हर्बल पदार्थ Acteoside ट्यूमर कोशिकाओं और इसके यांत्रिक अंतर्दृष्टि के खिलाफ की चयनात्मक cytotoxicity
Mar 14, 2022
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क्रिस्टीना Cheimonidi एट अल
सारांश
प्राकृतिक उत्पादों को चरम संरचनात्मक विविधता की विशेषता है और इस प्रकार वे उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों की पहचान के लिए एक अद्वितीय स्रोत प्रदान करते हैं। यहाँ, हम रिपोर्ट करते हैं कि हर्बल पदार्थऐक्टियोसाइडLippia citriodora पत्तियों से उन्नत phytochemical तरीकों से अलग किया जा रहा मेटास्टैटिक ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ बढ़ी हुई cytotoxicity दिखाया; विभिन्न साइटोटॉक्सिक एजेंटों और संवेदनशील chemoresistant कैंसर कोशिकाओं के साथ तालमेल में काम किया.Acteosideशारीरिक सेलुलर संदर्भों में विषाक्त नहीं था, जबकि यह ऑक्सीडेटिव लोड में वृद्धि हुई, प्रोटियोस्टैटिक मॉड्यूल की गतिविधि को प्रभावित किया, और ट्यूमर सेल लाइनों में मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनेज को दबा दिया। इंट्रापेरिटोनियल या मौखिक (पीने के पानी के माध्यम से) एक मेलेनोमा माउस मॉडल में acteoside के प्रशासन ट्यूमर में antioxidant प्रतिक्रियाओं upregulated; फिर भी, केवल intraperitoneal प्रसव ट्यूमर के विकास को दबा दिया और विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया। मास-स्पेक्ट्रोमेट्री पहचान / मात्रा विश्लेषण से पता चला है कि इंट्रापेरिटोनियल डिलीवरीऐक्टियोसाइडइसके परिणामस्वरूप काफी अधिक, बनाम मौखिक प्रशासन, प्लाज्मा और इलाज किए गए चूहों के ट्यूमर में यौगिक की एकाग्रता, यह सुझाव देते हुए कि इसका विवो एंटी-ट्यूमर प्रभाव प्रशासन के मार्ग और ट्यूमर में प्राप्त एकाग्रता पर निर्भर करता है। अंत में, आणविक मॉडलिंग अध्ययन और एंजाइमेटिक गतिविधि assays से पता चला है किऐक्टियोसाइडप्रोटीन किनेज सी को रोकता है निर्णायक रूप से, acteoside उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों के विकास के लिए एक रासायनिक पाड़ के रूप में वादा करता है।
खोजशब्दों:Acteoside, कैंसर, प्राकृतिक यौगिक, ऑक्सीडेटिव तनाव, प्रोटियोस्टैसिस, इम्युनोमॉड्यूलेशन
1. परिचय
कार्सिनोजेनेसिस को कई सेल सिग्नलिंग मार्गों के विनियमन की विशेषता है और यह सेलुलर ऑक्सीडेटिव, प्रतिकृति, चयापचय, जीनोटॉक्सिक और प्रोटिओटॉक्सिक तनाव [1] में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है। इन तनाव फेनोटाइप्स को अनुकूलित करने और दूर करने के लिए, घातक कोशिकाएं (ऑन्कोजीन के अलावा) कई गैर-ऑन्कोजेनिक मार्गों को या तो दबाने या (कम से कम) चल रहे तनाव को कम करने का लक्ष्य रखती हैं। विभिन्न गैर-ऑन्कोजेनिक मार्गों में से एक को अक्सर अपरेगुलेटेड पाया जाता है, जो सेलुलर एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ प्रोटियोस्टैसिस नेटवर्क (पीएन) के मॉड्यूल हैं [2,3]।
पीएन के प्रमुख घटक दो मुख्य गिरावट मशीनरी हैं, अर्थात् ऑटोफैगी- लाइसोसोम पाथवे (एएलपी) और यूबिकिटिन-एंटिओमेट पाथवे (यूपीपी), सेलुलर आणविक चैपरोन के नेटवर्क के साथ। एएलपी मुख्य रूप से प्रोटीन समुच्चय और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल [4] के क्षरण में शामिल है, जबकि यूपीपी सामान्य अल्पकालिक प्रोटीन और गैर-मरम्मत योग्य मिसफोल्ड या खुले प्रोटीन [5-8] को नीचा दिखाता है। 26 Seukaryotic antibody का गठन 19S नियामक कणों (RP) और 20 स्कोर कण (CP) से किया जाता है; उत्तरार्द्ध में चार स्टैक्ड हेप्टामेरिक छल्ले (α-प्रकार के दो β-प्रकार के आसपास के दो) शामिल हैं जो एक बैरल जैसी संरचना बनाते हैं। काइमोट्रिप्सिन-जैसे (सीटी-एल), ट्रिप्सिन-जैसे (टी-एल), और एपोप्टोज़-जैसे (सी-एल) की गतिविधियों को क्रमशः 5, π2, और π1 प्रोटीओसोमल सबयूनिट्स पर स्थित किया जाता है। विभिन्न हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं के खिलाफ एंटीऑक्सीबिटर बोर्टेजोमिब (वेल्केड®; जिसे पीएस -341 भी कहा जाता है) और कार्फिफिलज़ोमिब की नैदानिक प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया गया है[9] ने कैंसर के उपचार के लिए एक आशाजनक रणनीति के रूप में यूपीपी को लक्षित करने के "प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट" प्रदान किया है। सेलुलर एंटीऑक्सिडेंट रक्षा मार्गों का जटिल नेटवर्क जो अक्सर कार्सिनोजेनेसिस के दौरान अपरेगुलेटेड होता है [3,10] में एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम शामिल हैं, साथ ही साथ कई प्रतिलेखन कारक भी शामिल हैं जो साइटोप्रोटेक्टिव जीनोमिक प्रतिक्रियाओं को जुटाते हैं; इनमें फोर्कहेड बॉक्स ओ (फॉक्सो) और परमाणु कारक 2-संबंधित कारक (एनआरएफ -2) शामिल हैं। एनआरएफ -2 ऑक्सीडेटिव और / या ज़ेनोबायोटिक क्षति के खिलाफ कोशिकाओं की सुरक्षा में केंद्रीय है क्योंकि यह एंटीऑक्सिडेंट और चरण II जीन [11-13] की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है।
हमने और अन्य लोगों ने हाल ही में प्रस्तावित किया है कि इन ट्यूमर निर्भरताओं (यानी, प्रोटियोस्टेटिक मॉड्यूल और / या एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया मार्गों) को लक्षित करना या एक परिवर्तित जीनोटाइप के संदर्भ में आरओएस के सेलुलर स्तर में वृद्धि ट्यूमर कोशिकाओं की चयनात्मक हत्या के लिए एक संभावित चिकित्सीय खिड़की प्रदान करती है [3,14]; समर्थन में, एक छोटे अणु द्वारा कैंसर कोशिकाओं की चयनात्मक हत्या जो सेलुलर आरओएस के स्तर को नियंत्रित करती है, की सूचना दी गई है [2]। यह उम्मीद की जाती है कि एंटी-ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के सक्रियण सहित संयुक्त दृष्टिकोण [15] संभवतः पीएन और एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रियाओं को बाधित करके और / या सेलुलर आरओएस स्तरों को बढ़ाकर पेश की जाने वाली चिकित्सीय खिड़की को अधिकतम करेगा।
विभिन्न स्रोतों (पौधों, समुद्री जीवों, सूक्ष्मजीवों, आदि) से प्राकृतिक उत्पादों (अर्क या शुद्ध यौगिक) (एनपी) को उनकी चरम संरचनात्मक विविधता और रासायनिक जटिलता के कारण एंटी-ट्यूमर एजेंटों के रूप में कार्य करने की उनकी क्षमता के लिए जांच की जाती है, साथ ही साथ क्योंकि वे कई सेलुलर सिग्नलिंग मार्गों को संशोधित करने के लिए कार्य करते हैं । कथित तौर पर, एनपी एंटी-इंफ्फ्लफ्लेमेटरी, एंटी-ट्यूमर और / या एंटी-मेटास्टैटिक प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करते हैं [16,17] और मल्टीड्रग प्रतिरोध [18,19] से भी बचते हैं। इनमें से, फेनोलिक यौगिकों (फेनिलथेनोइड ग्लाइकोसाइड्स सहित) ने विभिन्न मानव रोगों की रोकथाम और / या उपचार में उनकी रिपोर्ट की गई भूमिका के कारण महत्वपूर्ण रुचि को आकर्षित किया है।
Acteoside, जिसे उपयोग या verbascoside [20] भी कहा जाता है, एक फेनिलएथेनोइड ग्लाइकोसाइड है जो कई डाइकोटिलेडोन से अलग है। कथित तौर पर, acteoside एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ, और सेल एपोप्टोसिस विनियमन गुणों सहित कुछ दिलचस्प जैविक गतिविधियों को लागू करता है [21,22]. फिर भी, इसकी संभावित एंटी-ट्यूमर गतिविधि को संबोधित नहीं किया गया है। हम यहां रिपोर्ट करते हैं, कि एक्टियोसाइड ने स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ साइटोटॉक्सिसिटी में वृद्धि दिखाई, जिसमें शारीरिक सेलुलर संदर्भों में कोई स्पष्ट विषाक्त प्रभाव नहीं था। इसके अलावा, acteoside विवो माउस मॉडल में मेलेनोमा ट्यूमर के विकास को दबा दिया, (दूसरों के बीच) विरोधी ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करके।
2. सामग्री और तरीके
2.1. संयंत्र सामग्री और निष्कर्षण
सूखे Lippia citriodora (Lamiaceae) पत्तियों (4.5 किलो) एथेंस, ग्रीस में स्थानीय बाजार से खरीदा गया था। पत्तियों pulverized थे और मेथनॉल (2 × 20 एल) के साथ 12 ज के लिए यांत्रिक सरगर्मी द्वारा निकाला गया था। मेथनॉलिक अर्क को सूखापन के लिए वाष्पित किया गया था और CH2Cl2 / MeOH 98/2 (15 एल) के मिश्रण के साथ धोया गया था। अघुलनशील अवशेषों को अलग और सुखाया गया था, जिससे एक हरे-पीले पाउडर (450 ग्राम) का उत्पादन हुआ।
2.2. acteoside और UPLC-HRMS विश्लेषण का शुद्धिकरण
उपर्युक्त अवशेषों का एक हिस्सा (10 ग्राम) एक तेज केन्द्रापसारक विभाजन क्रोमैटोग्राफी (एफसीपीसी) उपकरण (क्रोमेटन, फ्रांस) का उपयोग करके काउंटरकरंट क्रोमैटोग्राफी के अधीन था; 5/0.5/4.5 के अनुपात में EtOAc/EtOH/H2O के मिश्रण का उपयोग बिफैसिक विलायक प्रणाली के रूप में किया गया था। एकत्र किए गए अंशों को पतली परत क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया था; फिर क्रोमैटोग्राम को एक यूवी लैंप (254 और 365 एनएम) के नीचे देखा गया था और मेथनॉल वैनिलिन सल्फेट के साथ छिड़काव करके कल्पना की गई थी, जिसके बाद दो मिनट के लिए हीटिंग की गई थी। उपर्युक्त प्रक्रिया द्वारा कुल 2.1 ग्राम एक्टिओसाइड (शुद्धता ≥ 90%) को अलग किया गया था। एक्टियोसाइड की पहचान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) स्पेक्ट्रा द्वारा की गई थी, जबकि इसकी शुद्धता यूपीएलसी-एमएस और एनएमआर विश्लेषण द्वारा स्थापित की गई थी; विवरण के लिए देखें Supple. सामग्री और विधियाँ.
2.3. सेल लाइनें
बी 16 के साथ मानव फेफड़े के भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (आईएमआर 90 कोशिकाएं)। F1, B16. F10, YAC-1, और WEHI-164 माउस सेल लाइनों को अमेरिकी ऊतक संस्कृति संग्रह (ATCC) से प्राप्त किया गया था। U2 OS और Sa OS मानव osteosarcoma सेल लाइनों को कृपया प्रोफेसर वी. गोर्गोउलिस (स्कूल ऑफ मेडिसिन, नेशनल एंड कापोडिस्ट्रियन यूनिवर्सिटी ऑफ एथेंस, ग्रीस) द्वारा दान किया गया था, जबकि केएच ओएस ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं और चेमोरिस्टेंट ऑस्टियोसारकोमा सेल लाइनों [23] डॉ ई गोनोस (नेशनल हेलेनिक रिसर्च फाउंडेशन, ग्रीस) का दान थे। माउस कैंसर सेल लाइनों C5N और A5 एक multistage माउस त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल [24,25] से संबंधित हैं और प्रोफेसर ए Balmain (व्यापक कैंसर केंद्र, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा दान किए गए थे। प्रयुक्त सेल लाइनों की कृषि स्थितियों को कोमल में सूचित किया गया है। सामग्री और विधियाँ।
का लाभसिस्टेंश ऐक्टिओसाइड
2.4. मेलेनोमा माउस मॉडल पुरुष
C57BL / 6 चूहों (वजन के 25-30 ग्राम, 6-8 सप्ताह की उम्र) हेलेनिक पाश्चर इंस्टीट्यूट से प्राप्त किए गए थे और पानी और भोजन तक मुफ्त पहुंच के साथ नियंत्रित तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) और फोटोपीरियड (12 एच प्रकाश: 12 घंटे अंधेरे) के तहत रखे गए थे। चूहों को चमड़े के नीचे 105 बी 16 के साथ संक्रमित किया गया था। F1 मेलेनोमा कोशिकाओं (100 μL PBS में) और बेतरतीब ढंग से 3 समूहों (n = 5 / समूह) को सौंपा गया था। जब ट्यूमर स्पष्ट हो गया (दिन 11) चूहों को दो मार्गों के माध्यम से एक्टियोसाइड प्राप्त हुआ; या तो इंट्रापेरिटोनियल रूप से (आईपी) (200 μL पीबीएस में पतला 1 मिलीग्राम / माउस; हर दूसरे दिन प्रशासित कुल 6 खुराक में) या मौखिक रूप से पीने के पानी (या) (2.5 मिलीग्राम / माउस; लगातार 13 दिनों के लिए कुल 13 खुराक में) द्वारा। नियंत्रण चूहों को पीबीएस प्रशासित किया गया था। एक डिजिटल कैलिपर के साथ गठित ट्यूमर के प्रमुख और मामूली कुल्हाड़ियों को मापकर ट्यूमर की वृद्धि हर 2 दिनों में दर्ज की गई थी। सूत्र का उपयोग करके माप को ट्यूमर की मात्रा में बदल दिया गया था: ट्यूमर की मात्रा (सेमी 3) = प्रमुख अक्ष × मामूली अक्ष 2 × 0.5। 28 वें दिन, जानवरों को गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा euthanized किया गया था, और प्लीहा को aseptically हटा दिया गया था। प्रयोग को समान निष्कर्षों के साथ तीन बार दोहराया गया था।
स्प्लेनोसाइट्स को व्यक्तिगत रूप से homogenized तिल्ली से अलग किया गया था और तुरंत उनकी साइटोटॉक्सिसिटी बनाम B16 के लिए परीक्षण किया गया था। F1, YAC-1, और WEHI-164 सेल लक्ष्य। साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन सेल सतह पर CD107 एक्सपोज़र का पता लगाने के आधार पर किया गया था, जो प्रभावक सेल डिग्रेनुलेशन के परिणामस्वरूप था। स्प्लेनोसाइट्स (105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को 96-अच्छी तरह से यू बॉटम माइक्रोप्लेट्स में लक्ष्य के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था, जो 100: 1 के प्रभावक (ई: टी) अनुपात को लक्षित करने के लिए, 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर था। FITC-संयुग्मित एंटी-CD107a और एंटी-CD107b मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (25 μL / mL) और मोनेसिन (6 μL / mL; सभी बीडी बायोसाइंसेज से) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था। कोशिकाओं को 6 घंटे बाद काटा गया और एक FACSCanto II प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। समानांतर में, ट्यूमर को नीचे की ओर assays के लिए उत्पादित और संसाधित किया गया था जैसा कि Supple. Materials and Methods में वर्णित है।
सिस्टेंश ऐक्टिओसाइड
