निकट अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा सिस्टांच ट्यूबुलोसा में छह प्रभावी घटकों का तेजी से एक साथ निर्धारण

1। परिचय

सिस्टांच (हॉफएमजी. एट लिंक) पौधों के ओरोबैंचेसी परिवार का एक बारहमासी फेनेरोगैमिक जीनस है। सिस्टांच जीनस से संबंधित अधिकांश प्रजातियों का उपयोग चीन में सहस्राब्दियों से औषधीय पौधे के रूप में किया जाता रहा है; एक बेहतरीन टॉनिक के रूप में प्रतिष्ठा है; और इसे "रेगिस्तान के जिनसेंग" के रूप में जाना जाता है। सिस्टांच ट्यूबुलोसा बारहमासी पौधे टैमारिक्स चिनेंसिस की जड़ों का एक अनिवार्य परजीवी है। इसे चीनी फार्माकोपिया में प्रामाणिक स्रोत के रूप में प्रलेखित किया गया हैसिस्टेन्चेस हर्बा(चीनी नाम: रूकोन्ग्रोंग) 2005 संस्करण से। सिस्टैंच प्रजातियों पर आधुनिक औषधीय अनुसंधान 1980 के दशक में शुरू किया गया था। औषधीय जांच से पता चला कि सिस्टैंच पौधों के अर्क में गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला होती है, जैसे कि गुर्दे की कमी और बुढ़ापे में कब्ज को ठीक करना, सीखने और याद रखने की क्षमता को आगे बढ़ाना, अल्जाइमर रोग को रोकना, प्रतिरक्षा को बढ़ाना, बुढ़ापा रोकना, थकान को दूर करना आदि। पिछले तीन दशकों में, व्यापक और व्यवस्थित औषधीय अध्ययनों को फाइटोकेमिकल जांच के साथ जोड़ा गया है ताकि सिस्टैंच पौधों की जड़ों के लाभकारी प्रभावों के भौतिक आधार को उजागर किया जा सके। ये सर्वेक्षण संकेत देते हैं कि फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड (PhGs) सिस्टैंच पौधों में मुख्य प्रभावी घटक थे जो गुर्दे की कमी, नपुंसकता, बुढ़ापा रोकने और अल्जाइमर रोग के उपचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते थे। चीनी फार्माकोपिया में दो PhGs (इचिनाकोसाइड और वर्बास्कोसाइड) की सामग्री की आवश्यकता थी। इस बीच, सिस्टांच पौधों में मैनिटोल, सुक्रोज, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज जैसे कार्बोहाइड्रेट रेचक कार्य करते हैं और कार्बोहाइड्रेट समूहसिस्टैंचे पौधेकब्ज के उपचार के लिए इस्तेमाल किया गया है।

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सी. ट्यूबुलोसा के जंगली संसाधन मुख्य रूप से चीन के दक्षिणी झिंजियांग स्वायत्त क्षेत्र में तकलामाकन रेगिस्तान के आसपास के क्षेत्र में वितरित किए जाते हैं। पारंपरिक चीनी दवाओं (TCM) के रूप में उपयोग की जाने वाली कई अन्य प्रजातियों की तरह, सी. ट्यूबुलोसा का बहुत अधिक आर्थिक मूल्य है और अत्यधिक संग्रह के कारण यह अपने जंगली आवास में लगभग विलुप्त हो चुका है। चीन में 1990 के दशक में सी. ट्यूबुलोसा की खेती शुरू हुई ताकि सिस्टेन्चेस हर्बा के लिए कच्चे माल की आपूर्ति सुनिश्चित की जा सके और साथ ही जंगली पौधों के संसाधनों की रक्षा की जा सके। 2017 तक, झिंजियांग के होटन प्रान्त में लगभग 13 हज़ार हेक्टेयर सी. ट्यूबुलोसा की खेती की जाती है। खेती का विस्तार करने के साथ-साथ सी. ट्यूबुलोसा की गुणवत्ता में सुधार के लिए रोपण तकनीक में प्रगति की मांग की जाती है।

सी. ट्यूबुलोसा की खेती का प्राथमिक उद्देश्य सिस्टान्चेस हर्बा का उत्पादन करना है, जो उन प्रभावी घटकों से भरपूर है। हालाँकि, प्रभावी घटकों की सामग्रीसिस्टेन्चेस हर्बापीएचजी और ओलिगोसेकेराइड जैसे तत्व उत्पादन के दौरान कई कारकों से काफी प्रभावित हो सकते हैं। सी. ट्यूबुलोसा की गुणवत्ता का वास्तविक समय पर पता लगाने वाली प्रणाली की खोज की जानी चाहिए। इसलिए, कम समय में बड़ी संख्या में नमूनों का विश्लेषण करने की आवश्यकता को पूरा करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट विधि विकसित करना आवश्यक है। परंपरागत रूप से, सी. ट्यूबुलोसा में पीएचजी और कार्बोहाइड्रेट जैसे प्राथमिक प्रभावी घटकों का निर्धारण आमतौर पर उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके प्राप्त किया जाता था। सटीक और विश्वसनीय होने के बावजूद, यह डेटा संग्रह और प्रसंस्करण के लिए समय लेने वाली और श्रमसाध्य है। इसके अलावा, नमूना तैयार करने के लिए भी बहुत समय और प्रयास की आवश्यकता होती है जिसमें आमतौर पर एचपीएलसी परख का चूर्णीकरण, निष्कर्षण और निस्पंदन शामिल होता है। इसलिए, अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में डेटा प्राप्त करने के लिए एक स्पष्ट सिद्धांत और आसानी से संचालित होने वाले उपकरण की आवश्यकता होती है। सौभाग्य से, निकट-अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (NIRS) का उपयोग कृषि उत्पादों, खाद्य, चिकित्सा नमूनों और दवा उत्पादों का आकलन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है क्योंकि यह तेज़ होने के साथ-साथ गैर-विनाशकारी भी है। इसलिए, एनआईआरएस टीसीएम के कुशल मापन की आवश्यकताओं से बिल्कुल मेल खा सकता है, और, आश्चर्य की बात नहीं है कि एनआईआरएस को टीसीएम में यौगिकों की गुणात्मक पहचान और परिमाणीकरण के लिए लागू किया गया है।

इस अध्ययन में, छह प्रभावी घटकों की सामग्री, जिनमें शामिल हैंइचिनाकोसाइड, वर्बास्कोसाइड, मैनिटोल, सुक्रोज, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज2013-2015 में झिंजियांग के होटन प्रान्त से एकत्रित किए गए सी. ट्यूबुलोसा नमूनों के 116 बैचों में सबसे पहले HPLC द्वारा निर्धारित किया गया था। इसके बाद, इन छह घटकों के अंशांकन मॉडल आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन (PLSR) विधि के साथ स्थापित किए गए थे। इन मॉडलों को फिर अंशांकन सेटों में सहसंबंध गुणांक और भविष्यवाणी त्रुटियों के साथ मान्य किया गया। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि विकसित विधि को सी. ट्यूबुलोसा के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय विधि के रूप में नियोजित किया जा सकता है।

2. परिणाम

2.1. एचपीएलसी विश्लेषण

की सामग्रीइचिनाकोसाइड और वर्बास्कोसाइडसाहित्य में अच्छी तरह से परिभाषित एचपीएलसी-यूवी विधि द्वारा निर्धारित किए गए थे और सभी 116 नमूनों के लिए चार कार्बोहाइड्रेट (मैनिटोल, सुक्रोज, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज) साहित्य में अच्छी तरह से परिभाषित एचपीएलसी-ईएलएसडी विधि द्वारा निर्धारित किए गए थे। नमूना तैयार करने और निर्धारण विधियों को अनुभाग 3.1 और 3.3 में वर्णित किया गया था। चित्र 1 मिश्रित मानकों के अभिलक्षणिक क्रोमैटोग्राम दिखाता है। यह देखा जा सकता है कि सभी छह प्रभावी घटक बेसलाइन से अलग थे और इसलिए उन्हें मात्राबद्ध किया जा सकता था। नमूना परीक्षण से पहले एचपीएलसी विधि को मान्य किया गया था। एचपीएलसी विधि के मुख्य परिणाम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। परिणामों में इचिनाकोसाइड निर्धारण विधि का एक अनुकूल रैखिक संबंध (आर=0.9998) और रिकवरी (98.5%) दिखाया गया है

2.2. एनआईआरएस विश्लेषण

चित्र 2 में सी. ट्यूबुलोसा नमूनों के NIR स्पेक्ट्रा (4000–10,000 cm−1) को दिखाया गया है। सभी नमूनों में 4000 cm−1 से 7500 cm−1 तक महत्वपूर्ण अवशोषण शिखर दिखाई दिए, जबकि 7500 cm−1 से 10,000 cm−1 तक हल्के उतार-चढ़ाव दिखाई दिए। NIR स्पेक्ट्रा का बेसलाइन बहाव इसलिए हुआ क्योंकि नमूना कण आकार और रंग जैसे कारकों से आसानी से प्रभावित हुआ (चित्र 2A)। स्पेक्ट्रा के गणितीय पूर्व उपचारों का उपयोग अनावश्यक जानकारी के प्रभाव को कुछ हद तक कम करने के लिए किया गया था। गणितीय पूर्व उपचारों में पहली व्युत्पत्ति (पहली व्युत्पत्ति), दूसरी व्युत्पत्ति (दूसरी व्युत्पत्ति), मानक सामान्य विविधता (SNV), और गुणात्मक बिखराव सुधार (MSC) शामिल थे। चित्र 2बी सी. ट्यूबुलोसा के एनआईआर स्पेक्ट्रा की दूसरी व्युत्पत्ति को दर्शाता है, और तीन क्षेत्रों, 4000–4500 सेमी−1, 5000–5500 सेमी−1, और 7000–7500 सेमी−1 से होने वाले महत्वपूर्ण बदलाव देखे गए हैं।

2.3. मात्रात्मक अंशांकन मॉडल की स्थापना

आंशिक न्यूनतम वर्ग प्रतिगमन (पीएलएसआर) एक क्लासिक मॉडलिंग विधि है और परिणामों की उच्च गुणवत्ता के कारण इसे मात्रात्मक मॉडल में व्यापक रूप से लागू किया गया है। पीएलएसआर के फायदों में इसकी अच्छी पूर्वानुमान क्षमता और सापेक्ष सरलता शामिल है। पीएलएसआर को टीसीएम के मात्रात्मक अंशांकन मॉडल की स्थापना में भी व्यापक रूप से लागू किया गया है [25]। पूर्व उपचारित एनआईआर स्पेक्ट्रा के आधार पर, सी. ट्यूबुलोसा में छह प्रभावी घटकों के लिए एक एनआईआर मात्रात्मक विश्लेषण मॉडल एचपीएलसी विश्लेषण डेटा के साथ पीएलएसआर विधि का उपयोग करके वास्तविक मूल्यों के रूप में स्थापित किया गया था। 116 नमूनों को 3:1 अनुपात के साथ अंशांकन और सत्यापन सेटों में यादृच्छिक रूप से विभाजित किया गया था। अंशांकन के लिए सबसे उपयुक्त स्थितियों को कम आरएमएसईसी और उच्च सहसंबंध गुणांक द्वारा चुना गया था।

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2.3.1. अंशांकन मॉडल के लिए तरंग बैंड का चयन

उपयुक्त तरंग बैंड का चयन अंशांकन मॉडल निर्माण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम था। इस अध्ययन में, 4000–7500 सेमी−1 (TQ विश्लेषक सॉफ़्टवेयर द्वारा अनुशंसित) और 4000–10,000 सेमी−1 के NIR अंतराल स्पेक्ट्रा की तुलना की गई। यह देखा गया कि यह सीमा तालिका 2 से 4000 सेमी−1 और 7500 सेमी−1 के बीच के अंतराल पर अंशांकन के लिए अनुपयुक्त है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन में, छह रासायनिक घटकों के लिए स्पेक्ट्रल अंतराल RMSEC और सहसंबंध गुणांक के प्रदर्शन की तुलना करके 4000 से 10,000 सेमी−1 के अंतराल से चुने गए थे।

2.3.2. अंशांकन मॉडल के लिए कारकों की इष्टतम संख्या का चयन

पीएलएसआर कारकों की गणना द्वारा स्पेक्ट्रा डेटा की आयामीता को कम करके डेटा में परिवर्तनशीलता की अधिकतम मात्रा की व्याख्या करता है। सीमित संख्या में कारकों के परिणामस्वरूप अपर्याप्त जानकारी के कारण "अंडरफिटेडनेस" समस्या सामने आई; हालाँकि, मॉडल में पेश किए गए इष्टतम मूल्यों से अधिक कारकों को चुनने से "ओवरफिटेडनेस" समस्या उत्पन्न होगी। या तो "अंडरफिटेडनेस" या "ओवरफिटेडनेस" स्थापित मॉडल की भविष्यवाणी करने की शक्ति को कम कर देगा [22]। चित्र 3 सभी छह यौगिकों के लिए RMSECV और कारकों के बीच संबंध दिखाता है। इसलिए, हमने RMSECV के सबसे कम मूल्यों के अनुरूप उन कारकों का चयन किया। अंशांकन मॉडल के लिए कारकों का इष्टतम चयन तालिका 3 में सूचीबद्ध है।

2.3.3. अंशांकन मॉडल के लिए स्पेक्ट्रल प्रीट्रीटमेंट का चयन

कैलिब्रेशन मॉडल के लिए एक और महत्वपूर्ण प्रभावशाली कारक स्पेक्ट्रल प्रीट्रीटमेंट है जिसका उद्देश्य बिखराव और बेसलाइन बहाव के प्रभाव को कम करना, सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाना और अनियमित भिन्नताओं को दूर करना है। विकिरण बिखराव के प्रभाव को खत्म करने के लिए गुणात्मक बिखराव सुधार (MSC) और मानक सामान्य चर (SNV) विधियों का उपयोग किया गया था। बेसलाइन बहाव के प्रभावों को हल करने के लिए, पहले और दूसरे व्युत्पन्न स्पेक्ट्रा की तुलना की गई और दूसरे व्युत्पन्न का चयन किया गया। वांछित प्रभाव के लिए, हमने शोर आवर्धन को रोकने के लिए व्युत्पत्ति से पहले सविट्ज़की-गोले (SG) फ़िल्टर एल्गोरिदम के साथ स्पेक्ट्रा को चिकना किया। तालिका 3 अंशांकन मॉडल के लिए स्पेक्ट्रल प्रीट्रीटमेंट और उसके परिणामों की जानकारी दिखाती है।

2.4. स्थापित मॉडलों का मूल्यांकन

एक अच्छे NIRS अंशांकन मॉडल में कम RMSEC और RMSEP मान होने चाहिए, साथ ही उच्च सहसंबंध गुणांक (r) और RMSEC और RMSEP के बीच छोटे अंतर होने चाहिए। छह चयनित यौगिकों के अंशांकन मॉडल ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार स्थापित किए गए थे (तालिका 3)। इचिनाकोसाइड के अंशांकन सेट के लिए RMSEC और r मान क्रमशः 27.6 और 0.9808 थे। अन्य रासायनिक यौगिक मॉडलों के प्रदर्शन मापदंडों को तालिका 3 में सूचीबद्ध किया गया है, जिससे हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि स्थापित मॉडल संतोषजनक पूर्वानुमान परिणाम देते हैं, और इसका उपयोग सी. ट्यूबुलोसा के तीव्र मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। अंशांकन मॉडल को अधिक वर्णनात्मक और दृष्टिगत रूप से देखने के लिए छह रासायनिक यौगिकों के स्कैटर प्लॉट चित्र 4 में दिखाए गए हैं। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, पूर्वानुमानित और मापे गए मानों के बीच मामूली अंतर हुआ, क्योंकि अधिकांश बिंदु y=x के समीकरण के साथ प्रतिगामी वक्र के चारों ओर वितरित किए गए थे। इसलिए, चित्र 4 में उत्कृष्ट पूर्वानुमानित प्रदर्शन देखे गए।

3. सामग्री और विधियाँ

3.1. नमूना तैयार करना

2013 से 2015 तक झिंजियांग स्वायत्त क्षेत्र के होटन प्रान्त से एक सौ सोलह सी. ट्यूबुलोसा के नमूने एकत्र किए गए। सभी नमूने खेती से उगाए गए थे, लेकिन उन्हें अलग-अलग विकास चरणों में एकत्र किया गया था। नमूनों का ताज़ा वजन 20 ग्राम से 1000 ग्राम तक था। धूप में सुखाने के बाद, सूखे नमूनों को कुचल दिया गया और 60-जाली वाली छलनी से छान लिया गया।

3.2. एनआईआर स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा संग्रह

नमूनों के एनआईआर स्पेक्ट्रा को 4000–10,000 सेमी−1 के स्पेक्ट्रल क्षेत्र पर 8 सेमी−1 अंतराल पर एंटारिस एमएक्सएफटी-एनआईआर सिस्टम (थर्मो साइंटिफिक, मैडिसन, WI, यूएसए) के साथ एक हैंड-हेल्ड ऑप्टिकल फाइबर रिफ्लेक्शन एडाप्टर से एकत्र किया गया था। प्रत्येक स्पेक्ट्रम को 64 स्कैन के औसत से प्राप्त किया गया था। सभी नमूनों को एनआईआर स्पेक्ट्रा स्कैनिंग से पहले कमरे के तापमान (25 ◦C) पर संतुलित होने दिया गया ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूनों का विश्लेषण एक ही तापमान पर किया गया था। प्रयोगशाला में आर्द्रता को परिवेश के स्तर पर रखा गया था।

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3.3. एचपीएलसी डेटा संग्रहण

3.3.1.निष्कर्षण की तैयारी

एक ग्राम सी. ट्यूबुलोसा पाउडर को 50% मेथनॉल के 50 एमएल के साथ एक शंक्वाकार फ्लास्क में अल्ट्रा-सोनिकेशन (500 वॉट, 40 किलोहर्ट्ज) के साथ 30 मिनट के लिए निकाला गया। अर्क को 4 ◦C पर संग्रहीत किया गया। HPLC विश्लेषण के लिए एक नमूना प्राप्त करने के लिए अर्क के सुपरनेटेंट को फ़िल्टर किया गया।

3.3.2. एच.पी.एल.सी.-यू.वी. के साथ इचिनाकोसाइड और वर्बास्कोसाइड का एक साथ निर्धारण

तरल क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण शिमादज़ु यूएचपीएलसी प्रणाली (शिमादज़ु, क्योटो, जापान) पर किया गया था जिसमें दो एलसी-20एडीएक्सआर विलायक वितरण इकाइयां, एक एलसी-20एडी पंप, एक एसआईएल-20एसीएक्सआर ऑटो सैंपलर, एक सीटीओ-20एसी कॉलम ओवन, एक एसपीडी-एम20ए डीएडी डिटेक्टर, डीजीयू-20ए3आर डिगैसर और एक सीबीएम-20ए नियंत्रक शामिल थे।

क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्रेस प्रीवेल कार्बोहाइड्रेट ES कॉलम (150 × 2.1 मिमी, 2.7 मिमी) को 35 ◦C पर बनाए रखा गया था। मोबाइल चरण में एसिटोनाइट्राइल (A) और 0.1% जलीय फॉर्मिक एसिड (B) शामिल थे और इसे ग्रेडिएंट प्रोग्राम के अनुसार वितरित किया गया था: 0–7 मिनट, 10–20% A का रैखिक ग्रेडिएंट; 7–15 मिनट, 20% A; और 15–20 मिनट, 20–10% A का रैखिक ग्रेडिएंट। मोबाइल चरण की प्रवाह दर 0.4 mL/min थी। UV मॉनिटरिंग 330 nm पर की गई थी।

3.3.3. HPLC-ELSD के साथ मैनिटोल, सुक्रोज, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज का एक साथ निर्धारण

एचपीएलसी का प्रदर्शन एजिलेंट 1100 श्रृंखला एलसी सिस्टम (पालो अल्टो, सीए, यूएसए) पर किया गया था, जिसमें एक G1322A डिगैसर, एक G1311A क्वाटरनेरी पंप, एक G1311A ऑटोसैम्पलर, एक G1316A कॉलम तापमान नियंत्रक और एक G1315B DAD डिटेक्टर शामिल थे।

क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण के लिए सिग्मा प्रीवेल कार्बोहाइड्रेट ईएस कॉलम (4.6 × 250 मिमी, 5 µm) का उपयोग किया गया और 25 ◦C के कॉलम तापमान पर बनाए रखा गया। मोबाइल चरण एसिटोनिट्राइल और पानी (77:23, v/v) से बना था और आइसोक्रेटिक रूप से 0.7 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर आपूर्ति की गई थी। डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ वाष्पीकरण प्रकाश बिखराव डिटेक्टर (ELSD) का उपयोग करके अपशिष्ट की निगरानी की गई।

3.4. डेटा प्रोसेसिंग

TQ विश्लेषक (संस्करण 8.0, थर्मो साइंटिफिक, मैडिसन, WI, USA) का उपयोग अंशांकन और सत्यापन सेटों के विभाजन, स्पेक्ट्रा के गणितीय पूर्व उपचार, अंशांकन मॉडल की स्थापना और अन्य गणनाओं को करने के लिए किया गया था। आंकड़े बनाने के लिए मूल (संस्करण 9.1) का उपयोग किया गया था।

4 निर्णय

इस अध्ययन में, हमने एक साथ विश्लेषण के लिए एक तीव्र और गैर-विनाशकारी विधि प्रस्तावित की हैइचिनाकोसाइड, वर्बास्कोसाइड, मैनिटोल, सुक्रोज, ग्लूकोज और फ्रुक्टोजमेंसी. ट्यूबुलोसाएनआईआरएस द्वारा। आरएमएसईसी, सहसंबंध गुणांक, आरएमएसईपी और आरपी मूल्यों के विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि स्थापित मात्रात्मक एनआईआर मॉडल का उपयोग छह चयनित प्रभावी घटकों की सामग्री की सटीक भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।सी. ट्यूबुलोसाएचपीएलसी की तुलना में, इस अध्ययन में बताई गई एनआईआरएस विधि संतोषजनक मात्रात्मक विश्लेषण क्षमता बनाए रखते हुए महत्वपूर्ण श्रम और समय बचा सकती है। इसलिए, यहाँ बताई गई विधि में गुणवत्ता नियंत्रण में उपयोग किए जाने की क्षमता है।सी. ट्यूबुलोसाऔर इस प्रकार खेती और प्रक्रिया प्रौद्योगिकी के विकास का मार्गदर्शन करनासी. ट्यूबुलोसा.

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