अनुसंधान प्रगति और फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंटीबॉडी के अनुप्रयोग: नैनोबॉडी पर केंद्रित एक समीक्षा

अमूर्त: फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की खोज के बाद से, उनके समृद्ध फ्लोरोसेंस स्पेक्ट्रा और फोटोकैमिकल गुणों ने व्यापक जैविक अनुसंधान अनुप्रयोगों को बढ़ावा दिया है। एफपी को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और इसके व्युत्पन्न, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) और इसके व्युत्पन्न, और निकट-अवरक्त एफपी में वर्गीकृत किया जा सकता है। एफपी के निरंतर विकास के साथ, एफपी को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी उभरे हैं। एंटीबॉडी, इम्युनोग्लोबुलिन का एक वर्ग, ह्यूमरल प्रतिरक्षा का मुख्य घटक है जो स्पष्ट रूप से एंटीजन को पहचानता है और बांधता है। एकल बी कोशिका से उत्पन्न होने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को इम्यूनोएसे, इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स और दवा विकास में व्यापक रूप से लागू किया गया है। नैनोबॉडी एक नए प्रकार का एंटीबॉडी है जो पूरी तरह से हेवी-चेन एंटीबॉडी के परिवर्तनीय डोमेन से बना है। पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना में, ये छोटे और स्थिर नैनोबॉडी जीवित कोशिकाओं में व्यक्त और कार्यात्मक हो सकते हैं। इसके अलावा, वे लक्ष्य की सतह पर खांचे, सीम या छिपे हुए एंटीजेनिक एपिटोप्स तक आसानी से पहुंच सकते हैं। यह समीक्षा विभिन्न एफपी, उनके एंटीबॉडी की अनुसंधान प्रगति, विशेष रूप से नैनोबॉडी और एफपी को लक्षित करने वाले नैनोबॉडी के उन्नत अनुप्रयोगों का अवलोकन प्रदान करती है। यह समीक्षा एफपी को लक्षित करने वाले नैनोबॉडीज़ पर आगे के शोध के लिए सहायक होगी, जिससे एफपी जैविक अनुसंधान में अधिक मूल्यवान हो जाएगी।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

कीवर्ड: फ्लोरोसेंट प्रोटीन; मोनोक्लोनल ऐंटीबॉडी; नैनोबॉडी; अनुसंधान प्रगति; आवेदन

1 परिचय

बायोमेडिकल विज्ञान अनुसंधान में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला टूल प्रोटीन है। एफपी के बढ़ते उपयोग के बाद, एफपी एंटीबॉडी भी विकसित की गई हैं। पारंपरिक एंटीबॉडी (चित्रा 1 ए) की तुलना में, कैमलिड (चित्रा 1 बी) से हेवी-चेन एंटीबॉडी (एचसीएबी) और शार्क (चित्रा 1 सी) से इम्युनोग्लोबुलिन नए एंटीजन रिसेप्टर्स (आईजीएनएआर) में स्वाभाविक रूप से प्रकाश श्रृंखला की कमी होती है। सिंगल-डोमेन एंटीबॉडी (sdAb) एक एंटीबॉडी है जो पूरी तरह से HCAb या IgNAR के वेरिएबल डोमेन से बना है। इसका आणविक भार 12-15 केडीए है, जो एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के आकार का लगभग 1/10 है; इसलिए, इसे नैनोबॉडी भी कहा जाता है। छोटे आकार, एसिड और गर्मी के खिलाफ उच्च स्थिरता, मजबूत प्रवेश क्षमता, आनुवंशिक इंजीनियरिंग और अभिव्यक्ति में आसानी और उच्च आत्मीयता वाले नैनोबॉडी को वैज्ञानिक शोधकर्ताओं द्वारा विभिन्न क्षेत्रों में लागू किया गया है। यह आसानी से लक्ष्य की सतह पर खांचे, सीम या छिपे हुए एंटीजेनिक एपिटोप्स तक पहुंच सकता है, कई एंटीजन को पहचान सकता है जिन्हें पारंपरिक एंटीबॉडी नहीं पहचान सकते हैं [1]। इसलिए, नैनोबॉडी का उपयोग विकासात्मक जीव विज्ञान में जीवों और कोशिका संवर्धन प्रणालियों में बायोमोलेक्यूल्स के रूप में किया गया है, स्थिर जीव विज्ञान में गठनात्मक अवस्था के लिए क्रिस्टलीय चैपरोन, एंजाइम गतिविधि के नियामक या अवरोधक, जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिकर्मकों और इम्युनोब्लॉटिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में माध्यमिक एंटीबॉडीज के रूप में उपयोग किया गया है। -6]। नैनोबॉडी जो विशेष रूप से एफपी को बांधती हैं, उनका व्यापक रूप से उपसेलुलर स्थानीयकरण, इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग अध्ययन, लाइव सेल इमेजिंग और लक्षित नैनोमटेरियल्स [7-9] में उपयोग किया जाता है। विशेष रूप से, सुपर हाई-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में पारंपरिक आईजीजी एंटीबॉडी पर नैनोबॉडी के अद्वितीय फायदे हैं।

चित्र 1. IgG (A), कैमलिड HCAb (B), और शार्क IgNAR (C) की संरचना आरेख। वीएच, भारी श्रृंखला का परिवर्तनशील क्षेत्र; वीएल, प्रकाश श्रृंखला का परिवर्तनशील क्षेत्र; सीएच/सी, भारी श्रृंखला का स्थिर क्षेत्र; सीएल, प्रकाश श्रृंखला का निरंतर क्षेत्र; VHH, HCAb का परिवर्तनशील डोमेन; VNAR, IgNAR का परिवर्तनशील डोमेन।

2. फ्लोरोसेंट प्रोटीन का अवलोकन

2.1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खोज

समुद्री अकशेरुकी जीवों में ल्यूमिनसेंस एक सामान्य घटना है। जेलीफ़िश, हाइड्रा और मूंगा सहित कोएलेंटरेट्स, पराबैंगनी (यूवी) या नीली रोशनी के तहत हरे रंग की प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं, जबकि केटेनोफ़ोर्स नीली प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की पहचान सबसे पहले शिमोमुरा एट अल द्वारा एक्वोरिया विक्टोरिया में की गई थी। 1962 में [10], और फिर क्लोन करके 1985 में व्यक्त किया गया [11]। तदनुसार, जंगली प्रकार के जीएफपी (डब्ल्यूटीजीएफपी) के अद्वितीय गुणों और स्थिर संरचना ने कई शोधकर्ताओं को इसका अध्ययन करने के लिए आकर्षित किया है। तब से, मौजूदा ज्ञान और इसकी क्रिस्टल संरचना के आधार पर, टिसेन और उनके सहयोगियों ने उत्परिवर्तन द्वारा विभिन्न फ्लोरोसेंट गुणों के साथ विभिन्न जीएफपी प्रोटीन उत्पन्न किए और जीएफपी के ल्यूमिनेसेंस तंत्र को विस्तृत किया [12]। जीएफपी से संबंधित अनुसंधान के संबंध में, तीन वैज्ञानिकों (शिमोमुरा, चाल्फी और त्सिएन) ने जीएफपी की खोज और इसके अनुप्रयोग में उनके उत्कृष्ट योगदान के लिए रसायन विज्ञान में 2008 का नोबेल पुरस्कार जीता।

पैतृक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी), अर्थात् डीएसआरड, को 1999 में गैर-बायोल्यूमिनसेंट रीफ कोरल से क्लोन किया गया था [13]। आरएफपी का उपयोग जीएफपी के साथ मिलकर उन वैज्ञानिक समस्याओं को हल करने के लिए किया जा सकता है जिन्हें जीएफपी अकेले हल नहीं कर सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि इंट्रासेल्युलर इमेजिंग में आरएफपी की कम पृष्ठभूमि के कारण, यह जैव विज्ञान अनुसंधान में अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है [14,15]। कई वैज्ञानिकों के प्रयासों से, एफपी के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा को पूरे दृश्य क्षेत्र और यहां तक ​​​​कि निकट-अवरक्त क्षेत्र को कवर करने की सूचना मिली है, जो जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन को देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपकरणों का खजाना प्रदान करता है [16]। चित्र 2 एफपी के विकास का सारांश प्रस्तुत करता है।

चित्र 2. फ्लोरोसेंट प्रोटीन का विकास। जीएफपी, हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; बीएफपी, नीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ईजीएफपी, उन्नत हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; YFP, पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएफपी, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; वीएचएच, भारी श्रृंखला का परिवर्तनशील डोमेन; VNAR, वैरिएबल न्यू एंटीजन रिसेप्टर। हल्का हरा मार्कर जीएफपी अनुप्रयोग पर अनुसंधान की प्रगति को इंगित करता है और पीला हरा मार्कर जीएफपी एंटीबॉडी पर अनुसंधान की प्रगति को इंगित करता है।

2.2. जीएफपी की संरचना और कार्यात्मक गुण

जीएफपी एक प्राकृतिक रूप से पाया जाने वाला, गोलाकार और घुलनशील अम्लीय एफपी है। जीएफपी की प्राथमिक संरचना में 238 अमीनो एसिड अवशेषों से बना एक मोनोमर होता है, जिसका आणविक भार 27-30 केडीए होता है। इसकी क्रिस्टल संरचना 11 एंटी-समानांतर श्रृंखलाओं द्वारा गठित एक केंद्र को प्रदर्शित करती है, जो एक बेलनाकार, कसकर पैक-बैरल संरचना बनाती है। -बैरल केंद्र को इसके -हेलिक्स से जुड़े 4-(पी-हाइड्रॉक्सीबेंज़िलिडीन){{10%)इमिडाज़ोलिनोन के प्रकाश-उत्सर्जक समूह द्वारा संरक्षित किया जाता है, जिसके दोनों सिरे शॉर्ट-हेलिक्स खंडों द्वारा सील किए जाते हैं [17,18]। क्रोमोफोर की परिपक्वता के लिए O2 [19] के अलावा किसी अन्य सहकारक की आवश्यकता नहीं होती है। जीएफपी नीली रोशनी या यूवी प्रकाश को अवशोषित करता है और हरे रंग की प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है, मुख्य उत्तेजना शिखर 395 एनएम पर, सबसे कम उत्तेजना शिखर 475 एनएम पर, और उत्सर्जन शिखर 509 एनएम पर होता है। जीएफपी बेहद स्थिर है और उच्च तापमान उपचार को आसानी से झेल सकता है। फॉर्मेल्डिहाइड निर्धारण या पैराफिन एम्बेडिंग इसकी प्रतिदीप्ति विशेषताओं को प्रभावित नहीं करता है। एफपी की संरचना और परिपक्वता प्रक्रिया की गहन जांच के माध्यम से, अधिक से अधिक शोधकर्ता एफपी की संरचना को नए कार्य और गुण प्रदान करने के लिए फिर से डिजाइन करते हैं, जिससे उनके विकास और अनुप्रयोग को और बढ़ावा मिलता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

2.3. जीएफपी डेरिवेटिव्स

जीएफपी अनुप्रयोगों में सीमित कारक पीएच, क्लोराइड आयन संवेदनशीलता और खराब फोटोस्टेबिलिटी हैं। जीएफपी के लक्षित संशोधन इन खामियों को ठीक करते हैं, इसकी क्वांटम उपज, चमक, दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक और फोटोस्टेबिलिटी को बढ़ाते हैं। इसके अलावा, नीले, अल्ट्रामरीन, सियान और पीले सहित उत्सर्जित रंगों की सीमा को व्यापक बनाने के लिए कई जीएफपी डेरिवेटिव स्थापित किए गए हैं।

नीली रोशनी उत्तेजना के तहत डब्ल्यूटीजीएफपी की कम प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्तनधारी कोशिकाओं में इसकी अस्थिर अभिव्यक्ति के जवाब में, झांग एट अल। जीएफपी (एफ64एल और एस65टी) के अमीनो एसिड प्रतिस्थापन का इंजीनियर किया गया, अर्थात् उन्नत जीएफपी (ईजीएफपी), जिसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता 35-गुना [20] बढ़ जाती है। इसकी अच्छी फोटोस्टेबिलिटी और उच्च चमक को देखते हुए, ईजीएफपी हरे प्रकाश क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला एफपी म्यूटेंट बना हुआ है। इसके अलावा, जीएफपी के फोल्डिंग गुणों को अनुकूलित किया गया है, जिससे सुपर फोल्डिंग क्षमता वाला एक सुपर फ़ोल्डर जीएफपी (एसएफजीएफपी) प्राप्त हो रहा है। एसएफजीएफपी में छह नए उत्परिवर्तन हैं, जिनमें S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V और A206V शामिल हैं। एसएफजीएफपी अघुलनशील प्रोटीन के साथ संलयन में व्यक्त होने पर भी कुशलतापूर्वक मोड़ सकता है, जिससे इसकी प्रतिदीप्ति की चमक सुनिश्चित होती है [21]। GFPuv, GFP का एक और संशोधित रूप, यूवी प्रकाश के तहत प्रतिदीप्ति के लिए अनुकूलित है। यह 395 एनएम पर उत्तेजना शिखर और 509 एनएम पर उत्सर्जन शिखर के साथ यूवी प्रकाश की उपस्थिति में चमकदार हरी प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है और इसका उपयोग विभिन्न इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के स्थान को इंगित करने के लिए किया जा सकता है [22,23]। GFPuv में तीन अमीनो एसिड प्रतिस्थापन होते हैं, जिनमें F99S, M153T, और V163A शामिल हैं। ये उत्परिवर्तन ई. कोली में डब्ल्यूटीजीएफपी की तुलना में जीएफपीयूवी की 18- गुना अधिक मजबूत अभिव्यक्ति उत्पन्न करते हैं। जीएफपीयूवी जीन एक सिंथेटिक जीन है जहां जीएफपीयूवी की प्रभावी अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए पांच कम आवृत्ति वाले आर्ग कोडन को ई. कोली के लिए उपयुक्त कोडन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

सिस्टैंच एन्हांस इम्युनिटी उत्पादों को देखने के लिए यहां क्लिक करें

【अधिक के लिए पूछें】 ईमेल:cindy.xue@wecistanche.com / व्हाट्स ऐप: 0086 18599088692 / वीचैट: 18599088692

Y66H का साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन 384 एनएम पर उत्तेजना शिखर और ~445 एनएम पर उत्सर्जन शिखर के साथ नीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (बीएफपी) का निर्माण करता है। इसका उत्तेजना स्पेक्ट्रम यूवी प्रकाश के करीब है, जो ऑपरेशन के दौरान कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाता है, और इसकी छोटी उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य कोशिकाओं में ऑटोफ्लोरेसेंस को प्रेरित करती है। उन्नत बीएफपी (ईबीएफपी) कमजोर रूप से ल्यूमिनसेंट है और सेलुलर इमेजिंग के लिए उच्च पृष्ठभूमि संकेत के साथ, फोटोब्लीचिंग और एसिड के लिए खराब प्रतिरोधी है। तीन उज्जवल ईबीएफपी म्यूटेंट विकसित किए गए हैं, जिनमें अज़ुराइट [24], ईबीएफपी2 [25], और एमटैगबीएफपी [26] शामिल हैं, जो 1.6-, 2.0-, और 3.{{13} हैं। }क्रमशः ईबीएफपी की तुलना में अधिक चमकदार। mTagBFP, सबसे चमकीला BFP, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) TagRFP [27] के एक उत्परिवर्ती से प्राप्त होता है, जिसका विलुप्त होने का गुणांक 52, 000 M−1 सेमी−1 और क्वांटम उपज {{19) है। }}.63, जो फोटोब्लीचिंग के प्रति इसके प्रतिरोध में काफी सुधार करता है। डब्ल्यूटीजीएफपी में वाई66एफ के उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप 442 एनएम [28] के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक अल्ट्रामरीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन बनता है। हालाँकि, GFP-Y66F वैरिएंट की कम प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज इमेजिंग में इसकी प्रयोज्यता को गंभीर रूप से सीमित कर देती है। T65Q, Y145G, H148S और T203V के अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के साथ GFP-Y66F के आगे उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप अल्ट्रामरीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन सिरियस बनता है, जो GFP-Y66F [29] से 25 गुना अधिक चमकीला होता है।

सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) का उत्तेजना शिखर 449 एनएम और उत्सर्जन शिखर ~482 एनएम है, जिसमें वर्णक्रमीय गुण बीएफपी और ईजीएफपी के बीच होते हैं। बीएफपी के समान, सीएफपी के निर्माण के लिए Y66W के साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन का उपयोग किया जाता है। अपनी उत्कृष्ट फोटोस्टेबिलिटी के कारण सीएफपी का बहुरंगा इमेजिंग और स्थानीयकरण अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग है। उदाहरण के लिए, जीन एन्कोडिंग सीएफपी को मानव कोडन प्राथमिकता के लिए अनुकूलित किया गया है और अब यह व्यापारिक नाम AmCyan1 (Clontech) के तहत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। इसके अतिरिक्त, उन्नत सीएफपी (ईसीएफपी) की तुलना में कई म्यूटेंट अधिक चमकीले हैं, जैसे सेरूलियन, एमटीएफपी (सेरूलियन से दोगुना चमकीला), और फ़िरोज़ा (ईसीएफपी से लगभग दोगुना चमकीला) [21,30]।

पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) में उत्परिवर्तन क्रोमोफोर Y66 के मूल रूप में प्रतिबंधित नहीं हैं, बल्कि संरचनात्मक रूप से Y66 से सटे अवशेषों में प्रतिबंधित हैं। YFP का उत्तेजना शिखर ~518 एनएम है, उत्सर्जन शिखर ~531 एनएम है। जीएफपी की तुलना में, वाईएफपी की प्रतिदीप्ति लाल स्पेक्ट्रम की ओर स्थानांतरित हो जाती है, जो मुख्य रूप से स्थिति 203 पर टायर के साथ थ्र के प्रतिस्थापन के कारण होती है। उन्नत वाईएफपी (ईवाईएफपी) इंट्रासेल्युलर पीएच का पता लगाने के लिए सबसे अधिक फ्लोरोसेंट और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले एफपी बायोसेंसरों में से एक है। क्लोराइड आयन सांद्रता. हालाँकि, यह एसिड और क्लोराइड आयनों के प्रति बहुत संवेदनशील है और कई जेलीफ़िश व्युत्पन्न एफपी [31] की तुलना में कम फोटोस्टेबल है। एमसिट्रिन और एमवीनस, ईवाईएफपी के उन्नत संस्करण, वर्तमान में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले वाईएफपी [32,33] हैं। जीएफपी और उसके डेरिवेटिव के फोटोफिजिकल गुणों को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है।

तालिका 1. जीएफपी, आरएफपी और उनके डेरिवेटिव के फोटोफिजिकल गुण।

तालिका 1. जारी.

2.4. आरएफपी डेरिवेटिव्स

आरएफपी एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला एफपी है। डीएसआरड एक टेट्रामर है जो प्रोटीन संलयन करते समय मल्टीमर्स बनाता है और इंट्रासेल्युलर रूप से व्यक्त होने पर विषाक्त हो सकता है, इसलिए इसे मोनोमर्स प्राप्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है। सबसे उल्लेखनीय RFP "mFruit" परिवार है, जिसमें mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine, और mStrawberry (तालिका 1) शामिल है, जिनमें से K163Q और K83L के उत्परिवर्तन के साथ mCherry सबसे पसंदीदा है। एमचेरी में तेजी से परिपक्वता, अच्छे मोनोमेरिक गुण और बेहतर फोटोस्टेबिलिटी है, हालांकि यह कम उज्ज्वल है [34]। हालाँकि, टैगआरएफपी अपने मोनोमर रूप में एमचेरी की तुलना में लगभग तीन से चार गुना अधिक चमकीला है, जो इसे एक अपेक्षाकृत चमकीला मोनोमेरिक आरएफपी बनाता है जो वर्तमान में उपलब्ध है [27]। एमकेट एक नवीन मोनोमेरिक दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो टैगआरएफपी के चार-साइट उत्परिवर्तन से प्राप्त होता है, जिसका उत्तेजना शिखर 588 एनएम और उत्सर्जन शिखर 635 एनएम है, जो ईजीएफपी जितना उज्ज्वल केवल 45% है; इसका डिमराइजेशन प्रोटीन, कटुष्का, ईजीएफपी [35] जितना चमकीला है। mKate2, V38A, S165A और K238R के अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के साथ mKate का एक उत्परिवर्ती है, जिसकी चमक mKate से लगभग दोगुनी है [36]। GFP और RFP की तुलना में, mKate और Katushka इंट्रा-ऑब्जेक्ट प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए बेहतर इमेजिंग गहराई और समृद्ध ऑप्टिकल सिग्नल प्रदर्शित करते हैं [35]। इसलिए, विवो बायोइमेजिंग के लिए दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन विकसित करना अधिक मूल्यवान है।

2.5. निकट-इन्फ्रारेड एफपी

इमेजिंग अनुप्रयोगों में प्रोटीन टैग के रूप में निकट-अवरक्त (एनआईआर) एफपी अत्यधिक वांछित हैं। अधिकांश एनआईआर एफपी बैक्टीरियल फाइटोक्रोम फोटोरिसेप्टर (बीपीएचपी) [37] से डिजाइन किए गए हैं। जीवित पशु इमेजिंग में उपयोग किया जाने वाला पहला एनआईआर एफपी आईएफपी1.4 है, जो बीपीएचपी से प्राप्त एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो बिलिवरडीन (बीवी) क्रोमोफोर से जुड़कर फ्लोरोसेंट होता है [38]। डीएनए फेरबदल और यादृच्छिक उत्परिवर्तन द्वारा, एक उज्जवल IFP2.0 तब विकसित किया जाता है [39]। हालाँकि मोनोमेरिक IFP1.4 और IFP2.0 को BphP के डिमराइज़ेशन इंटरफ़ेस को तोड़कर प्राप्त किया जा सकता है, फिर भी वे उच्च सांद्रता पर डिमराइज़ होते हैं। एक प्राकृतिक मोनोमेरिक इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आईएफपी), एमआईएफपी, 2015 में डिजाइन किया गया था [40]। ड्रोसोफिला लार्वा और न्यूरॉन्स में एमआईएफपी का ध्वनि इमेजिंग प्रभाव साबित हुआ है। शचरबकोवा एट अल। अलग-अलग स्पेक्ट्रा, अर्थात् miRFP670, miRFP703, और miRFP709 [41] के साथ तीन चमकीले मोनोमेरिक NIR FP डिज़ाइन किए गए। बीपीएचपी व्युत्पन्न एनआईआर एफपी को कम से कम दो डोमेन, पीएएस (प्रति-एआरएनटी-सिम) और जीएएफ (सीजीएमपी फॉस्फोडिएस्टरेज़-एडेनाइलेट साइक्लेज-एफएचएलए) की आवश्यकता होती है, ताकि बीवी क्रोमोफोर को सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सके और इसमें एक जटिल "आठ गाँठ का आंकड़ा" संरचना भी हो। जीएएफ और पीएएस डोमेन को स्थलीय रूप से जोड़ना, जो उनकी तह को प्रभावित करता है। इसलिए, बैक्टीरियल फोटोरिसेप्टर का एक अन्य वर्ग, एलोफाइकोसायनिन (एपीसी), का उपयोग एनआईआर एफपी, जैसे कि एसएमआरएफपी [42] को इंजीनियर करने के लिए किया जाता है। हालांकि एपीसी-आधारित एनआईआर एफपी छोटे होते हैं, वे बीवी को कम कुशलता से बांधते हैं, जिससे स्तनधारी कोशिकाओं में बीपीएचपी-व्युत्पन्न एनआईआर एफपी की तुलना में काफी कम चमक होती है। बीपीएचपी- और एपीसी-आधारित एनआईआर एफपी के दोषों को दूर करने के लिए, सायनोबैक्टीरियोक्रोम (सीबीसीआर) से miRFP670nano नामक एक एकल-डोमेन एनआईआर एफपी विकसित किया गया था, जो पहले सीबीसीआर-व्युत्पन्न एनआईआर एफपी का प्रतिनिधित्व करता है जो अंतर्जात बीवी क्रोमोफोर को कुशलता से बांध सकता है और उज्ज्वल प्रतिदीप्ति उत्सर्जित कर सकता है। स्तनधारी कोशिकाएँ [43]। BphP-व्युत्पन्न NIR FPs की तुलना में miRFP670nano का एक अनिवार्य लाभ उच्च फोटोस्टेबिलिटी है। पैतृक miRFP670nano के सापेक्ष 14 उत्परिवर्तन के साथ उन्नत miRFP670nano3, miRFP670nano के समान फोटोस्टेबिलिटी प्रदर्शित करता है [44]। तालिका 2 एनआईआर एफपी के फोटोफिजिकल गुणों का सारांश प्रस्तुत करती है।

तालिका 2. एनआईआर एफपी के फोटोफिजिकल गुण।

एफपी की खोज और अनुप्रयोग ने आधुनिक जीव विज्ञान के लिए एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण प्रदान किया है। आजकल, एफपी उन सामान्य उपकरणों में से एक बन गया है जिसका उपयोग वैज्ञानिक अपने अनुप्रयोगों को कई अनुसंधान क्षेत्रों में विस्तारित करने के लिए करते हैं, जैसे कि जीन अभिव्यक्ति विनियमन, ऑर्गेनेल लेबलिंग, सिग्नल ट्रांसमिशन, ड्रग स्क्रीनिंग और बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन। एफपी को व्यक्त करने वाले अधिकांश क्लोनिंग वैक्टर का व्यावसायीकरण किया गया है और ये वाणिज्यिक कंपनियों के माध्यम से उपलब्ध हैं।

3. फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंटीबॉडी पर अनुसंधान प्रगति

3.1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन को लक्षित करने वाला मोनोक्लोनल एंटीबॉडी

एंटीबॉडी एक प्रकार का इम्युनोग्लोबुलिन है जो बी लिम्फोसाइटों द्वारा स्रावित होता है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में दो भारी श्रृंखलाएं और दो हल्की श्रृंखलाएं होती हैं, भारी श्रृंखला में एक चर क्षेत्र (वीएच) और तीन स्थिर क्षेत्र (सीएच) होते हैं, और प्रकाश श्रृंखला में एक चर क्षेत्र (वीएल) और एक स्थिर क्षेत्र (सीएल) होता है। ). भारी श्रृंखलाएं सहसंयोजक रूप से डाइसल्फ़ाइड बांड से जुड़ी होती हैं, और प्रकाश श्रृंखला का सीएल क्षेत्र एक स्थिर एंटीबॉडी अणु बनाने के लिए भारी श्रृंखला के सीएच1 डोमेन से गैर-सहसंयोजक रूप से जुड़ा होता है [45]। अपनी विशिष्ट रिसेप्टर बाइंडिंग क्षमता के कारण, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विभिन्न प्रकार की जैविक गतिविधियों का उत्पादन करते हैं, जैसे कि शास्त्रीय अवरोधन, तटस्थता, पूरक सक्रियण, एफसी रिसेप्टर के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं की हत्या और प्रतिरक्षा गतिविधि का विनियमन। वे महत्वपूर्ण जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स हैं जिनका व्यापक रूप से इम्यूनोएसे, इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स और दवा विकास में उपयोग किया जाता है। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी कई बी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रक्रिया से प्राप्त हेटरोटाइपिक एंटीबॉडी का मिश्रण है, और प्रत्येक एंटीबॉडी एक ही एंटीजन के एक अलग एपिटोप को पहचानता है [45]। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशेष रूप से एंटीजन पर एक एपिटोप का पता लगाते हैं और अन्य प्रोटीन के साथ क्रॉस-रिएक्शन करने की संभावना कम होती है, इस प्रकार कम पृष्ठभूमि धुंधला संकेत उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, समान प्रायोगिक स्थितियों के तहत मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से संबंधित परिणामों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में अधिक है।

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%) को mAb FMU-GFP का उपयोग करके एक सीधी {{1}चरणीय तकनीक का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है। {{3}युग्मित सेफ़रोज़ 4B रेज़िन। इसके अलावा, जीएफपी से जुड़े सभी कार्यात्मक पुनः संयोजक लक्ष्य प्रोटीन को जीएफपी एपिटोप के कारण कोशिकाओं से आसानी से और सीधे अलग किया जा सकता है। ये आंकड़े बताते हैं कि यह विधि किसी भी उपलब्ध विधि की तुलना में जीएफपी को शुद्ध करने में अधिक प्रभावी है और अधिकांश जीएफपी शुद्धि विधियों में कम उपज और शुद्धता की चुनौती का समाधान करती है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

3.2. नैनोबॉडी फ्लोरोसेंट प्रोटीन को लक्षित कर रही है

3.2.1. नैनोबॉडी का परिचय

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के अंतर्निहित गुण, जैसे कि उनके बड़े आणविक भार, जटिल संरचना और सीमित जैविक गतिविधि, ने उनके आगे के अनुप्रयोगों को तेजी से प्रतिबंधित कर दिया है। इसलिए, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के विकल्प विकसित करना अत्यावश्यक है। 1989 में, वार्ड एट अल। लाइसोजाइम के प्रति कमजोर बंधन क्षमता वाले हेवी-चेन एंटीबॉडी का एक वैरिएबल डोमेन तैयार किया, जिससे एसडीएबी अनुसंधान में रुचि बढ़ गई [48]। 1993 में, हैमर्स कास्टरमैन एट अल। पहली बार ऊँट के सीरम में एक नए प्रकार के एंटीबॉडी की खोज की गई, जो पारंपरिक स्तनधारी एंटीबॉडी से बिल्कुल अलग है [49]। प्रकाश श्रृंखलाओं की प्राकृतिक कमी के कारण इस प्रकार के एंटीबॉडी को HCAb नाम दिया गया है। HCAb में CH2, CH3, हिंज क्षेत्र और HCAb (VHH) का परिवर्तनशील डोमेन शामिल है, लेकिन इसमें अभी भी पूर्ण एंटीजन-बाइंडिंग क्षमता है। 1995 में, ग्रीनबर्ग एट अल। नर्स शार्क में भारी-श्रृंखला वाले एंटीबॉडी की खोज की, जिसे IgNAR के रूप में जाना जाता है [50]। यह स्रावी और झिल्ली-बद्ध दोनों रूपों में मौजूद है, और इसमें एक परिवर्तनशील क्षेत्र होता है, जिसे वैरिएबल न्यू एंटीजन रिसेप्टर (वीएनएआर) कहा जाता है, और कई स्थिर क्षेत्र होते हैं। इसके बाद, IgNAR को वोबेगोंग शार्क, स्पाइनी डॉगफिश, हॉर्न शार्क और सफेद-धब्बेदार बांस शार्क में पाया गया है, जो sdAbs प्रदर्शनों की सूची का पूरक है। एक नैनोबॉडी में छोटे आणविक भार, उच्च आत्मीयता, मजबूत स्थिरता, अच्छी घुलनशीलता, मजबूत ऊतक प्रवेश और छिपे हुए एंटीजन एपिटोप्स की पहचान की विशेषताएं होती हैं। इसने रोग निदान, प्रतिरक्षा अभिकर्मकों, रोगज़नक़ का पता लगाने और दवा विकास में अधिक ध्यान आकर्षित किया है [51]। आणविक जीव विज्ञान तकनीकों के विकास और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एंटीबॉडी तैयारी तकनीक में सुधार के साथ, नैनोबॉडी इम्यूनोएसे में एक लोकप्रिय अनुसंधान क्षेत्र बन गया है। चित्र 3 आज तक नैनोबॉडी के विकास का सारांश प्रस्तुत करता है।

चित्र 3. नैनोबॉडी का विकास। हल्का नीला मार्कर नैनोबॉडी दवाओं पर अनुसंधान की प्रगति को इंगित करता है। एफडीए, खाद्य एवं औषधि प्रशासन; ईएमए, यूरोपीय औषधि एजेंसी; एनएमपीए, राष्ट्रीय चिकित्सा उत्पाद प्रशासन; एचसीएबी, हेवी-चेन एंटीबॉडी; IgNAR, Ig नए एंटीजन रिसेप्टर्स; एसडीएबी, एकल डोमेन एंटीबॉडी; वीएचएच, एचसीएबी का परिवर्तनीय डोमेन; VNAR, IgNAR का परिवर्तनशील डोमेन; पीडी-एल1, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु 1 लिगैंड 1।

3.2.2. नैनोबॉडी फ्लोरोसेंट प्रोटीन को लक्षित कर रही है

फ्लोरोसेंट प्रोटीन ने उपयोग में आसान जीन-एनकोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों की पेशकश करके कोशिका जीव विज्ञान और जैव रसायन को बदल दिया है। समानांतर विकास के दौरान प्रोटीन मचान पुस्तकालयों के संश्लेषण और चयन के माध्यम से अनुसंधान और दवा लक्ष्यों के लिए कई कड़े बाध्यकारी एजेंट विकसित किए गए हैं [52]। एक उदाहरण नैनोबॉडी का विकास है, जिसे बेहतर स्थिरता, घुलनशीलता और उपज के साथ चुनना आसान है [53]। पारंपरिक एंटीबॉडी के विपरीत, ये छोटे और स्थिर नैनोबॉडी जीवित कोशिकाओं में कार्य करते हैं। इसलिए, एफपी के लिए विशिष्ट बाइंडिंग गतिविधि वाला नैनोबॉडी जैविक अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में एफपी संलयन, पृथक्करण और सेलुलर इंजीनियरिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

• कैमलिडे-व्युत्पन्न नैनोबॉडीज़ GFP को लक्षित करती हैं

उत्कृष्ट उपकोशिकीय स्थानीयकरण विशेषताओं वाले विभिन्न प्रोटीनों को जीएफपी से जोड़ा गया है, जिससे विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में सीधे प्रोटीन का पता लगाने के लिए दृश्य एंटीजन बनाए जा रहे हैं। 2006 में, रोथबॉयर एट अल। जीएफपी [54] के साथ अल्पाका को प्रतिरक्षित करके एक जीएफपी-विशिष्ट एंटीबॉडी टुकड़े (सीएबीजीएफपी4) की जांच की गई। cAbGFP4 और GFP एंटीजन के बीच परस्पर क्रिया के सतह प्लास्मोन अनुनाद परख (SPR) ने एक उच्च संबंध (KD=0.23 nM) दिखाया। इसके अलावा, एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी को एक मोनोमेरिक आरएफपी के साथ जोड़ा गया था, जिससे जीवित कोशिकाओं में एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी के वितरण की जांच करने के लिए दृश्यमान जीएफपी-बाध्यकारी एंटीबॉडी का उत्पादन किया गया था। जेल निस्पंदन, इम्युनोब्लॉटिंग और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी परख द्वारा, जीएफपी-विशिष्ट नैनोबॉडी को स्तनधारी कोशिकाओं में पता लगाने योग्य प्रोटीन गिरावट या एकत्रीकरण के बिना स्थिर रूप से वितरित किया गया था जो आमतौर पर एकल-श्रृंखला चर टुकड़ों के साथ पाया जाता है। इसके अलावा, कुबाला एट अल। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) [55] द्वारा जीएफपी: सीएबीजीएफपी4 कॉम्प्लेक्स (चित्र 4ए) की विशेषता, प्रोटीन बाइंडिंग में नैनोबॉडी की उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के आधार का खुलासा करती है। 2020 में, फेज डिस्प्ले [56] का उपयोग करके चार अलग-अलग एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी, जिन्हें ए12, बी9, डी5 और ई6 कहा जाता है, की पहचान की गई। नेटिव पेज और इम्युनोप्रेजर्वेशन एसेज़ से पता चला कि ये नैनोबॉडीज़ इन विट्रो और विवो में जीएफपी को बांध सकती हैं।

चित्र 4. जीएफपी-नैनोबॉडी कॉम्प्लेक्स का आरेख। (ए) सीएबीजीएफपी4 (पीडीबी:3ओजीओ, नारंगी); (बी) जीबीपी1 (पीडीबी: 3के1के, हल्का नीला); (सी) जीबीपी4 (पीडीबी: 3जी9ए, गुलाबी); (डी) एलएजी16 (पीडीबी: 6एलआर7, पीला); (ई) एनबीएसजीएफपी02 (पीडीबी: 7ई53, मैजेंटा)। (एफ) जीएफपी कॉम्प्लेक्स के साथ उपरोक्त नैनोबॉडी का संरचनात्मक सुपरपोजिशन। GFP को हरे रंग में दिखाया गया है.

प्रोटीन संरचना का कार्य से गहरा संबंध है और आमतौर पर इसे नियामक कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है। एक्सल एट अल. सात जीएफपी-विशिष्ट बाइंडर्स की पहचान की गई, अर्थात् जीएफपी-बाइंडिंग प्रोटीन (जीबीपी) 1-7 [57]। उनमें से, GBP1 ने GFP प्रतिदीप्ति को 10-गुना बढ़ा दिया, जबकि GBP4 ने GFP प्रतिदीप्ति में 5-गुना कमी ला दी; इसलिए, इन्हें क्रमशः "एन्हांसर्स" और "मिनिमाइज़र्स" कहा जाता था। जीएफपी-नैनोबॉडी कॉम्प्लेक्स (चित्र 4बी, सी) के संरचनात्मक विश्लेषण से पता चला कि दो नैनोबॉडीज ने क्रोमोफोर परिवेश में मामूली विपरीत परिवर्तन किए, जिससे इसकी अवशोषण विशेषताओं में बदलाव आया [58]। इसके अलावा, 25 जीएफपी-विशिष्ट नैनोबॉडीज (एलएजी) की पहचान की गई, जिनमें केडी मान 0.5 एनएम से लेकर 2{31}} µM [59] तक थे। एक द्विसंयोजक नैनोबॉडी (LaG-16-LaG-2) ने 36 pM के KD मान के साथ उच्चतम आत्मीयता दिखाई। इसके अलावा, अतिरिक्त एलएजी प्रोटीन के साथ ऊष्मायन करने पर जीएफपी की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता ~ 60% बढ़ गई। झांग एट अल. 1.67 Å रिज़ॉल्यूशन [60] पर एलएजी16 (चित्र 4डी) के साथ जटिल जीएफपीयूवी की क्रिस्टल संरचना की सूचना दी। GFP-बैरल पर LaG16 की बाइंडिंग साइट GFP एन्हांसर के दूसरी तरफ स्थित थी। इसलिए, LaG16 और GFP-एन्हांसर को (GS)4 लिंकर के साथ जोड़ा गया था। द्विसंयोजक नैनोबॉडी में 0.5 एनएम की आत्मीयता थी, जो विभिन्न एपिटोप्स के साथ बाइंडिंग करने वाले 2 नैनोबॉडी के डिमराइजेशन द्वारा अल्ट्रा-हाई-एफ़िनिटी लक्ष्य प्रोटीन बाइंडर्स को डिजाइन करने की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करता है।

2014 में, ट्वेयर एट अल। एसएफजीएफपी तैयार किया और एक वयस्क एक-कूबड़ वाले ऊंट का टीकाकरण किया। तीन एपिटोप्स (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07, और 08) को लक्षित करने वाले सात एंटी-एसएफजीएफपी नैनोबॉडी को अलग किया गया [61]। एलिसा और प्रतिरक्षा-ब्लॉटिंग परीक्षणों के आधार पर, इन नैनोबॉडीज ने एसएफजीएफपी को मुक्त या वृद्धि हार्मोन से जुड़े लेबल के रूप में पहचाना। इसके अलावा, sfGFP (चित्र 4E) के साथ जटिल नैनोबॉडी NbsfGFP02 की क्रिस्टल संरचना 2.2 Å के रिज़ॉल्यूशन पर स्थापित की गई थी। बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई) द्वारा एनबीएसएफजीएफपी02 और एसएफजीएफपी के बीच संबंध 15.8 एनएम निर्धारित किया गया था। NbsfGFP02 [62] के लिए पिघलने का तापमान 75.6 डिग्री था; इसलिए, यह उन अनुप्रयोगों में एक संभावित जीएफपी नैनोबॉडी उम्मीदवार है जो कठोर परीक्षण स्थितियों की मांग करते हैं। अधिकांश नैनोबॉडीज़ को यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्लास्मिड ट्रांसफ़ेक्शन के माध्यम से कार्यात्मक रूप से व्यक्त किया जा सकता है। इसलिए, जीवित कोशिकाओं में संरचनात्मक या गतिशील विशेषताओं की पहचान करने के लिए नैनोबॉडी एक उत्कृष्ट उपकरण हैं। 2020 में, झोउ एट अल। निर्मित जीएफपी-बाइंडिंग नैनोबॉडीज (सीएबीजीएफपी4) को इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) एमआरएनए के रूप में व्यक्त करने की एक नई विधि का प्रस्ताव रखा, जिसे नैनोबॉडी-एमचेरी [63] कहा जाता है। रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लियोटाइड और पॉली (ए) पूंछ के साथ अनूदित क्षेत्रों और रिवर्स कैप एनालॉग्स के साथ एमआरएनए इन विट्रो में तैयार किया गया था और ट्रांसफ़ेक्शन के लिए उपयोग किया गया था। प्लास्मिड डीएनए का उपयोग करके व्यक्त किए गए नैनोबॉडी के विपरीत, आईवीटी एमआरएनए का उपयोग करके व्यक्त किए गए एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी को ट्रांसफ़ेक्शन के 3 घंटे के भीतर पहचाना गया और 48 घंटे के भीतर नष्ट कर दिया गया। इसलिए, जीवित कोशिकाओं में नैनोबॉडी के एन्कोडेड एमआरएनए को व्यक्त करने से नैनोबॉडी की कुशल डिलीवरी की अनुमति मिलती है।

• शार्क-व्युत्पन्न नैनोबॉडीज़ GFP को लक्षित करती हैं।

वेई एट अल. प्रदर्शित किया गया कि बांस शार्क ने जीएफपी टीकाकरण के खिलाफ एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न की, जो बढ़ी हुई लिम्फोसाइट गिनती और एंटीजन-विशिष्ट आईजीएनएआर द्वारा विशेषता है [64]। कुल मिलाकर, 0.3 nM तक की आत्मीयता के साथ BsG3, 73, 80, 89, 93, 98, और 105 सहित 7 एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी को प्रतिरक्षित बांस शार्क से अलग किया गया था, जिसका अर्थ है कि बांस शार्क उच्च-आत्मीयता वाले IgNARs का निर्माण करें। इसके अलावा, जीएफपी (20.7 पीएम) के लिए उच्चतम आत्मीयता वाले द्वि-पैराटोपिक वीएनएआर का निर्माण किया गया था, और इंट्राबॉडी के रूप में एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी के चरित्र को स्तनधारी कोशिकाओं में मान्य किया गया था। ये निष्कर्ष बायोमेडिकल उद्योग के लिए कम लागत और उपयोग में आसान नैनोबॉडी प्रदान करने के लिए बांस शार्क एसडीएबीएस के अनुसंधान और प्रगति को गति देंगे।

• नैनोबॉडीज़ अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन को लक्षित करती हैं।

मसाबी एक चमकीला मोनोमेरिक हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन है। ली एट अल. एक एंटीजन के रूप में mWasabi के साथ ऊंटों को प्रतिरक्षित करके 4 × 1 0 7 ट्रांसफॉर्मेंट्स की एक एंटीबॉडी लाइब्रेरी का सफलतापूर्वक निर्माण किया गया और 3 उच्च-आत्मीयता mWasabi-विशिष्ट नैनोबॉडी की जांच की गई, जिन्हें Nb4, Nb6 और Nb27 कहा जाता है [65]। इन नैनोबॉडीज़ ने वसाबी को अकेले या प्रोग्राम्ड डेथ 1 (पीडी-1) के साथ मिलाने पर पहचाना। कुल मिलाकर, उच्च विशिष्टता के साथ एमचेरी को लक्षित करने वाले 6 नैनोबॉडी (एलएएम) की पहचान की गई, जिसमें केडी मान 0.18 एनएम से 63 एनएम [59] तक थे। इसके अलावा, नैनोमोलर बाइंडिंग एफ़िनिटी वाले तीन आईआरएफपी 713- विशिष्ट नैनोबॉडी (बीएसआर1, बीएसआर3, और बीएसआर4) को अलग किया गया था [64]। ये आंकड़े बताते हैं कि बांस शार्क के टीकाकरण से उच्च-आत्मीयता वाले नैनोबॉडी उत्पन्न हो सकते हैं। कुल मिलाकर, सेलुलर प्रोटीन को बांधने और एफपी संलयन प्रोटीन को आकर्षित करने की नैनोबॉडी की क्षमता जीवित कोशिकाओं में सेलुलर प्रक्रियाओं और संरचनाओं के सटीक नियंत्रण को सक्षम बनाती है। यह बहुक्रियाशील एफपी-नैनो ट्रैप एक ही प्रोटीन के अनूठे संयोजन के साथ सूक्ष्म, जैव रासायनिक और कार्यात्मक विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। एफपी को लक्षित करने वाले नैनोबॉडीज़ को तालिका 3 में संक्षेपित किया गया है।

तालिका 3. एफपीएस को लक्षित करने वाले नैनोबॉडी का सारांश।

4. फ्लोरोसेंट प्रोटीन नैनोबॉडी के अनुप्रयोग

4.1. प्रोटीन जांच में अनुप्रयोग

4.1.1. इंट्रासेल्युलर प्रोटीन का पता लगाना

प्रोटीन फ़ंक्शन को समझने के लिए विश्वसनीय और मात्रात्मक उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोटीन स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है। यद्यपि लक्ष्य प्रोटीन को लेबल करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग आणविक जीव विज्ञान में अच्छी तरह से स्थापित किया गया है, यह तकनीक पारंपरिक एंटीबॉडी के आकार और बहुसंयोजकता से बाधित है। नैनोबॉडी के छोटे आकार को देखते हुए, उन्हें फ्लोरोसेंट अणुओं, एंजाइमों, पेप्टाइड्स, रिसेप्टर्स, बायोटिन और अन्य दवाओं के साथ बंधन के बाद इंट्रासेल्युलर इमेजिंग के लिए ट्रेसर के रूप में उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कार्बनिक रंगों [66,67] के साथ टैग किए जाने पर एफपी के विरुद्ध नैनोबॉडी का उपयोग सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग में किया गया था। Ptk2 कोशिकाएं जो लगातार ट्युबुलिन YFP को व्यक्त करती हैं, उन्हें इस दृष्टिकोण का उपयोग करके चित्रित किया गया था, और पारंपरिक एंटीबॉडी के साथ लगभग 450 Å के विपरीत, रिज़ॉल्यूशन को 269 ± 37 Å तक सुधार दिया गया था।

नैनोबॉडी-मध्यस्थता लेबलिंग परिष्कृत एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) इमेजिंग के लिए लगभग किसी भी सामान्य रूप से सुलभ एफपी-व्युत्पन्न संलयन संरचना को लेबल करने के लिए एक त्वरित और बहुमुखी विधि प्रदान करता है। विशेष रूप से, दो-रंग वाला एसएमएलएम किसी भी कार्यात्मक जीएफपी और आरएफपी संलयन निर्माण के उपसेलुलर स्थानीयकरण की जांच कर सकता है जब जीएफपी और आरएफपी के खिलाफ नैनोबॉडी का एक साथ उपयोग किया जाता है [68]। इस प्रकार, दो-रंग एसएमएलएम इमेजिंग का उपयोग करके कई जैविक समस्याओं को तुरंत संबोधित किया जा सकता है। एरियोटी एट अल. एंजाइम-आधारित प्रोटीन लेबलिंग के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण का प्रस्ताव दिया, जिससे ईएम-रिज़ॉल्यूशन के लिए उपसेलुलर प्रोटीन वितरण का विश्लेषण करने के लिए बेहतर गति और नमूनाकरण की अनुमति मिल सके। GBP4 को सीधे संशोधित सोयाबीन एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज (APEX) टैग पर डिज़ाइन करके, यह दिखाया गया कि APEX को रुचि के किसी भी GFP-लेबल प्रोटीन की ओर निर्देशित किया जा सकता है। APEX-GBP4 फ़्यूज़न ऑर्गेनेल उपडोमेन को उल्लेखनीय उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोटीन स्थानीयकरण प्रदान करता है और उपसेलुलर प्रोटीन वितरण को चिह्नित करने के लिए समय को काफी कम कर देता है। इसके अलावा, यह अंतर्जात स्तरों पर व्यक्त जीएफपी-लेबल प्रोटीन के ईएम-रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है।

एफपी-विशिष्ट नैनोबॉडी-एन्कोडिंग प्लास्मिड का एक टूलबॉक्स तैयार किया गया और कार्यात्मक मॉड्यूल में जोड़ा गया। यह टूलबॉक्स जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों के दृश्य और हेरफेर को सक्षम बनाता है, जिससे विवो में इसके उपयोग में काफी विस्तार होता है [9]। इनमें Ca2+, H+, और ATP/ADP के गतिशील दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट सेंसर और ऑलिगोमेरिक या हेटेरोडिमेरिक मॉड्यूल शामिल हैं जो प्रोटीन भर्ती या अलगाव और ऑर्गेनेल के बीच झिल्ली संपर्क साइटों की पहचान की अनुमति देते हैं। 2017 में, हर्से एट अल। इम्यूनोलेबलिंग और एंटीजन हेरफेर के लिए एंटीबॉडी को सीधे कोशिकाओं में ले जाने के लिए सेल-पेनेट्रेटिंग पेप्टाइड (सीपीपी) का उपयोग किया जाता है [69]। एक ऐसी प्रणाली का निर्माण किया गया, जिसने न्यूक्लियोलस में आरएनए के प्रति चक्रीय आर्जिनिन-समृद्ध सीपीपी की उच्च आत्मीयता का लाभ उठाया। चक्रीय आर्जिनिन-समृद्ध सीपीपी को जीएफपी नैनोबॉडी से जोड़कर, न्यूक्लियोलस में जीएफपी का पुन: स्थानीयकरण सीधे कोशिकाओं में देखा जा सकता है (चित्र 5ए)। इसलिए, इस विज़ुअलाइज़्ड प्रणाली का उपयोग प्रोटीन के स्थान को ट्रैक करने और मात्रात्मक रूप से विभिन्न सीपीपी की दक्षता की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।

प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) तकनीक का व्यापक रूप से जीवन विज्ञान अनुसंधान में उपयोग किया जाता है क्योंकि यह जीवित कोशिकाओं में शारीरिक स्थितियों के तहत सिग्नलिंग अणुओं का गतिशील वास्तविक समय पता लगाने में सक्षम बनाता है। अपनी असाधारण संवेदनशीलता और विशिष्टता के कारण, बायोमेडिकल अनुसंधान में समय-समाधान फ़ॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (TR-FRET)-आधारित विश्लेषण तेजी से लोकप्रिय हो रहा है। नैनोबॉडी-आधारित टीआर-एफआरईटी विधि पारंपरिक प्रतिदीप्ति तीव्रता रीडआउट की तुलना में बहुत अधिक संवेदनशीलता के साथ लाइसेट्स में फ्लोरोसेंट (संलयन) प्रोटीन की आसान मात्रा का ठहराव की अनुमति देती है [70]।

चित्र 5. फ्लोरोसेंट प्रोटीन नैनोबॉडी के अनुप्रयोग। (ए) प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का दृश्य। कोशिका-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (सीपीपी) से बंधा एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी (एनबी) कोशिका नाभिक में प्रवेश कर सकता है। यदि जीएफपी-टैग प्रोटीन आरएफपी-टैग प्रोटीन के साथ बातचीत नहीं करता है, तो केवल जीएफपी-टैग प्रोटीन एनबी-सीपीपी के माध्यम से न्यूक्लियोलस में पुनः स्थानीयकृत होता है, जो हरा रंग दिखाता है। हालाँकि, यदि दो प्रोटीन परस्पर क्रिया करते हैं, तो दोनों प्रोटीन न्यूक्लियोलस में पुनः स्थानीय हो जाते हैं, और पीला रंग दिखाते हैं। (बी) जीएफपी नैनोबॉडी नव एक्सोसाइटोज्ड वेसिकल प्रोटीन के चयनात्मक लेबलिंग को सक्षम बनाता है। चरण 1: वेसिकल प्रोटीन को जीएफपी से जोड़ा जाता है और एक गैर-फ्लोरोसेंट नैनोबॉडी (एनबीजीएफपी) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंस-बाइंडिंग नैनोबॉडी (एनबीजीएफपी*) के साथ जीएफपी की दुर्गमता होती है। चरण 2 और 3: सेलुलर एक्सोसाइटोसिस की उत्तेजना के बाद, नया पुटिका प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के संपर्क में आता है और इसे एनबीजीएफपी* द्वारा लेबल किया जा सकता है। (सी) अपमानित का योजनाबद्ध चित्रण। प्रोटीन का चयनात्मक क्षरण यूबिकिटिन मार्ग के माध्यम से पूरा किया जाता है, जो एंजाइमों की एक जटिल श्रृंखला द्वारा किया जाता है। एसकेपी में एफ-बॉक्स प्रोटीन (एफबीपी) को जीएफपी संलयन प्रोटीन को पहचानने के लिए एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी (एनबी) से जोड़ा जाता है, और यूबिकिटिन-संयुग्मन एंजाइम (E2) सहसंयोजक रूप से कई यूबिकिटिन अणुओं को लक्ष्य प्रोटीन से जोड़ता है। इसके बाद, पॉलीयूबीक्यूटिनेटेड प्रोटीन को प्रोटीसोम द्वारा नष्ट कर दिया जाता है। (डी) BiCAP का योजनाबद्ध विवरण। उसका प्रोटीन जीएफपी के एन-टर्मिनल (जीएफपी1) या सी-टर्मिनल (जीएफपी2) टुकड़ों से जुड़ा हुआ है। जब दो संलयन एक डिमर बनाते हैं, तो जीएफपी पुनः मुड़ जाता है और प्रतिदीप्त हो जाता है। उसके बाद एचईआर डिमर और इसके इंटरैक्टिंग प्रोटीन को जीएफपी नैनोबॉडी का उपयोग करके समृद्ध किया जाता है, जिसमें जीएफपी टुकड़ों के प्रति कोई बाध्यकारी क्षमता नहीं होती है और इस प्रकार, डिमर को अलग करने में सक्षम बनाता है। (ई) जीएफपी-निर्भर प्रतिलेखन प्रणाली। डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (डीबीडी) और सक्रियण डोमेन (एडी) क्रमशः जीएफपी नैनोबॉडी 1 (एनबी1) और जीएफपी नैनोबॉडी 2 (एनबी2) के साथ जुड़े हुए हैं। जीएफपी की उपस्थिति में, डीबीडी-एनबी1, और एडी-एनबी2 अपस्ट्रीम एक्टिवेटिंग सीक्वेंस (यूएएस) रिपोर्टर जीन को सक्रिय कर सकते हैं, जिससे लक्ष्य जीन का अपनियमन होता है। (एफ) डीएनए नैनोस्ट्रक्चर पर जीएफपी-लेबल प्रोटीन की पहचान। दो बाइंडिंग साइटों वाले डीएनए नैनोस्ट्रक्चर को चुंबकीय राल पर जोड़ा जाता है, पूरक बेस पेयरिंग द्वारा जीएफपी नैनोबॉडी (एनबी) के साथ बांधा जाता है, और फिर जीएफपी-लेबल प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। इसलिए, जीएफपी-लेबल प्रोटीन को नैनोस्ट्रक्चर से सटीक रूप से जोड़ा जा सकता है।

चित्र 5. जारी.

4.1.2. कोशिका की सतह पर प्रोटीन का पता लगाना

जीवाणु सतह प्रदर्शन सेल-एंकर प्रोटीन के उत्पादन और पूरे सेल उत्प्रेरक को डिजाइन करने के लिए एक आशाजनक तकनीक है। यद्यपि सतह प्रदर्शन के लिए विभिन्न बाहरी झिल्ली प्रोटीन का उपयोग किया जाता है, सतह प्रदर्शन प्रणालियों का मूल्यांकन और विकास करने के लिए कोई सरल, सार्वभौमिक और उच्च-थ्रूपुट संगत विधियां उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर और सतह पर प्रदर्शित प्रोटीन के बीच अंतर करना चुनौतीपूर्ण है। वेंडेल एट अल. बाहरी झिल्ली एंकर [71] में जीएफपी-नैनोबॉडी को फ्यूज करके एक प्रतिदीप्ति-आधारित सतह डिस्प्ले डिटेक्शन सिस्टम का निर्माण किया। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो बाहरी झिल्ली प्रोटीन को एंकर के रूप में चुना गया था: बाहरी झिल्ली प्रोटीन ए (ओएमपीए) और ऑटोट्रांसपोर्टर (सी-आईजीएपी)। इसलिए, दो अलग-अलग डिस्प्ले मॉड्यूल का निर्माण ओएमपीए या सी-आईजीएपी को जीएफपी-विशिष्ट नैनोबॉडी के साथ जोड़कर किया जाता है, जिसे बाहरी रूप से शुद्ध जीएफपी जोड़कर देखा जाता है। हालाँकि GFP स्वयं कोशिका की सतह पर प्रदर्शित किया जा सकता है, यह नई विधि झूठी सकारात्मकता की समस्या से बचती है क्योंकि केवल अगर GFP कोशिका की सतह पर प्रस्तुत नैनोबॉडी से जुड़ता है तो कोशिकाएँ एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न कर सकती हैं। परख कई प्रतिदीप्ति पता लगाने के तरीकों के साथ संगत है, जिसमें प्लेट में पूरे सेल प्रतिदीप्ति का पता लगाना, इन-जेल प्रतिदीप्ति, माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री शामिल है। यह सस्ती और आसानी से पढ़ी जाने वाली सतह प्रदर्शन विधि जीवित कोशिकाओं की सतह पर प्रोटीन के परिवहन तंत्र को प्रदर्शित करने में मदद करेगी, जिससे भविष्य में जीवाणु सतह प्रदर्शन प्रणालियों और मजबूत पूरे-सेल जैव उत्प्रेरक के तर्कसंगत विकास को सक्षम किया जा सकेगा।

न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई के लिए एक्सोसाइटोसिस, एंडोसाइटोसिस और नए संलयन पुटिकाओं के निर्माण की आवश्यकता होती है। एक्सोसाइटोसिस के बाद, जब प्लाज़्मा झिल्ली पर छोड़ दिया जाता है, वेसिकल प्रोटीन का क्या होता है, यह बहुत कम समझा जाता है। ये प्रोटीन अक्सर पीएच-संवेदनशील जीएफपी अंशों (फ्लोरीन) से संयुग्मित होते हैं। चूँकि pHluorin इमेजिंग आमतौर पर पुटिकाओं से कई गुना बड़े धब्बों के विवर्तन द्वारा सीमित होती है, इसलिए एक्सोसाइटोज़ पुटिकाओं को चुनिंदा रूप से लेबल करने के लिए एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी का उपयोग करना मूल्यवान है [72]। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए उपयुक्त रासायनिक फ़्लोरोफ़ोर्स के साथ एंटी-जीएफपी नैनोबॉडीज़ को जोड़कर, विभिन्न परिस्थितियों में पीएचलूरिन-लेबल प्रोटीन के आकार और तीव्रता का पता ऐसे तरीकों से लगाया जा सकता है जो अकेले पीएचलूरीन के साथ संभव नहीं हैं। एक्सोसाइटोसिस की उत्तेजना पर, नए पुटिका प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के संपर्क में आते हैं, और फिर फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए नैनोबॉडीज़ pHluorin (चित्र 5B) के साथ बंध जाएंगे। इस प्रकार, न्यूरॉन्स में एक्सोसाइटोसिस के बाद की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए नैनोबॉडी-आधारित पीएचलुओरिन का पता लगाना एक आशाजनक उपकरण है।

4.2. प्रोटीन अणुओं के लक्षित क्षरण में अनुप्रयोग

जीन संपादन और आरएनए हस्तक्षेप की तुलना में, प्रोटीन स्तर पर बायोमोलेक्यूल्स का प्रत्यक्ष हेरफेर प्रोटीन फ़ंक्शन अध्ययन के लिए एक अधिक कुशल मार्ग है, जो संभावित ऑफ-टार्गेट प्रभाव, जीन निष्क्रियता और आवश्यक जीन फेनोटाइपिक फ़ंक्शन के नुकसान जैसी सीमाओं पर काबू पाता है। लक्षित प्रोटीन क्षरण वर्तमान में रुचि के प्रोटीन के कार्य और प्रोटियोलिसिस के नुकसान को प्राप्त करने के लिए एक प्रमुख अनुसंधान रणनीति है। एक नैनोबॉडी-आधारित प्रोटीन डिग्रेडर रुचि के प्रोटीन के तेजी से गिरावट और प्रतिवर्ती विनियमन को प्राप्त करने में मदद कर सकता है। कॉसिनस एट अल. किसी भी यूकेरियोटिक प्रणाली में लक्ष्य जीएफपी संलयन प्रोटीन की प्रत्यक्ष और तेजी से कमी के लिए एक प्रोटीन क्षरण विधि विकसित की गई है [73]। संक्षेप में, जीएफपी संलयन प्रोटीन को ख़त्म करने के लिए, एक एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी को एसकेपी {5}सीयूएल{6}}एफ-बॉक्स प्रोटीन (एससीएफ) ई3 लिगेज कॉम्प्लेक्स में एफ-बॉक्स प्रोटीन (एफबीपी) से जोड़ा जाता है। GFP संलयन प्रोटीन को पहचानने के लिए। यूबिकिटिन-संयुग्मन एंजाइम (ई2) सहसंयोजक रूप से कई यूबिकिटिन अणुओं को लक्ष्य जीएफपी संलयन प्रोटीन से जोड़ता है। इसके बाद, एससीएफ कॉम्प्लेक्स पॉलीयूबीक्यूटिनेटेड प्रोटीन को क्षीण कर देता है; इस प्रकार, लक्ष्य प्रोटीन को हटाने की निगरानी करना आसान है (चित्र 5सी)। इस तकनीक, जिसे डीग्रेड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (डीग्रैडएफपी) कहा जाता है, का उपयोग जीएफपी के क्षरण और स्तनधारी कोशिकाओं, जेब्राफिश भ्रूण [74] और पौधों [75] में इसके संलयन के लिए किया गया है।

4.3. द्विआणविक पूरक एफ़िनिटी शुद्धिकरण प्रणाली में अनुप्रयोग

2016 में, क्राउचर एट अल। एक द्वि-आणविक पूरकता आत्मीयता शुद्धि प्रणाली (बीआईसीएपी) विकसित की है जो मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (एचईआर) डिमर (समरूप और विषमलैंगिक) को मोनोमर [76] से प्रभावी ढंग से अलग कर सकती है। इस प्रणाली में, एक एफपी अणु के दो पूरक टुकड़े दो एचईआर प्रोटीन (एचईआर1, एचईआर2, या एचईआर3) के साथ जुड़े होते हैं। इन दो टुकड़ों को सक्रिय फ्लोरोसेंट प्रोटीन में स्वचालित रूप से इकट्ठा नहीं किया जा सकता है। हालाँकि, मान लीजिए कि दो HER प्रोटीन एक दूसरे के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। उस स्थिति में, दोनों टुकड़े स्थानिक रूप से एक-दूसरे के करीब और पूरक होंगे, जिससे वे एक पूर्ण और सक्रिय फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्र 5D) में पुनर्निर्मित होंगे। एचईआर डिमर और इसके इंटरैक्टिंग प्रोटीन को जीएफपी नैनोबॉडी का उपयोग करके समृद्ध किया जा सकता है, जिसमें जीएफपी टुकड़ों के लिए कोई समानता नहीं थी, इस प्रकार डिमर के अलगाव और संवर्धन को सक्षम किया गया। पहचाने गए प्रोटीन का विश्लेषण करने पर, यह पता चला कि तीन डिमर (HER2:HER2, HER2:HER3, और HER1:HER2) में सामान्य अंतःक्रियात्मक प्रोटीन और उनके विशिष्ट अंतःक्रियात्मक होते हैं। FAM59A, एक प्रोटीन जो विशेष रूप से HER1:HER3 डिमर के साथ संपर्क करता है, ने बाह्यकोशिकीय सिग्नल-विनियमित किनेज़ मार्ग के सक्रियण में मध्यस्थता की, जिससे स्तन कैंसर चिकित्सा के लिए एक नया लक्ष्य प्रदान किया गया।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

4.4. अन्य क्षेत्रों में अनुप्रयोग

रोग का प्रारंभिक इन विट्रो निदान और चिकित्सीय प्रभावों की निगरानी रोग निदान में एक बड़ी समस्या है। एक आदर्श कंट्रास्ट एजेंट में अच्छे ऊतक प्रवेश, उच्च एंटीजन एफ़िनिटी और सामान्य ऊतकों को न्यूनतम क्षति के साथ तेजी से निकासी क्षमता होनी चाहिए। नैनोबॉडीज़ में आदर्श इमेजिंग एजेंट के रूप में क्षमता होती है जो रक्त वाहिकाओं को पार कर सकती है और बेहतर इमेजिंग और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए ऊतकों में प्रवेश कर सकती है।

एफपी न केवल कोशिकाओं और जैविक प्रक्रियाओं को रोशन करते हैं बल्कि कई मेजबान प्रोटीन नेटवर्क से जुड़ाव की स्पष्ट कमी के कारण उत्कृष्ट मचान भी बनाते हैं। जैविक रूप से सक्रिय जटिल गठन को चलाने के लिए एक मचान के रूप में जीबीपी और जीएफपी का उपयोग करना, तांग एट अल। हाइब्रिड ट्रांसक्रिप्शन कारकों की एक लाइब्रेरी बनाई जो विशेष रूप से जीएफपी और उसके डेरिवेटिव की उपस्थिति में जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करती है [77]। जीएफपी का उत्पादन कोशिका-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है (चित्र 5ई) और माउस रेटिना और मस्तिष्क की शिथिलता को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों और जेब्राफिश उपभेदों को तंत्रिका सर्किट की फोटोजेनेटिक निगरानी के लिए जीएफपी-निर्भर प्रतिलेखन प्राप्त करने के लिए संशोधित किया गया है। यह कार्य एक बहुमुखी पाड़ के रूप में जीएफपी की स्थिति स्थापित करता है और ट्रांसजेनिक उपभेदों में विभिन्न जीएफपी-टैग की गई कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से हेरफेर करने का द्वार खोलता है। इसके आधार पर, अन्य इंट्रासेल्युलर उत्पादों को भी बहुकोशिकीय जीवों में कोशिका-विशिष्ट मचान के रूप में विकसित किया जा सकता है।

एंजाइम गतिविधि और प्रोटीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए डीएनए नैनोस्ट्रक्चर एक आवश्यक और प्रभावी उपकरण बन गया है। हालाँकि, डीएनए नैनोस्ट्रक्चर पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए सार्वभौमिक रणनीति विकसित करना मुश्किल है। कठिनाइयों में से एक डीएनए नैनोस्ट्रक्चर में रुचि के प्रोटीन का जुड़ाव है। सोम्मेस एट अल. डीएनए नैनोस्ट्रक्चर को लेबल करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तावित किया गया [78]। उन्हें जीएफपी नैनोबॉडी के साथ क्रियाशील करके, प्रोटीन लगाव की क्षमता को सटीक रूप से नियंत्रित किया जा सकता है (चित्रा 5एफ)। जीएफपी-विशिष्ट डीएनए एप्टामर्स की तुलना में, नैनोबॉडीज जीएफपी के प्रति उच्च विशिष्टता, स्थिरता और आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, जैविक अनुसंधान में एक प्रोग्राम योग्य मचान के रूप में डीएनए नैनोस्ट्रक्चर के अनुप्रयोग को डीएनए नैनोस्ट्रक्चर को आमतौर पर कोशिकाओं, विकासात्मक जीव विज्ञान और प्रोटीन जैव रसायन में पाए जाने वाले एफपी के साथ जोड़कर नाटकीय रूप से सरल बनाया गया है।

5. भविष्य के आउटलुक पर चर्चा

पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना में, नैनोबॉडी में बेहतर भौतिक और रासायनिक गुण होते हैं और इन्हें व्यक्त करना और स्क्रीन करना आसान होता है। पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना में नैनोबॉडी की संरचना बहुत सरल होती है। वे एक ही जीन द्वारा एन्कोड किए गए हैं और सूक्ष्मजीवों द्वारा आसानी से उत्पादित किए जा सकते हैं, जिससे उत्पादन लागत काफी कम हो जाती है। हालाँकि नैनोबॉडीज़ एंटीबॉडी अनुसंधान के लिए एक सफलता प्रदान करती हैं, फिर भी कुछ समस्याओं को हल करने की आवश्यकता है। एक ओर, उन्हें असुविधाजनक संचालन और पशु टीकाकरण की उच्च लागत का नुकसान होता है। इसके अलावा, चूंकि HCAb और IgNAR परिधीय रक्त मोनोसाइट्स में प्रचुर मात्रा में हैं, एफपी एंटीजन को लक्षित करने वाले नैनोबॉडी आमतौर पर विशिष्ट कैमेलिडे या शार्क प्रतिरक्षा पुस्तकालयों से जांचे जाते हैं। पुस्तकालय निर्माण और नैनोबॉडी विकास प्रौद्योगिकियों की परिपक्वता के साथ, सिंथेटिक पुस्तकालयों से एफपी-विशिष्ट नैनोबॉडी की स्क्रीनिंग एक नई दिशा है जो जानवरों के टीकाकरण की असुविधा को दूर करेगी, प्रयोगात्मक अवधि को छोटा करेगी और लागत को काफी कम करेगी। दूसरी ओर, हालांकि नैनोबॉडी की स्क्रीनिंग और अभिव्यक्ति अपेक्षाकृत सरल है, संभावित अनुप्रयोग मूल्यों के साथ एफपी नैनोबॉडी प्राप्त करना एक बहुत ही जटिल प्रक्रिया है। फ़ेज़ नैनोबॉडी लाइब्रेरीज़ की स्क्रीनिंग एंटीजन के साथ फिलामेंटस फ़ेज़ सतह के बंधन के कारण होने वाली झूठी सकारात्मकता से बच नहीं सकती है, जबकि यीस्ट और बैक्टीरियल नैनोबॉडी लाइब्रेरीज़ की छोटी क्षमता नैनोबॉडी स्क्रीनिंग में एक और कठिन समस्या है।

भविष्य में एफपी के विरुद्ध नैनोबॉडी के अनुप्रयोग बढ़ते रहेंगे। (1) इंट्रासेल्युलर एंटीबॉडी तकनीक के विकास के साथ, जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर अणुओं का पता लगाना आसान हो गया है। इस संबंध में नैनोबॉडी के अनूठे फायदे हैं, इसमें (i) नैनोबॉडी छोटी है, और कोशिका प्रवेश की दक्षता पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना में बहुत अधिक है; और (ii) नैनोबॉडी को जीवित कोशिकाओं में व्यक्त और क्रियाशील किया जा सकता है। (2) बाइस्पेसिफिक नैनोबॉडी एक प्रकार का कृत्रिम रूप से संशोधित एंटीबॉडी है जो विशेष रूप से दो अलग-अलग एंटीजन को एक साथ बांध सकता है। इसे आसानी से मोनोवैलेंट नैनोबॉडी से बनाया जा सकता है और सूक्ष्मजीवों में व्यक्त किया जा सकता है। इसलिए, एफपी के विरुद्ध नैनोबॉडीज़ विशिष्ट नैनोबॉडी विकास के लिए एक व्यापक अनुप्रयोग संभावना प्रदान करते हैं।

6। निष्कर्ष

यह पेपर एफपी की उत्पत्ति, संरचना और गुणों की समीक्षा करता है। एफपी को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और नैनोबॉडी और उनके अनुप्रयोगों को भी संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। यद्यपि एंटीबॉडी स्थिर कोशिकाओं में जैविक घटकों को प्रदर्शित करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं, जीवित कोशिकाओं में पारंपरिक एंटीबॉडी का उपयोग उनकी चर भारी और हल्की श्रृंखलाओं के अप्रभावी तह और संयोजन द्वारा बाधित होता है। एंटीबॉडी का प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन एंटीबॉडी इंट्रासेल्युलर अनुप्रयोगों में उपयोग की जाने वाली प्राथमिक विधि है, जो तकनीकी रूप से कोशिकाओं के लिए चुनौतीपूर्ण और तनावपूर्ण है। ऊंट या शार्क-व्युत्पन्न एकल-डोमेन एंटीबॉडी भारी श्रृंखलाओं के अपने परिवर्तनीय डोमेन के माध्यम से एंटीजन को पहचानते हैं। ये छोटे और स्थिर नैनोबॉडी जीवित कोशिकाओं में व्यक्त और क्रियाशील हो सकते हैं। इसलिए, एफपी को लक्षित करने वाले नैनोबॉडी उत्पन्न करने से वे जैविक अनुसंधान में अधिक मूल्यवान हो जाएंगे।

संदर्भ

1. मुइल्डरमैन्स, एस. नैनोबॉडीज़: प्राकृतिक सिंगल-डोमेन एंटीबॉडीज़। अन्नू. रेव बायोकेम। 2013, 82, 775-797। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

2. हेल्मा, जे.; कार्डोसो, एमसी; मुइल्डरमैन्स, एस.; लिओनहार्ट, एच. नैनोबॉडीज़ और कोशिका जीव विज्ञान में पुनः संयोजक बाइंडर्स। जे. सेल बायोल. 2015, 209, 633-644। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

3. अशौर, जे.; श्मिट, एफआई; हैंके, एल.; क्रैग्नोलिनी, जे.; कैवेलरी, एम.; अल्टेनबर्ग, ए.; ब्रेवर, आर.; इनग्राम, जे.; शूमेकर, सी.; इन्फ्लूएंजा वायरस न्यूक्लियोप्रोटीन के लिए विशिष्ट कैमेलिड सिंगल-डोमेन एंटीबॉडीज की प्लॉघ, एचएल इंट्रासेल्युलर अभिव्यक्ति इसके परमाणु स्थानीयकरण की विशिष्ट विशेषताओं को उजागर करती है। जे. विरोल. 2015, 89, 2792-2800। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

4. मांगलिक, ए.; कोबिल्का, बीके; स्टेयार्ट, जे. नैनोबॉडीज़ जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर संरचना और कार्य का अध्ययन करेंगे। अन्नू. रेव. फार्माकोल. टॉक्सिकॉल. 2017, 57, 19-37. [क्रॉसरेफ]

5. हरमन्सा, एस.; हमराटोग्लू, एफ.; एफ़ोल्टर, एम.; कॉसिनस, ई. डीपीपी प्रसार औसत दर्जे के लिए आवश्यक है, लेकिन पार्श्व विंग डिस्क वृद्धि के लिए नहीं। प्रकृति 2015, 527, 317-322। [क्रॉसरेफ]

6. यामागाटा, एम.; सेन्स, जेआर रिपोर्टर-नैनोबॉडी फ़्यूज़न (रैनबॉडीज़) बहुमुखी, छोटे, संवेदनशील इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिकर्मकों के रूप में। प्रोक. नेटल. अकाद. विज्ञान. यूएसए 2018, 115, 2126-2131। [क्रॉसरेफ]

7. एरियोटी, एन.; हॉल, टीई; राय, जे.; फर्ग्यूसन, सी.; मैकमोहन, के.-ए.; मार्टेल, एन.; वेब, आरई; वेब, आरआई; टीसडेल, आरडी; पार्टन, आरजी कोशिकाओं और जीवों में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा तेजी से जांच के लिए जीएफपी-लेबल प्रोटीन का मॉड्यूलर पता लगाना। देव. सेल 2015, 35, 513-525। [क्रॉसरेफ]

8. फ्रुहोल्ज़, एस.; फ़ैस्लर, एफ.; कोलुकिसाओग्लू, Ü.; पिंपल, पी. वीएसआर के नैनोबॉडी-ट्रिगर लॉकडाउन से गोल्गी में लिगैंड पुनः लोड होने का पता चलता है। नेट. कम्यून. 2018, 9, 643. [क्रॉसरेफ]

9. प्रोल, डीएल; टेलर, सीडब्ल्यू इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग को देखने और हेरफेर करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के खिलाफ कार्यात्मक नैनोबॉडी का आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टूलकिट। बीएमसी बायोल. 2019, 17, 41. [क्रॉसरेफ]

10. शिमोमुरा, ओ.; जॉनसन, एफएच; सैगा, वाई. एक्वोरिन का निष्कर्षण, शुद्धिकरण और गुण, ल्यूमिनस हाइड्रोमेडुसन, एक्वोरिया से एक बायोल्यूमिनसेंट प्रोटीन। जे. सेल. कॉम्प. फिजियोल। 1962, 59, 223-239। [क्रॉसरेफ]

11. प्राशर, डी.; मैककैन, आरओ; कॉर्मियर, एमजे क्लोनिंग और एक बायोल्यूमिनसेंट कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन, एक्वारिन के लिए सीडीएनए कोडिंग की अभिव्यक्ति। जैव रसायन। बायोफिज़। रेस. कम्यून. 1985, 126, 1259-1268। [क्रॉसरेफ]

12. हेम, आर.; प्राशर, डीसी; त्सियेन, आरवाई वेवलेंथ म्यूटेशन और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पोस्टट्रांसलेशनल ऑटोऑक्सीडेशन। प्रोक. नेटल. अकाद. विज्ञान. यूएसए 1994, 91, 12501-12504। [क्रॉसरेफ]

13. मैट्ज़, एम.; फ्रैडकोव, एएफ; लाबास, वाईए; सावित्स्की, ए.; ज़ारैस्की, एजी; मार्केलोव, एमएल; लुक्यानोव, एसए नॉनबायोल्यूमिनसेंट एंथोजोआ प्रजाति से फ्लोरोसेंट प्रोटीन। नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 1999, 17, 969-973। [क्रॉसरेफ]

14. पार्क, एन.; सॉन्ग, जे.; जियोंग, एस.; ट्रैन, टीटी; को, एचडब्ल्यू; किम, ईवाई वैक्सीनिया-संबंधित काइनेज 3 (वीआरके3) स्तनधारी कोशिकाओं में क्लॉक प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को प्रभावित करके सर्कैडियन अवधि और आयाम निर्धारित करता है। जैव रसायन। बायोफिज़। रेस. कम्यून. 2017, 487, 320-326। [क्रॉसरेफ]

15. झाओ, डी.; ज़ू, सी.; लिन, एस.; शि, एस.; ली, क्यू.; लियू, एम.; कै, एक्स.; लिन, वाई. नॉच सिग्नलिंग पाथवे 3डी सह-संस्कृति मॉडल में एंडोथेलियल सेल के माध्यम से एंजियोजेनेसिस को नियंत्रित करता है। जे. सेल. फिजियोल। 2016, 232, 1548-1558। [क्रॉसरेफ]

16. रोड्रिग्ज, ईए; कैंपबेल, आरई; लिन, जेवाई; लिन, एमजेड; मियावाकी, ए.; पामर, एई; शू, एक्स.; झांग, जे.; त्सिएन, आरवाई फ्लोरोसेंट और फोटोएक्टिव प्रोटीन का बढ़ता और चमकता टूलबॉक्स। रुझान बायोकेम। विज्ञान. 2017, 42, 111-129। [क्रॉसरेफ]

17. यांग, एफ.; मॉस, एलजी; फिलिप्स, जीएन, जूनियर। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आणविक संरचना। नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 1996, 14, 1246-1251। [क्रॉसरेफ]

18. ओर्मो, एम.; क्यूबिट, एबी; कल्लियो, के.; सकल, एलए; त्सिएन, आरवाई; रेमिंगटन, एक्वोरिया विक्टोरिया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एसजे क्रिस्टल संरचना। विज्ञान 1996, 273, 1392-1395। [क्रॉसरेफ]

19. रीड, बीजी; फ्लिन, जीसी क्रोमोफोर फॉर्मेशन इन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। जैव रसायन 1997, 36, 6786-6791। [क्रॉसरेफ]

20. झांग, जी.; गुर्टू, वी.; केन, एसआर एक उन्नत हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्तनधारी कोशिकाओं में जीन स्थानांतरण का संवेदनशील पता लगाने की अनुमति देता है। जैव रसायन। बायोफिज़। रेस. कम्यून. 1996, 227, 707-711। [क्रॉसरेफ]

21. पेडेलैक, जे.-डी.; कैबेंटस, एस.; ट्रॅन, टी.; टेरविलिगर, टी.; वाल्डो, जीएस इंजीनियरिंग और एक सुपरफोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का लक्षण वर्णन। नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 2006, 24, 79-88. [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

22. क्रैमेरी, ए.; व्हाइटहॉर्न, ईए; टेट, ई.; स्टेमर, डब्ल्यूपी ने डीएनए शफलिंग का उपयोग करके आणविक विकास द्वारा ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन में सुधार किया। नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 1996, 14, 315-319। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

23. मिउरा, एच.; इनोको, एच.; इनौए, मैं.; तनाका, एम.; सातो, एम.; ओहत्सुका, एम. सकारात्मक/नकारात्मक संकेतक के रूप में GFPuv जीन का उपयोग करते हुए सरल क्लोनिंग रणनीति। गुदा. जैव रसायन। 2011, 416, 237-239। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

24. मैना, एमए; ट्रेयनोर, टीपी; मेयो, एसएल; डौघेर्टी, पीएस ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक संरचनात्मक रूप से लक्षित पुस्तकालय से बढ़ी हुई चमक और फोटोस्टेबिलिटी के साथ। नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 2006, 24, 1569-1571। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

25. ऐ, एच.; शैनेर, एन.; चेंग, जेड.; त्सिएन, आरवाई; कैंपबेल, आरई नई क्रोमोफोर संरचनाओं की खोज से बेहतर ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन की पहचान होती है। जैव रसायन 2007, 46, 5904-5910। [क्रॉसरेफ]

26. सुबाच, ओम; गुंडोरोव, आईएस; योशिमुरा, एम.; सुबाच, एफवी; झांग, जे.; ग्रुएनवाल्ड, डी.; सूसलोवा, ईए; चुडाकोव, डीएम; वेरखुशा, वी.वी. लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चमकदार नीली जांच में रूपांतरण। रसायन. बायोल. 2008, 15, 1116-1124। [क्रॉसरेफ]

27. मर्ज़लियाक, ई.; गोएडहार्ट, जे.; शचेरबो, डी.; बुलिना, एमई; शचेग्लोव, एएस; फ्रैडकोव, एएफ; गेनत्ज़ेवा, ए.; लुक्यानोव, के.; लुक्यानोव, एस.; गैडेला, टी.; और अन्य। विस्तारित प्रतिदीप्ति जीवनकाल के साथ चमकीला मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन। नेट. विधियाँ 2007, 4, 555-557। [क्रॉसरेफ]

28. क्यूबिट, एबी; हेम, आर.; एडम्स, एसआर; बॉयड, एई; सकल, एलए; त्सिएन, आरवाई हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को समझना, सुधारना और उपयोग करना। रुझान बायोकेम। विज्ञान. 1995, 20, 448-455। [क्रॉसरेफ]

29. टोमोसुगी, डब्ल्यू.; मात्सुदा, टी.; तानी, टी.; नेमोटो, टी.; कोटेरा, आई.; सैटो, के.; होरिकावा, के.; नागाई, टी. एक अल्ट्रामरीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जिसमें बढ़ी हुई फोटोस्टेबिलिटी और पीएच असंवेदनशीलता है। नेट. विधियाँ 2009, 6, 351-353। [क्रॉसरेफ]

30. गोएडहार्ट, जे.; वैन वीरेन, एल.; हिंक, एमए; विचर, एनओई; जालिंक, के.; गैडेला, टीडब्ल्यूजे ब्राइट सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट की पहचान फ्लोरोसेंस लाइफटाइम स्क्रीनिंग द्वारा की गई। नेट. विधियाँ 2010, 7, 137-139। [क्रॉसरेफ]

31. दिन, आरएन; डेविडसन, मेगावाट फ्लोरोसेंट प्रोटीन पैलेट: सेलुलर इमेजिंग के लिए उपकरण। रसायन. समाज. रेव. 2009, 38, 2887-2921। [क्रॉसरेफ]

32. ग्रिस्बेक, ओ.; बेयर्ड, जीएस; कैंपबेल, आरई; जकारियास, डीए; त्सिएन, आरवाई पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की पर्यावरणीय संवेदनशीलता को कम करना। जे. बायोल. रसायन. 2001, 276, 29188-29194। [क्रॉसरेफ]

33. नागाई, टी.; इबाता, के.; पार्क, ईएस; कुबोटा, एम.; मिकोशिबा, के.; मियावाकी, ए. कोशिका-जैविक अनुप्रयोगों के लिए तेज़ और कुशल परिपक्वता के साथ पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक प्रकार। नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 2002, 20, 87-90। [क्रॉसरेफ]

34. शैनेर, एनसी; कैंपबेल, आरई; स्टीनबैक, पीए; गिपमैन्स, बीएन; पामर, एई; त्सिएन, आरवाई डिस्कोसोमा एसपी से प्राप्त बेहतर मोनोमेरिक लाल, नारंगी और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन। लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन. नेट. जैव प्रौद्योगिकी। 2004, 22, 1567-1572। [क्रॉसरेफ]

35. शचेरबो, डी.; मर्ज़लियाक, ईएम; चेपर्निख, टीवी; फ्रैडकोव, एएफ; एर्मकोवा, जीवी; सोलोविएवा, ईए; लुक्यानोव, केए; बोगदानोवा, ईए; ज़ारैस्की, एजी; लुक्यानोव, एस.; और अन्य। पूरे शरीर की इमेजिंग के लिए चमकीला दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन। नेट. विधियाँ 2007, 4, 741-746। [क्रॉसरेफ]

36. शचेरबो, डी.; मर्फी, सीएस; एर्मकोवा, जीवी; सोलोविएवा, ईए; चेपर्निख, टीवी; शचेग्लोव, एएस; वेरखुशा, वी.; पलेटनेव, वीजेड; हेज़लवुड, केएल; रोश, पीएम; और अन्य। जीवित ऊतकों में प्रोटीन इमेजिंग के लिए दूर-लाल फ्लोरोसेंट टैग। जैव रसायन। जे. 2009, 418, 567-574। [क्रॉसरेफ]

37. ओलिनिक, ओएस; चेर्नोव, केजी; वेरखुशा, वीवी बैक्टीरियल फाइटोक्रोमेस, सायनोबैक्टीरियोक्रोमेस और एलोफाइकोसायनिन निकट-इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट जांच के स्रोत के रूप में। इंट. जे. मोल. विज्ञान. 2017, 18, 1691. [क्रॉसरेफ]

38. शू, एक्स.; रोयंट, ए.; लिन, एमजेड; एगुइलेरा, टीए; लेव-राम, वी.; स्टीनबैक, पीए; त्सिएन, आरवाई एक बैक्टीरियल फाइटोक्रोम से इंजीनियर किए गए इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्तनधारी अभिव्यक्ति। विज्ञान 2009, 324, 804-807। [क्रॉसरेफ]

39. यू, डी.; गुस्ताफसन, डब्ल्यूसी; हान, सी.; लाफये, सी.; नोइरक्लर्क-सावॉय, एम.; जीई, डब्ल्यू.-पी.; थायर, डीए; हुआंग, एच.; कोर्नबर्ग, टीबी; रोयंट, ए.; और अन्य। न्यूरोनल और ट्यूमर मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक बेहतर मोनोमेरिक इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन। नेट. कम्यून. 2014, 5, 3626. [क्रॉसरेफ]

40. यू, डी.; बेयर्ड, एमए; एलन, जेआर; होवे, ईएस; क्लासेन, एमपी; रीडे, ए.; मखीजानी, के.; गीत, वाई.; लियू, एस.; मूर्ति, जेड.; और अन्य। विवो में प्रोटीन लेबलिंग के लिए एक प्राकृतिक मोनोमेरिक इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन। नेट. विधियाँ 2015, 12, 763-765। [क्रॉसरेफ]

41. शचरबकोवा, डीएम; बलबन, एम.; एमिलीनोव, एवी; ब्रेनोविट्ज़, एम.; गुओ, पी.; मल्टीस्केल इमेजिंग के लिए टैग और बायोसेंसर के रूप में वेरखुशा, वीवी ब्राइट मोनोमेरिक निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन। नेट. कम्यून. 2016, 7, 12405। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

42. रोड्रिग्ज, ईए; ट्रान, जीएन; सकल, एलए; क्रिस्प, जेएल; शू, एक्स.; लिन, जेवाई; त्सिएन, आरवाई एक सुदूर लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक सायनोबैक्टीरियल फ़ाइकोबिलिप्रोटीन से विकसित हुआ। नेट. विधियाँ 2016, 13, 763-769। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

43. ओलिनिक, ओएस; शेमेतोव, एए; पलेटनेव, एस.; शचरबकोवा, डीएम; वेरखुशा, वीवी सबसे छोटा निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन वर्णक्रमीय मल्टीप्लेक्सिंग के लिए एक बहुमुखी टैग के रूप में साइनोबैक्टीरियोक्रोम से विकसित हुआ। नेट. कम्यून. 2019, 10, 279. [क्रॉसरेफ]

44. ओलिनिक, ओएस; बलबन, एम.; क्लार्क, सीएल; कैरी, ई.; पलेटनेव, एस.; निम्मरजहाँ, ए.; वेरखुशा, वीवी सिंगल-डोमेन निकट-अवरक्त प्रोटीन एंटीजन-निर्भर फ्लोरोसेंट नैनोबॉडी के लिए एक मचान प्रदान करता है। नेट. विधियाँ 2022, 19, 740-750। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

45. टिलर, केई; टेसियर, पीएम एंटीबॉडी डिज़ाइन में आगे बढ़े। अन्नू. रेव बायोमेड। इंजी. 2015, 17, 191-216। [क्रॉसरेफ]

46. ​​गेंग्यो-एंडो, के.; मितानी, एस. 1020 हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन और लक्षण वर्णन। तंत्रिका विज्ञान. रेस. 1997, 28, एस122. [क्रॉसरेफ]

47. ज़ुआंग, आर.; झांग, वाई.; झांग, आर.; गीत, सी.; यांग, के.; यांग, ए.; जिन, बी. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-युग्मित आत्मीयता स्तंभ क्रोमैटोग्राफी द्वारा उच्च शुद्धता और उपज के साथ जीएफपी संलयन प्रोटीन की शुद्धि। प्रोटीन एक्सप्र. शुद्धि. 2008, 59, 138-143। [क्रॉसरेफ]

48. वार्ड, ईएस; गुस्सो, डी.; ग्रिफ़िथ्स, एडी; जोन्स, पीटी; विंटर, जी. एस्चेरिचिया कोलाई से स्रावित एकल इम्युनोग्लोबुलिन चर डोमेन के प्रदर्शनों की सूची की बाइंडिंग गतिविधियाँ। प्रकृति 1989, 341, 544-546। [क्रॉसरेफ]

49. हैमर्स-कास्टरमैन, सी.; अतरहौच, टी.; मुइल्डरमैन्स, एस.; रॉबिन्सन, जी.; हैमर, सी.; सोंगा, ईबी; बेंडाहमान, एन.; हैमर्स, आर. प्रकाश श्रृंखलाओं से रहित प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले एंटीबॉडीज। प्रकृति 1993, 363, 446-448। [क्रॉसरेफ]

50. ग्रीनबर्ग, एएस; अविला, डी.; ह्यूजेस, एम.; ह्यूजेस, ए.; मैककिनी, ईसी; फ्लैजनिक, एमएफ एक नया एंटीजन रिसेप्टर जीन परिवार जो शार्क में पुनर्व्यवस्था और व्यापक दैहिक विविधीकरण से गुजरता है। नेट. सेल बायोल. 1995, 374, 168-173। [क्रॉसरेफ]

51. डी मेयर, टी.; मुइल्डरमैन्स, एस.; डिपिकर, ए. अनुसंधान और निदान उपकरण के रूप में नैनोबॉडी-आधारित उत्पाद। ट्रेंड्स बायोटेक्नॉल। 2014, 32, 263-270। [क्रॉसरेफ]

52. स्केरा, ए. आणविक पहचान के लिए वैकल्पिक गैर-एंटीबॉडी मचान। कर्र. राय. जैव प्रौद्योगिकी। 2007, 18, 295-304। [क्रॉसरेफ]

53. मुइल्डरमैन्स, एस.; बराल, टी.; रेटामोज़ो, वीसी; डी बेत्सेलियर, पी.; डी जेनस्ट, ई.; किन्ने, जे.; लियोनहार्ट, एच.; मागेज़, एस.; गुयेन, वी.; रेवेट्स, एच.; और अन्य। कैमलिड इम्युनोग्लोबुलिन और नैनोबॉडी प्रौद्योगिकी। पशुचिकित्सक. इम्यूनोल. इम्यूनोपैथोल। 2009, 128, 178-183। [क्रॉसरेफ]

54. रोथबाउर, यू.; ज़ोलघद्र, के.; टिलिब, एस.; नोवाक, डी.; शेर्मेलेह, एल.; गहल, ए.; बैकमैन, एन.; कॉनराथ, के.; मुइल्डरमैन्स, एस.; कार्डोसो, एमसी; और अन्य। फ्लोरोसेंट नैनोबॉडी के साथ जीवित कोशिकाओं में एंटीजन को लक्षित करना और उनका पता लगाना। नेट. विधियाँ 2006, 3, 887-889। [क्रॉसरेफ]

55. कुबाला, एमएच; कोवतुन, ओ.; अलेक्जेंड्रोव, के.; कोलिन्स, बीएम जीएफपी का संरचनात्मक और थर्मोडायनामिक विश्लेषण: जीएफपी-नैनोबॉडी कॉम्प्लेक्स। प्रोटीन विज्ञान. 2010, 19, 2389-2401। [क्रॉसरेफ]

56. फैंग, जेड.; काओ, डी.; किउ, जे. विशेष रूप से हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन के विरुद्ध नैनोबॉडी का विकास और उत्पादन। आवेदन. माइक्रोबायोल. जैव प्रौद्योगिकी। 2020, 104, 4837-4848। [क्रॉसरेफ]

57. किर्चहोफ़र, ए.; हेल्मा, जे.; श्मिटथल्स, के.; फ्राउअर, सी.; कुई, एस.; करचर, ए.; पेलिस, एम.; मुइल्डरमैन्स, एस.; कैसस-डेलुची, सीएस; कार्डोसो, एमसी; और अन्य। नैनोबॉडी का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन गुणों का मॉड्यूलेशन। नेट. संरचना. मोल. बायोल. 2009, 17, 133-138. [क्रॉसरेफ]

58. रोथबाउर, यू.; ज़ोलघद्र, के.; मुइल्डरमैन्स, एस.; शेपर्स, ए.; कार्डोसो, एमसी; लियोनहार्ट, एच. फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के साथ जैव रासायनिक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक बहुमुखी नैनोट्रैप। मोल. कक्ष। प्रोटीन. 2008, 7, 282-289। [क्रॉसरेफ]

59. फ्रिडी, पी.; ली, वाई.; कीगन, एस.; थॉम्पसन, एमके; न्यूडेलमैन, आई.; स्कीड, जेएफ; ओफिंगर, एम.; नुसेन्ज़विग, एमसी; फेन्यो, डी.; चैत, बीटी; और अन्य। बहुमुखी नैनोबॉडी प्रदर्शनों की सूची के तेजी से उत्पादन के लिए एक मजबूत पाइपलाइन। नेट. विधियाँ 2014, 11, 1253-1260। [क्रॉसरेफ]

60. झांग, जेड.; वांग, वाई.; डिंग, वाई.; हत्तोरी, एम. शुद्धि के लिए अल्ट्रा-हाई-एफ़िनिटी अभिकर्मकों के रूप में एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी टेंडेम की संरचना-आधारित इंजीनियरिंग। विज्ञान. प्रतिनिधि 2020, 10, 6239। [क्रॉसरेफ]

61. ट्वेयर, ए.; अल-ओक्ला, एस.; जरकावी, एम.; एबडी, सुपरफ़ोल्डर जीएफपी संलयन प्रोटीन के लिए विशिष्ट ऊंट नैनोबॉडी की एक्यू विशेषता। मोल. बायोल. प्रतिनिधि 2014, 41, 6887-6898। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

62. झोंग, पी.; वांग, जेड.; चेंग, एस.; झांग, वाई.; जियांग, एच.; लियू, आर.; डिंग, वाई. हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक ही एपिटोप को पहचानने वाले दो अलग-अलग नैनोबॉडी में संरचनात्मक अंतर्दृष्टि। जैव रसायन। बायोफिज़। रेस. कम्यून. 2021, 565, 57-63। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

63. झोउ, एक्स.; हाओ, आर.; चेन, सी.; सु, ज़ेड.; झाओ, एल.; लुओ, जेड.; ज़ी, डब्लू. इन विट्रो-ट्रांसक्राइब्ड एमआरएनए के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में नैनोबॉडी/वीएचएच की तीव्र डिलीवरी। मोल. वहाँ.-तरीके क्लिनिक. देव. 2020, 17, 401-408। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

64. वेई, एल.; वांग, एम.; जियांग, एच.; जियांग, वाई.; गोंग, जे.; सु, डी.; अल आज़ाद, मार्च; डोंग, एच.; फेंग, एल.; वू, जे.; और अन्य। एकल डोमेन एंटीबॉडी उत्पादन के लिए एक छोटे पशु मॉडल के रूप में बांस शार्क। सामने। बायोएंग. जैव प्रौद्योगिकी। 2021, 9, 792111। [क्रॉसरेफ]

65. ली, एस.; शान, एच.; वांग, टी.; झेंग, एक्स.; शि, एम.; चेन, बी.; लू, एच.; झांग, वाई.; झाओ, एस.; हुआ, जेड. एमवसाबी फ्लोरोसेंट प्रोटीन-बाइंडिंग नैनोबॉडी की पीढ़ी। गुदा. जैव रसायन। 2020, 608, 113875। [क्रॉसरेफ]

66. रीस, जे.; कपलान, सी.; प्लैटोनोवा, ई.; एघ्लिडी, एचएम; इवर्स, एच. नैनोबॉडीज़ के माध्यम से जीएफपी-आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए एक सरल, बहुमुखी विधि। नेट. विधियाँ 2012, 9, 582-584। [क्रॉसरेफ]

67. बेघिन, ई.; गेटमैन्स, जे. नैनोबॉडी टेक्नोलॉजी: माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन एनालिसिस और प्रोटीन फंक्शन एक्सप्लोरेशन के लिए एक बहुमुखी टूलकिट। सामने। इम्यूनोल. 2017, 8, 771. [क्रॉसरेफ]

68. प्लैटोनोवा, ई.; विंटरफ़्लूड, सीएम; जुनेमैन, ए.; अल्ब्रेक्ट, डी.; फैक्स, जे.; ईवर्स, एच. नैनोबॉडी बाइंडर्स का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं में जीएफपी या आरएफपी डेरिवेटिव के साथ टैग किए गए अणुओं की एकल-अणु माइक्रोस्कोपी। विधियाँ 2015, 88, 89-97। [क्रॉसरेफ]

69. हर्से, एचडी; शूमाकर, डी.; श्नाइडर, एएफ; लुडविग, एके; मान, एफए; फ़िलीज़, एम.; कैस्पर, एम.-ए.; रिंकी, एस.; क्रॉस, ई.; लियोनहार्ट, एच.; और अन्य। जीवित कोशिकाओं में लक्षित इम्यूनोलैबलिंग और एंटीजन हेरफेर के लिए सेल-पारगम्य नैनोबॉडी। नेट. रसायन. 2017, 9, 762-771। [क्रॉसरेफ]

70. पायने, एनसी; माज़ित्शेक, आर. टाइनी टाइटन्स: टीआर-एफआरईटी परख विकास के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में नैनोबॉडीज़। गुदा. सेंसर 2022, 2, e202200020। [क्रॉसरेफ]

71. वेंडेल, एस.; फिशर, ईसी; मार्टिनेज, वी.; सेप्पला, एस.; नॉरहोम, एमएचएच एक नैनोबॉडी: जीएफपी बैक्टीरियल प्लेटफॉर्म जो कार्यात्मक एंजाइम डिस्प्ले और डिस्प्ले क्षमता की आसान मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है। सूक्ष्म जीव। सेल फ़ैक्टरियाँ 2016, 15, 71। [क्रॉसरेफ]

72. सेट्ज़, केजे; रिज़ोली, एसओ जीएफपी नैनोबॉडीज़ हाल ही में एक्सोसाइटोज़ किए गए पीएचलुओरिन अणुओं को प्रकट करते हैं। विज्ञान. प्रतिनिधि 2019, 9, 7773। [क्रॉसरेफ]

73. कॉसिनस, ई.; कांका, ओ.; एफ़ोल्टर, एम. फ्लोरोसेंट फ़्यूज़न प्रोटीन नॉकआउट, एंटी-जीएफपी नैनोबॉडी द्वारा मध्यस्थता। नेट. संरचना. मोल. बायोल. 2011, 19, 117-121. [क्रॉसरेफ]

74. शिन, वाईजे; पार्क, एसके; जंग, वाईजे; ना किम, वाई.; किम, केएस; पार्क, ठीक है; क्वोन, एस.-एच.; जियोन, एसएच; त्रिन्ह, एलए; फ़्रेज़र, एस.; और अन्य। नैनोबॉडी-लक्षित E3-ubiquitin ligase कॉम्प्लेक्स परमाणु प्रोटीन को क्षीण करता है। विज्ञान. प्रतिनिधि 2015, 5, 14269। [क्रॉसरेफ]

75. बॉडिश, बी.; पफोर्ट, आई.; सोरगे, ई.; कॉनराड, यू. पौधों में 26एस-प्रोटियासोम द्वारा नैनोबॉडी-निर्देशित प्रोटीन का विशिष्ट क्षरण। सामने। पादप विज्ञान. 2018, 9, 130. [क्रॉसरेफ]

76. क्राउचर, डीआर; इकोनोमो, एम.; हेस्टिंग्स, जेएफ; कैनेडी, एसपी; हान, जेजेडआर; शियरर, आरएफ; मैककेना, जे.; वान, ए.; लाउ, जे.; अपारिसियो, एस.; और अन्य। द्विआणविक पूरकता आत्मीयता शुद्धि (बीआईसीएपी) ईआरबीबी2 डिमर के लिए डिमर-विशिष्ट प्रोटीन इंटरैक्शन का खुलासा करता है। विज्ञान. संकेत. 2016, 9, 436. [क्रॉसरेफ]

77. तांग, जे.सी.; स्ज़िक्रा, टी.; कोज़ोरोवित्स्की, वाई.; टेक्सेरा, एम.; सबातिनी, बीएल; रोस्का, बी.; सेप्को, सीएल एक नैनोबॉडी-आधारित प्रणाली है जो सेल-विशिष्ट जीन हेरफेर के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन को मचान के रूप में उपयोग करती है। सेल 2013, 154, 928-939। [क्रॉसरेफ]

78. सोम्मेस, आरएफ; हरियादी, आरएफ; किम, के.; लियू, एम.; टिस्का, एमजे; शिवरामकृष्णन, एस. जीएफपी नैनोबॉडी का उपयोग करके डीएनए नैनोस्ट्रक्चर पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का पैटर्न तैयार करना। प्रोटीन विज्ञान. 2016, 25, 2089-2094। [क्रॉसरेफ]