मल्टीप्लेक्स टायरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन और डीप लर्निंग का उपयोग करके किडनी ट्रांसप्लांट बायोप्सी में भड़काऊ घुसपैठ का मात्रात्मक आकलन

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मायके हर्मसेन¹वालेरी वोल्को²जान हेनरिक ब्रासेनो²और अन्य

सार

डिलेड ग्राफ्ट फंक्शन (DGF) किडनी ट्रांसप्लांट में इंटरस्टीशियल ब्रोसिस और ट्यूबलर एट्रोफी (IFTA) के विकास के लिए एक मजबूत जोखिम कारक है। डीजीएफ रोगियों की किडनी बायोप्सी में इन-एम्मेटरी इन-इंट्रेट्स का मात्रात्मक मूल्यांकन आईएफटीए विकास के लिए भविष्य कहनेवाला मार्कर प्रकट कर सकता है। इस अध्ययन में, हमने प्रत्यारोपण के 6 सप्ताह बाद लिए गए डीजीएफ रोगियों (एन=22) की किडनी बायोप्सी में इन-एम्मेटरी माइक्रोएन्वायरमेंट का आकलन करने के लिए मल्टीप्लेक्स टाइरामाइड सिग्नल एम्प्लिकेशन (एमटीएसए) और कन्वेन्शनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) को जोड़ा। IFTA विकास के लिए मरीजों का स्तरीकरण किया गया (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

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परिचय

गुर्दा प्रत्यारोपण के बाद विलंबित ग्राफ्ट फ़ंक्शन (डीजीएफ) बहुक्रियात्मक है और मुख्य रूप से दाता विशेषताओं और इस्किमिया समय से संबंधित है। डीजीएफ को आमतौर पर प्रत्यारोपण के बाद 7 दिनों के भीतर डायलिसिस की आवश्यकता के रूप में वर्णित किया जाता है और यह क्रोनिक किडनी ग्राफ्ट की चोट [1-3] के लिए एक मजबूत जोखिम कारक है। क्रोनिक किडनी की चोट का एक शास्त्रीय घटक अंतरालीय फाइब्रोसिस और ट्यूबलर एट्रोफी (आईएफटीए) की उपस्थिति है। हालांकि, सभी डीजीएफ रोगी आईएफटीए के विकास में प्रगति नहीं करते हैं, और डीजीएफ और आईएफटीए के बीच के जटिल संबंध को अभी भी कम समझा जाता है। यह संभावित कारक घटनाओं और कार्यात्मक गिरावट के बीच अंतराल के समय के कारण पहला है, और दूसरा संभावित संकेतकों के परिवर्तनीय और जटिल प्रभावों जैसे अस्वीकृति और दवा के दुष्प्रभाव [1, 4] के कारण है। सूजन और विशिष्ट मैक्रोफेज की सामान्य उपस्थिति को कई अध्ययनों में भ्रष्टाचार के नुकसान [5-8] के भविष्यवक्ता के रूप में वर्णित किया गया है। हालांकि, अंतर्निहित रोग प्रक्रियाओं को पूरी तरह से समझा नहीं गया है, और उच्च स्तर की सूजन हमेशा दीर्घकालिक भ्रष्टाचार हानि का कारण नहीं बनती है। पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के परिणामस्वरूप, मैक्रोफेज विशेष कार्य प्राप्त करते हैं और विभिन्न फेनोटाइप में ध्रुवीकरण करते हैं। कई अध्ययनों से पता चलता है कि विशिष्ट मैक्रोफेज उपप्रकार (वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज) ऊतक मरम्मत या ब्रोसिस को प्रेरित करके ऊतक रीमॉडेलिंग में शामिल होते हैं। ऊतक रीमॉडेलिंग (कभी-कभी प्रो-ब्रोटिक) फेनोटाइप की ओर ध्रुवीकरण को टी-हेल्पर लिम्फोसाइट उपप्रकारों [9–11] द्वारा प्रदान किए गए अन्य लोगों के बीच पर्यावरणीय उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर निर्भर होने के लिए जाना जाता है। डीजीएफ के समय ग्राफ्ट में टी-हेल्पर सेल आबादी के आकलन से एक प्रचलित टी-हेल्पर 1 उपप्रकार का पता चला, लेकिन ग्राफ्ट परिणाम या आईएफटीए की प्रगति के सहसंबंधों की अब तक जांच नहीं की गई थी [12]। विशेष रूप से चयनित रोगी समूहों में मैक्रोफेज और टी-हेल्पर सेल सबसेट पर विशेष रूप से केंद्रित इन-एम्मेटरी माइक्रोएन्वायरमेंट का एक व्यापक मूल्यांकन इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि क्यों कुछ, लेकिन सभी डीजीएफ रोगी आईएफटीए के विकास के लिए प्रगति नहीं करते हैं।

हालांकि, भड़काऊ घुसपैठ की एक व्यापक जांच कई (तकनीकी) सीमाओं से बाधित है। पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक एक ऊतक खंड में केवल सीमित संख्या में सेल मार्करों के दृश्य का समर्थन करती हैं। गुर्दे की बायोप्सी जैसे छोटे, मूल्यवान ऊतक के टुकड़ों की सीरियल सेक्शनिंग वांछित नहीं है और विभिन्न वर्गों में कोशिकाओं के बीच संबंधों की व्याख्या करना कठिन है। इसके अलावा, दृश्य अनुमान द्वारा घुसपैठ की घुसपैठ का मात्रात्मक मूल्यांकन इंटरऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता के एक महत्वपूर्ण स्तर के साथ आता है [13]। पारंपरिक छवि प्रसंस्करण तकनीक जैसे कि पिक्सेल थ्रेशोल्डिंग, वाटरशेड, और आकारिकी-आधारित विभाजन एक डेटा सेट [14-16] में सभी मॉर्फोलॉजिक सेल अभ्यावेदन और ऊतक दाग की तीव्रता के पूर्व ज्ञान पर निर्भर करते हैं। इसलिए, इन विधियों में अक्सर जैविक और तकनीकी छवि विविधताओं के लिए मजबूती का अभाव होता है और नए या बाहरी डेटा सेटों में खराब अनुवाद होता है। डिजिटल पैथोलॉजी के उदय ने संपूर्ण-स्लाइड छवियों (डब्ल्यूएसआई) [17, 18] के मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक तरीकों के विकास को गति दी है। डीप लर्निंग मॉडल, विशेष रूप से, कन्वेन्शनल न्यूरल नेटवर्क (सीएनएन) हिस्टोपैथोलॉजिकल स्लाइड्स [19-23] में प्रासंगिक जैविक संरचनाओं को खंडित करने और उनका पता लगाने में सक्षम साबित हुए हैं। इन तकनीकों में व्यक्तिपरक दृश्य अनुमान और पारंपरिक छवि प्रसंस्करण से सटीक, उद्देश्य और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल का पता लगाने की क्षमता है।

इस अध्ययन का उद्देश्य व्यापक सीरियल स्लाइड सेक्शनिंग की आवश्यकता को दरकिनार करते हुए उद्देश्य के लिए एक विधि विकसित करना है, जो कई इन-एम्मेटरी सेल मार्करों का मात्रात्मक मूल्यांकन करता है। ऐसा करने के लिए, हम मल्टीप्लेक्स IHC, मल्टी-स्पेक्ट्रल इमेजिंग और डीप लर्निंग मॉडल को मिलाते हैं। इन तकनीकों की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, हम डीजीएफ रोगियों की निगरानी ग्राफ्ट बायोप्सी में आईएफटीए के विकास के साथ, गहन शिक्षण मॉडल द्वारा परिमाणित, इन-एम्मेटरी माइक्रोएन्वायरमेंट के सहसंबंधों का अध्ययन करते हैं।

गुर्दे की बीमारियों का इलाज करने वाले सिस्टैंच का अर्क

सामग्री और तरीके

डीजीएफ रोगियों की किडनी बायोप्सी में इन-एम्मेटरी माइक्रोएन्वायरमेंट का आकलन करने के लिए, हमने प्रत्यारोपण के 6 सप्ताह बाद ली गई निगरानी बायोप्सी पर मल्टीप्लेक्स आईएचसी का प्रदर्शन किया। IFTA विकास के लिए मरीजों का स्तरीकरण किया गया (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

ऊतक के नमूने

हमने हनोवर मेडिकल स्कूल (हनोवर, जर्मनी) में किडनी प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से निगरानी बायोप्सी का इस्तेमाल किया, जिसे एक संभावित निगरानी बायोप्सी कार्यक्रम के संदर्भ में हासिल किया गया था। समावेशन मानदंड थे: डीजीएफ घटना<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

आईएफटीए मूल्यांकन

6 सप्ताह और 6 महीने में इंटरस्टीशियल ब्रोसिस (सीआई) और ट्यूबलर एट्रोफी (सीटी) (आईएफटीए) की सीमा, बैनफ लेसियन ग्रेडिंग सिस्टम [24] का उपयोग करके व्यक्त की गई थी, जिसे पैथोलॉजी रिपोर्ट से हासिल किया गया था। प्रारंभिक प्रारंभिक घुसपैठ और आईएफटीए विकास के बीच संबंधों का अधिक विस्तार से आकलन करने के लिए, सभी पीएएस-दाग वाली स्लाइडों को पैनोरमिक 250 फ्लैश II डिजिटल स्लाइड स्कैनर (3DHistech, हंगरी) का उपयोग करके 20 के साथ पुन: परीक्षा के लिए डिजीटल किया गया था। × 0.24 माइक्रोन/पिक्सेल के संकल्प पर उद्देश्य। दोनों समय बिंदुओं (6 सप्ताह और 6 महीने) के पीएएस डब्ल्यूएसआई को तीन गुर्दा रोगविज्ञानी द्वारा आईएफटीए (सतह क्षेत्र का प्रतिशत, 10 प्रतिशत अंतराल के साथ) की सीमा के लिए स्कोर किया गया था। पैथोलॉजिस्ट के माध्य IFTA स्कोर का उपयोग अंतिम स्कोर के रूप में IFTA में 6 सप्ताह और 6 महीने के बाद प्रत्यारोपण के बीच परिवर्तन की गणना के लिए किया गया था। आईएफटीए स्कोर में 10 प्रतिशत या उससे अधिक (एन=13) की पूर्ण वृद्धि से मरीजों का स्तरीकरण किया गया था और नहीं या नहीं<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

इसके अलावा, विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण का उपयोग करके समय बिंदुओं के बीच बैनफ घाव के स्कोर की तुलना की गई। इसने Banff श्रेणियों ti (p=0.017), ci (p=0.004), और ct (p=0.011) के लिए 6 सप्ताह और 6 महीने की बायोप्सी के बीच महत्वपूर्ण अंतर प्रकट किया। .

मल्टीप्लेक्स टीएसए धुंधला

हमने 6 सप्ताह की बायोप्सी में कई सेल मार्करों की कल्पना करने के लिए एमटीएसए का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स आईएचसी का प्रदर्शन किया। एक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, ऊतक को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले टायरामाइड के साथ इलाज किया गया था। द्वितीयक एंटीबॉडी से हॉर्स-मूली पेरोक्सीडेज सक्रिय टाइरामाइड रेडिकल्स के गठन को उत्प्रेरित करता है। टाइरामाइड रेडिकल्स सहसंयोजक रूप से एंटीजन पर टाइरोसिन अवशेषों से बंधते हैं। इस स्थायी बंधन ने प्राथमिक-माध्यमिक एंटीबॉडी परिसर के गर्मी-प्रेरित हटाने की अनुमति दी, जबकि फ्लोरोसेंट टाइरामाइड जमा [25] को संरक्षित किया। इसने लक्ष्य प्रतिजनों के खिलाफ एक ही प्रजाति से आगे के एंटीबॉडी के साथ बाद के क्रमिक ऊष्मायन को सक्षम किया।

एमटीएसए 6 सप्ताह की निगरानी बायोप्सी से लगातार दो स्लाइड्स पर किया गया था। हमने अपने रोगी समूहों में भड़काऊ घुसपैठ और पेरिटुबुलर केशिका सीमा का आकलन करने के लिए दो एमटीएसए पैनल विकसित किए। पैनल I में एंटी-सीडी3, सीडी4, सीडी8, सीडी20, सीडी68, और सीडी34 एंटीबॉडी मौजूद थे। पैनल II का उपयोग टी-हेल्पर सेल और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण की जांच के लिए एंटी-सीडी 4, टीबीईटी, जीएटीए 3, सीडी 68 और सीडी 163 एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया था। एंटीबॉडी विनिर्देश, कमजोर पड़ने और धुंधला होने के आदेश पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। सभी स्लाइड्स को xylene में चित्रित किया गया था, 95 प्रतिशत इथेनॉल में निर्जलित किया गया था, नल के पानी में धोया गया था, और 10x पतला ट्रिबोरेट-ईडीटीए (टीबीई 10x) में एपिटोप पुनर्प्राप्ति के लिए उबाला गया था। , 0658, वीडब्ल्यूआर लाइफ साइंसेज, यूएस) बफर। ठंडा होने के बाद, स्लाइड्स को अंतर्जात पेरोक्सीडेज को अवरुद्ध करने के लिए 3 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्सीडेज घोल में धोया गया और 0.05 प्रतिशत ट्वीन 20 (822184, मर्क केजीए, जर्मनी) (टीबीएस-टी) के साथ ट्रिस-बफर खारा बफर से धोया गया। 1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) (एमटीएसए चरण 1) के साथ टीबीएस-टी का उपयोग करके प्रोटीन अवरोधन किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर, या रात भर चार डिग्री सेल्सियस (एमटीएसए चरण 2) पर लगाए गए थे। टीबीएस-टी में धोने के बाद, स्लाइड्स को एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (पॉली-एचआरपी-जीएएम / आरबी आईजीजी, वीडब्ल्यूआरकेडीपीवीओ 999 एचआरपी, इम्यूनोलॉजिक, नीदरलैंड) के साथ कमरे के तापमान (एमटीएसए चरण 3) पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। इसके बाद, टीएसए को ओपल 7- कलर मैनुअल आईएचसी किट (एनईएल811001केटी, अकोया बायोसाइंसेज, यूएस) से ओपल टीएसए uorophores का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया (एमटीएसए चरण 4) (fluorophores और उनके संबंधित एंटीबॉडी पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं)। एंटीबॉडी-टीएसए कॉम्प्लेक्स को टीबीई बफर (एमटीएसए चरण 5) में उबलते चक्र के साथ हटा दिया गया था। संबंधित पैनल से सभी एंटीबॉडी के साथ स्लाइड्स को दागने तक mTSA चरण 1-5 को दोहराया गया था। स्लाइड्स को DAPI (00-4959-52, थर्मो फिशर, यूएस) के साथ uoromount-G के साथ कवर किया गया था।

हर्बा सिस्टेनचे

मल्टीप्लेक्स टीएसए सत्यापन

बार-बार उबलने के चक्र लक्ष्य एपिटोप आत्मीयता को प्रभावित कर सकते हैं। ऊतक को कई बार उबालने के बाद कुछ एंटीबॉडी एक कमजोर धुंधला पैटर्न दिखाते हैं, अन्य एंटीबॉडी को इष्टतम धुंधला तीव्रता तक पहुंचने के लिए अधिक उबलते चक्र की आवश्यकता होती है, और अन्य बिल्कुल भी प्रभावित नहीं होते हैं। हमने एफएफपीई नियंत्रण टॉन्सिल ऊतक पर क्रोमोजेनिक आईएचसी का उपयोग करने वाले सभी एंटीबॉडी के लिए इस प्रभाव का आकलन किया। प्रत्येक परीक्षण किए गए एंटीबॉडी (n=9) के लिए, छह वर्गों को काटा गया (4 माइक्रोन मोटा)। सभी स्लाइड्स को xylene में चित्रित किया गया, 95 प्रतिशत इथेनॉल में निर्जलित, नल के पानी में धोया गया, और 10x पतला TBE (उबलते चक्र एक) में एपिटोप पुनर्प्राप्ति के लिए उबाला गया। ठंडा होने के बाद, प्रति परीक्षण प्रति शरीर एक स्लाइड फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में संग्रहीत किया गया था। शेष स्लाइड्स को फिर से उबाला गया। यह चक्र पांच बार दोहराया गया। बाद में सभी स्लाइड्स को 3 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्सीडेज घोल में धोया गया और उसके बाद पीबीएस में रिंस किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी (पूरक तालिका 1) को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। ऊष्मायन के बाद, स्लाइड्स को पीबीएस में धोया गया था। एंटी-सीडी68, तिब्बत और GATA3 एंटीबॉडी से सना हुआ स्लाइड्स को 15 मिनट (VWRKDPVB ब्लॉकिंग, इम्यूनोलॉजिक, द नीदरलैंड्स) के लिए पोस्ट-एंटीबॉडी ब्लॉकिंग (PAB) के साथ एक अतिरिक्त ऊष्मायन की आवश्यकता होती है। ऊष्मायन के बाद, स्लाइड्स को पीबीएस में धोया गया और एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (पीएबी वीडब्ल्यूआरकेडीपीवीबी 110 एचआरपी, इम्यूनोलॉजिक, नीदरलैंड्स के बाद, अन्य के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी अनुपूरक तालिका 1 देखें) के साथ ऊष्मायन किया गया। विज़ुअलाइज़ेशन 3,3′-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) (ब्राइट-डीएबी, वीडब्ल्यूआरकेबीएस04, इम्यूनोलॉजिक, द नीदरलैंड्स) का उपयोग करके किया गया था। परिणाम अनुपूरक चित्र 1 में देखे गए हैं। 1. इन परिणामों के आधार पर, हमने एमटीएसए प्रयोगों के लिए इष्टतम एंटीबॉडी क्रम निर्धारित किया, जैसा कि पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध है।

यदि ब्याज के प्रसंग सह-स्थानीयकृत हैं, तो टायरामाइड जमा एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस स्थैतिक अवरोध का परीक्षण करने के लिए, हमने टॉन्सिल नियंत्रण ऊतक स्लाइड का उपयोग किया और इन्हें हमारे एमटीएसए पैनल के साथ दाग दिया। एमटीएसए में एंटीबॉडी अभिव्यक्ति की तुलना एकल-दाग वाली स्लाइड्स में की गई थी, जो समान संख्या में उबलते चक्रों से गुजरती थी। हमने सिंगल और मल्टीप्लेक्स-सना हुआ स्लाइड्स (पैनल I, सप्लीमेंट्री अंजीर 2 और 3 से शामिल उदाहरण) के बीच धुंधला पैटर्न में अंतर नहीं देखा। एमटीएसए में सभी प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग उसी कमजोर पड़ने में किया गया था जिसका उपयोग क्रोमोजेनिक आईएचसी के लिए किया गया था। टीएसए समाधान कमजोर पड़ने को समायोजित करके फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता को अनुकूलित किया गया था।

मल्टीप्लेक्स टीएसए इमेजिंग

मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग एक वेक्ट्रा पोलारिस इमेजिंग सिस्टम (CLS143455, अकोया बायोसाइंसेज, यूएस) का उपयोग करके 2 0 x उद्देश्य के साथ, 0.49 माइक्रोन प्रति पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन पर, और DAPI, FITC, CY3, टेक्सास रेड, और का उपयोग करके किया गया था। Cy5 वर्णक्रमीय क्यूब्स। वेक्ट्रा प्रणाली मल्टीस्पेक्ट्रल अधिग्रहण के लिए क्षेत्रों के मैनुअल चयन की अनुमति देती है, जिन्हें बाद में सिस्टम द्वारा टाइलों में विभाजित किया जाता है (चित्र 1.1)। ऑटो-प्रतिदीप्ति का स्पेक्ट्रा और सभी ओपल टीएसए फ्लोरोफोरस को सूचित उन्नत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 2.4.6 का उपयोग करके वर्णक्रमीय "लाइब्रेरी" में पूर्व-दर्ज किया गया था। (अकोया बायोसाइंसेज, यूएस)। वर्णक्रमीय पुस्तकालय ने मल्टीप्लेक्स टाइल को कई एकल टाइलों में विघटित करने में सक्षम किया जो प्रत्येक uorophore ("अनमिक्सिंग") के योगदान का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके परिणामस्वरूप मोनो-क्रोम, बहु-चैनल वाली टाइलें, प्रत्येक चैनल एक एकल uorophore के अनुरूप होता है और इस प्रकार, एंटीबॉडी (चित्र 1.2)।

आर्टिफिशियल ब्राइट (एल्ड आईएचसी) में रूपांतरण

संग्रहीत निर्देशांकों के आधार पर, कस्टम पायथन लिपि (चित्र 1.3) का उपयोग करके एक बहु-चैनल WSI बनाने के लिए टाइलों को सिला गया था। डीएपीआई सिग्नल (आईडीएपीआई) का प्रतिनिधित्व करने वाले चैनल और एंटीबॉडी (आईआईएचसी) में से एक का प्रतिनिधित्व करने वाले चैनलों को क्रमशः कृत्रिम हेमटॉक्सिलिन और डीएबी धुंधला में बदल दिया गया था (अंजीर। 1.4 और 1.5)। ज्ञात क्रोमैटिक हेमेटोक्सिलिन और डीएबी सीएक्स के आधार पर, साइ रंग-संतृप्ति-घनत्व (एचएसडी) परिवर्तन के बाद समन्वय करता है, पिछले अध्ययनों में दाग वैक्टर हासिल किए गए थे [26, 27]। इन दाग सदिशों का उपयोग आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC (चित्र 1.5) के लिए लाल-हरे-नीले मानों की गणना के लिए किया गया था, जैसे:

सीआर के साथ, स्पेक्ट्रम के लाल हिस्से में डाई सेंट के प्रकाश अवशोषण सेंट। B और G के मानों की गणना एक समान तरीके से की गई थी।

छवि विश्लेषण

रुचि के क्षेत्र (आरओआई)

स्वचालित स्लाइड विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म सॉफ़्टवेयर (ASAP; संस्करण 1.9, GitHub पर ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के रूप में उपलब्ध) का उपयोग करके कॉहोर्ट में हर मामले के लिए रुचि के क्षेत्र (ROI) को एनोटेट किया गया था। इन आरओआई में कॉर्टिकल ट्यूबलोइंटरस्टिटियम शामिल था, इस प्रकार कैप्सूल, ग्लोमेरुली और धमनियों को छोड़कर। चूंकि वृक्क उपकैप्सुलर क्षेत्रों में सूजन को प्रत्यारोपण विकृति विज्ञान में गैर-विशिष्ट माना जाता है, इस अध्ययन में बायोप्सी का मुख्य रूप से उपकैप्सुलर क्षेत्र (कैप्सूल के नीचे 400 माइक्रोन के रूप में परिभाषित) को छोड़कर विश्लेषण किया गया था। दूसरे, हमने उप-क्षेत्र सहित विश्लेषणों को दोहराया। आरओआई के दृश्य उदाहरण अनुपूरक चित्र 4 में शामिल हैं।

लिम्फोसाइट डिटेक्शन सीएनएन I

सीडी 3, सीडी 4, सीडी 8 और सीडी 20 धुंधला का प्रतिनिधित्व करने वाली कलात्मक उज्ज्वल-पुरानी आईएचसी छवियों का विश्लेषण यू-नेट आर्किटेक्चर [22, 28] के साथ मौजूदा सीएनएन का उपयोग करके किया गया था। यह नेटवर्क विशेष रूप से IHC में साइटोप्लाज्मिक लिम्फोसाइट मार्करों का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया था। सीएनएन के प्रदर्शन को सटीक, रिकॉल और एफ1- स्कोर में व्यक्त किया जा सकता है, जहां:

CNN ने परीक्षण सेट पर {{0}}.76 की सटीकता, 0.79 की एक याद, और एक F1-0.78 का स्कोर हासिल किया जिसका उपयोग मूल पेपर में किया गया था, जिसमें पारंपरिक IHC WSI शामिल था। व्यक्तिगत सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सीएनएन आउटपुट को थ्रेशोल्ड करने की आवश्यकता होती है, इसके बाद पोस्टप्रोसेसिंग होती है। क्योंकि mTSA पैनल में CD3 धुंधला CD4, CD8, और CD2 0 की तुलना में अधिक मजबूत था, बाद के तीन (0.4) के लिए कम ऑब्जेक्ट डिटेक्शन थ्रेशोल्ड और CD3 (0.7) के लिए मूल ऑब्जेक्ट डिटेक्शन थ्रेशोल्ड का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI पर CNN के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए, इस अध्ययन में चार आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI (दो रोगियों से CD8 और CD20) का उपयोग परीक्षण सेट के रूप में किया गया था। ASAP सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डॉट एनोटेशन (n=1115) उत्पन्न किए गए थे। नेटवर्क को लागू करने के बाद, सीएनएन के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए सटीक, रिकॉल और एफ 1- स्कोर की गणना की गई। जमीनी सच्चाई के एनोटेशन से 4 माइक्रोन (औसत लिम्फोसाइट व्यास) के भीतर पाए जाने पर जांच को सही सकारात्मक माना जाता था। जब 4 µm रेंज के भीतर दो डिटेक्शन पाए गए, तो केवल एनोटेशन के सबसे नज़दीकी डिटेक्शन को ही सही पॉज़िटिव माना गया। इसके बाद, लिम्फोसाइट डिटेक्शन CNN I का उपयोग साइटोप्लाज्मिक लिम्फोसाइट मार्करों (CD3, CD4, CD8, और CD20) का प्रतिनिधित्व करने वाले सभी आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI के विश्लेषण के लिए किया गया था।

लिम्फोसाइट डिटेक्शन सीएनएन II

डीएपीआई और सीडी4 का प्रतिनिधित्व करने वाले न्यूक्लियर स्टेनिंग पैटर्न (जैसा कि टी-बेट और जीएटीए3 द्वारा प्रस्तुत किया गया है) के साथ आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई के विश्लेषण को एक डब्ल्यूएसआई (4) में संयोजित करने के लिए चुना गया था। पिछले अध्ययनों में प्राप्त दाग वैक्टर का उपयोग डीएपीआई सिग्नल ब्लू (हेमेटोक्सिलिन) और सीडी 4 सिग्नल ब्राउन (डीएबी) को कृत्रिम रूप से रंगने के लिए किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई (5) था।

एक नए सीएनएन के लिए आवश्यक प्रशिक्षण, सत्यापन और परीक्षण। इस प्रयोजन के लिए, किडनी, टॉन्सिल और अपेंडिक्स एफएफपीई नियंत्रण ऊतक से नौ स्लाइड काटे गए। ये स्लाइड IHC- तिब्बत विरोधी (क्लोन 4B1 {{1 0}}, 14-5825-82, थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएस) और GATA3 विरोधी (क्लोन L 50-823, CM) से सना हुआ था। -405बी, बायोकेयर मेडिकल, नीदरलैंड) एंटीबॉडीज। स्लाइड्स को पैनोरमिक 25 0 फ्लैश II डिजिटल स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके 0.12 माइक्रोन/पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन पर डिजीटल किया गया था। दो पर्यवेक्षकों ने ASAP सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विभिन्न क्षेत्रों में 5726 डॉट एनोटेशन तैयार किए। यू-नेट आर्किटेक्चर सीएनएन को प्रशिक्षित करने के लिए पांच स्लाइड्स के एनोटेशन का उपयोग 256 × 256 पिक्सल के पैच का उपयोग करके 0.49 माइक्रोन / पिक्सेल के पिक्सेल आकार के साथ किया गया था। दो WSI का उपयोग CNN के सत्यापन और ऑब्जेक्ट डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (0.4) के निर्धारण के लिए किया गया था। पारंपरिक IHC WSI पर CNN के प्रदर्शन का मूल्यांकन दो IHC WSI के रोके गए परीक्षण सेट पर किया गया था। आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI पर CNN के प्रदर्शन का मूल्यांकन एक सेकेंडरी टेस्ट सेट पर किया गया, जिसमें 1082 डॉट एनोटेशन के साथ चार आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI (दो रोगियों से तिब्बत और GATA3) शामिल थे। दोनों परीक्षण सेटों पर प्रदर्शन का आकलन करने के लिए प्रेसिजन, रिकॉल और F1-स्कोर की गणना की गई। जमीनी सच्चाई की व्याख्या से 4 माइक्रोन के भीतर पाए जाने पर जांच को सही सकारात्मक माना जाता था। जब 4 µm रेंज के भीतर दो डिटेक्शन पाए गए, तो केवल एनोटेशन के सबसे नज़दीकी डिटेक्शन को ही सही पॉज़िटिव माना गया। इसके बाद, लिम्फोसाइट डिटेक्शन CNN II का उपयोग परमाणु (लिम्फोसाइट) मार्करों (तिब्बत और GATA3) का प्रतिनिधित्व करने वाले सभी कृत्रिम उज्ज्वल-पुराने IHC WSI के विश्लेषण के लिए किया गया था।

मैक्रोफेज डिटेक्शन सीएनएन

लिम्फोसाइट पहचान के विपरीत, व्यक्तिगत मैक्रोफेज की पहचान स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से संकुल दृश्यों में, पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता के एक महत्वपूर्ण स्तर की उम्मीद की जा सकती है। इसलिए, सीडी68 प्लस और सीडी163 प्लस मैक्रोफेज का पता लगाने के लिए एक समर्पित, तीसरे सीएनएन को प्रशिक्षित करने के लिए बहुत अधिक संख्या में मामलों और मानव एनोटेशन का उपयोग किया गया था। IHC- सना हुआ स्लाइड (n=111) देशी और प्रत्यारोपण गुर्दे के ऊतकों से एकत्र किए गए थे। IHC के दागों को CD68 (क्लोन PG-M1, GA 61361-2, डको ओम्निस, डेनमार्क या क्लोन KP1, M 0 876, डको, डेनमार्क) या विरोधी CD163 (क्लोन MRQ) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। -26, या 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) एंटीबॉडी। IHC स्लाइड्स को 0.24 या 0 के रिज़ॉल्यूशन पर एक पैनोरमिक 250 फ्लैश II डिजिटल स्लाइड स्कैनर या एक Aperio AT2 स्लाइड स्कैनर (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany) का उपयोग करके डिजिटाइज़ किया गया था। .25 माइक्रोन/पिक्सेल, क्रमशः। चार पर्यवेक्षकों ने मैक्रोफेज एनोटेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए डब्ल्यूएसआई में कई आरओआई में 37,709 डॉट एनोटेशन का उत्पादन किया, जिस पर प्रारंभिक पायलट प्रयोगों के बाद सहमति हुई थी। YoloV2 आर्किटेक्चर CNN [29] के प्रशिक्षण के लिए 101 स्लाइड्स के एनोटेशन का उपयोग किया गया था। योलो विशेष रूप से कार्यों का पता लगाने के उद्देश्य से कार्यों के लिए उपयुक्त है। सात संकेंद्रित परतों वाले नेटवर्क को 0.98 माइक्रोन/पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन पर निकाले गए 256×256 पिक्सल के पैच पर 21 माइक्रोन (औसत मैक्रोफेज आकार के आधार पर) के बाउंडिंग बॉक्स के साथ प्रशिक्षित किया गया था। सीएनएन के सत्यापन और ऑब्जेक्ट डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (0.45) और गैर-अधिकतम दमन मापदंडों (0.05) के निर्धारण के लिए दस डब्ल्यूएसआई का उपयोग किया गया था। पारंपरिक IHC WSI पर CNN के प्रदर्शन का मूल्यांकन दस IHC WSI के रोके गए परीक्षण सेट पर किया गया था। आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI पर CNN के प्रदर्शन का मूल्यांकन एक माध्यमिक परीक्षण सेट पर किया गया था जिसमें 1033 डॉट एनोटेशन के साथ चार आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI (दो रोगियों से CD68 और CD163) शामिल थे। दोनों परीक्षण सेटों पर प्रदर्शन का आकलन करने के लिए प्रेसिजन, रिकॉल और F1 स्कोर की गणना की गई। यदि वे जमीनी सच्चाई एनोटेशन से 21 µm (औसत मैक्रो-फेज व्यास) के भीतर पाए जाते हैं, तो उन्हें सही सकारात्मक माना जाता है। जब 21μm की सीमा के भीतर अधिक डिटेक्शन पाए गए, तो केवल एनोटेशन के सबसे नज़दीकी डिटेक्शन को ही सही सकारात्मक माना गया। इसके बाद, मैक्रोफेज डिटेक्शन सीएनएन का उपयोग मैक्रोफेज मार्करों (सीडी68 और सीडी163) का प्रतिनिधित्व करने वाले सभी आर्टिफिशियल ब्राइटफील्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई के विश्लेषण के लिए किया गया था।

सिस्टैंच ट्यूबोलोसा टेस्टोस्टेरोन

दोहरी सकारात्मकता

विभिन्न चैनलों में सेल डिटेक्शन के बीच पिक्सल की संख्या निर्धारित करके दो मार्करों (डबल पॉजिटिविटी) के लिए कोशिकाओं की सकारात्मकता का आकलन किया गया था। यदि दो लिम्फोसाइट डिटेक्शन के बीच की दूरी थी<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

सेल नंबरों की गणना आरओआई के अंदर की गई थी, और सेल घनत्व सेल गिनती और एनोटेट आरओआई के क्षेत्र पर आधारित थे।

स्थानिक रिश्ते

WSI में स्वचालित सेल डिटेक्शन कोशिकाओं के बीच स्थानिक संबंधों की जांच की अनुमति देता है। CD68 प्लस कोशिकाओं और CD3 प्लस, CD3 प्लस CD8 प्लस, और CD20 प्लस कोशिकाओं के लिए पैनल I के WSI में दोनों रोगियों के समूहों के लिए, और CD163 प्लस कोशिकाओं और CD4 के बीच औसत सबसे छोटी दूरी (उप-क्षेत्रीय क्षेत्र को छोड़कर) निर्धारित की गई थी। प्लस, सीडी4 प्लस टीबी प्लस, और सीडी4 प्लस जीएटीए3 प्लस दोनों रोगी समूहों के लिए डब्ल्यूएसआई में।

पेरिटुबुलर केशिका सीमा

पेरिटुबुलर केशिका सीमा का आकलन करने के लिए, CD34 चैनल का प्रतिनिधित्व करने वाले अमिश्रित WSI का फिजी में विश्लेषण किया गया (ImageJ संस्करण 2.0।0, US, मैक्रोज़ और प्लगइन्स: "ओपन एंड डुप्लीकेट", "ASAP आरओआई रीडर") [30]। सकारात्मक पिक्सेल स्वचालित थ्रेशोल्डिंग के माध्यम से निर्धारित किए गए थे और बाद में आरओआई के अंदर पिक्सेल की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए थे।

सांख्यिकीय विश्लेषण

निम्नलिखित सेल आबादी के घनत्व की गणना 6 सप्ताह की बायोप्सी में की गई: टी-लिम्फोसाइट्स (सीडी 3 प्लस), साइटोटोक्सिक टी-लिम्फोसाइट्स (सीडी 3 प्लस सीडी 8 प्लस), बी-लिम्फोसाइट्स (सीडी 20 प्लस), मैक्रोफेज (सीडी 68 प्लस, पैनल I और II), ध्रुवीकृत मैक्रोफेज (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), T-helper 1 लिम्फोसाइट्स (CD4 plus Tbet plus), और T-helper 2 लिम्फोसाइट्स (CD4 plus GATA3 plus)। स्पीयरमैन के सहसंबंध गुणांक की गणना यह आकलन करने के लिए की गई थी कि क्या टी-हेल्पर 1 और टी-हेल्पर 2 लिम्फोसाइट घनत्व (सीडी 4 प्लस टीबी प्लस, सीडी 4 प्लस जीएटीए 3 प्लस) और ध्रुवीकृत मैक्रोफेज घनत्व (या तो सीडी 68 प्लस सीडी 163 प्लस या सीडी 163 प्लस) के बीच एक सहसंबंध मौजूद था। हमने एक पैनल I के आर्टिफिशियल सीडी4 (फ्लोरोफोर 520 एनएम) आईएचसी में सीडी68 सिग्नल (fluorophore 540 एनएम) देखा। इसलिए, हम अतिरिक्त रूप से सीडी3 प्लस सीडी8− कोशिकाओं के लिए सेल घनत्व की रिपोर्ट करते हैं। विभिन्न IFTA परिणामों वाले रोगी समूहों के बीच अंतर का आकलन करने के लिए, हम प्रति समूह औसत, न्यूनतम और अधिकतम सेल घनत्व मूल्यों की रिपोर्ट करते हैं। स्वतंत्र नमूनों के लिए मान-व्हिटनी के यू परीक्षण का उपयोग करके समूहों के बीच सेल घनत्व और पेरिटुबुलर केशिका सीमा (सीडी 34- सकारात्मक पिक्सेल प्रतिशत के रूप में परिभाषित) में महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन किया गया था। क्या अलग-अलग IFTA परिणामों वाले मरीज़ अलग-अलग CD3 प्लस CD8 - / CD3 प्लस CD8 प्लस सेल अनुपात दिखाते हैं, स्वतंत्र नमूनों के लिए एक t -est का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। CD68 प्लस के स्थानिक संबंधों में रोगी समूहों के बीच अंतर और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ CD163 प्लस कोशिकाओं को स्वतंत्र नमूनों के लिए मान-व्हिटनी के यू परीक्षण का उपयोग करके महत्वपूर्णता के लिए मूल्यांकन किया गया था।

परिणाम

सीएनएन-आधारित आईएचसी सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाना

मौजूदा सीएनएन को लागू करने के लिए, जो मूल रूप से उज्ज्वल-एल्ड माइक्रोस्कोपी के लिए विकसित किए गए थे, एमटीएसए-यूओरेसेंस छवियों को कृत्रिम उज्ज्वल-पुरानी छवियों में बदल दिया गया था। एमटीएसए-दाग वाले क्षेत्रों के उदाहरण उनके संबंधित आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी छवियों के साथ अंजीर में शामिल हैं। 2. एक आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई का एक उदाहरण सप्लीमेंट्री अंजीर में प्रदर्शित किया गया है। 4. मल्टी-रिज़ॉल्यूशन डब्ल्यूएसआई को खोला और डिजिटल स्लाइड देखने में देखा जा सकता है। ASAP और Aperio ImageScope [v12.4.3.5008] जैसे सॉफ़्टवेयर। जैसा कि चित्र 2 में देखा गया है, आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड IHC WSI CNN द्वारा स्वचालित विश्लेषण के लिए उपयुक्त था जो मूल रूप से पारंपरिक IHC WSI के लिए विकसित किए गए थे।

6 सप्ताह के एमटीएसए-सना हुआ प्रत्यारोपण बायोप्सी में भड़काऊ कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए तीन सीएनएन का उपयोग किया गया था: साइटोप्लाज्मिक (सीएनएन I) और परमाणु (सीएनएन II) आईएचसी धुंधला के साथ लिम्फोसाइट का पता लगाने और मैक्रोफेज का पता लगाने के लिए। तालिका 2 डीएबी से सना हुआ आईएचसी डब्ल्यूएसआई और आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई दोनों के होल्ड-आउट सेट के लिए सीएनएन प्रदर्शन (सटीक, रिकॉल और एफ 1- स्कोर) दिखाती है। CNN का प्रदर्शन आम तौर पर उतना ही अच्छा था, या पहले वर्णित बेसलाइन CNN से बेहतर था (F1- स्कोर 0.78 के साथ), जो अनुभवी मैनुअल पर्यवेक्षकों के साथ तुलनीय प्रदर्शन के लिए दिखाया गया था [22] . जबकि लिम्फोसाइट डिटेक्शन सीएनएन II ने वास्तविक डीएबी छवियों (जिस पर सीएनएन को प्रशिक्षित किया गया था) की तुलना में आभासी उज्ज्वल-पुरानी छवियों पर कुछ हद तक कम प्रदर्शन दिखाया, मैक्रोफेज का पता लगाने के लिए सीएनएन के लिए विपरीत देखा गया।

एक सफल स्वचालित दोहरी सकारात्मकता मूल्यांकन का एक उदाहरण चित्र 3 में शामिल है।

विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का सहसंबंध

CD4 प्लस GATA3 प्लस सेल घनत्व और CD163 प्लस सेल घनत्व (स्पीयरमैन के गुणांक 0.75, p < 0।="" 0="" 0)="" के="" बीच="" सबसे="" मजबूत="" सहसंबंध="" देखा="" गया।="" 6="" सप्ताह="" की="" बायोप्सी="" (सप्लीमेंट्री="" अंजीर।="" 5="" ए)।="" यह="" सहसंबंध="" सीडी4="" प्लस="" टीबी="" प्लस="" सेल="" घनत्व="" और="" सीडी163="" प्लस="" सेल="" घनत्व="" (स्पीयरमैन="" के="" गुणांक="" 0.61,="" पी="">< 0.01)="" (पूरक="" चित्र="" 5="" बी)="" के="" बीच="" कमजोर="" था।="" .="" जब="" सेल="" की="" आबादी="" को="" डबल-पॉजिटिव="" मैक्रोफेज="" (cd68="" प्लस="" cd163="" प्लस)="" तक="" सीमित="" करते="" हैं,="" तो="" स्पीयरमैन="" का="" सहसंबंध="" गुणांक="" 0.65="" (p=""><0.01) cd4="" प्लस="" gata3="" प्लस="" सेल="" और="" 0.66="" (p=""><0.01) cd4="" के="" साथ="" था।="" प्लस="" tbet="" प्लस="" सेल="" (सप्लीमेंट्री="" अंजीर।="" 5c,="" d)।="" विश्लेषण="" में="" उपकैपुलर="" क्षेत्र="" को="" शामिल="" करने="" से="" परिणामों="" में="" कोई="" बदलाव="" नहीं="">

के बीच घुसपैठ घुसपैठ की तुलनाआईएफटीए बनाम गैर-आईएफटीए में प्रगति करने वाले रोगी

6 महीने में IFTA में प्रगति करने वाले मरीजों ने प्रत्यारोपण के 6 सप्ताह बाद ली गई बायोप्सी में काफी अधिक CD163 प्लस सेल घनत्व प्रदर्शित किया (औसत 505 कोशिकाओं / मिमी 2) बनाम रोगियों जो IFTA (औसत 370 कोशिकाओं / मिमी 2; पी=0) में प्रगति नहीं करते थे। .043) (तालिका 3)। सबकैप्सुलर क्षेत्र को शामिल करने से इस प्रभाव में थोड़ी कमी आई (p=0.051)। दोनों पैनल में CD68 और CD4 का इस्तेमाल किया गया था। एमटीएसए पैनल के साथ सना हुआ स्लाइड मैंने एमटीएसए पैनल II के साथ दागी गई स्लाइड्स की तुलना में अधिक सीडी 68 सकारात्मकता दिखाई। एमटीएसए पैनल I (तालिका 3) की तुलना में एमटीएसए पैनल II में सीडी4 सेल घनत्व अधिक है।

पेरिटुबुलर केशिका की सीमा अलग-अलग IFTA परिणामों (तालिका 3) के साथ DGF रोगियों की 6 सप्ताह की बायोप्सी में समान थी, दोनों को छोड़कर (p=0.74) और (p=0.90) उपकैपुलर क्षेत्र को शामिल करते हुए। से/विश्लेषण में।

सीडी3 प्लस सीडी8-/सीडी3 प्लस सीडी8 प्लस सेल अनुपात के आकलन ने रोगियों में काफी अधिक अनुपात दिखाया।<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

सीडी68 प्लस सेल से सीडी3 प्लस, सीडी3 प्लस सीडी8 प्लस, और सीडी20 प्लस सेल (पैनल I) और सीडी163 प्लस सेल से सीडी4 प्लस, सीडी4 प्लस टीबी प्लस, और सीडी4 प्लस GATA3 प्लस सेल (पैनल II) तक की औसत न्यूनतम दूरी रोगी समूहों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं है। परिणाम चित्र 4 में देखे गए हैं।

सिस्टैंच का अर्क: गुर्दे की कार्यक्षमता और शारीरिक शक्ति में सुधार करता है

बहस

इस अध्ययन में, हमने डीजीएफ के साथ गुर्दा प्रत्यारोपण रोगियों की ग्राफ्ट बायोप्सी में इन-एम्मेटरी सेल के सटीक और वस्तुनिष्ठ परिमाणीकरण के लिए एक विधि विकसित की, जो किडनी बायोप्सी सामग्री के व्यापक सीरियल कटिंग को दरकिनार करती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने सीएनएन द्वारा मल्टीप्लेक्स आईएचसी, टायरामाइड सिग्नल एम्पली-केशन, मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग और क्वांटि-केशन को जोड़ा। हम सबसे पहले टाइल वाले मल्टीस्पेक्ट्रल डेटा को प्रति सेल मार्कर एक एकल कृत्रिम क्रोमोजेनिक छवि में परिवर्तित करने वाले थे, जिससे WSI विश्लेषण और उज्ज्वल-पुराने IHC के लिए डिज़ाइन किए गए CNN के अनुप्रयोग की सुविधा हुई। हमने परमाणु-सना हुआ लिम्फोसाइट्स और मैक्रोफेज का पता लगाने के लिए दो नए सीएनएन डिज़ाइन किए और पारंपरिक आईएचसी डब्ल्यूएसआई पर कृत्रिम उज्ज्वल-एल्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई पर विकसित सीएनएन की सामान्यता का प्रदर्शन किया। आईएफटीए 6 महीने के बाद प्रत्यारोपण के विकास के साथ डीजीएफ रोगियों की 6 सप्ताह की बायोप्सी में भड़काऊ माइक्रोएन्वायरमेंट के सहसंबंधों का अध्ययन करने के लिए सीएनएन द्वारा प्राप्त मात्रात्मक परिणामों का उपयोग करके हमारी पद्धति की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया गया था।

हमने मल्टीप्लेक्स आईएचसी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैनुअल स्टेनिंग किट का इस्तेमाल किया, ताकि 6 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण प्राप्त निगरानी बायोप्सी में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और पेरिटुबुलर केशिकाओं की कल्पना की जा सके। मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रक्रिया में कई धुलाई, ऊष्मायन और ऊतक उबलते चरण शामिल हैं और इसमें कई अभिकर्मक समाधान शामिल हैं। व्यापक विधि सत्यापन और गुणवत्ता नियंत्रण इसलिए बहुत महत्व रखते हैं, और विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश की जाती है जो लगातार धुंधला तीव्रता उत्पन्न करते हैं। प्रदर्शन किए गए सत्यापन चरणों के बावजूद, एमटीएसए पैनल I और II से स्लाइड के सीडी 4 चैनलों में मैक्रोफेज जैसे धुंधला पैटर्न देखे गए थे। CD4 और CD68 धुंधला चक्र लगातार नहीं किए गए थे, इस प्रकार यह घटना CD68 एंटीबॉडी (पूरक तालिका 1) के अधूरे स्ट्रिपिंग के कारण नहीं हो सकती है। हालांकि CD4 के साथ मैक्रोफेज दोहरी-सकारात्मकता की दुर्लभ घटनाओं का वर्णन किया गया है [31], एक अधिक प्रशंसनीय व्याख्या uorophores' उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की निकटता में निहित है जिसका उपयोग CD4 (520 एनएम) और CD68 (540 एनएम) विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया गया था, दोनों को कवर किया गया था। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के FITC फिल्टर क्यूब द्वारा। यह CD4 चैनल में मजबूत CD68 सिग्नल के "ब्लीडिंग" का कारण बन सकता है। इस संकेत में से अधिकांश को पैनल I में विश्लेषण से बाहर रखा गया था क्योंकि केवल सीडी 4 प्लस कोशिकाएं जो सीडी 3 के साथ डबल-पॉजिटिव थीं, सामान्य टी-हेल्पर सेल विश्लेषण के लिए उपयोग की जाती थीं। बहरहाल, हमने एक प्रतिस्थापन के रूप में CD3 प्लस CD8− का उपयोग करते हुए, अप्रत्यक्ष रूप से सामान्य टी-हेल्पर कोशिकाओं का भी आकलन करने का निर्णय लिया। पैनल II में, CD4 का उपयोग पूरी तरह से तिब्बत और GATA3 के संयोजन में किया गया था, जो झूठी-सकारात्मक पहचान के उपयोग के जोखिम को सीमित करता है।

पैनल I की तुलना में पैनल II में कम CD68 सकारात्मकता देखी गई। हम अनुमान लगाते हैं कि यह CD163 ("छाता प्रभाव") [32] से संबंधित टायरामाइड जमा द्वारा स्टेरिक अवरोध का परिणाम है। हमने टॉन्सिल ऊतक की तुलना में अध्ययन किए गए कॉहोर्ट में महत्वपूर्ण रूप से अधिक सीडी 163- सकारात्मक कोशिकाएं देखीं, जिनका उपयोग स्टेरिक अवरोध की जांच के लिए किया गया था, संभवतः यह बताते हुए कि सत्यापन के दौरान इस प्रभाव की खोज क्यों नहीं की गई थी।

मल्टीप्लेक्स IHC को कई ऑन्कोलॉजी अध्ययनों में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग के साथ जोड़ा गया है, और हाल ही में किडनी एलोग्राफ़्ट अस्वीकृति के विश्लेषण के लिए भी [33-35]। एमटीएसए स्लाइड्स में सभी मार्करों के योगदान को निकालने के लिए, वर्गों को एक वेक्ट्रा सिस्टम या एक मल्टीस्पेक्ट्रल सेटअप के साथ एक समान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया जाता है। कम-आवर्धन अवलोकन छवि रिकॉर्ड करने के बाद, वेक्ट्रा सिस्टम ऊतक को टाइलों में विभाजित करता है और स्वचालित रूप से टाइल्स को बहु-स्पेक्ट्रम रूप से स्कैन करता है। यह कई योगदान स्पेक्ट्रा के साथ छवि टाइलों में परिणत होता है। चूंकि एकल uorophores के स्पेक्ट्रा को पहले से रिकॉर्ड की गई वर्णक्रमीय "लाइब्रेरी" से जाना जाता है, इसलिए मल्टीप्लेक्स टाइलों को कई एकल टाइलों में विघटित करना संभव है जो प्रत्येक uorophore ("अनमिक्सिंग") के योगदान का प्रतिनिधित्व करते हैं। अधिकांश अध्ययनों में, अमिश्रित छवियों का बाद में व्यावसायिक सॉफ़्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जाता है। कई मामलों में, ये प्रोग्राम WSI विश्लेषण का समर्थन नहीं करते हैं, क्लस्टर्ड कोशिकाओं का विश्लेषण करने में कठिनाई होती है, और अक्सर कलाकृतियों और धुंधला विविधताओं के लिए लचीला नहीं होते हैं। मिश्रित टाइलों को आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी डब्ल्यूएसआई में परिवर्तित करने से, हमें आईएचसी [22] में लिम्फोसाइट डिटेक्शन के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए मौजूदा सीएनएन को लागू करने में सक्षम बनाया गया है (जिसे लिम्फोसाइट डिटेक्शन सीएनएन आई कहा जाता है)। यह नेटवर्क बैकग्राउंड स्टेनिंग (छवि 2, सीडी 3) के लिए लचीला होने के साथ-साथ उच्च सटीकता के साथ व्यक्तिगत और क्लस्टर लिम्फोसाइटों का पता लगा सकता है। इसके अलावा, हमने परमाणु धुंधला पैटर्न (तिब्बत, GATA3) (लिम्फोसाइट डिटेक्शन सीएनएन II) के साथ कोशिकाओं का पता लगाने और मैक्रोफेज का पता लगाने के लिए दो नए सीएनएन को प्रशिक्षित किया। मैक्रोफेज अपने बिखरे हुए धुंधला पैटर्न के कारण पता लगाने के लिए कुख्यात हैं। इसलिए मैक्रोफेज डिटेक्शन सीएनएन को चार अलग-अलग विशेषज्ञों की टिप्पणियों का उपयोग करके प्रशिक्षित किया गया था। एनोटेशन करने से पहले, कई बैठकों की योजना बनाई गई थी जहां मैक्रोफेज की व्याख्या करने के मानदंडों पर चर्चा और मूल्यांकन किया गया था। इसके परिणामस्वरूप एक ऐसा नेटवर्क बना जो गैर-विशिष्ट धुंधला (तालिका 2, अंजीर। 2, और अनुपूरक चित्र 6) के लिए मजबूत होते हुए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन में मैक्रोफेज का पता लगा सकता है। हमारी जानकारी के लिए, स्कैन किए गए हिस्टोपैथोलॉजिकल सेक्शन में मैक्रोफेज डिटेक्शन के लिए यह पहला एल्गोरिथम है। हमने पारंपरिक IHC WSI (प्रशिक्षण के दौरान उपयोग किए जाने वाले के समान) और एक माध्यमिक परीक्षण सेट पर सभी तीन नेटवर्क के प्रदर्शन का परीक्षण किया, जिसमें बहु-स्पेक्ट्रल रूप से रिकॉर्ड की गई छवियों से उत्पन्न कृत्रिम उज्ज्वल-पुराना IHC WSI शामिल था। सभी CNN प्राथमिक परीक्षण सेटों पर बहुत अच्छा प्रदर्शन करते हैं और द्वितीयक परीक्षण सेटों पर समान F1-स्कोर दिखाते हैं। लिम्फोसाइट डिटेक्शन सीएनएन I के प्रदर्शन मेट्रिक्स की गणना सामान्य ऊतक, कलाकृतियों और सेल समूहों पर की गई थी। दूसरे परीक्षण सेट के आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड आईएचसी में कोई ऊतक कलाकृतियां और कम सेल क्लस्टर नहीं थे। यह दूसरे परीक्षण सेट पर इस नेटवर्क के समग्र बेहतर प्रदर्शन की व्याख्या कर सकता है। मैक्रोफेज डिटेक्शन सीएनएन को चार अलग-अलग एनोटेटर्स से एनोटेशन पर प्रशिक्षित और परीक्षण किया गया था। जबकि एनोटेशन मानदंड पर विशेष रूप से चर्चा की गई थी, फिर भी एनोटेशन शैली में बदलाव देखे गए। इसलिए सीएनएन की संवेदनशीलता शायद कहीं न कहीं एनोटेशन शैली की चरम सीमाओं के बीच में है। दूसरे परीक्षण सेट के लिए एनोटेशन एक एनोटेटर द्वारा उत्पन्न किया गया था, जो सीएनएन संवेदनशीलता से मेल खाता प्रतीत होता है।

वर्णित सीएनएन का उपयोग करने से हमें डीजीएफ के साथ प्रत्यारोपण रोगियों की कठोर रूप से चयनित प्रारंभिक निगरानी बायोप्सी की एक अनूठी श्रृंखला में अभूतपूर्व सटीकता के साथ अचूक घुसपैठ की जांच करने की अनुमति मिली।

दुर्भाग्य से, कई नमूनों को विश्लेषण से बाहर करना पड़ा, ज्यादातर नैदानिक ​​​​कार्य के बाद अपर्याप्त अवशिष्ट ऊतक के कारण। डेटा सेट के सीमित आकार के साथ भी, हमने IFTA के विकास के लिए प्रगति करने वाले DGF रोगियों की बायोप्सी में उल्लेखनीय रूप से उच्च CD163 प्लस सेल घनत्व पाया, जो इन कोशिकाओं की संभावित प्रो-ब्रोटिक भूमिका के अनुरूप है [11]। जबकि मनाया गया रुझान प्रकाशित आंकड़ों के अनुरूप था, हम सीडी 68 प्लस मैक्रोफेज की शुरुआती उपस्थिति के हानिकारक प्रभाव की पुष्टि नहीं कर सके जो पहले अन्य किडनी प्रत्यारोपण रोगी समूहों [7, 36, 37] के लिए रिपोर्ट किए गए थे। हमने CD4 प्लस GATA3 प्लस कोशिकाओं और CD163 प्लस कोशिकाओं के घनत्व के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध पाया, जो कि प्रो-ब्रोटिक सूक्ष्म वातावरण की ओर टी-हेल्पर 2 लिम्फोसाइटों के योगदान की पुष्टि कर सकता है। जबकि इस अध्ययन में डीजीएफ रोगियों में आईएफटीए विकास के लिए कोई नया भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर नहीं खोजा गया था, हमने प्रत्यारोपण बायोप्सी जैसे विरल ऊतक में सूजन के सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्केलेबल मूल्यांकन के लिए सफलतापूर्वक तरीके विकसित किए। हिस्टोपैथोलॉजिकल ऊतक में सूजन पर भविष्य के मात्रात्मक अध्ययन के लिए ये विधियां मूल्यवान हैं।

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डेटा उपलब्धता

इस अध्ययन में प्रस्तुत डेटा के उपयोग से जुड़े सहयोग अनुरोधों को संबंधित लेखक (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) या FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de) को संबोधित किया जा सकता है।

स्वीकृतियाँ

हम एमटीएसए धुंधला और इमेजिंग पर उनकी सलाह के लिए मार्क गोरिस और कीक वेरिजप को धन्यवाद देते हैं, अनुकूलित इमेजजे कार्यक्षमता विकसित करने के लिए मेरिजन वैन एआरपी, और मैक्रोफेज डिटेक्शन नेटवर्क के लिए जमीनी सच्चाई पैदा करने के लिए सोफी वैन डेन ब्रोक, मिल्ली वैन डी वारेनबर्ग और मार्टिजन ओटेन। इसके अलावा, हम नैदानिक ​​डेटा संग्रह में मदद के लिए इरीना शेफ़नर को धन्यवाद देते हैं।

लेखक का योगदानMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH, और JAWML

अध्ययन को डिजाइन किया। रोगी सामग्री और नैदानिक ​​​​डेटा जेएस, डब्ल्यूजी और एफएफ द्वारा एकत्र और प्रदान किए गए थे। FF ने MHH में किए गए प्रयासों का समन्वय किया। जेएचबी, ईजेएस और जेके ने आईएफटीए प्रतिशत के लिए पीएएस स्लाइड स्कोर किया। MH ने mTSA स्टेनिंग, पैनल I और II के सत्यापन और पैनल I की इमेजिंग और अनमिक्सिंग का प्रदर्शन किया। VV इमेज और अनमिक्स्ड पैनल II। डीजेजी ने एमटीएसए टाइल्स को आर्टिफिशियल ब्राइट-एल्ड डब्ल्यूएसआई में बदलने के तरीके विकसित किए। एमएच ने रूपांतरण किया। ZS-C ने लिम्फोसाइट डिटेक्शन CNNs विकसित किया और लिम्फोसाइट मात्राओं के लिए स्क्रिप्ट लिखी। जेएल ने मैक्रोफेज डिटेक्शन सीएनएन विकसित किया और मैक्रोफेज क्वांटि-केशंस के लिए स्क्रिप्ट लिखी। एमएच ने सेल और केशिका परिमाणीकरण का प्रदर्शन किया। एनएसएस ने सेल दूरियों की गणना की। MH, BS, LBH, और JAWML ने डेटा का विश्लेषण किया। एमएच ने आंकड़े बनाए और कागज का मसौदा तैयार किया। पांडुलिपि के अंतिम संस्करण को सभी लेखकों द्वारा संशोधित और अनुमोदित किया गया था।

अनुदानइस काम को ERACoSysMed पहल (प्रोजेक्ट SysMIFTA) द्वारा ZonMw (अनुदान संख्या 9003035004) द्वारा प्रस्तावित यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 फ्रेमवर्क कार्यक्रम के हिस्से के रूप में समर्थित किया गया था, जर्मन अनुसंधान और शिक्षा मंत्रालय (बीएमबीएफ) द्वारा सह-वित्त पोषण के साथ, अनुदान संख्या . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T), और FKZ01ZX1608A (SYSIMIT)। JAWML ने फिलिप्स (नीदरलैंड्स) से परामर्श शुल्क प्राप्त किया, और से अनुदान प्राप्त किया

ContextVision, Philips (नीदरलैंड्स), और Sectra (स्वीडन), प्रस्तुत कार्य के बाहर। जेके को डच किडनी फाउंडेशन (प्रोजेक्ट डीईपीजीआरएएफटी, ग्रांट नंबर 17ओकेजी23) से वित्तीय सहायता मिली।

नैतिक मानकों का अनुपालन

हितों का टकरावलेखक गण घोषित करते हैं कि कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

नैतिकता अनुमोदन और भाग लेने के लिए सहमतिडेटा संग्रह और विश्लेषण सूचित रोगी सहमति के साथ और हनोवर मेडिकल स्कूल के नैतिकता बोर्ड (संख्या 2765) के अनुमोदन के साथ किया गया था।

प्रकाशक का नोटस्प्रिंगर नेचर प्रकाशित नक्शों और संस्थागत संबद्धताओं में क्षेत्राधिकार के दावों के संबंध में तटस्थ रहता है।

खुला एक्सेसयह लेख क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन 4 के तहत लाइसेंस प्राप्त है। 0 अंतर्राष्ट्रीय लाइसेंस, जो किसी भी माध्यम या प्रारूप में उपयोग, साझाकरण, अनुकूलन, वितरण और पुनरुत्पादन की अनुमति देता है, जब तक आप मूल लेखक को उचित श्रेय देते हैं। ) और स्रोत, Creative Commons लाइसेंस के लिए एक लिंक प्रदान करें, और इंगित करें कि क्या परिवर्तन किए गए थे। इस आलेख में छवियों या अन्य तृतीय-पक्ष सामग्री को लेख के क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस में शामिल किया गया है, जब तक कि सामग्री के लिए क्रेडिट लाइन में अन्यथा इंगित न किया गया हो। यदि सामग्री को लेख के क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस में शामिल नहीं किया गया है और वैधानिक विनियमन द्वारा आपके इच्छित उपयोग की अनुमति नहीं है या अनुमत उपयोग से अधिक है, तो आपको सीधे कॉपीराइट धारक से अनुमति प्राप्त करने की आवश्यकता होगी।

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