हर्बल पदार्थ एक्टोसाइड ट्यूमर कोशिकाओं को कैसे रोकता है?

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सार

प्राकृतिक उत्पादों को अत्यधिक संरचनात्मक विविधता की विशेषता है और इस प्रकार वे उपन्यास एंटी-ट्यूमर एजेंटों की पहचान के लिए एक अनूठा स्रोत प्रदान करते हैं। यहां, हम रिपोर्ट करते हैं कि हर्बल पदार्थएक्टोसाइडLippia citriodora के पत्तों से उन्नत फाइटोकेमिकल विधियों द्वारा पृथक किए जाने से मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ बढ़ी हुई साइटोटोक्सिसिटी दिखाई देती है; विभिन्न साइटोटोक्सिक एजेंटों और संवेदनशील रसायन प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं के साथ तालमेल में काम किया।एक्टियोसाइडHerba cistanchce . सेशारीरिक सेलुलर संदर्भों में विषाक्त नहीं था, जबकि इसने ऑक्सीडेटिव लोड को बढ़ाया, प्रोटियोस्टैटिक मॉड्यूल की गतिविधि को प्रभावित किया, और ट्यूमर सेल लाइनों में मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस को दबा दिया। इंट्रापेरिटोनियल या मौखिक (पीने के पानी के माध्यम से) प्रशासनसिस्टैंचेएक्टोसाइड एक मेलेनोमा माउस मॉडल में ट्यूमर में अपंजीकृत एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रियाएं; फिर भी, केवल इंट्रापेरिटोनियल डिलीवरी ने ट्यूमर के विकास को दबा दिया और एंटी-ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया। मास-स्पेक्ट्रोमेट्री पहचान/मात्रा विश्लेषण से पता चला है कि की इंट्रापेरिटोनियल डिलीवरीएक्टोसाइडइसके परिणामस्वरूप काफी अधिक, बनाम मौखिक प्रशासन, प्लाज्मा में यौगिक की सांद्रता और उपचारित चूहों के ट्यूमर, यह सुझाव देते हैं कि यह विवो एंटी-ट्यूमर प्रभाव में है, प्रशासन के मार्ग और ट्यूमर में प्राप्त एकाग्रता पर निर्भर करता है। अंत में, आणविक मॉडलिंग अध्ययन और एंजाइमी गतिविधि परख ने दिखाया कि एक्टोसाइड प्रोटीन किनेज सी को रोकता है। विशेष रूप से, एक्टोसाइड उपन्यास एंटी-ट्यूमर एजेंटों के विकास के लिए एक रासायनिक मचान के रूप में वादा करता है।

कीवर्ड:एक्टियोसाइड, कैंसर, प्राकृतिक यौगिक, ऑक्सीडेटिव तनाव, प्रोटियोस्टेसिस, इम्यूनोमॉड्यूलेशन

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1 परिचय

कार्सिनोजेनेसिस को कई सेल सिग्नलिंग पाथवे के डीरेग्यूलेशन की विशेषता है और यह बढ़े हुए सेलुलर ऑक्सीडेटिव, रेप्लिकेटिव, मेटाबॉलिक, जीनोटॉक्सिक और प्रोटियोटॉक्सिक स्ट्रेस [1] से जुड़ा है। इन तनाव फेनोटाइप को अनुकूलित करने और दूर करने के लिए, घातक कोशिकाएं कई गैर-ऑन्कोजेनिक मार्गों को अपग्रेड करती हैं (ओंकोजीन के अलावा) या तो दबाने या (कम से कम) चल रहे तनाव को कम करने का लक्ष्य रखती हैं। ट्यूमरजेनिसिस के दौरान अक्सर अपंजीकृत पाए जाने वाले विभिन्न गैर-ऑन्कोजेनिक मार्गों में सेलुलर एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रियाओं [2,3] के साथ प्रोटियोस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के मॉड्यूल हैं।

पीएन के प्रमुख घटक दो मुख्य डिग्रेडेशन मशीनरी हैं, अर्थात् ऑटोफैगी-लाइसोसोम पाथवे (एएलपी) और यूबिकिटिन-प्रोटिएसम पाथवे (यूपीपी), सेलुलर आणविक चैपरोन के नेटवर्क के साथ। एएलपी मुख्य रूप से प्रोटीन समुच्चय और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल [4] के क्षरण में शामिल है, जबकि यूपीपी सामान्य अल्पकालिक प्रोटीन और गैर-मरम्मत योग्य मिसफॉल्ड या अनफोल्डेड प्रोटीन [5-8] का क्षरण करता है। 26Seukaryotic proteasome का गठन 19S नियामक कणों (RP) और 20 स्कोर कण (CP) से होता है; उत्तरार्द्ध में चार स्टैक्ड हेप्टामेरिक रिंग्स (दो-प्रकार के आसपास के दो-प्रकार) शामिल होते हैं जो बैरल जैसी संरचना बनाते हैं। काइमोट्रिप्सिन-लाइक (सीटी-एल), ट्रिप्सिन-लाइक (टीएल), और कैस्पेज़-लाइक (सीएल) प्रोटीसोम पेप्टिडेज़ गतिविधियाँ क्रमशः 5, 2, और 1 प्रोटीसोमल सबयूनिट्स में स्थित हैं [6]। विभिन्न हेमटोलोगिक विकृतियों के खिलाफ प्रोटीसम इनहिबिटर्स बोर्टेज़ोमिब (वेल्केड®; जिसे पीएस -341 भी कहा जाता है) और कारफीफिलज़ोमिब की नैदानिक ​​​​प्रभावकारिता ने यूपीपी को एक आशाजनक रणनीति के रूप में लक्षित करने की "प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट" प्रदान की है। कैंसर का उपचार। सेलुलर एंटीऑक्सिडेंट रक्षा मार्गों के जटिल नेटवर्क को कार्सिनोजेनेसिस के दौरान अक्सर अपग्रेड किया जाता है [3,10] में एंटीऑक्सिडेंट एंजाइम, साथ ही कई प्रतिलेखन कारक शामिल हैं जो साइटोप्रोटेक्टिव जीनोमिक प्रतिक्रियाओं को जुटाते हैं; इनमें फोर्कहेड बॉक्स O (फॉक्सो) और परमाणु कारक एरिथ्रोइड 2-संबंधित कारक (Nrf-2) शामिल हैं। एनआरएफ -2 ऑक्सीडेटिव और/या ज़ेनोबायोटिक क्षति के खिलाफ कोशिकाओं की सुरक्षा में केंद्रीय है क्योंकि यह एंटीऑक्सिडेंट और चरण II जीन [11-13] की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है।

हमने और अन्य ने हाल ही में प्रस्तावित किया है कि इन ट्यूमर निर्भरता (यानी, प्रोटियोस्टैटिक मॉड्यूल और / या एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया मार्ग) को लक्षित करना या एक रूपांतरित जीनोटाइप के संदर्भ में आरओएस के बढ़ते सेलुलर स्तर ट्यूमर कोशिकाओं की चयनात्मक हत्या के लिए एक संभावित चिकित्सीय खिड़की प्रदान करते हैं [3] ,14]; समर्थन में, सेल्युलर आरओएस स्तरों को अपग्रेड करने वाले एक छोटे अणु द्वारा कैंसर कोशिकाओं की चयनात्मक हत्या की सूचना दी गई है [2]। यह उम्मीद की जाती है कि एंटी-ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं [15] की सक्रियता सहित संयोजक दृष्टिकोण संभवतः पीएन और एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रियाओं को रोककर और / या सेलुलर आरओएस स्तरों को बढ़ाकर चिकित्सीय खिड़की को अधिकतम करेंगे।

विभिन्न स्रोतों (पौधों, समुद्री जीवों, सूक्ष्मजीवों, आदि) से प्राकृतिक उत्पादों (अर्क या शुद्ध यौगिक) (एनपी) को उनकी अत्यधिक संरचनात्मक विविधता और रासायनिक जटिलता के कारण एंटी-ट्यूमर एजेंटों के रूप में कार्य करने की क्षमता के लिए जांचा जाता है, साथ ही क्योंकि वे कई सेलुलर सिग्नलिंग मार्ग [16] को प्लियोट्रोपिक रूप से संशोधित करते हैं। कथित तौर पर, एनपी एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटी-ट्यूमर और / या एंटी-मेटास्टेटिक प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करते हैं [16,17] और मल्टीड्रग प्रतिरोध [18,19] से भी बचते हैं। इनमें से, फेनोलिक यौगिकों (फिनाइलथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स सहित) ने विभिन्न मानव रोगों की रोकथाम और / या उपचार में उनकी कथित भूमिका के कारण महत्वपूर्ण रुचि को आकर्षित किया है।

एक्टियोसाइड, जिसे कुसागिन या वर्बास्कोसाइड [20] भी कहा जाता है, एक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड है जो कई डाइकोटाइलडॉन से पृथक होता है। कथित तौर पर, एक्टोसाइड कुछ दिलचस्प जैविक गतिविधियों को अंजाम देता है, जिसमें एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ और सेल एपोप्टोसिस रेगुलेटिंग गुण [21,22] शामिल हैं। फिर भी, इसकी संभावित एंटी-ट्यूमर गतिविधि को संबोधित नहीं किया गया है। हम यहां रिपोर्ट करते हैं, कि एक्टोसाइड ने स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ शारीरिक सेलुलर संदर्भों में कोई स्पष्ट विषाक्त प्रभाव नहीं दिखाया है। इसके अलावा, एक्टोसाइड ने एक विवो माउस मॉडल में मेलेनोमा ट्यूमर के विकास को दबा दिया, (दूसरों के बीच) एंटी-ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय किया।

एंटी-ट्यूमर सिस्टैंच एक्सट्रैक्ट

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. संयंत्र सामग्री और निष्कर्षण

सूखे लिप्पिया सिट्रियोडोरा (लैमियासी) के पत्ते (4.5 किग्रा) एथेंस, ग्रीस के स्थानीय बाजार से खरीदे गए थे। मेथनॉल (2 × 20 L) के साथ 12 घंटे के लिए यांत्रिक क्रियाशीलता द्वारा पत्तियों को चूर्णित और निकाला गया। मेथनॉलिक अर्क को सूखने के लिए वाष्पित किया गया और CH2Cl2 / MeOH 98/2 (15 L) के मिश्रण से धोया गया। अघुलनशील अवशेषों को अलग किया गया और सुखाया गया, जिससे हरे-पीले पाउडर (450 ग्राम) का उत्पादन हुआ।

2.2. Acteoside और UPLC-HRMS विश्लेषण की शुद्धि

पूर्वोक्त अवशेषों के एक हिस्से (10 g) को एक तेज़ सेंट्रीफ्यूगल पार्टीशन क्रोमैटोग्राफी (FCPC) उपकरण (क्रोमैटन, फ्रांस) का उपयोग करके काउंटरकरंट क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया था; 5/0.5/4.5 के अनुपात में EtOAc/EtOH/H2O के मिश्रण का उपयोग द्विभाषी विलायक प्रणाली के रूप में किया गया था। एकत्रित अंशों को पतली परत क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया; तब क्रोमैटोग्राम एक यूवी लैंप (254 और 365 एनएम) के नीचे देखे गए और मेथनॉल वैनिलिन सल्फेट के साथ छिड़काव करके दो मिनट तक गर्म किया गया। उपरोक्त प्रक्रिया द्वारा कुल 2.1 ग्राम एक्टोसाइड (शुद्धता 90 प्रतिशत से अधिक या उसके बराबर) को अलग किया गया था। एक्टियोसाइड की पहचान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) स्पेक्ट्रा द्वारा की गई थी, जबकि इसकी शुद्धता यूपीएलसी-एमएस और एनएमआर विश्लेषण द्वारा स्थापित की गई थी; विवरण के लिए सप्लिमेंट देखें। सामग्री और तरीके।

2.3. सेल लाइनों

B16.F1, B16.F10, YAC -1, और WEHI -164 माउस सेल लाइनों के साथ मानव फेफड़े के भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (IMR90 कोशिकाएं) अमेरिकी ऊतक संस्कृति संग्रह (ATCC) से प्राप्त किए गए थे। U2 OS और Sa OS मानव ऑस्टियोसारकोमा सेल लाइनों को प्रो. वी. गोरगौलिस (स्कूल ऑफ मेडिसिन, नेशनल एंड कपोडिस्ट्रियन यूनिवर्सिटी ऑफ एथेंस, ग्रीस) द्वारा दान किया गया था, जबकि केएच ओएस ओस्टियोसारकोमा सेल और केमोरेसिस्टेंट ओस्टियोसारकोमा सेल लाइन [23] थे। डॉ. ई. गोनोस (नेशनल हेलेनिक रिसर्च फाउंडेशन, ग्रीस) का एक दान। माउस कैंसर सेल लाइन्स C5N और A5 एक मल्टीस्टेज माउस स्किन कार्सिनोजेनेसिस मॉडल [24,25] से संबंधित हैं और इन्हें प्रो. ए. बाल्मैन (व्यापक कैंसर सेंटर, यूनिवर्सिटी ऑफ कैलिफोर्निया, यूएसए) द्वारा दान किया गया था। सप्ल में प्रयुक्त सेल लाइनों की खेती की स्थिति की सूचना दी गई है। सामग्री और तरीके।

सिस्टैंच के अर्क का लाभ: कैंसर रोधी

2.4. मेलेनोमा माउस मॉडल

नर C57BL/6 चूहों (25-3 0 वजन का ग्राम, 6-8 सप्ताह की आयु) हेलेनिक पाश्चर संस्थान से प्राप्त किया गया था और नियंत्रित तापमान (22 डिग्री) और फोटोपेरियोड (12 घंटे प्रकाश: 12 घंटे) के तहत रखा गया था। अंधेरा) पानी और भोजन तक मुफ्त पहुंच के साथ। चूहे को सूक्ष्म रूप से 105 बी16.एफ1 मेलेनोमा कोशिकाओं (100 μL पीबीएस में) के साथ टीका लगाया गया था और बेतरतीब ढंग से 3 समूहों (एन=5/समूह) को सौंपा गया था। जब ट्यूमर स्पष्ट हो गया (दिन 11) चूहों ने दो मार्गों के माध्यम से एक्टोसाइड प्राप्त किया; या तो अंतर्गर्भाशयी (आईपी) (200 μL पीबीएस में पतला 1 मिलीग्राम / माउस; कुल 6 खुराक हर दूसरे दिन प्रशासित) या मौखिक रूप से पीने के पानी (OR) (2.5 मिलीग्राम / माउस; कुल 13 खुराक में लगातार 13 दिनों तक)। नियंत्रण चूहों को पीबीएस प्रशासित किया गया था। एक डिजिटल कैलीपर के साथ गठित ट्यूमर के प्रमुख और मामूली कुल्हाड़ियों को मापकर हर 2 दिनों में ट्यूमर की वृद्धि दर्ज की गई। सूत्र का उपयोग करके माप को ट्यूमर की मात्रा में बदल दिया गया: ट्यूमर की मात्रा (सेमी 3)=प्रमुख अक्ष × मामूली अक्ष 2 × 0.5। 28 वें दिन, जानवरों को गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से हटा दिया गया था, और तिल्ली को असमान रूप से हटा दिया गया था। प्रयोग इसी तरह के निष्कर्षों के साथ तीन बार दोहराया गया था।

स्प्लेनोसाइट्स को व्यक्तिगत रूप से समरूप स्पलीन से अलग किया गया और तुरंत उनकी साइटोटोक्सिसिटी बनाम बी16.एफ1, वाईएसी-1, और WEHI-164 सेल लक्ष्यों के लिए परीक्षण किया गया। कोशिका की सतह पर CD107 जोखिम का पता लगाने के आधार पर साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया गया था, जो कि प्रभावकारक कोशिका क्षरण के परिणामस्वरूप होता है। स्प्लेनोसाइट्स (105 कोशिकाओं/कुएं) को लक्ष्य के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था 96-अच्छी तरह से यू बॉटम माइक्रोप्लेट्स को लक्ष्य (ई: टी) के अनुपात में 100:1 के अनुपात में 5% सीओ2 में 37 डिग्री पर। FITC-संयुग्मित एंटी-CD107a और एंटी-CD107 b मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (25 μL / mL) और मोनेंसिन (6 μL / mL; सभी BD बायोसाइंसेस से) प्रत्येक कुएं में जोड़े गए थे। कोशिकाओं को 6 घंटे बाद काटा गया और FACSCanto II फ्लफ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। समानांतर में, ट्यूमर को एक्साइज किया गया और डाउनस्ट्रीम assays के लिए संसाधित किया गया जैसा कि सप्ल में वर्णित है। सामग्री और तरीके।

सिस्टेन्च निकालने के प्रभाव: एंटी-ट्यूमर और कैंसर