पीढ़ी एंग II-प्रेरित सेल क्षति में शामिल हो सकती है, और ईपीसी के साथ सह-संस्कृति द्वारा सुधारा जा सकता है।

एंग II भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को बढ़ावा देकर कोशिकाओं को भी नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि ईपीसी सूजन को रोक सकता है (32)। इसके बाद, यह जांच की गई कि क्या एंग II पीआरके में भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को बढ़ावा देता है, और क्या ईपीसी भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को रोककर अपनी सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकता है। एंग II के अलावा पीआरके में IL-1, IL-6 और TNF‑ के स्राव को काफी हद तक अपग्रेड किया गया था। इसके विपरीत, EPC के साथ सह-संवर्धित PRK में, IL-1, IL-6 और TNF‑ (चित्र 2E‑G) का स्तर तुलनात्मक रूप से कम था (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">

ईपीसी का सुरक्षात्मक प्रभाव एमवी के माध्यम से होता है।तंत्र जिसके माध्यम से EPCs Ang II- प्रेरित पर सुरक्षात्मक प्रभाव डालते हैंगुर्दाईपीसी (छवि 3 ए) से एमवी को अलग करके कोशिकाओं का और अधिक विश्लेषण किया गया। EPC-MVs को PKH26 के साथ लेबल किया गया था और एक ट्रांसवेल प्लेट में Ang II के साथ PRK में जोड़ा गया था, जैसा कि पहले वर्णित है। PKH26 प्रतिदीप्ति PRKs (छवि 3B) के साइटोप्लाज्म में पाया गया था, यह दर्शाता है कि EPC-MVs PRK के साथ जुड़े हुए थे। फिर, यह पाया गया कि एंग II-प्रेरित प्रसार दर में कमी आई, जी 1 चरण में एपोप्टोसिस और चक्र गिरफ्तारी को बढ़ावा दिया गया, ईपीसी-एमवी (छवि 3 सी-ई) द्वारा बाधित किया गया। ईपीसी के साथ सह-संवर्धित पीआरके के समान, पीआरके ईपीसी-एमवी की उपस्थिति में विकसित हुए और एंग II के संपर्क में आने से आरओएस और एमडीए (छवि 4 ए और बी) के स्तर में कमी आई, जीएसएच और एसओडी स्तर में वृद्धि हुई (छवि 4 सी और डी)। और एंग II समूह की तुलना में भड़काऊ साइटोकिन्स IL-1, IL-6 और TNF‑ (छवि 4E‑G) के स्राव में कमी आई।

बहस

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, वर्तमान अध्ययन ने पहली बार प्रदर्शित किया कि ईपीसी पीआरके को एंग II-प्रेरित सेल क्षति से बचा सकता है। यह सुरक्षात्मक प्रभाव, कम से कम आंशिक रूप से, एमवी द्वारा मध्यस्थता है जो ईपीसी द्वारा स्रावित होते हैं और सह-संस्कृति के दौरान पीआरके के साथ फ्यूज होते हैं। एंग II के संपर्क में आने वाले पीआरके में समृद्ध एमवी जोड़कर, यह पाया गया कि अकेले ईपीसी-एमवी ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन को रोककर पीआरके को एंग II-प्रेरित क्षति से बचा सकते हैं। एमवी को झिल्ली नैनोडेब्रिस (0.05‑1 माइक्रोन) (33) के रूप में परिभाषित किया जाता है, और सक्रियण, तनाव या एपोप्टोसिस के बाद कोशिका की सतह से बहाया जाता है। इसके अलावा, एमवी को विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि प्लेटलेट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं, ईपीसी और श्वेत रक्त कोशिकाएं (34,35)। एमवी विशिष्ट सेल सतह मार्करों को व्यक्त करते हैं, जो मूल कोशिका और उनके गठन के साथ भिन्न होते हैं और विरोधी भड़काऊ, थक्कारोधी और एंजियोजेनिक प्रभाव डाल सकते हैं (36)। ईपीसी से जारी एमवी अपने मूल कोशिका की जैविक जानकारी ले सकते हैं, और इस प्रकार लक्ष्य कोशिकाओं (33) पर एक समान कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, ईपीसी-एमवी कार्डियोमायोसाइट्स को एंग II-प्रेरित हाइपरट्रॉफी और एपोप्टोसिस (28) से बचाते हैं, एंडोथेलियल फ़ंक्शन और एंजियोजेनेसिस (37) को विनियमित करने की क्षमता में सुधार करते हैं, और ऑक्सीडेटिव तनाव (38) से प्रेरित एंडोथेलियल डिसफंक्शन को कम करते हैं। हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, उच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी पर ईपीसी-एमवी का प्रभाव पहले नहीं बताया गया है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य ईपीसी और ईपीसी-एमवी के संभावित सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करना हैगुर्दे की कोशिका की चोट।

वर्तमान अध्ययन में, एंग II के साथ क्षति को प्रेरित करके एक पीआरके चोट मॉडल स्थापित किया गया था। पिछली रिपोर्टों (26,39) के अनुरूप, Ang II ने PRK प्रसार को कम किया, एपोप्टोसिस को बढ़ाया और S चरण में प्रवेश करने से पहले G1 चरण में सेल चक्र को गिरफ्तार कर लिया। इन उच्च रक्तचाप से संबंधित मार्करों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला गया कि एंग II-प्रेरित पीआरके हाइपर-टेंशन मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था। इसके अलावा, यह निर्धारित किया गया था कि ईपीसी के साथ सह-संस्कृति ने पीआरके को एंग II-प्रेरित क्षति से बचाया। पीआरके प्लस एंग II के साथ ईपीसी के सह-ऊष्मायन के बाद, पीआरके में ऑक्सीडेटिव तनाव एंजाइमों और भड़काऊ कारकों के स्तर में कमी आई थी। इस प्रकार, संभावित तंत्र जिसके माध्यम से ईपीसी पीआरके पर अपने सुरक्षात्मक प्रभाव डालते हैं, उनमें ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन का विनियमन शामिल हो सकता है। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, वर्तमान अध्ययन ने पहली बार प्रदर्शित किया कि ईपीसी पीआरके में एंग II-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया और सूजन को ठीक कर सकता है।

ईपीसी प्रभावी रूप से रक्षा करते हैंगुर्दे समारोहसीकेडी (40) में और संवहनी अखंडता को बनाए रखने और एंडोथेलियल चोट (15) की मरम्मत में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, साथ ही संवहनी रिसाव को कम करते हैं, अंग कार्य में सुधार करते हैं और सेप्सिस (41) में जीवित रहने की दर में वृद्धि करते हैं। संचित साक्ष्य बताते हैं कि ईपीसी एमवी (37,42,43) के स्राव के माध्यम से एक सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकते हैं। पीआरके में ईपीसी-एमवी के सुरक्षात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, ईपीसी-एमवी को अलग किया गया और पीकेएच 26 के साथ लेबल किया गया, और फिर लेबल किए गए एमवी को पीआरके प्लस एंग II के साथ जोड़ा गया। EPC-MVs PRK के साथ जुड़े हुए हैं और Ang II द्वारा प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया और सूजन को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करते हैं, और ये परिणाम फू एट अल (44) के समान हैं। ऑक्सीडेटिव तनाव एंजाइमों के स्तर पर ईपीसी-एमवी का निरोधात्मक प्रभाव अकेले ईपीसी की तुलना में अधिक था; इसका श्रेय एमवी को ईपीसी-एमवी के साथ इलाज किए गए पीआरके में ईपीसी के साथ सह-संवर्धित लोगों की तुलना में उच्च सांद्रता में मौजूद होने के लिए दिया जा सकता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि एंग II-प्रेरित सेल क्षति के खिलाफ पीआरके पर ईपीसी का सुरक्षात्मक प्रभाव गुप्त एमवी पर निर्भर हो सकता है। वर्तमान अध्ययन की एक सीमा यह है कि संभावित तंत्र जिसके माध्यम से ईपीसी-एमवी माइक्रोआरएनए / एमआरएनए / सिग्नल ट्रांसडक्शन कुल्हाड़ियों को विनियमित करते हैं, उनकी पूरी तरह से जांच नहीं की गई थी। भूमिका और तंत्र जिसके माध्यम से EPC‑MVs सुरक्षा प्रदान करते हैंगुर्दे खराबउच्च रक्तचाप से ग्रस्त नेफ्रोपैथी के एक पशु मॉडल में मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जो भविष्य के अनुसंधान के लिए एक आशाजनक दिशा है। निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन ने प्रदर्शित किया कि ईपीसी पीआरके को एंग II-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से बचा सकता है और एमवी के स्राव के माध्यम से सूजन में वृद्धि कर सकता है। यह उच्च रक्तचाप से ग्रस्त अपवृक्कता के उपचार के लिए एक नई दिशा प्रदान करता है और अध्ययन के लिए एक इन विट्रो मॉडल स्थापित करता हैगुर्दे की चोट।