साइक्लोस्पोरिन पर न्यू वेन्शेन शेंगजिंग काढ़े के सुरक्षात्मक प्रभाव, टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण और शुक्राणुजन्य एपोप्टोसिस की प्रेरित हानि

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ज़ियाओयान पैन, ज़ियान वांग, ज़ुएनन वांग, वानशेंग झांग 4, झानक्सुआन सन 1, जुआन जुआन लिआंग, ज़ू झांग, वेनजुन ली और ज़िक्सिन ली

सार

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य नए वेनशेन शेंगजिंग काढ़े (नए WSSJD; कॉर्नू सर्वि निप्पॉन परवुम, पैनाक्स जिनसेंग, सिनोमोरियम धूपघड़ी, सहित) के संभावित सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करना है।सिस्टांचे डेजर्टिकोला, रेडिक्स एस्ट्रैगली, एपिमेडियम ब्रेविकोर्नम, और एंजेलिका साइनेंसिस) टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण और चूहों में शुक्राणुजन्य एपोप्टोसिस के साइक्लोस्पोरिन-प्रेरित हानि पर। कुल 90 वयस्क पुरुष कुनमिंग चूहों को निम्नलिखित 6 समूहों में विभाजित किया गया था: नियंत्रण (कोई हस्तक्षेप नहीं), डाइमिथाइलसल्फॉक्साइड (डीएमएसओ; केवल डीएमएसओ प्राप्त), साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए), क्लोमीफीन साइट्रेट (सीसी; सीएसए प्लस सीसी, 15 मिलीग्राम / किग्रा) /दिन), WSSJD (CsA plus WSSJD, क्रूड ड्रग 12 g/kg/day) और नया WSSJD (CsA plus new WSSJD, क्रूड ड्रग 12 g/kg/day)। सभी चूहों का 30 दिनों तक ओरल गैवेज के जरिए इलाज किया गया। बाद में अंडकोष को ठीक किया गया और सेमिनिफेरस एपिथेलिया के विकास का आकलन करने के लिए हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन के साथ दाग दिया गया। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकों का उपयोग वृषण लेडिग कोशिकाओं में ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन रिसेप्टर (LHR) और P450 साइड-चेन क्लीवेज (P450scc) की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। इसके अलावा, वृषण में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं के एपोप्टोसिस का पता एक टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडाइल ट्रांसफ़ेज़-मध्यस्थता dUTP निक-एंड लेबलिंग परख का उपयोग करके लगाया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग एपिडीडिमिस में शुक्राणु की उत्तरजीविता दर और प्रारंभिक एपोप्टोसिस का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। CsA और CC समूहों की तुलना में, नए WSSJD प्रशासन ने सीरम टेस्टोस्टेरोन के स्तर और वृषण लेडिग कोशिकाओं (P) में LHR और P450scc की अभिव्यक्तियों में काफी वृद्धि की है।<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">

सिस्टांचे डेजर्टिकोला

परिचय

साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला इम्यूनोसप्रेसिव एजेंट है जो विशेष रूप से टी कोशिकाओं को लक्षित करता है और इंटरल्यूकिन के स्राव को रोकता है-2, और नाटकीय रूप से यकृत, गुर्दे और कॉर्निया प्रत्यारोपण की सफलता दर को बढ़ाता है, साथ ही साथ जीवित रहने की दर भी बढ़ाता है प्राप्तकर्ता (1-3)। हालांकि, लंबे समय तक CsA के उपयोग से प्रेरित इम्युनोसुप्रेशन हृदय रोगों, संक्रमण और घातक ट्यूमर (4) के जोखिम को काफी बढ़ा देता है। ईद एट अल (5) ने बताया कि पुरुष किडनी प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में सीरम CsA की एकाग्रता के साथ शुक्राणु की एकाग्रता और गतिशीलता को नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि CsA पुरुष प्राप्तकर्ताओं में प्रजनन प्रणाली की शिथिलता को प्रेरित कर सकता है। इसके अलावा, यह प्रलेखित किया गया है कि CsA बिगड़ा हुआ शुक्राणुजनन और पुरुष प्रजनन प्रणाली (6) को नुकसान के लिए जिम्मेदार हो सकता है।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि CsA ने टेस्टोस्टेरोन बायोसिंथेसिस और वृषण में स्राव को प्रभावित करके सीरम टेस्टोस्टेरोन के स्तर को कम किया है। उन्होंने और अन्य (7) ने देखा कि 40 मिलीग्राम/किलोग्राम/दिन सीएसए के साथ इलाज किए गए चूहों ने सीरम में ल्यूटिनिज़िंग हार्मोन (एलएच) के उच्च स्तर और टेस्टोस्टेरोन के काफी कम स्तर का प्रदर्शन किया, जिससे खराब टेस्टिकुलर विकास हुआ। अली एट अल (8) ने बताया कि सीएसए के साथ उपचार ने लेडिग कोशिकाओं की झिल्ली पर एलएच रिसेप्टर (एलएचआर) की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, जिससे बाद में एलएच-मध्यस्थता टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण और लेडिग कोशिकाओं से स्राव में कमी आई। सीतालक्ष्मी एट अल (9) द्वारा किए गए एक अन्य अध्ययन में बताया गया है कि CsA ने टेस्टोस्टेरोन बायोसिंथेसिस के दौरान 17 अल्फा-हाइड्रॉक्सिलेज़ की गतिविधि को असहयोगात्मक रूप से और 17 - हाइड्रॉक्सीस्टेरॉइड डिहाइड्रोजनेज गतिविधि को प्रतिस्पर्धी रूप से रोककर टेस्टोस्टेरोन के स्तर को कम किया, और CsA निषेध के लिए प्राथमिक साइट चक्रीय एडेनोसिन को बाधित किया गया था। मोनोफॉस्फेट उत्तेजना। इसके अलावा, इस रिपोर्ट ने संकेत दिया कि Leydig कोशिकाओं में CsA द्वारा प्रेरित टेस्टोस्टेरोन स्राव में कमी ने सीधे पुरुष प्रजनन प्रणाली के विकास और प्रजनन क्षमता के रखरखाव को प्रभावित किया। सीतालक्ष्मी एट अल (10) ने अंतर्जात टेस्टोस्टेरोन के स्तर को बढ़ाने के लिए CsA- उपचारित चूहों में बहिर्जात टेस्टोस्टेरोन इंजेक्ट किया। यह देखा गया कि बहिर्जात टेस्टोस्टेरोन की उच्च खुराक ने प्रजनन अंग के वजन, कूप-उत्तेजक हार्मोन (FSH) के सीरम स्तर को काफी हद तक बहाल कर दिया, और रोगाणु कोशिका की संख्या में वृद्धि की, इस प्रकार यह दर्शाता है कि CsA- प्रेरित शुक्राणुजनन की हानि को बहिर्जात द्वारा आंशिक रूप से रोका जा सकता है। टेस्टोस्टेरोन का प्रशासन (10)। हालांकि, बहिर्जात टेस्टोस्टेरोन क्षतिग्रस्त वृषण ऊतक की मरम्मत में अपर्याप्त पाया गया, क्योंकि टेस्टोस्टेरोन स्राव और शुक्राणुजनन अभी भी CsA से प्रभावित थे, और शुक्राणु और शुक्राणुजन्य कोशिकाओं (10) में एपोप्टोसिस की उच्च दर देखी गई थी।

Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) में 15 हर्बल दवाएं शामिल हैं, जिनमें मुख्य रूप से Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium Solarium,सिस्टांचे डेजर्टिकोला, मूलांक Astragali, Epimedium brevicorneum, और Angelica Sinensis (11)। WSSJD को साइक्लोफॉस्फेमाइड-प्रेरित शुक्राणुजन्य एपोप्टोसिस (11) को कम करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। WSSJD के चिकित्सीय प्रभाव को और बेहतर बनाने के लिए, वर्तमान अध्ययन ने WSSJD घटकों की खुराक को समायोजित करके CsA- प्रेरित वृषण ऊतक क्षति के तंत्र के आधार पर एक नया WSSJD विकसित किया। आधुनिक औषधीय अध्ययनों से पता चला है कि WSSJD में एंटलर वेलवेट एक सेक्स हार्मोन (12) के रूप में कार्य कर सकता है; रेडिक्स एस्ट्रैगली टेस्टिकुलर सर्टोली कोशिकाओं (13) के प्रसार और पोषक तत्वों की आपूर्ति में सुधार कर सकता है, और पैनाक्स जिनसेंग टेस्टिकुलर हाइपरऑक्साइड के स्तर को कम कर सकता है और शुक्राणुजन्य एपोप्टोसिस (14) को रोक सकता है। उपर्युक्त दवाएं गुर्दे के कार्य को भी बढ़ा सकती हैं और शुक्राणुजन्य कोशिकाओं (12-14) ​​के विकास को बढ़ावा दे सकती हैं। पिछले नैदानिक ​​अध्ययनों (15,16) में पुरुष बांझपन पर चिकित्सीय प्रभाव डालने के लिए क्लोमीफीन साइट्रेट (सीसी) का प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, CC को बेहतर टेस्टोस्टेरोन और वीर्य मापदंडों के साथ जोड़ा गया है, और CC के सुरक्षात्मक तंत्र WSSJD (15,16) के समान हो सकते हैं। इसके अलावा, वांग एट अल (17) के एक अध्ययन में, चूहों में शुक्राणुजनन गड़बड़ी पर चीनी दवा शेंगजिंग के प्रभाव की जांच के लिए सीसी का उपयोग उपचार नियंत्रण के रूप में किया गया था। इसके आधार पर वर्तमान अध्ययन में सीसी का प्रयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया।

वर्तमान अध्ययन में, संशोधित दवा की चिकित्सीय प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए वृषण ऊतकों में नए WSSJD के सुरक्षात्मक प्रभाव के अंतर्निहित तंत्र की जांच की गई थी। सुरक्षात्मक तंत्र को स्पष्ट करना CsA- प्रेरित शुक्राणुजन्य क्षति को कम करने में नए WSSJD के उपयोग के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है।

सिस्टैंच डेजर्टिकोला के प्रभाव: रोकेंशुक्राणुजन्य क्षति

सामग्री और तरीके

जानवरों। चांगचुन इंस्टीट्यूट ऑफ बायोलॉजिकल प्रोडक्ट्स कं, लिमिटेड (चांगचुन, चीन) द्वारा कुल 90 नर कुनमिंग चूहों (8-सप्ताह पुराने; 35-40 g) प्रदान किए गए थे। वर्तमान अध्ययन जिलिन मेडिकल यूनिवर्सिटी (चांगचुन, चीन) की आचार समिति से अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया था। चूहे को 12 घंटे के अंधेरे-प्रकाश चक्र के तहत 21 ± 3˚C और 55-65 प्रतिशत सापेक्ष आर्द्रता पर रखा गया था। चूहे को एक मानक प्रयोगशाला माउस आहार और बाँझ पानी तक मुफ्त पहुंच दी गई थी।

डब्ल्यूएसएसजेडी की तैयारी WSSJD के 15 चीनी दवा घटक, जिनमें कॉर्नू सर्वि निप्पॉन परवुम, पैनाक्स जिनसेंग, सिनोमोरियम सोलारियम, शामिल हैं।सिस्टांचे डेजर्टिकोला, मूलांक Astragali, Epimedium brevicornum, और Angelica Sinensis (11), Tongrentang (बीजिंग, चीन) से खरीदे गए थे। इन सामग्रियों को चीनी औषधीय काढ़े (18) की पारंपरिक विधि के अनुसार काढ़ा गया था। संक्षेप में, सामग्री को नुस्खा के अनुसार तौला गया, और जड़ी-बूटियों को डुबोने के लिए कुल 250 मिलीलीटर आसुत जल मिलाया गया। जड़ी बूटियों को 30 मिनट के लिए भिगोया गया और बाद में गरम किया गया। जड़ी बूटियों को पहले 10 मिनट तक उबाला गया और फिर गर्मी को 20 मिनट तक उबालने के लिए कम कर दिया गया। गर्म करने के 30 मिनट के बाद, तरल काढ़े जड़ी बूटियों से अलग किया गया था, जो आगे 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 200 मिलीलीटर आसुत जल के साथ काढ़ा किया गया था। इस प्रक्रिया को दोहराया गया और काढ़े के तरल की अंतिम मात्रा को धुंध की 4-5 परतों के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। जड़ी बूटियों से तरल को भी फ़िल्टर्ड काढ़े में निचोड़ा गया था। काढ़े को बाद में 6-7 घंटे के लिए पानी के स्नान में 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया जब तक कि एकाग्रता 2 ग्राम कच्ची दवा/एमएल तक नहीं पहुंच गई, और काढ़े को उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। नया WSSJD WSSJD के निर्माण के आधार पर तैयार किया गया था जिसमें Panax ginseng, Cynomorium Solarium, Radix Astragali, और Epimedium brevicornum की खुराक में मामूली समायोजन किया गया था। काढ़ा बनाने की विधि WSSJD की तरह ही थी। नई WSSJD में निम्नलिखित शामिल हैं: Panax ginseng, 6 g; साइनोमोरियम धूपघड़ी, 9 ग्राम; मूलांक अस्त्रगली, 12 ग्राम; एपिमेडियम ब्रेविकोर्नम, 6 ग्राम; कॉर्नू सर्वि निप्पॉन परवम, 1 ग्राम;सिस्टांचे डेजर्टिकोला, 9 ग्राम; एंजेलिका साइनेंसिस, 6 ग्राम; फ्लैटस्टेम मिल्कवेच बीज, 9 ग्राम; Rhizoma Dioscoreae, 15 ग्राम; बड़ा सिर एट्रैक्टिलोड्स राइजोम, 6 ग्राम; लिगस्टिकम वालिची, 3 ग्राम; मूलांक Paeoniae अल्बा, 6 ग्राम; दालचीनी कैसिया, 1 ग्राम; कॉस्टस्टूट, 1.5 ग्राम, और फ्रुक्टस फोनीकुली, 3 ग्राम।

कच्चे दवा के अर्क की सांद्रता निम्नानुसार निर्धारित की गई थी: कच्चे माल का वजन / अंतिम मात्रा। पारंपरिक चीनी चिकित्सा (19-21) के अध्ययन में इस गणना पद्धति का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। औषधि प्रशासन। चूहे बेतरतीब ढंग से 6 समूहों (प्रति समूह 15 चूहों) में विभाजित किए गए थे और उन्हें दवा के साथ इंट्रागैस्ट्रिक रूप से प्रशासित किया गया था। समूह इस प्रकार थे: नियंत्रण (सामान्य खारा); डाइमिथाइलसल्फॉक्साइड (डीएमएसओ); सीएसए; सीसी; डब्ल्यूएसएसजेडी; और नया WSSJD। CsA, CC, WSSJD, और नए WSSJD समूहों में चूहों को 30 दिनों के लिए 15 मिलीग्राम/किग्रा/दिन CsA (शांक्सी पॉवरडोन फ़ार्मास्यूटिक्स कं, लिमिटेड, दातोंग, चीन) के साथ अंतःक्षिप्त (आईपी) इंजेक्ट किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया है (8 ) नियंत्रण में चूहे और डीएमएसओ समूहों ने 30- दिन की प्रायोगिक अवधि के दौरान क्रमशः सामान्य खारा या डीएमएसओ विलायक की समान मात्रा के साथ एक दैनिक आईपी इंजेक्शन लगाया। सामान्य खारा में पतला DMSO की सांद्रता 3.25 प्रतिशत (v/v) थी। सीसी समूह को 21.6 मिलीग्राम/किग्रा/दिन सीसी (जीकेएच फार्मास्युटिकल, लिमिटेड, ग्वांगझू, चीन) के साथ प्रशासित किया गया था जैसा कि पहले बताया गया था (13), जिसे 3.25 प्रतिशत (वी/वी) डीएमएसओ (पीएच {{14}) में भी पतला किया गया था। }.2)। WSSJD और नए WSSJD समूहों में चूहों को क्रमशः WSSJD की 12 ग्राम कच्ची दवा/किग्रा/दिन और नए WSSJD के साथ प्रशासित किया गया।हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला हो जाना। चूहे के वृषण को काटा गया और तुरंत 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएच =7 .2) में तय किया गया, इसके बाद इथेनॉल निर्जलीकरण, इथेनॉल को हटाने के लिए जाइलीन उपचार, मोम एम्बेडिंग और सेक्शनिंग किया गया। एक रोटरी माइक्रोटोम का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल सेक्शन (5 माइक्रोन) प्राप्त किए गए थे। इन्हें एच एंड ई धुंधला के लिए कांच की स्लाइड से चिपका दिया गया था। अर्धवृत्ताकार नलिकाओं के विकास का मूल्यांकन करने और हिस्टोमेट्रिक डेटा प्राप्त करने के लिए हाइलाइट हिस्टोपैथोलॉजिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वृषण वर्गों को देखा गया। जॉन्सन स्कोरिंग सिस्टम (22) का उपयोग करके अर्धवृत्ताकार नलिकाओं के विकास का आकलन किया गया था।

एलिसा। उपचार के 30 दिन, चूहों को सीओ2 के साथ इच्छामृत्यु से पहले 10 प्रतिशत क्लोरल हाइड्रेट (शंघाई गुओयाओ केमिकल रिएजेंट कं, लिमिटेड) के साथ 0.004 मिली/जी शरीर के वजन आईपी के साथ संवेदनाहारी किया गया था। ट्रंक रक्त काटा गया और सीरम को अलग किया गया और 20˚C पर संग्रहीत किया गया। संक्षेप में, रक्त को 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में एकत्र किया गया और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। ट्यूब को फिर 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,300 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और सीरम एकत्र किया गया। एलिसा किट (शंघाई एलिसा बायोटेक कं, लिमिटेड, शंघाई, चीन) का उपयोग टेस्टोस्टेरोन (बिल्ली संख्या ईआईए -2380) और एलएच (बिल्ली संख्या ईआईए -2385) की सीरम सामग्री को निर्धारित करने के लिए किया गया था। ) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार। ऑप्टिकल घनत्व (OD) एक मॉडल 680 माइक्रोप्लेट रीडर (बायो-रेड लेबोरेटरीज, इंक।, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, और टेस्टोस्टेरोन और एलएच के स्तर मानक वक्र के आधार पर निर्धारित किए गए थे।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर वृषण ऊतक 4 प्रतिशत फॉर्मलाडेहाइड में तय किए गए थे और पैराफिन में एम्बेडेड थे। पैराफिन वर्गों को 5 माइक्रोन वर्गों में काट दिया गया और बाद में डीवैक्स किया गया। एंटीजन पुनर्प्राप्ति 0.01 एम साइट्रेट बफर (पीएच=6.0) में वर्गों को 5 मिनट के लिए 95‑98˚C पर इनक्यूबेट करके प्राप्त किया गया था। बाद में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 5 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क केजीए, डार्मस्टैड, जर्मनी; ए 3675) के साथ वर्गों को अवरुद्ध कर दिया गया। अवरुद्ध करने के बाद, वर्गों को LHR (बिल्ली नं। L6792; सिग्मा-एल्ड्रिच; मर्क KGaA; 1:200) या P450 साइड-चेन क्लीवेज (P450scc; cat. no. ab75497; Abcam, कैम्ब्रिज, यूके) के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। ; 1:200) रात में 4˚C पर अंधेरे में। स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (SABC) विधि का उपयोग निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार SABC किट (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA) का उपयोग करके LHR और P450scc की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण चूहों से पृथक ऊतकों के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी को पीबीएस से बदल दिया गया था। झिल्ली या प्लाज्मा पर पीले या भूरे रंग के धुंधला होने वाली लेडिग कोशिकाओं को एलएचआर-पॉजिटिव सेल माना जाता था। प्रत्येक नमूने से पांच स्लाइड प्राप्त की गईं और लेडिग ऊतक क्षेत्रों में पांच क्षेत्रों को यादृच्छिक रूप से चुना गया और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (आवर्धन, x400) के तहत मूल्यांकन किया गया। लेडिग ऊतक क्षेत्रों में सकारात्मक कोशिकाओं का औसत आयुध डिपो इमेज-प्रो प्लस 6.0 सॉफ्टवेयर (मीडिया साइबरनेटिक्स, इंक।, रॉकविले, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। LHR और P450scc के भाव OD मानों के समानुपाती थे, जिनमें उच्च OD मान उच्च प्रोटीन अभिव्यक्तियों का प्रतिनिधित्व करते थे।

टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडाइल ट्रांसफ़ेज़ (TdT)-मध्यस्थता dUTP निक-एंड लेबलिंग (TUNEL) परख। चूहे के वृषण को विच्छेदित किया गया, मोम में जड़ा गया और खंडित किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार वर्गों (5- माइक्रोन मोटी) को तब TUNEL परख किट (MK1024; Boster Biological Technology) का उपयोग करके दाग दिया गया था। संक्षेप में, नियंत्रण (सामान्य खारा), DMSO, CsA, CC, WSSJD, और नए WSSJD समूहों से वृषण ऊतकों को 37˚C पर 30 मिनट के लिए बायोटिन-लेबल वाले डिगॉक्सिन एंटीबॉडी के 1: 100 कमजोर पड़ने का उपयोग करके दाग दिया गया था। सना हुआ चूहा अंतरालीय उपकला ऊतक (किट में प्रदान किया गया) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और बायोटिन-लेबल वाले डिगॉक्सिन एंटीबॉडी के बजाय पीबीएस के साथ ऊष्मायन किए गए नमूनों का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। हरे रंग के परमाणु धुंधलापन को प्रदर्शित करने वाली TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति का मूल्यांकन एक लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। उच्च आवर्धन (x400) के तहत कुल 10 यादृच्छिक क्षेत्रों का मूल्यांकन किया गया और सकारात्मक कोशिकाओं की गणना की गई। प्रति क्षेत्र सकारात्मक कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना की गई थी।

प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) या एनेक्सिन वी-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। कॉडा एपिडीडिमिस को निम्नलिखित बलिदान से काटा गया था और एपिडीडिमिस निलंबन प्राप्त करने के लिए एपिडीडिमिस से शुक्राणु को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर पीबीएस में छोड़ने के लिए एपिडर्मिस को ब्लेड से काट दिया गया था। बाद में निलंबन को 37˚C पर 10 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया ताकि शुक्राणु बाहर निकल सकें। शुक्राणु के एकत्रीकरण को त्याग दिया गया और शेष शुक्राणु के नमूनों को अलग कर दिया गया और 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता देने के लिए पीबीएस में पुन: निलंबित कर दिया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, एनेक्सिन वी-एफआईटीसी एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (नानजिंग कीजेन बायोटेक कं, लिमिटेड, नानजिंग, चीन) का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस का विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए शुक्राणु निलंबन के 1 मिलीलीटर को 10 μl पीआई या 500 μl बाध्यकारी बफर और 5 μl एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के साथ अंधेरे में दाग दिया गया था। कोशिकाओं का तुरंत एपिक्स एक्सएल फ्लो साइटोमेट्री (बेकमैन कल्टर, इंक.) और एक टेट्राओन ™ सिस्टम (6915050; बेकमैन कल्टर, इंक।) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। एपोप्टोसिस के शुरुआती चरणों में कोशिकाओं की पहचान एनेक्सिन वी-पॉजिटिव स्टेनिंग द्वारा की गई थी और नेक्रोटिक कोशिकाओं की पहचान पीआई-पॉजिटिव स्टेनिंग द्वारा की गई थी।

सांख्यिकीय विश्लेषण। डेटा विश्लेषण SPSS 13.0 सॉफ़्टवेयर (SPSS, Inc., शिकागो, IL, USA) का उपयोग करके किया गया था और संकेत के अनुसार माध्य प्लस या ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया था। तुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट के बाद विचरण के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग करके समूहों के बीच अंतर का महत्व के लिए मूल्यांकन किया गया था। पी<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

सिस्टांचे डेजर्टिकोला

परिणाम

वृषण सेमिनिफेरस नलिकाओं के विकास पर नए WSSJD का प्रभाव। माउस वृषण सेमिनिफेरस नलिकाओं के विकास पर नए WSSJD के संभावित सुरक्षात्मक प्रभाव की जांच करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत एच एंड ई-दाग वाले माउस वृषण की आकृति विज्ञान की तुलना की गई थी। CsA और CC समूहों से चूहों के अर्धवृत्ताकार नलिकाओं ने नियंत्रण के साथ तुलना में नलिका फ्रिंज के सिकुड़न, नलिका व्यास में कमी और वृषण सेमिनिफेरस एपिथेलियम की परतों को कम किया। इसके अलावा, शुक्राणुजन्य कोशिकाओं ने एक अव्यवस्थित व्यवस्था का प्रदर्शन किया, शुक्राणुजन्य कोशिकाओं की संख्या कम हो गई और लुमेन में कुछ परिपक्व शुक्राणु दिखाई दे रहे थे (चित्र 1)। DMSO, WSSJD और नए WSSJD समूहों के चूहों में, वृषण सेमिनिफेरस एपिथेलिया की अधिक परतें दिखाई दे रही थीं और सेमिनिफेरस ट्यूब्यूल फ्रिंज को बिना संकोचन या पतन के एकीकृत किया गया था (चित्र 1)। जॉन्सन स्कोर डीएमएसओ समूह और नियंत्रण समूहों के बीच, या सीसी और डीएमएसओ समूहों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थे। हालांकि, नियंत्रण समूह की तुलना में सीएसए समूह और डब्ल्यूएसएसजेडी समूह में जॉन्सन स्कोर में काफी कमी आई थी, और सीसी या सीएसए समूह (पी) की तुलना में डब्ल्यूएसएसजेडी और नए डब्ल्यूएसएसजेडी समूहों के स्कोर में काफी वृद्धि हुई थी।<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">

सीरम टेस्टोस्टेरोन और LH पर नए WSSJD का प्रभाव। सीरम में टेस्टोस्टेरोन और एलएच के स्तर को बाद में मापा गया। डीएमएसओ प्रशासन के बाद टेस्टोस्टेरोन और एलएच के सीरम स्तर अप्रभावित थे। इसके विपरीत, सीरम टेस्टोस्टेरोन को काफी कम कर दिया गया था, और LH को CsA- उपचारित चूहों में नियंत्रण के सापेक्ष काफी हद तक अपग्रेड किया गया था (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">

LHR और P450scc के भावों पर नए WSSJD का प्रभाव। P450scc और LHR के भावों का मूल्यांकन वृषण लेडिग कोशिकाओं में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (अंजीर। 3 और 4) द्वारा किया गया था। नियंत्रण समूह में, एलएचआर को अर्धवृत्ताकार नलिकाओं (छवि 3 ए) के बीच लेडिग कोशिकाओं की बाहरी झिल्लियों पर व्यक्त किया गया था, और पी 450 सीसी को टेस्टिकुलर लेडिग कोशिकाओं (छवि 4 ए) के साइटोप्लाज्म में व्यक्त किया गया था। DMSO उपचार का LHR और P450scc के भावों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। इसके विपरीत, CsA उपचार ने नियंत्रण चूहों ( P .) की तुलना में LHR और P450scc के भावों को काफी कम कर दिया<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">

शुक्राणुजन्य कोशिका एपोप्टोसिस पर नए WSSJD का प्रभाव। माउस वृषण में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं के एपोप्टोसिस का विश्लेषण ट्यूनल परख द्वारा किया गया था। एपोप्टोटिक कोशिकाओं के नाभिक मुख्य रूप से शुक्राणुजन और प्राथमिक शुक्राणुनाशक (चित्र 5 ए) में देखे गए थे। स्पर्मेटोगोनिया स्पर्मेटोसाइट्स से बड़े होते हैं और बेसमेंट मेम्ब्रेन (23) के करीब स्थित होते हैं। वृषण में एपोप्टोटिक शुक्राणुजन्य कोशिकाओं की संख्या पर डीएमएसओ उपचार का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। इसके विपरीत, CsA के साथ उपचार ने नियंत्रण और DMSO समूहों (P) की तुलना में एपोप्टोटिक शुक्राणुजन्य कोशिकाओं की संख्या में काफी वृद्धि की<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">

शुक्राणु के अस्तित्व और प्रारंभिक एपोप्टोसिस पर नए WSSJD के प्रभाव। CsA- प्रेरित शुक्राणु एपोप्टोसिस के खिलाफ नए WSSJD के सुरक्षात्मक प्रभावों को सत्यापित करने के लिए, एपिडीडिमिस में शुक्राणु के अस्तित्व और प्रारंभिक एपोप्टोसिस को निर्धारित किया गया था। एपिडीडिमल शुक्राणु को पीआई या एनेक्सिन वी के साथ दाग दिया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री (अंजीर। 6 और 7) द्वारा विश्लेषण किया गया था। उपरोक्त परिणामों के बाद, CsA उपचार ने जीवित शुक्राणुओं के प्रतिशत को काफी कम कर दिया और प्रारंभिक एपोप्टोटिक शुक्राणु (P) के प्रतिशत में काफी वृद्धि की।<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">

बहस

यह पहले प्रलेखित किया गया है कि एक इम्यूनोसप्रेसिव एजेंट के रूप में CsA का दीर्घकालिक उपयोग प्रजनन क्षमता (6) को प्रभावित करता है। जू (24) ने बताया कि CsA के साथ इलाज किए गए रोगियों में शुक्राणु की आकृति विज्ञान और जीवन शक्ति एक अनुपचारित समूह की तुलना में काफी कम थी, जैसा कि CsA की विभिन्न खुराक और 12 स्वस्थ स्वयंसेवकों के साथ इलाज किए गए 26 गुर्दे प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के वीर्य के नमूनों में देखा गया है। यह भी देखा गया कि सीएसए-उपचारित प्राप्तकर्ताओं (24) में शुक्राणु के सिर की विकृति दर काफी अधिक थी। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि सीएसए का वीर्य मापदंडों पर खुराक पर निर्भर प्रभाव था। इसलिए, सीएसए-प्रेरित वृषण क्षति को कम करने और अंग प्रत्यारोपण के बाद पुरुष प्रजनन क्षमता में सुधार करने में सक्षम उपन्यास औषधीय एजेंटों की पहचान करने के लिए अध्ययनों की आवश्यकता है।

वृषण का विशिष्ट सूक्ष्म वातावरण शुक्राणुजनन को बढ़ावा देता है, और इस प्रकार वृषण संरचना और कार्य की हानि से शुक्राणुजन्य गिरफ्तारी (25) हो सकती है। मोंटेइरो एट अल (26) ने 56 दिनों के लिए प्रति दिन 15 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर सीएसए के साथ विस्टार चूहों का इलाज किया, और संयोजी ऊतक के बढ़े हुए वॉल्यूमेट्रिक अनुपात को देखा और सीएसए-उपचारित चूहों में लेडिग कोशिकाओं के वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में कमी आई। यह भी देखा गया कि CsA ने अर्धवृत्ताकार उपकला अध: पतन का कारण बना, जिसके परिणामस्वरूप सर्टोली कोशिका का टीकाकरण, असामान्य गोल और लम्बी शुक्राणु, और लुमेन (26) से सटे उपकला सीमा पर अवशिष्ट कोशिका द्रव्य का संचय हुआ। वर्तमान अध्ययन में, कुनमिंग चूहों को 30 दिनों के लिए प्रतिदिन 15 मिलीग्राम / किग्रा सीएसए के साथ इलाज किया गया था, जिससे सिकुड़न और अर्धवृत्ताकार नलिकाओं के व्यास में कमी, अर्धवृत्ताकार उपकला परतों में कमी, अर्धवृत्ताकार कोशिकाओं की अव्यवस्थित व्यवस्था, परिपक्व में कमी लुमेन में शुक्राणु और जॉन्सन स्कोर में काफी कमी आई है।

इसके अलावा, सीएसए उपचार के साथ उपचार ने टेस्टिकुलर संरचना को गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त कर दिया। वर्तमान अध्ययन ने सीएसए-उपचारित चूहों के वृषण पर एक नई चीनी दवा के रूप में नई डब्ल्यूएसएसजेडी के सुरक्षात्मक प्रभावों का भी मूल्यांकन किया। यह देखा गया कि नए WSSJD के साथ उपचार के बाद वृषण सेमिनिफेरस एपिथेलियल परतों और सेमिनिफेरस कोशिकाओं की व्यवस्था को बहाल किया गया था। इसके अलावा, नए WSSJD समूह में चूहों ने बिना सिकुड़न या पतन के एकीकृत अर्धवृत्ताकार नलिकाओं का प्रदर्शन किया और CsA- उपचारित चूहों की तुलना में जॉन्सन का स्कोर काफी अधिक था। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि WSSJD ने CsA- प्रेरित वृषण क्षति की काफी मरम्मत की, यह दर्शाता है कि यह हर्बल दवा यौगिक CsA- प्रेरित वृषण क्षति की रोकथाम में एक प्रभावी उपचार हो सकता है। यह कोशिका मरम्मत उपकला के भीतर के स्थान पर निर्भर है या नहीं, यह भी एक महत्वपूर्ण प्रश्न है, जिसकी जांच भविष्य के अध्ययनों में की जानी चाहिए।

हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी-वृषण अक्ष जननांग गतिविधि (27) के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पुरुष जननांग अंगों के विकास और कार्यक्षमता को हाइपोथैलेमस और पिट्यूटरी ग्रंथियों (28) से हार्मोन द्वारा नियंत्रित किया जाता है। क्रूगर एट अल (29) ने स्प्रेग डावले चूहों को 25 मिलीग्राम/किग्रा/दिन सीएसए या 40 मिलीग्राम/किग्रा/दिन सीएसए के साथ 6 दिनों के लिए इलाज किया और देखा कि एलएच और एफएसएच के सीरम स्तर में 2-4 गुना वृद्धि हुई है, जबकि पी450एससीसी अभिव्यक्ति नियंत्रण समूह में घटकर 30 प्रतिशत हो गया। इसके अलावा, सीएसए-उपचारित चूहों में सीरम टेस्टोस्टेरोन का स्तर काफी कम हो गया था, जिसके परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ शुक्राणुजनन (29) हुआ। वर्तमान अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया कि CsA उपचार ने Leydig कोशिकाओं में LHR की अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया। हालांकि सीरम एलएच में वृद्धि हुई थी, एलएचआर की घटी हुई अभिव्यक्ति ने टेस्टोस्टेरोन बायोसिंथेसिस की एलएच-मध्यस्थता वसूली को खराब कर दिया हो सकता है और टेस्टोस्टेरोन बायोसिंथेसिस (30) के दर-सीमित एंजाइम के रूप में पी 450 एससीसी की अभिव्यक्ति में कमी आई है, इस प्रकार लेडिग कोशिकाओं द्वारा टेस्टोस्टेरोन बायोसिंथेसिस को प्रभावित करता है। नए WSSJD में नए तत्व, जैसे कि पाइलोज एंटलर, सेक्स हार्मोन (12) के समान प्रभाव प्रदर्शित करते हैं, जो सीरम टेस्टोस्टेरोन के स्तर में सुधार कर सकते हैं और सीरम LH स्तर को कम कर सकते हैं, इस प्रकार Leydig कोशिकाओं में LHR और p450scc अभिव्यक्ति को बढ़ा सकते हैं। विशेष रूप से, वर्तमान परिणामों ने संकेत दिया कि नए WSSJD ने शुक्राणुजनन को बढ़ावा देने के लिए लेडिग कोशिकाओं में टेस्टोस्टेरोन जैवसंश्लेषण और स्राव को उत्तेजित किया।

सीएसए-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव और वृषण क्षति शुक्राणु और शुक्राणुजन्य कोशिकाओं के डिसप्लेसिया को प्रेरित करती है (31)। यह बताया गया है कि लंबे समय तक CsA उपचार जानवरों के वृषण ऊतकों में एंटीऑक्सिडेंट प्रणाली को नुकसान पहुंचाता है, जिससे ग्लूटाथियोन, ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर में कमी आती है और वृषण में मैलोनिक डायल्डिहाइड का स्तर बढ़ जाता है (31)। इसलिए, वृषण ऊतकों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के अत्यधिक स्तर को समाप्त नहीं किया जा सकता है, जिससे शुक्राणु झिल्ली लिपिड के पेरोक्सीडेशन, डीएनए क्षति, और शुक्राणु जीवन शक्ति में कमी आती है। वर्तमान अध्ययन में, यह देखा गया कि CsA उपचार ने डीएनए के टूटने और अर्धवृत्ताकार नलिकाओं में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं की एपोप्टोटिक दर में काफी वृद्धि की। एपिडीडिमिस में शुक्राणु के जीवित रहने की दर में भी कमी आई, जबकि प्रारंभिक एपोप्टोटिक शुक्राणु के प्रतिशत में वृद्धि हुई, यह दर्शाता है कि वृषण की शुक्राणुजन्य गतिविधि काफी क्षतिग्रस्त हो गई थी। Türk et al (32) ने प्रलेखित किया कि CsA- प्रेरित वृषण क्षति पर एलाजिक एसिड का सुरक्षात्मक प्रभाव नर चूहों में ऑक्सीडेटिव तनाव से जुड़ा था। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए नए WSSJD में हर्बल दवा जिनसेंग सहित विभिन्न एंटीऑक्सिडेंट घटक शामिल हैं, जो पहले वृषण में हाइपरऑक्साइड के स्तर को काफी कम करने के लिए प्रदर्शित किया गया है (14)।

वर्तमान अध्ययन में, टेस्टोस्टेरोन संश्लेषण और शुक्राणुजन्य एपोप्टोसिस के CsA- प्रेरित हानि पर नए WSSJD के प्रभावों की जांच की गई, और यह देखा गया कि नए WSSJD ने शुक्राणुजन्य कोशिकाओं और शुक्राणुओं की एपोप्टोटिक दरों में काफी कमी की, और इस प्रकार वृषण सेमिनिफेरस को क्षति की मरम्मत की। उपकला. वृषण सेमिनिफेरस नलिकाओं की आकृति विज्ञान और शुक्राणुजन्य कोशिकाओं और शुक्राणु के एपोप्टोसिस की जांच हिस्टोकेमिस्ट्री और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके की गई थी। यद्यपि कोशिका चक्र वितरण और दैनिक शुक्राणु उत्पादन की जांच नहीं की गई थी, वे हमारे समूह द्वारा भविष्य के अध्ययन का फोकस होंगे।

WSSJD ने वृषण में टेस्टोस्टेरोन के स्तर में काफी वृद्धि की और शुक्राणुजन्य कोशिकाओं और शुक्राणु के एपोप्टोसिस को कम किया, जिसने प्रभावी रूप से CsA- प्रेरित वृषण क्षति की मरम्मत की। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि नया WSSJD CsA- प्रेरित वृषण क्षति के उपचार और रोकथाम में एक उपयोगी औषधीय एजेंट हो सकता है।

सिस्टांचे डेजर्टिकोला पूरे रूट्स

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