चूहों में cistanche phenylethanol ग्लाइकोसाइड्स के एंटीडिप्रेसेंट प्रभाव और तंत्र पर अनुसंधान
Dec 17, 2024
अमूर्त:
इस अध्ययन का उद्देश्य चिकित्सीय प्रभावों और तंत्रों की जांच करना हैसिसकला(CPHGs) चूहों में क्रोनिक अप्रत्याशित हल्के तनाव (CUMS) से प्रेरित अवसाद जैसे व्यवहार पर। चूहों को बेतरतीब ढंग से नियंत्रण समूह, मॉडल समूह, उच्च खुराक CPHGS समूह (700 मिलीग्राम/किग्रा), मध्य खुराक CPHGS समूह (350 मिलीग्राम/किग्रा), कम खुराक CPHGS समूह (175 मिलीग्राम/किग्रा), और फ्लुओक्सेटिन समूह (15 मिलीग्राम/किग्रा) में विभाजित किया गया था। इसी दवा के हस्तक्षेप के चार सप्ताह के बाद, न्यूरोबेहेवियरल परीक्षण किए गए थे; एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉर्बेंट परख का उपयोग सीरम में न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर का पता लगाने के लिए किया गया था, साथ ही हिप्पोकैम्पस ऊतक में भड़काऊ कारकों और मध्यस्थों की सामग्री भी। हिप्पोकैम्पस टिशू में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए हेमटॉक्सिलिन-इओसिन और निस्ल धुंधला को नियोजित किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधियों का उपयोग चूहों के हिप्पोकैम्पल ऊतक में एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के घनत्व का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, साथ ही टोल-जैसे रिसेप्टर 4/परमाणु कारक κB/NOD- जैसे रिसेप्टर प्रोटीन 3 (TLR4/NF-κB/NLRP3) की अभिव्यक्ति स्तर। परिणामों से पता चला कि सीपीएचजी चूहों में अवसाद जैसे व्यवहार में सुधार कर सकते हैं, मीठे पानी के लिए वरीयता बढ़ा सकते हैं, और गतिहीनता समय को कम कर सकते हैं, माउस सीरम में सेरोटोनिन और डोपामाइन के स्तर को काफी बढ़ा सकते हैं, जबकि हिप्पोकैम्पस में भड़काऊ मध्यस्थों और कारकों की अभिव्यक्ति को बाधित करते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण ने संकेत दिया कि सीपीएचजी हिप्पोकैम्पस में एस्ट्रोसाइट्स के घनत्व को बढ़ा सकते हैं, माइक्रोग्लिया की सक्रियता को कम कर सकते हैं, और एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमासोम-संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को रोक सकते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों ने प्रदर्शित किया कि जिस तंत्र के माध्यम से सीपीएचजी सूजन गठन को कम करते हैं, वह हिप्पोकैम्पल ऊतक में टीएलआर 4/एनएफ- κB सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता को कम करके होता है। सारांश में, CPHGs पर महत्वपूर्ण अवसादरोधी प्रभाव प्रदर्शित करते हैंव्यवहार की तरह cums- प्रेरित अवसाद, संभावित रूप से न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर के नियमन और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं के निषेध के माध्यम से, अवसाद के उपचार में इसके आवेदन के लिए प्रयोगात्मक साक्ष्य प्रदान करते हैं।
मुख्य शब्द: cistanche phenylethanol ग्लाइकोसाइड्स; अवसाद; न्यूरोइनफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया; एस्ट्रोसाइट्स; TLR4/NFκB/NLRP3 पाथवे
अवसाद एक सामान्य और जटिल भावात्मक मानसिक विकार है जो कम मूड, एहेडोनिया, धीमी सोच और शारीरिक शिथिलता जैसे लक्षणों की विशेषता है। गंभीर मामलों में, आत्मघाती प्रवृत्ति भी हो सकती है [1]। "चीनी निवासियों (2020) के पोषण और पुरानी बीमारी की स्थिति पर रिपोर्ट" के अनुसार, मेरे देश में अवसाद की व्यापकता 2.1%तक पहुंच गई, और विश्व स्वास्थ्य संगठन द्वारा दुनिया में उच्चतम विकलांगता दरों वाली बीमारियों में से एक के रूप में सूचीबद्ध किया गया था [2]। चूंकि अवसाद का रोगजनन बहुत जटिल है, इसलिए विशिष्ट तंत्र आज तक अस्पष्ट रहता है, जो इसके उपचार के लिए एक बड़ी चुनौती है। हाल के वर्षों में, घरेलू और विदेशी विद्वानों ने पाया है कि अवसाद प्रतिरक्षा भड़काऊ सक्रियण से निकटता से संबंधित हो सकता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में भड़काऊ प्रतिक्रिया सक्रियण की प्रक्रिया में, हिप्पोकैम्पस भड़काऊ कोशिकाओं की सक्रियता इसकी विशेषता अभिव्यक्ति है। लगातार सक्रिय हिप्पोकैम्पस भड़काऊ कोशिकाएं कई भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई को प्रेरित करती हैं, जिससे एक भड़काऊ साइटोकाइन "कैस्केड प्रभाव" बनता है, जिससे अवसाद [3] जैसी मानसिक बीमारियों के रोगजनन और रोग प्रक्रिया में भाग लिया जाता है। वर्तमान में, इस बीमारी का उपचार मुख्य रूप से पश्चिमी चिकित्सा पर निर्भर करता है, जैसे कि फ्लुओक्सेटीन, वेनलाफैक्सिन, ड्यूलोक्सेटीन, आदि। हालांकि, कम नैदानिक इलाज दर, प्रमुख अवशिष्ट लक्षण, उच्च पुनरावृत्ति दर, और अंग की शिथिलता के लिए आसान जैसी कमियां हैं, जो इसके नैदानिक अनुप्रयोग को सीमित करती है [4]। पारंपरिक चीनी चिकित्सा में भावनात्मक रोगों के उपचार में अधिक लक्ष्यों और कम दुष्प्रभावों के फायदे हैं, और अवसाद और इसकी जटिलताओं के उपचार में व्यापक अनुप्रयोग संभावनाएं हैं [5]।
सभापतिCistanche deserticola ycma और/या cistanche tubulosa (Schenk) Wight के फास्फोरस पत्तियों के साथ सूखे मांसल स्टेम है, जो दोनों ओरोबानचैसी परिवार के पौधे हैं। यह एक अच्छा भोजन और दवा उत्पाद है। आधुनिक औषधीय अनुसंधान ने पुष्टि की है कि Cistanche Deserticola का एक न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है (यह अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, आदि) को रोक सकता है। "Cistanche Total Glycosides" कैप्सूल, जो मुख्य रूप से Cistanche Deserticola में फेनिलथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स से बने होते हैं, का उपयोग व्यापक रूप से न्यूरोलॉजिकल रोगों के उपचार में किया जाता है [6]। Phenylethanol ग्लाइकोसाइड्स (CPHGs) Cistanche कुल ग्लाइकोसाइड में महत्वपूर्ण सक्रिय तत्व हैं। उनके पास कई जैविक कार्य हैं जैसे कि एंटी-ट्यूमर, इम्युनोमॉड्यूलेशन और एंटीऑक्सिडेंट, और अच्छे अनुप्रयोग संभावनाएं दिखाते हैं [7]। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सीपीएचजी मोनोमाइंस के प्रभावों की रक्षा कर सकते हैं और स्ट्रिएटम [8] में डोपामाइन (डीए) की सामग्री और डोपामाइन (डीए) की सामग्री में सेरामाइड चयापचय मार्ग को बढ़ाकर अवसादग्रस्तता के लक्षणों को राहत दे सकते हैं; यह मस्तिष्क में मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में सुधार करके पेरिमेनोपॉज़ल सिंड्रोम के साथ चूहों के अवसादग्रस्तता-जैसे व्यवहार को भी समायोजित कर सकता है [9]। हालांकि, क्रोनिक अप्रत्याशित हल्के तनाव (CUMS) -इंडेड माउस डिप्रेशन मॉडल के इलाज में इसके उपयोग पर कोई रिपोर्ट नहीं हुई है, और इसके तंत्र को कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट किया जाना बाकी है। पिछले शोध के आधार पर और एंटी-ऑक्सीडेटिव तनाव में सीपीएचजी की वर्तमान क्षमता के साथ संयुक्त, न्यूरोइन्फ्लेमेशन को विनियमित करने और न्यूरोनल एपोप्टोसिस को बाधित करने के लिए, इस अध्ययन ने सीपीएचजी के एंटीडिप्रेसेंट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सीयूएमएस-प्रेरित माउस अवसाद मॉडल का उपयोग किया और CPHGs का एंटीडिप्रेसेंट प्रभाव, इसके नैदानिक अनुप्रयोग का विस्तार करना, और इसे स्वास्थ्य भोजन के रूप में विकसित करना और उपयोग करना।
1 सामग्री और तरीके
1.1 सामग्री और उपकरण
CPHGS अर्क (फेनिलथेनॉल ग्लाइकोसाइड्स में 85%से अधिक या उसके बराबर अर्क में या 40%से अधिक या उससे अधिक के बराबर, जो कि 40%या उससे अधिक के बराबर है, 16%से अधिक, बैच संख्या: 20231221, Xinjiang Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., LTD.); फ्लुओक्सेटीन हाइड्रोक्लोराइड कैप्सूल (फ्लुओक्सेटीन, एफएलएक्स) (बैच संख्या: 8533 सी, पैथोन फ्रांस फार्मास्युटिकल कंपनी, फ्रांस); 5- हाइड्रॉक्सीट्रीप्टामाइन (5- ht), डीए डिटेक्शन किट (बैच नंबर: 20240305, 20240305, शंघाई फ्यूचर इंडस्ट्रियल कंपनी, लिमिटेड); इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (INOS), cyclooxygenase -2 (cyclooxygenase -2, cox -2), प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (प्रोस्टाग्लैंडीन E2, PGE2), ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा, टीएनएफ 2) । Immunosorbent परख किट (BATCH NO।: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X2865471, ER049H746823, ER049H746823, जैव प्रौद्योगिकी कं, लिमिटेड); आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1 (आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1, आईबीए -1) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, ग्लिअल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन (जीएफएपी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, नोड नोड-लिक रिसेप्टर प्रोटीन 3 (एनएलआरपी 3 (एनएलआरपी 3 (एनएलआरपी 3)। Gr {{५४}}, gr {{{५५}}, abcam, uk); टोल-लाइक रिसेप्टर 4 (TLR4) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, फॉस्फोराइलेटेड परमाणु कारक- κB P65 (फॉस्फो-न्यूक्लियर फैक्टर- κB P65, P-NF-κB P65) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (बैच नंबर 10032512, 00128965, 00128965, WUHAN BIOTECHINING 4% पैराफॉर्मलडिहाइड, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग किट (बैच नंबर 20240106, 20240315, शंघाई बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड); हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (हेक्सा) ईओसिन, वह) धुंधला किट, निस्ल धुंधला किट (बैच संख्या: 20240401, 20240402, लिआनिंग मीलुन जीव विज्ञान); इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री यूनिवर्सल किट (बैच नंबर: 43731 ए, बीजिंग झोंगशान जिनकियाओ बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड)।
Me2 0 4e 1/10, 000 इलेक्ट्रॉनिक बैलेंस (मेटलर टोलेडो, यूएसए); मिलि-क्यू प्रयोगशाला शुद्ध जल प्रणाली (मर्क, जर्मनी); स्पेक्ट्रामैक्स ID3 मल्टीफंक्शनल माइक्रोप्लेट रीडर (आणविक डिवाइस, यूएसए); लीकाडम 2000 प्रतिदीप्ति ईमानदार माइक्रोस्कोप (लीका, जर्मनी); 63008 ओपन फील्ड, 63010 एलिवेटेड प्लस भूलभुलैया, 63022 मजबूर तैराकी, DB001 मॉरिस वाटर भूलभुलैया, स्मार्ट 3.0 पशु व्यवहार वीडियो विश्लेषण प्रणाली (शेन्ज़ेन रुइवोड लाइफ साइंस टेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेड)।
60 SPF C57BL/6 चूहों, वजन 18-22 g, बीजिंग वेइटोंग लिहुआ प्रायोगिक पशु प्रौद्योगिकी कं, लिमिटेड (उत्पादन लाइसेंस नंबर SCXK (बीजिंग) 2020-0033, प्रायोगिक पशु उपयोग लाइसेंस नंबर SYXK (BEIJING) 2021-0011) से खरीदे गए थे।
चूहों को एक एसपीएफ वातावरण में रखा गया था, जिसमें परिवेश के तापमान (21) 2) डिग्री पर नियंत्रित किया गया था, आर्द्रता 60% ± 10% और 12 एच प्रकाश-अंधेरे चक्र पर बनाए रखी गई थी। चूहों में भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच थी, और प्रयोग 1 सप्ताह के अनुकूली भोजन के बाद शुरू हुआ। प्रायोगिक जानवरों को चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय के प्रयोगात्मक पशु केंद्र में रखा गया था। इस अध्ययन में सभी माउस प्रायोगिक प्रक्रियाओं को चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है (SUCMDL20231015003)।
1.2 प्रायोगिक तरीके
1.2.1 समूहन, मॉडलिंग और औषधि प्रशासन
7- सप्ताह पुराने SPF C57BL/6 चूहों के 1 सप्ताह के अनुकूली खिलाने के बाद, गैर-लोचदार चूहों जो बाद के प्रयोगों की आवश्यकताओं को पूरा करते थे, उन्हें चीनी जल वरीयता परीक्षण के माध्यम से जांच की गई और बेतरतीब ढंग से एक नियंत्रण समूह (CON), एक मॉडल समूह (MOD), एक उच्च खुराक CPHGS-H; 700 mg), (CPHGS-M; 350 मिलीग्राम/किग्रा), एक कम खुराक CPHGS समूह (CPHGSL; 175 मिलीग्राम/किग्रा) और एक फ्लुओक्सेटीन समूह (FLX; 15 मिलीग्राम/किग्रा), प्रत्येक समूह में 10 चूहों के साथ। CON को छोड़कर, अन्य समूहों में चूहों को 4 सप्ताह [10] के लिए CUMS तनाव के अधीन होने लगा। कुल 10 तनावों का उपयोग किया गया था, जिसमें संयम (1 घंटे), झटकों (1 घंटे), पूंछ निलंबन (1 घंटे), 45- डिग्री केज झुकाव (24 घंटे), गीले बिस्तर (24 घंटे), खाली पिंजरे (24 घंटे), रात की रोशनी (12 घंटे), 5 मिनट के लिए 4 डिग्री गर्म पानी तैराकी, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री बर्फ पानी तैराकी, और 5 मिनट के लिए 5 मिनट, 4 डिग्री बर्फ पानी तैराकी। दो उत्तेजनाओं को हर दिन बेतरतीब ढंग से चुना जाता था, और एक ही उत्तेजना लगातार दो दिनों में दिखाई नहीं देती थी। मॉडलिंग के 4 सप्ताह के बाद, CPHGS-H, CPHGS-M, और CPHGS-L चूहों को शरीर के वजन के अनुसार Gavage द्वारा इसी CPHGS खुराक दिया गया था, और FLX चूहों को Gavage (10 mg/kg) द्वारा फ्लुओक्सेटीन दिया गया था। चूहों में CPHGS-M और FLX की खुराक को वयस्कों और चूहों के बीच शरीर की सतह क्षेत्र के बराबर गुणांक के अनुसार परिवर्तित किया गया था, और 2 बार का उतार-चढ़ाव CPHGs की कम और उच्च खुराक था। Con और Mod चूहों को Gavage द्वारा विआयनीकृत पानी की एक समान मात्रा दी गई थी। चूहों को दिन में एक बार 4 सप्ताह के लिए गाया जाता था। 8 वें सप्ताह में न्यूरोबेवियरल परीक्षण किए गए थे।
1.2.2 न्यूरोबेवियरल प्रयोग
1.2.2.1 चीनी जल वरीयता प्रयोग
सुक्रोज वरीयता परीक्षण (एसपीटी) से पहले, चूहों को एक ही पिंजरे में रखा जाना चाहिए और फिर 3 दिनों के लिए चीनी पानी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। पहले दिन, 1% सुक्रोज पानी की दो बोतलें 24 घंटे के लिए दी गईं, और दूसरे दिन, एक बोतल चीनी पानी और एक बोतल विआयनीकृत पानी 24 घंटे के लिए दी गई। तीसरे दिन, चीनी के पानी और शुद्ध पानी की स्थिति का आदान -प्रदान 24 घंटे के लिए किया गया, और प्रयोग 24 घंटे बाद समाप्त हो गया। चौथे दिन, चूहों को 24 घंटे तक पानी से वंचित और वंचित किया गया। पांचवें दिन, एक बोतल चीनी पानी और शुद्ध पानी की एक बोतल तौलने के बाद दी गई थी, और 12 घंटे के बाद पदों का आदान -प्रदान किया गया था। 24 घंटे के बाद, दो बोतलों को बाहर निकाल दिया गया और फिर से तौला गया, और चीनी पानी की खपत दर की गणना की गई (चीनी पानी की खपत दर=चीनी पानी की खपत/(चीनी पानी की खपत + पानी की खपत) × 100%)।
1.2.2.2 ओपन फील्ड टेस्ट
ओपन फील्ड टेस्ट (OFT) 50 सेमी × 50 सेमी × 50 सेमी क्यूब ओपन बॉक्स में आयोजित किया गया था। बॉक्स के केंद्र को 25 सेमी की साइड लंबाई के साथ एक वर्ग के रूप में परिभाषित किया गया था। चूहों को बॉक्स के केंद्र में रखा गया और 5 मिनट के लिए अनुकूलित करने की अनुमति दी गई। पिछले 5 मिनट में चूहों के आंदोलन प्रक्षेपवक्र का विश्लेषण किया गया था। मूल्यांकन संकेतकों में खुले क्षेत्र में चूहों की कुल आंदोलन दूरी, खुले क्षेत्र के केंद्र में गतिविधि का समय और केंद्र में प्रवेश करने की संख्या शामिल थी। 1.2.2.3 टेल सस्पेंशन टेस्ट टेल सस्पेंशन टेस्ट (टीएसटी) माउस को अपनी पूंछ से निलंबित करना है ताकि इसका सिर जमीन से एक निश्चित दूरी पर रखा जाए। 6 मिनट के भीतर चूहों का संघर्ष दर्ज किया गया था, और पिछले 4 मिनट में चूहों के गतिहीनता समय का विश्लेषण किया गया था।
1.2.2.4 मजबूर तैराकी परीक्षण
मजबूर तैराकी परीक्षण (FST) एक पारदर्शी बेलनाकार बैरल (15 सेमी व्यास × 50 सेमी ऊंचाई) में चूहों को (25) 2) डिग्री पानी से भरा हुआ है, जिसमें जल स्तर 20 सेमी तक पहुंच जाता है। 6 मिनट के भीतर पानी में चूहों के संघर्ष को दर्ज किया गया था, और पिछले 4 मिनट में चूहों के गतिहीनता समय का विश्लेषण किया गया था।
1.2.3 नमूना संग्रह
8 वें सप्ताह के अंत में, चूहों को सोडियम पेंटोबार्बिटल (3%, 10 एमएल/किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा गहराई से एनेस्थेटाइज़ किया गया था। एनेस्थीसिया के बाद, एनेस्थीसिया राज्य की पुष्टि धीमी सांस लेने, मांसपेशियों में छूट, और सर्जिकल ऑपरेशन के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं थी। फिर, चूहों का रक्त आंखों को हटाने से एकत्र किया गया था, और चूहों को सर्वाइकल डिस्लोकेशन द्वारा मार दिया गया था। दिल को खारा के साथ सुगंधित किया गया था, और फिर मस्तिष्क को जल्दी से खोला गया और बरकरार मस्तिष्क को हटा दिया गया। यह पूर्व-कूल्ड खारा के साथ rinsed था, और इसका आधा हिस्सा 72 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde के साथ तय किया गया था; अन्य आधे के हिप्पोकैम्पस ऊतक को बर्फ पर अलग किया गया था और बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया था। 10 मिलीग्राम माउस हिप्पोकैम्पस टिशू सैंपल लें, 1: 9 के द्रव्यमान-मात्रा अनुपात में प्री-कूल्ड फिजियोलॉजिकल खारा जोड़ें, और बर्फ के पानी के स्नान में यंत्रवत् रूप से समरूपता करें। होमोजेनाइजेशन के बाद, 15 मिनट (सेंट्रीफ्यूगल त्रिज्या 4.5 सेमी) के लिए 4 000 r/मिनट पर सेंट्रीफ्यूज, पता लगाने के लिए सतह पर तैरनेवाला एकत्र करें।
1.2.4 न्यूरोट्रांसमीटर सूचकांक का निर्धारण
माउस सीरम और हिप्पोकैम्पस टिशू होमोजेनेट सुपरनैटेंट की उचित मात्रा लें, और किट ऑपरेशन विधि के अनुसार 5- HT और DA सामग्री की सामग्री का पता लगाएं।
1.2.5 हिप्पोकैम्पल ऊतक जैव रासायनिक सूचकांक का निर्धारण
हिप्पोकैम्पस टिशू होमोजेनेट के सतह पर तैरनेवाला लें, और प्रोटीन एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए बीसीए किट का उपयोग करें। किट निर्देशों के अनुसार, भड़काऊ मध्यस्थों (iNOS, कॉक्स -2 और PGE2) और भड़काऊ कारक (TNF, il -1, il -18, il -6, ifn- ifn- ifn-) प्रत्येक पदार्थ की सामग्री की गणना की जाती है, और डेटा को रिकॉर्ड किया जाता है और सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया जाता है।
1.2.6 वह हिप्पोकैम्पस ऊतक का धुंधला हो जाना
72 घंटे से अधिक के लिए तय किए गए पूरे मस्तिष्क ऊतक के नमूने लिए गए और पैराफिन वर्गों को 4 माइक्रोन की मोटाई के साथ बनाया गया। Xylene के साथ डेवैक्सिंग के बाद, नमूनों को ग्रेडिएंट इथेनॉल (5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल I और II में डूबे हुए, और 95%, 90%, 80% और 70% इथेनॉल में क्रमशः 2 मिनट के लिए हाइड्रेटेड किया गया, और पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया, 5 मिनट के लिए ईओसिन के साथ दाग। 2 एस के लिए एसिड इथेनॉल, और 10 मिनट के लिए नल के पानी में rinsed। ग्रेडिएंट इथेनॉल (2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, इथेनॉल I और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल II) के साथ निर्जलित, Xylene के साथ पारदर्शी, तटस्थ गम और वायु-सूखे के साथ सील। चूहों के प्रत्येक समूह में हिप्पोकैम्पस ऊतक कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन एक माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए थे।
1.2.7 हिप्पोकैम्पस ऊतक का निस्ल धुंधला
"1.2.5" के तहत तैयार किए गए पैराफिन वर्गों को dewaxed और हाइड्रेटेड किया गया था, फिर 10 मिनट के लिए NISSL धुंधला समाधान के साथ दाग दिया गया, हर बार 3 मिनट के लिए आसुत जल के साथ दो बार धोया गया, ग्रेडिएंट इथेनॉल के साथ निर्जलित (2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए, ट्रांसपेरेंट, 5 मिनट के लिए, 5% इथानोल II) हवा में सूखा। चूहों के प्रत्येक समूह में हिप्पोकैम्पस ऊतक कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन एक माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए थे।
1.2.8 हिप्पोकैम्पल ऊतक की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
पैराफिन-एम्बेडेड हिप्पोकैम्पस टिशू नमूनों को सार्वभौमिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री किट के निर्देशों के अनुसार इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) धुंधला द्वारा संसाधित किया गया था। डेवैक्सिंग के बाद, हाइड्रेशन, एंटीजन रिपेयर, पेरोक्सीडेज ब्लॉकिंग, और ब्लॉकिंग, IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) और CASPSAE1 (1: 400) प्राथमिक एंटीबॉडी को रात भर में जोड़ा गया और 4 डिग्री पर संभाला गया। डीएबी रंग के विकास के बाद, परमाणु धुंधला, निर्जलीकरण और सीलिंग, IBA1, GFAP, NLRP3 और CASPSAE -1 की सकारात्मक अभिव्यक्ति एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखी गई और छवि जे। द्वारा छवि का विश्लेषण किया गया।
1.2.9 हिप्पोकैम्पल ऊतक का इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाना
पैराफिन-एम्बेडेड हिप्पोकैम्पस ऊतक नमूनों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस किट के निर्देशों के अनुसार इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा संसाधित किया गया था। "1.2.5" के तहत तैयार किए गए पैराफिन वर्गों को ओस, हाइड्रेटेड, एंटीजन की मरम्मत की गई, और अवरुद्ध किया गया, और फिर TLR4 (1: 400) और P-NF-κB P65 (1: 200) प्राथमिक एंटीबॉडी को वर्गों में जोड़ा गया और 4 डिग्री पर रात भर ऊष्मायन किया गया। अगले दिन प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दिया गया, पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया, और माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500) को जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए अंधेरे में ऊष्मायन किया गया। तीन बार धोने के बाद, वर्गों को डीएपीआई युक्त एक फिक्सेटिव के साथ सील कर दिया गया था। हिप्पोकैम्पस ऊतक क्षेत्र के प्रतिदीप्ति संकेत को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था और छवियों का विश्लेषण छवि जे द्वारा किया गया था।
1.3 डेटा प्रसंस्करण
प्रयोगात्मक डेटा को सांख्यिकीय रूप से सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर SPSS 26 का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। 0 और ग्राफपैड प्रिज्म 9। 0। डेटा को ± मानक विचलन (± x ± S) के रूप में व्यक्त किया गया था, और विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था। दोनों समूहों के बीच तुलना डननेट के परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। पी<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
